CN105586367A - 一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法，包括将淀粉质原料进行调浆、液化、接种发酵，制得终发酵液，还包括在发酵培养过程中，当发酵液pH降至2.0~3.0时，向其中分阶段等量添加糖化酶的步骤，所述分阶段等量添加为每间隔2~8h等量添加，所述糖化酶的添加总量为40~1000U/g残余非葡萄糖量。本发明方法能解决柠檬酸发酵中后期糖化酶活力损失的问题，有效缩短发酵周期，提高发酵转化率，降低终发酵液残糖量，降低废水排放，同时能够抵消自身分泌的葡萄糖糖苷酶活性，减少非发酵糖的产生，具有重要的经济效益与环境效益。

Description

一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，尤其涉及一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法。
背景技术
柠檬酸（CitricAcid）是一种具有多种功能的重要有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域，是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸，全球产量超过170万吨。同时，柠檬酸又具有优良的生物特性，在生物聚合、药物运输、细胞培养等新兴产业领域有巨大的应用潜力，其需求量以每年5%的速度增长。
柠檬酸往往通过液态深层发酵法获得，工业化生产中仍然沿用传统的分批发酵方式。因黑曲霉具有酶系丰富、底物广泛、产率高等优势，是柠檬酸发酵最重要的菌株，黑曲霉自身能够分泌糖化酶，一般采用边糖化边发酵的方式。但在黑曲霉发酵生产柠檬酸过程中，随着合成的柠檬酸不断积累，发酵液pH会显著下降，糖化酶活性逐步受到抑制，致使终发酵醪液中残糖偏高，发酵周期较长。
现有技术针对柠檬酸发酵过程的糖化作用进行了一些研究。申请号201010513719.7的发明专利“一种添加糖化酶发酵制备柠檬酸的方法”公开一种在液化后接种前，降温至40~60℃添加糖化酶的工艺，其缺点是加酶温度太高，大部分糖化酶失活，导致糖化酶利用率低；申请号201110162278.5的发明专利“一种发酵生产柠檬酸的方法”公开了在接种发酵后，在36~38℃正常控温过程中添加糖化酶；申请号201210009294.5的发明专利“一种发酵制备柠檬酸的方法”公开了在柠檬酸发酵菌种接种后的0~8小时内向发酵培养基中添加糖化酶。
上述几种方法基于共同的指导思想即通过添加糖化酶在发酵初期即获得高浓度的小分子糖（如葡萄糖），但并未解决发酵过程中后期pH显著下降、糖化酶活力损失而引起葡萄糖供应与菌株耗糖速率不协调、柠檬酸合成速率放缓、发酵周期偏长、残糖量偏高等问题。同时带来新的问题：发酵初期培养基本身存在葡萄糖，自身分泌的糖化酶已能够满足发酵菌株对营养的需求，过高浓度葡萄糖反而会抑制菌种的生长，延长发酵延滞期，不利于柠檬酸的快速合成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法，该方法能解决柠檬酸发酵中后期糖化酶活力损失的问题，有效缩短发酵周期，提高发酵转化率，降低终发酵液残糖量。
为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法，包括将淀粉质原料进行调浆、液化、接种发酵，制得终发酵液，还包括在发酵培养过程中，当发酵液pH降至2.0~3.0时，向其中分阶段等量添加糖化酶的步骤。
具体地，所述分阶段等量添加为每间隔2~8h等量添加。
具体地，所述糖化酶的添加总量是基于所述发酵液中残余非葡萄糖的含量（残余总糖与残余葡萄的差值）来确定，添加总量为40~1000U/g残余非葡萄糖量。
具体地，所述淀粉质原料包括玉米粉、小麦粉、木薯粉、红薯粉、淀粉、糖蜜、小麦中的至少一种。
优选地，本发明具体包括以下步骤：
（1）将所述淀粉质原料粉末与水按照1:1.5~1:4比例混合均匀，调节pH至5.8~6.0，然后添加高温α—淀粉酶，所述淀粉酶添加量为15~50U/g粉末；
（2）将步骤（2）获得的混合料液经过两次喷射，一次喷射温度95~105℃，二次喷射温度120~130℃，经碘试合格，获得液化混液，再将所述液化混液经过板框过滤获得液化清液；
（3）将步骤（2）获得的液化混液与水混合，加氮源，调节混合液总糖为6~12%，总氮为0.2%~0.4%，得到种子培养基；
（4）将黑曲霉孢子悬液接种步骤（3）中的种子培养基进行培养，得到成熟种子液；
（5）将步骤（2）获得的液化混液、液化清液与水混合，调节混合液的总糖为16~18%，总氮为0.05~0.15%，得到发酵培养基；
（6）将步骤（4）获得的成熟种子液接种至步骤（5）获得的发酵培养基中，培养20~32h；
（7）当上述发酵培养基发酵液pH降至2.0~3.0时，每间隔2~8h向其中等量添加糖化酶，添加总量为40~1000U/g残余非葡萄糖量。
如无特殊说明，以上所述百分数均为重量百分数（wt%）。
本发明具有如下有益技术效果：
本发明基于发酵菌株生理特性与柠檬酸合成特点，采用在发酵液pH降至特定范围内时，根据残余非葡萄糖量分阶段等量添加糖化酶，协调整个发酵过程中葡萄糖供应与葡萄糖消耗之间达到平衡最优化。一方面既能实现自身糖化酶的高效利用，确保发酵前期菌种的快速生长；另一方面适时适量添加糖化酶又能有效补偿自身活力的损失，协同柠檬酸发酵过程，确保在发酵中后期柠檬酸的快速积累，同时能够抵消自身分泌的葡萄糖糖苷酶活性，减少非发酵糖的产生。应用结果表明，本发明可缩短发酵周期，提高发酵转化率，降低终发酵液残糖量，降低废水排放，减少废水CODcr，具有重要的经济效益和环境效益。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例及对比例中，总糖、还原糖的测定方法采用菲林滴定法，柠檬酸的测定采用浓度0.1429mol/L的NaOH滴定，孢子计数采用血球计数板；如无特殊说明，均采用本领域常用设备和工艺方法。
所用原料和试剂如无特殊说明均为市售通用产品。
实施例1
将玉米粉与水按照1:1.5比例混合均匀，调节pH至5.8，然后添加高温α-淀粉酶，添加量为50U/g玉米粉；二次喷射液化，其中一喷温度为105℃，二次喷射温度130℃，经碘试合格，得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液；液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖6%，总氮0.25%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基，培养8h时，提高搅拌转速至800rpm，共培养27h，获得成熟种子液；将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖16%，总氮0.05%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液pH降至3.00时添加糖化酶，添加总量为40U/g残余非葡萄糖量，每间隔4h等量添加糖化酶3840U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期52h，柠檬酸含量16.1%，残糖1.2%。
实施例2
将玉米粉与水按照1:4比例混合均匀，调节pH至6.0，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为15U/g玉米粉；二次喷射液化，其中一喷温度为95℃，二次喷射温度120℃，经碘试合格，得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液；液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖10%，总氮0.30%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基，培养26h，获得成熟种子液；将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖16.8%，总氮0.08%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液pH降至2.52时添加糖化酶，添加总量为100U/g残余非葡萄糖量，每间隔4h等量添加糖化酶16000U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期53h，柠檬酸含量16.9%，残糖0.9%。
实施例3
将木薯粉与水按照1:2.5比例混合均匀，调节pH至5.9，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为25U/g木薯粉；二次喷射液化，其中一喷温度为100℃，二次喷射温度125℃，经碘试合格，得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液；液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖12%，总氮0.40%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基，培养30h，获得成熟种子液；将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖16.7%，总氮0.12%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液pH降至2.00时添加糖化酶，添加总量为300U/g残余非葡萄糖量，每间隔8h等量添加糖化酶48000U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期为55h，柠檬酸含量16.5%，残糖1.2%。
实施例4
将木薯粉与水按照1:2.5比例混合均匀，调节pH至5.8，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为25U/g木薯粉；二次喷射液化，其中一喷温度为100℃，二次喷射温度125℃，经碘试合格，得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液；液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖12%，总氮0.40%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基，培养32h，获得成熟种子液；将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖17.5%，总氮0.12%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液pH降至2.60时添加糖化酶，添加总量为500U/g残余非葡萄糖量，每间隔6h等量添加糖化酶50400U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期为63h，柠檬酸含量17.4%，残糖1.6%。
实施例5
将木薯粉与水按照1:3.5比例混合均匀，调节pH至5.9，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为30U/g木薯粉；二次喷射液化，其中一喷温度为98℃，二次喷射温度127℃，经碘试合格，得到木薯液化混液，然后经过板框过滤得到木薯液化清液。将玉米粉与水按照1:2.5比例混合均匀，调节pH至5.8，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为20U/g玉米粉；二次喷射液化，其中一喷温度为105℃，二次喷射温度125℃，经碘试合格，得到玉米液化混液，部分玉米液化混液经过板框过滤得到玉米液化清液。将玉米液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖8%，总氮0.28%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基，培养29h，获得成熟种子液；将玉米液化混液，玉米液化清液，木薯液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖18.0%，总氮0.15%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液pH降至2.15时添加糖化酶，添加总量为1000U/g残余非葡萄糖量，每间隔3h等量添加糖化酶36800U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期为67h，柠檬酸含量17.7%，残糖2.2%。
实施例6
将玉米粉与水按照1:3.0比例混合均匀，调节pH至5.8，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为34U/g玉米粉；二次喷射液化，其中一喷温度为96℃，二次喷射温度123℃，经碘试合格，得到玉米液化混液，然后经过板框过滤得到玉米液化清液。将小麦粉与水按照1:2.0比例混合均匀，调节pH至6.0，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为23U/g小麦粉；二次喷射液化，其中一喷温度为95℃，二次喷射温度128℃，经碘试合格，得到小麦液化混液，然后经过板框过滤得到小麦液化清液。将玉米液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖10%，总氮0.32%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基，培养28h，获得成熟种子液；将玉米液化混液，玉米液化清液，小麦液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖17.2%，总氮0.09%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液pH降至2.05时添加糖化酶，当发酵液pH降至2.05时添加糖化酶，添加总量为70U/g残余非葡萄糖量,每间隔5h等量添加糖化酶5600U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期为63h，柠檬酸含量17.1%，残糖1.3%。
对比例（现有技术）
将玉米粉与水按照1:2.5比例混合均匀，调节pH至5.8，然后添加高温α—淀粉酶，添加量为40U/g玉米粉；二次喷射液化，其中一喷温度为98℃，二次喷射温度130℃，经碘试合格，得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液；液化混液与水混合均匀，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖12%，总氮0.25%），将成熟的黑曲霉孢子悬液接种种子培养基培养28h，获得成熟种子液；将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基（总糖16.6%，总氮0.85%）；将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期64h，柠檬酸含量16.2%，残糖2.8%。
将实施例1~6各项测试指标与对比例进行比较，结果参见下表。
表1实施例1~6与对比例各项测试指标对比结果
从表1可以看出，实施例1~6在发酵液特定pH范围（pH2.0~3.0）响应分阶段等量添加糖化酶，既能确保发酵前期菌种的快速生长，又能确保在发酵中后期柠檬酸的快速积累，缩短发酵周期，提高发酵转化率和发酵指数，有效降低终发酵液残糖量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法，包括将淀粉质原料进行调浆、液化、接种发酵，制得终发酵液，其特征在于：还包括在发酵培养过程中，当发酵液pH降至2.0~3.0时，向其中分阶段等量添加糖化酶的步骤。
2.根据权利要求1所述生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述分阶段等量添加为每间隔2~8h等量添加。
3.根据权利要求1所述生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述糖化酶的添加总量是基于所述发酵液中残余非葡萄糖的含量（残余总糖与残余葡萄的差值）来确定。
4.根据权利要求3所述生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述糖化酶的添加总量为40~1000U/g残余非葡萄糖量。
5.根据权利要求1所述生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述淀粉质原料包括玉米粉、小麦粉、木薯粉、红薯粉、淀粉、糖蜜、小麦中的至少一种。
6.权利要求1~5任一项所述生产柠檬酸的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）将所述淀粉质原料粉末与水按照1:1.5~1:4比例混合均匀，调节pH至5.8~6.0，然后添加高温α—淀粉酶，所述淀粉酶添加量为15~50U/g粉末；
（2）将步骤（2）获得的混合料液经过两次喷射，一次喷射温度95~105℃，二次喷射温度120~130℃，经碘试合格，获得液化混液，再将所述液化混液经过板框过滤获得液化清液；
（3）将步骤（2）获得的液化混液与水混合，加氮源，调节混合液总糖为6~12%，总氮为0.2%~0.4%，得到种子培养基；
（4）将黑曲霉孢子悬液接种步骤（3）中的种子培养基进行培养，得到成熟种子液；
（5）将步骤（2）获得的液化混液、液化清液与水混合，调节混合液的总糖为16~18%，总氮为0.05~0.15%，得到发酵培养基；
（6）将步骤（4）获得的成熟种子液接种至步骤（5）获得的发酵培养基中，培养20~32h；
（7）当上述发酵培养基发酵液pH降至2.0~3.0时，每间隔2~8h向其中等量添加糖化酶，添加总量为40~1000U/g残余非葡萄糖量；
（8）当上述发酵培养基还原糖浓度低于0.5%时结束发酵；
如无特殊说明，以上所述百分数均为重量百分数（wt%）。
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