CN105039271A - 一种提高多种酶制剂产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述发酵生产的发酵培养基包括通式(1)化合物中的一种或者两种以上；其中，R代表C1～C20烷基。通过在培养基中加入通式(1)化合物，缓解了的菌体呼吸抑制及胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题，使细胞代谢途径始终朝着生产目的酶的途径快速进行，最终明显提高各种酶制剂产量并降低能耗，从而降低生产成本，提高经济效益。

Description

一种提高多种酶制剂产量的方法
技术领域
本发明涉及一种酶制剂的生产方法，特别涉及一种提高多种酶制剂产量的方法。
背景技术
酶制剂工业在国民经济中占据了重要作用，其应用领域遍及轻工、食品、化工、医药、卫生、农业以及能源、环境保护等，产生巨大的社会和经济效益。目前，酶制剂应用领域不断扩大，生产技术水平不断提高，然而与国外先进水平相比尚有差距。目前利用微生物发酵法生产酶制剂的不足之处是在于酶分泌效率不高，导致发酵产率低、生产成本较高。
大多数工业酶制剂的发酵生产主要是利用好氧菌进行有氧发酵，无论是种子培养还是大罐发酵都需要进行通风供氧。由于菌株好氧发酵过程中需氧量大，特别是发酵中后期，短时间内需氧量很高，而此时由于菌体及代谢产物不断增多导致发酵液粘稠，细胞膜通透性降低，不利于氧气的传递，常规的依靠增大通风量或不断提高搅拌转速等方式来提高溶氧有时也不能满足需要。无论是通风量亦或是搅拌转速都有上限，不能无限提高，况且开启程度越大，发酵设备的损坏度以及能耗也越大，使得维修费用和成本增加。另外，通气量过高或转速过快，也容易对细胞造成机械损伤。
当前，大多数工业酶制剂为胞外酶，生产过程为在胞内产生后通过细胞膜分泌到细胞外。随着发酵的进行，尤其是中后期，发酵液粘稠度增大，细胞内外渗透压增大，细胞通透性降低，而此时胞内酶也处于大量产生阶段，若胞内的酶向外分泌不及时，会引发由于胞内发酵产物浓度过高而导致的反馈性抑制，使酶的合成量减少，产量降低。
为了提高酶制剂的产量，国内外的本领域技术人员进行了大量的研究工作，并提供了一系列的方法。
比如：中国专利申请CNN101851614公开了一种提高酶制剂产量的生产工艺，该工艺方法在生产过程中通入高含氧量的压缩空气，以达到增加酶制剂产量的目的。但上述方法需要氧气发生器，工艺复杂，成本较高。
日本专利JPS55148090公开了通过外加磁场的方法提高酶制剂产量的方法，该方法需要额外的磁力发生器，同样工艺复杂，成本较高。
日本专利JPS527481公开了一种提高酶制剂产量的方法，该方法采用有机溶剂为助剂，虽然在一定程度提高了酶制剂的产量，但是加入的有机溶剂对酶活性及后续的分离步骤带来了不利的影响。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于一种提高多种酶制剂产量且经济方便的方法。
为了实现上述目的，本发明提供的提高多种酶制剂产量的方法为发酵生产，其中的发酵培养基，包括碳源、氮源、无机盐，其特征在于还包括通式(1)化合物中的一种或者两种以上；
R代表C1～C20烷基。
优选的通式(1)化合物R为C1～C12烷基。优选的化合物为甜菜碱、月桂基甜菜碱(N-十二烷基-N,N-二甲基甘氨酸)、辛基甜菜碱(N-辛基-N,N-二甲基甘氨酸)、异丙基甜菜碱(N-异丙基-N,N-二甲基甘氨酸)。
通式(1)化合物在培养基中所起的作用，可能具有以下机理：
1、作为高效甲基供体，参与甲基化反应以及能提高代谢途径中关键酶的酶活，来加快菌体生长速率及代谢物产量。
2、能提高细胞膜通透性，促进营养物质及氧气在胞内外的交换，以及提高微生物的呼吸链***，显著提高菌体的呼吸特性。
3、作为渗透压保护剂，能够调节细胞内外渗透压，更有利于胞内产物向胞外的释放，解决由胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题。降低高渗透压导致的呼吸抑制，加快氧气在细胞内外的传递速率，降低能耗。
4、作为表面活性剂具有乳化剂的作用，更加快了氧气在粘稠的发酵液中的传递速度。
最优的通式(1)化合物R为甲基，即为甜菜碱，可以选自无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磷酸甜菜碱中的一种或者两种以上。
甜菜碱，又名N,N,N-三甲基甘氨酸，是一种季铵型水溶性生物碱。因最初从甜菜中提取而得名甜菜碱，纯品为白色片状结晶，有甜味，易吸潮，可速溶于水，易被消化吸收，使用安全，无毒副作用。除了上述可能的作用机理外，甜菜碱对提高种子液中菌球的分散度和菌体量也有明显的良性效果。
通式(1)化合物在酵母发酵培养基中的浓度0.015～7.0g/dl，优选为0.05～0.5g/dl。
本发明方法适用的酶制剂包括：纤维素酶、木聚糖酶、糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶等。
本发明方法适用于以下各种酶制剂的发酵菌：
细菌类：
大肠杆菌，(枯草、地衣、解淀粉、短小、多粘类)芽胞杆菌等。
真菌类：
1.酵母类：(毕赤、假丝)酵母等；
2.霉菌类：(里氏、长柄)木霉，(米、黑)曲霉，(绳状、特异)青霉等。
根据底物的不同，发酵条件也有所改变。发酵在有氧条件下进行，需要搅拌或振荡。
本发明在现有技术基础上，通过在发酵培养基中添加通式(1)化合物来提高酶制剂产量，解决问题一：由于发酵过程供氧不足及氧传递减弱导致的菌体呼吸抑制；解决问题二：解决胞内产物(酶制剂)向胞外的分泌出现不畅或不及时，而引起的胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题。从而提高酶合成效率，最终提高酶制剂产率并降低能耗。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
种子培养基(g/dl)：玉米浆3,葡萄糖3，微晶纤维0.6，MgSO4·7H2O0.05，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.2，NaNO30.15，尿素0.1，pH调至5.0，在115℃下，加热15分钟进行灭菌。
将里氏木霉CICC40358接种于5L种子罐中，在30℃下，振荡培养40h。
纤维素酶的发酵培养基(g/dl)为：麸皮3,玉米秸秆粉3，微晶纤维0.6，MgSO4·7H2O0.05，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.2，NaNO30.15，尿素0.1，培养基中分别添加下表所示浓度的的月桂基甜菜碱，调整pH至5.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在121℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用液碱和磷酸调节培养基的pH，使其维持在4.0-5.5，发酵培养100小时结束。纤维素酶活测定采用滤纸酶(FPA)活测定。酶活定义：以lml酶液1min分解底物生成lμmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位。结果见下表：
表1.
实施例2
种子培养基(g/dl)：玉米粉5,玉米浆5，豆饼粉3，pH4.5，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
将黑曲霉菌CICC2108接种于装液量3L的5L种子罐中，在30℃下，培养42h。
糖化酶发酵培养基(g/dl)为：玉米粉14，玉米浆6，豆饼粉5，(NH4)2SO40.2。培养基中分别添加下表所示浓度的辛基甜菜碱，调整pH至4.5。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用液氨调节培养基的pH，使其维持在4.4-4.6。发酵培养160小时后，发酵完毕。测定培养基中的糖化酶酶活。在40℃、pH4.6的条件下，1ml液体酶(1g固体酶粉)每小时降解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，U/ml(U/g)。次碘酸盐容量法测定糖化酶酶活。结果见下表：
表2.
实施例3
种子培养基(g/dl)：葡萄糖3,玉米浆3，酵母粉0.5，NaCL1.5，K2HPO40.1，MgSO4·7H2O0.04，pH10.0，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
将地衣芽胞杆菌CICC20203接种于装液量3L的5L种子罐中，在34℃下，培养42h。
蛋白酶发酵培养基(g/dl)为：豆粕6，蔗糖5，葡萄糖2，CaCl20.07，Mg2SO40.04，KCl0.03。培养基中分别添加下表所示浓度的异丙基甜菜碱，调整pH至10.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入150ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为34±1℃。在培养过程中，采用液碱和盐酸调节培养基的pH，使其维持在9.5-10.0。发酵培养78小时后，发酵完毕。测定培养基中的蛋白酶酶活。酶活测量采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。1mL酶液在40℃、pH10.5的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位。结果见下表：
表3
实施例4：
种子培养基(g/dl)：葡萄糖5，蛋白胨1，酵母膏1.5，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O0.1，pH5.0，于121℃灭菌20分钟。
将黑曲霉CICC40616接种于装液量3L的5L种子罐中，在30℃下，振荡培养42h。
木聚糖酶的发酵培养基(g/dl)为：玉米芯粉3,葡萄糖0.5，蛋白胨1，MgSO4·7H2O0.1，KH2PO40.5，尿素0.3，培养基中分别添加下表所示浓度的一水甜菜碱及十二烷基甜菜碱，调整pH至5.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用氨水和盐酸调节培养基的pH，使其维持在5.0-5.5，发酵培养120小时结束。木聚糖酶活力测定采用DNS法。在40℃、pH5.2的条件下,1mL液体酶每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。结果见下表：
表4.
实施例5
种子培养基(g/dl)：葡萄糖3，玉米浆3，(NH4)2SO40.5，谷氨酸1，KH2PO40.5，pH6.0，于115℃灭菌20分钟。
将地衣芽胞杆菌CICC10181接种于装液量3L的5L种子罐中，在37℃下，振荡培养16h。
淀粉酶的发酵培养基(g/dl)为：白糊精12,豆饼粉2，(NH4)2SO40.5，谷氨酸1，KH2PO40.8，培养基中分别添加下表所示浓度的辛基甜菜碱及异丙基甜菜碱，调整pH至6.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入150ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为37±1℃。在培养过程中，采用液碱和盐酸调节培养基的pH，使其维持在6.0-6.5，发酵培养108小时结束。淀粉酶活力测定采用YoungJ.Yoo改良法。在40℃,5min内水解1mg淀粉(0.5％淀粉)的酶量为一个活力单位。结果见下表：
表5
实施例6
种子培养基(g/dl)：玉米浆3,葡萄糖3，微晶纤维0.6，MgSO4·7H2O0.05，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.2，NaNO30.15，尿素0.1，pH调至5.0，在115℃下，加热15分钟进行灭菌。
将里氏木霉CICC40358接种于5L种子罐中，在30℃下，振荡培养40h。
纤维素酶的发酵培养基(g/dl)为：麸皮3,玉米秸秆粉3，微晶纤维0.6，MgSO4·7H2O0.05，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.2，NaNO30.15，尿素0.1，培养基中分别添加下表所示浓度的盐酸盐甜菜碱，调整pH至5.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在121℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用液碱和磷酸调节培养基的pH，使其维持在4.0-5.5，发酵培养100小时结束。纤维素酶活测定采用滤纸酶(FPA)活测定。酶活定义：以lml酶液1min分解底物生成lμmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位。结果见下表：
表6
实施例7
种子培养基(g/dl)：玉米浆3,葡萄糖3，微晶纤维0.6，MgSO4·7H2O0.05，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.2，NaNO30.15，尿素0.1，pH调至5.0，在115℃下，加热15分钟进行灭菌。
将里氏木霉CICC40358接种于5L种子罐中，在30℃下，振荡培养40h。
纤维素酶的发酵培养基(g/dl)为：麸皮3,玉米秸秆粉3，微晶纤维0.6，MgSO4·7H2O0.05，KH2PO40.3，(NH4)2SO40.2，NaNO30.15，尿素0.1，调整pH至5.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在121℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用液碱和磷酸调节培养基的pH，使其维持在4.0-5.5。分别在发酵培养0，3，8，14，18小时后，添加0.15g/dl的盐酸盐甜菜碱，发酵培养100小时后，发酵完毕。纤维素酶活测定采用滤纸酶(FPA)活测定。酶活定义：以lml酶液1min分解底物生成lμmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位。结果见下表：
表7
实施例8
种子培养基(g/dl)：玉米粉5,玉米浆5，豆饼粉3，pH4.5，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
将黑曲霉菌CICC2108接种于装液量3L的5L种子罐中，在30℃下，培养42h。
糖化酶发酵培养基(g/dl)为：玉米粉14，玉米浆6，豆饼粉5，(NH4)2SO40.2。培养基中分别添加下表所示浓度的磷酸甜菜碱，调整pH至4.5。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用液氨调节培养基的pH，使其维持在4.4-4.6。发酵培养160小时后，发酵完毕。测定培养基中的糖化酶酶活。在40℃、pH4.6的条件下，1ml液体酶(1g固体酶粉)每小时降解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，U/ml(U/g)。次碘酸盐容量法测定糖化酶酶活。结果见下表：
表8
实施例9
种子培养基(g/dl)：葡萄糖3,玉米浆3，酵母粉0.5，NaCL1.5，K2HPO40.1，MgSO4·7H2O0.04，pH10.0，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
将地衣芽胞杆菌CICC20203接种于装液量3L的5L种子罐中，在34℃下，培养42h。
蛋白酶发酵培养基(g/dl)为：豆粕6，蔗糖5，葡萄糖2，CaCl20.07，Mg2SO40.04，KCl0.03。培养基中分别添加下表所示浓度的无水甜菜碱，调整pH至10.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入150ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为34±1℃。在培养过程中，采用液碱和盐酸调节培养基的pH，使其维持在9.5-10.0。发酵培养78小时后，发酵完毕。测定培养基中的蛋白酶酶活。酶活测量采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。1mL酶液在40℃、pH10.5的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位。结果见下表：
表9
实施例10
种子培养基(g/dl)：葡萄糖5，蛋白胨1，酵母膏1.5，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O0.1，pH5.0，于121℃灭菌20分钟。
将黑曲霉CICC40616接种于装液量3L的5L种子罐中，在30℃下，振荡培养42h。
木聚糖酶的发酵培养基(g/dl)为：玉米芯粉3,葡萄糖0.5，蛋白胨1，MgSO4·7H2O0.1，KH2PO40.5，尿素0.3，培养基中分别添加下表所示浓度的一水甜菜碱，调整pH至5.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为30℃。在培养过程中，采用氨水和盐酸调节培养基的pH，使其维持在5.0-5.5，发酵培养120小时结束。木聚糖酶活力测定采用DNS法。在40℃、pH5.2的条件下,1mL液体酶每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。结果见下表：。
表10
实施例11
种子培养基(g/dl)：葡萄糖3，玉米浆3，(NH4)2SO40.5，谷氨酸1，KH2PO40.5，pH6.0，于115℃灭菌20分钟。
将地衣芽胞杆菌CICC10181接种于装液量3L的5L种子罐中，在37℃下，振荡培养16h。
淀粉酶的发酵培养基(g/dl)为：白糊精12,豆饼粉2，(NH4)2SO40.5，谷氨酸1，KH2PO40.8，培养基中分别添加下表所示浓度的磷酸甜菜碱，调整pH至6.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入150ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为37±1℃。在培养过程中，采用液碱和盐酸调节培养基的pH，使其维持在6.0-6.5，发酵培养108小时结束。淀粉酶活力测定采用YoungJ.Yoo改良法。在40℃,5min内水解1mg淀粉(0.5％淀粉)的酶量为一个活力单位。结果见下表：
表11
实施例12
种子培养基(g/dl)：葡萄糖3，玉米浆3，(NH4)2SO40.2，MgSO40.05，KH2PO40.01，pH6.5，于115℃灭菌20分钟。
将假丝酵母菌CICC1973接种于装液量3L的5L种子罐中，在28℃下，振荡培养42h。
淀粉酶的发酵培养基(g/dl)为：豆油4,豆粕4，(NH4)2SO40.1，MgSO40.05，KH2PO40.1，K2HPO40.2。培养基中分别添加下表所示浓度的盐酸盐甜菜碱，调整pH至6.0-6.5。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为28℃。在培养过程中，采用液碱和盐酸调节培养基的pH，使其维持在6.0-6.5，发酵培养70小时结束。采用橄榄油乳化液水解滴定法(简称滴定法)，酶活定义:在40℃、pH8下每分钟产生1μmol脂肪酸所需的酶量，为1个脂肪酶国际单位(IU)。结果见下表：
表12
实施例13
种子培养基(g/dl)：葡萄糖2，玉米浆3，蛋白胨1，MgSO40.1，(NH4)2SO40.2，K2HPO41.2，pH,7.0，0.1MPa、115℃灭菌20分钟。
将多粘类芽孢杆菌CICC20185接种于装液量3L的5L种子罐中，在35℃下，振荡培养24h。
果胶酶的发酵培养基(g/dl)为：果胶1,蛋白胨2，KH2PO40.3，K2HPO4,0.6，MgSO40.1，NaCl1。培养基中分别添加下表所示浓度的磷酸甜菜碱，调整pH至9.0。将3L培养基放入5L的全自动发酵罐，在115℃下，加热20分钟进行灭菌。
在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通空气培养，温度为35℃。在培养过程中，采用液碱和盐酸调节培养基的pH，使其维持在8.5-9.0，发酵培养36小时结束。酶活测定采用DNS分光光度计法。酶活力单位定义为：在pH值为10.0，50℃条件下，每分钟催化果胶水解生成1μg半乳糖醛酸所需酶量为1个酶活力单位。结果见下表：
表13
通过在培养基中加入通式(1)化合物，一方面缓解了由于发酵过程供氧不足、不及时及氧传递减弱导致的菌体呼吸抑制；另一方面由于及时帮助细胞将胞内产生的大量的酶分泌到胞外，降低了由胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题，使细胞代谢途径始终朝着生产目的酶的途径快速进行，最终明显提高各种酶制剂产量并降低能耗(并且从实施例7可以看到通式(1)化合物应该在发酵之前或者前期及时加入)，从而降低生产成本，提高经济效益。
应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种提高多种酶制剂产量的方法，该方法为发酵生产，其特征在于所述发酵生产的发酵培养基含有通式(1)化合物中的一种或者两种以上；
R代表C1～C20烷基。
2.根据权利要求1所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述通式(1)化合物R为C1～C12烷基。
3.根据权利要求1或2所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述通式(1)化合物为甜菜碱、月桂基甜菜碱、辛基甜菜碱、异丙基甜菜碱。
4.根据权利要求3所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述通式(1)化合物为无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磷酸甜菜碱。
5.根据权利要求1所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述通式(1)化合物在所述发酵培养基中的浓度为0.015～7.0g/dl。
6.根据权利要求5所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述通式(1)化合物在所述发酵培养基中的浓度为0.05～0.5g/dl。
7.根据权利要求1所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述酶制剂包括纤维素酶、木聚糖酶、糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶。
8.根据权利要求1、2、4、5、6任意一项所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于生产上述酶制剂的发酵菌包括大肠杆菌，芽胞杆菌、酵母、木霉、青霉。
9.根据权利要求8所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌中的一种。
10.根据权利要求8所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于所述酵母为毕赤酵母或者假丝酵母；所述木霉为里氏木霉或者长柄木霉；所述曲霉为米曲霉或者黑曲霉；所述青霉为绳状青霉或者特异青霉。
11.根据权利要求1所述的提高多种酶制剂产量的方法，其特征在于发酵在有氧条件下进行，需要搅拌或振荡。
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