CN103243131A - 发酵制备l-谷氨酸的方法 - Google Patents

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本发明提供了一种发酵制备L-谷氨酸的方法。本发明在L-谷氨酸发酵过程中采用温度敏感型谷氨酸生产菌，并分期于培养基中添加不同的低浓度甜菜碱刺激细胞呼吸，提高菌体的氧消耗速率，抑制乳酸菌的积累，同时调节和控制发酵培养温度，从而提高谷氨酸的产酸量和糖酸转化率。由本发明方法制得的谷氨酸，不含磷的成分，可直接用于保健食品和医药行业，有较大的应用价值。

Description

发酵制备L-谷氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及氨基酸的制备方法，尤其涉及一种优化温度敏感型谷氨酸生产菌发酵制备L-谷氨酸的方法。 
背景技术
L-谷氨酸在食品、医药、工业方面均有广泛的用途,尤其是在食品方面,它是制造味精的前体。有关L-谷氨酸的制备方法较多，以发酵法为主。经过众多科研人员的努力,不断选育出一些活性较高的新菌种供生产使用,并开发出许多新方法,然而，糖酸转化率较低。另外，受原辅料价格不断上涨，谷氨酸生产成本不断提高的影响，生产谷氨酸的利润下滑。因此，寻求更优化的发酵条件，提高谷氨酸产量，降低成本是需要解决的问题。甜菜碱作为一种高效的甲基供体，具有替代蛋氨酸的供甲基功效。另外，甜菜碱还是一种非毒性的、对生物有效的渗透压缓冲物质，可作为细胞的渗透压保护剂。各种生物和动物组织在不同压力下，甜菜碱与其他酶的功能保持高度一致，对于稳定细胞的代谢起着重要作用。当细胞内渗透压激变时，如外部渗透压升高时，细胞开始产生或吸收甜菜碱以维持正常渗透压的平衡，同时防止细胞水分流出和盐分的入侵，并能提高钠钾泵的功效，确保细胞的正常功能。因此，甜菜碱作为发酵助剂广泛应用于温度敏感型菌株强制发酵生产L-谷氨酸的生产中，添加方式普遍采用在初始培 养基中一次性添加。研究表明，发酵液中低浓度的甜菜碱明显有利于产物合成。在菌体生长阶段，初始培养基中的甜菜碱浓度过高，则容易造成大量的甜菜碱被分解代谢用于菌体的合成，造成甜菜碱消耗量的增加。在产物合成期，高浓度的甜菜碱不利于产物积累，低浓度的甜菜碱有利于胞内产物向胞外的释放从而增加合成，这与甜菜碱分子具有两性有关。但是，甜菜碱浓度并非越低越好，甜菜碱的浓度应控制在既能满足甲基供体的需要又有利于产物合成的范围内。在发酵过程中，甜菜碱对细菌受到的渗透压呼吸抑制有缓解作用，从而刺激呼吸，提高菌体的氧消耗速率，抑制乳酸菌的积累，提高菌体生长速率和产酸速率。由于在发酵培养基中添加磷酸盐甜菜碱，制得的L-谷氨酸中必然含有磷的成分，在安全性要求较高的保健食品和医药行业，往往不能直接应用，限制了它的使用。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种在初始培养基和发酵变温过程中，添加较低浓度甜菜碱的方法来提高温度敏感型谷氨酸生产菌发酵产率的方法。 
本发明提供了一种发酵制备L-谷氨酸的方法。 
本发明采用温度敏感型谷氨酸生产菌，在L-谷氨酸发酵过程中，分期于培养基中添加不同的低浓度甜菜碱，并调节和控制发酵培养温度，来提高谷氨酸的产酸量和糖酸转化率。 
本发明方法包括下列步骤： 
（1）种子培养 
种子培养基（/L）： 
葡萄糖15g，玉米浆20g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O1g，VB1200μg/L，DL-蛋氨酸50μg/L，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各2mg/L，尿素0.55（分消），pH7.0～7.2，121℃灭菌15min； 
方法：采用温度敏感型谷氨酸生产菌（谷氨酸黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等），接种量为12%；培养温度32℃，160rpm，振荡培养14～16h至对数期； 
（2）发酵培养 
发酵培养基（/L）： 
葡萄糖20g，玉米浆20g，盐酸盐甜菜碱0.1～0.3g，K2HPO47.5g，MgSO4·7H2O1.5g，VB1200μg/L，VH600μg/L，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各30mg/L，尿素0.55（分消），pH7.0～7.2，121℃灭菌15min； 
方法：按12%的接种量将种子液接入含有发酵培养基全自动控制发酵罐中，控制pH值7.0～7.2；分阶段供氧模式控制溶氧：0～10h为20%，10～32h为5%；控制初始培养温度为32℃；当相对生长△OD＝0.3左右时（此为发酵液稀释20倍浓度在620nm处的OD值），转换温度到37℃，同时添加0.1～0.3g/L的盐酸盐甜菜碱；△OD＝0.6时，再次提高温度到38℃继续发酵至结束。通过流加80%的葡萄糖浓溶液将残糖控制在为0.1～3g/L。全过程流加液氨控制pH，发酵 0～14h，pH为7.0～7.1，14～25h为7.2～7.3，25h至发酵结束为6.8，产酸值不再变化并有pH值上升时即为发酵终点；发酵时间为30-32h。 
本发明方法所述步骤（1）温度敏感型谷氨酸生产菌为谷氨酸黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌。所述菌株是公开报道使用的，如：陈宁，彭飞，张克旭.L-谷氨酸温度敏感突变株的细胞融合育种及发酵条件,发酵科技通迅，2004,33(1),10-14. 
张克旭，陈宁.谷氨酸温度敏感突变株C N1021发酵条件的研究,发酵科技通迅，2003，33(2):3-5. 
本发明方法所述步骤（2）添加的甜菜碱为盐酸盐甜菜碱、无水甜菜碱或一水甜菜碱中的一种或多种的混合物。 
本发明根据在温度敏感型谷氨酸生产菌发酵过程中，低浓度的甜菜碱有利用菌体的生长和产物的合成的特性，分别在初始和变温过程中，在培养基中添加甜菜碱来提供甲基，以及刺激细胞呼吸，提高菌体的氧消耗速率，抑制乳酸菌的积累，提高菌体生长速率和产酸速率。由此制得的谷氨酸，不含磷的成分，可直接用在保健食品和医药行业，有较大的应用价值。 
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，所举之例并不限制本发明的保护范围： 
实施例1 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌 
种子培养基（/L）： 
葡萄糖15g，玉米浆20g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O1g，VB1200μg/L，DL-蛋氨酸50μg/L，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各2mg/L，尿素0.55（分消），pH7.0～7.2，121℃灭菌15min； 
种子培养方法：将斜面菌种用10ml无菌水洗下，转接于装有1200mL种子培养基的5000mL种瓶中，培养温度32℃，160rpm，振荡培养14～16h； 
发酵培养基（/L）： 
葡萄糖20g，玉米浆20g，盐酸盐甜菜碱0.1g，K2HPO47.5g，MgSO4·7H2O1.5g，VB1200μg/L，VH600μg/L，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各30mg/L，尿素0.55（分消），pH7.0～7.2，121℃灭菌15min； 
发酵培养方法：按12%的接种量将种子液全部接入含有发酵培养基的15L全自动控制发酵罐中，控制pH值调至7.0～7.2；分阶段供氧模式控制溶氧：0～10h为20%，10～32h为5%；控制初始培养温度为32℃。当相对生长光密度值△OD＝0.3左右时（发酵液稀释20倍浓度在620nm处的OD值），转换温度到37℃，同时，再添加0.1g/L的盐酸盐甜菜碱；△OD＝0.6时，再次提高温度到38℃继续发酵至结束。通过流加80%的葡萄糖浓溶液将残糖控制在为1g/L。全过程流加液氨控制pH，发酵0～14h，pH为7.0～7.1，14～25h为7.2～7.3，25h至发酵结束为6.8，产酸值不再变化并有pH值略升时即为发酵终点（31h）。放罐时，L-谷氨酸的产量为216.7g/L，糖酸转化率为65.3%。 
对比例1： 
对照例1跟实施例1的不同点在于:当温度转换至37℃时不添加甜菜碱，而在温度转换至38℃时,添加1.0g/L的一水甜菜碱，其他条件与实施例1相同。发酵结束时L-谷氨酸的产量为212.9g/L,糖酸转化率为63.3%。对比结果表明实施例1发酵结束时的L-谷氨酸产量和糖酸转化率明显优于对比例1。 
实施例2： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸棒杆菌；在转换温度到37℃时，同时添加1g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为213.1g/L，糖酸转化率为62.8%。 
实施例3： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；在转换温度到37℃时，同时添加1.5g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为211.8g/L，糖酸转化率为61.7%。 
实施例4： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；发酵初始培养基为在发酵培养基中加0.3g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为219.4g/L，糖酸转化率为68.1%。 
对比例2： 
对照例2跟实施例4的不同点在于:通过流加80%的葡萄糖浓溶液将残糖控制在为4g/L。其他条件与实施例4相同。发酵结束时L-谷氨酸的产量为216.8g/L,糖酸转化率为65.5%。对比结果表明实施例4发酵结束时的L-谷氨酸产量和糖酸转化率明显优于对比例2。 
对比例3： 
对照例3跟实施例4的不同点在于:通过流加80%的葡萄糖浓溶液将残糖控制在为10g/L。其他条件与实施例4相同。发酵结束时L-谷氨酸的产量为211.2g/L,糖酸转化率为61.3%。对比结果表明实施例4发酵结束时的L-谷氨酸产量和糖酸转化率明显优于对比例3。 
实施例4与对比例2,3结果对比表（表1） 
Figure BDA00003257002700071
实施例5： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；在转换温度到37℃时，同时添加1g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例4。放罐时，L-谷氨酸的产量为214.3g/L，糖酸转化率为63.4%。 
实施例6： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；在转换温度到37℃时，同时添加1.5g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例4。放罐时，L-谷氨酸的产量为209.7g/L，糖酸转化率为61.2%。 
实施例7： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸棒杆菌；发酵初始培养基为在发酵培养基中加1.5g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为216.2g/L，糖酸转化率为65.1%。 
实施例8： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸棒杆菌；在转换温度到37℃时，同时添加1g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例7。放罐时，L-谷氨酸的产量为213.8g/L，糖酸转化率为63.1%。 
实施例9： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；在转换温度到37℃时，同时添加1.5g/L的盐酸盐甜菜碱；其他条件与培养方法同实施例7。放罐时，L-谷氨酸的产量为210.2g/L，糖酸转化率为61.4%。 
实施例1～9结果对比表（表2） 
实施例10： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸棒杆菌；应用现有的甜菜碱添加方式即发酵初始培养基中一次性加入盐酸盐甜菜碱0.4g/L，后期不再添加甜菜碱。其他发酵条件同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为213.3g/L，糖酸转化率为62.6%。 
实施例11： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；应用现有的甜菜碱添加方式即发酵初始培养基中一次性加入盐酸盐甜菜碱1.6g/L，后期不再添加甜菜碱。其他发酵条件同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为215.6g/L，糖酸转化率为64.1%。 
实施例12： 
采用的菌株为温度敏感型谷氨酸生产菌：谷氨酸黄色短杆菌；应用现有的甜菜碱添加方式即发酵初始培养基中一次性加入盐酸盐甜菜碱3.0g/L，后期不再添加甜菜碱。其他发酵条件同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为213.1g/L，糖酸转化率为62.9%。 
实施例10～12与实施例4结果对比表（表3） 
Figure BDA00003257002700091
。

Claims (5)

1.发酵制备L-谷氨酸的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤： 
（1）种子培养 
种子培养基/L： 
葡萄糖15g，玉米浆20g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O1g，VB1200μg/L，DL-蛋氨酸50μg/L，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各2mg/L，尿素0.55分消，pH7.0～7.2，121℃灭菌15min； 
方法：采用温度敏感型谷氨酸生产菌，接种量为12%；培养温度32℃，160rpm，振荡培养14～16h至对数期； 
（2）发酵培养 
发酵培养基/L： 
葡萄糖20g，玉米浆20g，盐酸盐甜菜碱0.1～0.3g，K2HPO47.5g，MgSO4·7H2O1.5g，VB1200μg/L，VH600μg/L，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各30mg/L，尿素0.55分消，pH7.0～7.2，121℃灭菌15min； 
方法：按12%的接种量将种子液接入含有发酵培养基全自动控制发酵罐中，控制pH值7.0～7.2；分阶段供氧模式控制溶氧：0～10h为20%，10～32h为5%；控制初始培养温度为32℃；当相对生长△OD＝0.3时此为发酵液稀释20倍浓度在620nm处的OD值，转换温度 到37℃，同时添加0.1～0.3g/L的盐酸盐甜菜碱；△OD＝0.6时，再次提高温度到38℃继续发酵至结束；通过流加80%的葡萄糖浓溶液将残糖控制在为0.1～3g/L；全过程流加液氨控制pH，发酵0～14h，pH为7.0～7.1，14～25h为7.2～7.3，25h至发酵结束为6.8，产酸值不再变化并有pH值上升时即为发酵终点；发酵时间为30-32h。 
2.根据权利要求1所述的发酵制备L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）温度敏感型谷氨酸生产菌为谷氨酸黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌。 
3.根据权利要求2所述的发酵制备L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）温度敏感型谷氨酸生产菌为谷氨酸黄色短杆菌。 
4.根据权利要求1所述的发酵制备L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步骤（2）添加的甜菜碱为盐酸盐甜菜碱、无水甜菜碱或一水甜菜碱中的一种或多种的混合物。 
5.根据权利要求4所述的发酵制备L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述步骤（2）添加的甜菜碱为盐酸盐甜菜碱。 
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