JP5801276B2 - エステラーゼ活性を用いたStreptococcusagalactiaeの検出方法 - Google Patents
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Description
を含むことが好ましい。
a) サンプルのすべて又は一部を上記反応培地に播種すること、
b) 播種した培地をインキュベートすること、
c) 少なくとも1つのエステラーゼ活性の存在を、単独で、又は、エステラーゼ活性以外の少なくとも1つの他の酵素活性と共に顕現させること
(本発明の別の主題を構成する)。
(実施例1)
1.1 反応培地の調製
反応培地は、心臓−脳抽出物(4.84g/l;Solabia社)、肉汁(1.96g/l;Solabia社)、ビオチン(biothione)(1g/l;Solabia社)、ビオトリプカーゼ(biotrypcase)(7.2g/l;Solabia社)、炭酸ナトリウム(0.3g/l;VWR社)、ピルビン酸ナトリウム(2g/l;Fluka社)、HEPESバッファー(0.4g/l;シグマ社)、ラクトアルブミンペプトン(2g/l;DMV)、グルコース(1g/l;メルク社)、アメリカ寒天(2g/l;Sobigel社)及びヨーロッパ寒天(12g/l;Roko社)を混合することによって調製された。
* 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルオクタノエート(X−C8;Inalco社)(これが消費されると青緑色になる)、
* 5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルオクタノエート(Magenta−C8;Inalco社)(これが消費されると赤ピンク色になる)。
Streptococcus agalactiae株3つ及び他の細菌株3つ(いずれも本出願人が保存している株に由来)を、生理食塩水中に懸濁して播種し、各培地上に別々にコロニーを形成させる。培養皿を37℃において48時間インキュベートした。18時間、24時間又は40時間以上インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの着色、増殖及びこの着色の濃さ(エステラーゼ活性を表す)について記録した。
得られた結果を、下記表1中に示し、以下のように示す。
− 増殖(G)について、大きさはmmで示される、
− 色(Co)について、T=青緑色、R=ピンク色又は赤色である、
− 着色の濃さ(I)について、0〜4の任意のスケールに基づいて、0は活性がないことに相当し、4は非常に濃い着色があることに相当する、
− インキュベート時間について、時間(T)である。
(実施例2)
エステラーゼ基質X−C8 0.3g/lと同時に、消費されるとピンク色の着色を与える6−クロロ−3−インドリル−α−D−グルコピラノシド(Rose−α−Glu)0.3g/l又は6−クロロ−3−インドリルリン酸塩(Rose−P)0.3g/lを添加する以外は、実施例1中で上述するプロトコルを繰り返した。
(実施例3)
X−C8 0.3g/l及びRose−P 0.2g/lを使用し、オートクレーブする前に他の基質と同時にNa2HPO4 0.5g/l及びK2HPO4 0.5g/lと共に5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−セロビオシダーゼ(Cellobio)0.08g/lを更に添加する以外は、実施例2中に記載されるプロトコルを繰り返した。
(実施例4)
Cellobioの代わりに5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−N−アセチルグルコサミニド(X−NAGlu)0.4g/lを使用する以外は、実施例3中に記載されるプロトコルを繰り返した。
(実施例5)
X−NAGluの代わりに5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルコピラノシド(X−β−Glu)0.08g/l及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−N−メチル−β−D−グルコピラノシド(GreenA−β−Glu)0.3g/lを使用する以外は、実施例4中に記載されるプロトコルを繰り返した。
(実施例6)
エステラーゼ基質X−C8 0.3g/lと同時にRose−P 0.3g/lとNa2HPO4 0.5g/l及びK2HPO4 0.5g/lを添加する以外は、実施例1中に記載されるプロトコルを繰り返した。
(実施例7)
上記の感度及び特異性を試験するために、実施例1中に記載されるように調製された、X−C8 0.3g/lと、Rose−P 0.2g/l、Cellobio 0.08g/l、Na2HPO4 0.5g/l、K2HPO4 0.5g/l、アズトレオナム0.012g/l及びアンフォテリシンB 0.004g/lを含む本発明による培地を使用した。
(実施例8)
この試験には、上記実施例7中で調製された本発明による培地を使用した。
Claims (12)
- (i)Streptococcus agalactiaeが播種後18時間未満に消費できないエステラーゼ酵素基質、
(ii)β−セロビオシダーゼ基質、N−アセチルグルコサミニダーゼ基質及びβ−グルコシダーゼ基質から選択される少なくとも1つの酵素基質、及び
(iii)ホスファターゼ基質
を含む、Streptococcus agalactiaeを検出するための反応培地。 - 前記(ii)における酵素基質がβ−セロビオシダーゼ基質である、請求項1に記載の反応培地。
- 前記(ii)における酵素基質がN−アセチルグルコサミニダーゼ基質である、請求項1に記載の反応培地。
- 前記(ii)における酵素基質がβ−グルコシダーゼ基質である、請求項1に記載の反応培地。
- β−グルコシダーゼ基質がインドキシル誘導体に基づく基質である、
請求項4に記載の反応培地。 - エステラーゼ酵素基質がインドキシルオクタノエート誘導体、インドキシルノナノエート誘導体、及びインドキシルデカノエート誘導体から選択される少なくとも1つの酵素基質である、請求項1〜5のいずれかに記載の反応培地。
- 前記酵素基質のそれぞれの濃度は10〜2000mg/lである、請求項1〜6のいずれかに記載の反応培地。
- リン酸塩溶液を更に含む、請求項1〜7のいずれかに記載の反応培地。
- リン酸塩溶液がNa2HPO4溶液、又はK2HPO4溶液である、請求項8に記載の反応培地。
- さらに、望ましくない菌株の増殖を阻害又は制限するための阻害剤の混合物を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の反応培地。
- 阻害剤が抗生物質である、請求項10に記載の反応培地。
- 抗生物質がアズトレオナム及びアンホテリシンBである、請求項11に記載の反応培地。
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