CN105368882A - 一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法 - Google Patents

一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法。该方法以秸秆为基质，利用黑曲霉和木霉混合发酵，制作粗酶液，产生纤维素酶，用粗酶液对秸秆进行处理，将秸秆中的纤维素分解产生还原糖。最后用重组运动发酵单胞菌发酵酶解后的还原糖，产生乙醇。本发明将黑曲霉和木霉分别发酵得到的纤维素酶粗酶液按1:1混合，有效地控制了产物反馈抑制，从而得到活性和产量更高的纤维素酶粗酶液。将运动发酵单胞菌接种于酶解后的含还原糖的发酵液中，大大提高了运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的效率，解决了运动发酵单胞菌底物利用范围狭窄，不能有效利用秸秆的弊端，本发明中利用秸秆转化为乙醇的转化率为5%，即100g秸秆产生5g的乙醇。

Description

一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法。
背景技术
秸秆的能源化是新形势下秸秆的一种利用方式。世界其他一些国家已较早的尝试了秸秆能源化的探索。丹麦是世界上首先用秸秆发电的国家之一。在美国，部分秸秆通过较为传统的方法利用；一部分秸秆作为原料，通过发酵的方式产生燃料乙醇来代替传统液体能源。同时，日本、加拿大可开始了秸秆能源化的研究，并在利用秸秆提取酒精方面取得了进展。
秸秆的主要成分是纤维素，要想利用秸秆必须将纤维素降解。纤维素酶不是单纯的某一种酶，而是一系列酶的总称，能将纤维素降解为短链纤维素分子、纤维二塘和葡萄糖。纤维素酶主要包括三种成分，能分别降解特定的糖苷键。(1)Cl酶(简称CBH)。它是一种外切酶，作用于无取代基的还原端，依次水解β-1，4糖苷键(2)Cx酶(简称EG)。它是一种内切酶，作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，产生大量非还原末端的小分子纤维素；(3)β-葡萄糖苷酶(简称βG)。它水解纤维二糖和短链的纤维寡糖，生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解速度较快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。
很多微生物均可产生纤维素酶，如真菌，细菌，放线菌。但细菌产纤维素酶的产量较低，目前主要用于产纤维素酶的微生物为真菌，如木霉属，曲霉属，青霉属。本章节利用里氏木霉和黑曲霉混合发酵制备纤维素酶。
里氏木霉纤维素酶产量高，并且产生的纤维素酶是胞外酶,易与菌体分离纯化从而得到所需的酶。里氏木霉产生的纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶(C1酶)、纤维二糖酶(Cx酶)及β-葡萄糖苷酶。
里氏木霉菌株虽然产生的内切型和外切型葡聚糖酶活力较高，但是β-葡萄糖苷酶的活力比较低，分解纤维二糖的能力不够强。而黑曲霉产生的β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力，通过加入产自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，或者通过使用里氏木霉和黑曲霉共同培养，可以有效地缓解纤维素酶降解纤维素过程中因纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑制现象。
运动发酵单胞菌Z.mobilis是一种革兰氏阴性菌，是发酵单胞菌属的一个种，因具有很强的运动性而得名。大多呈直杆状，尾端呈圆形或卵圆形，常成对存在，但很少集结成短链状。兼性厌氧条件生长，在无氧条件下生长最佳，有氧条件下也可生存，高度耐酸，能在pH3.5～7.5之间生长。运动发酵单胞菌利用Entner-Doudomff途径代谢生产乙醇，这种途径耗能较少，产量较高。Z.mobills作为乙醇生产菌株具有一定优良的特性：如较高的乙醇产率，较强的乙醇耐受性，以及高度发酵底物专一性。与酵母相比，运动发酵单胞菌乙醇产量比酵母要高5%～10%，可达理论值的97％，乙醇转化率是酵母的5倍。但是，Z.mobills也有自身的局限性，底物利用范围较窄，只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖。近来已有人利用基因工程的方法对其不利因素进行了改造，使其能够利用多种底物。
发明内容
本发明的目的是提供一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法。该方法以秸秆为基质，利用黑曲霉和木霉混合发酵，制作粗酶液，产生纤维素酶，用粗酶液对秸秆进行处理，将秸秆中的纤维素分解产生还原糖。最后用重组运动发酵单胞菌发酵酶解后的还原糖，产生乙醇。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，步骤如下：
一、氨爆预处理秸秆:将秸秆粉碎至200目细微粉末状，将粉碎后的秸秆与水按照重量比为秸秆：水=5:2的比例混匀，在密封条件下加热搅拌，使其在温度为130-150℃之间，压力在0.4Mpa条件下反应6-8min，反应结束后，瞬间放气，待其冷却后，即得到预处理的秸秆；
二、纤维素粗酶液的制备:（1）分别对里氏木霉菌和黑曲霉菌进行培养、活化、发酵后得到里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液；（2）将里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液按照体积比为1:1的条件进行混合，将两者的混合液在4℃下，于8000rpm的转速下离心10min，取其上清液并将其转移到另一离心管中在相同条件下进行第二次离心，取上清液，即得纤维素酶粗酶液；
三、酶解秸秆：将上步所得纤维素酶粗酶液加入到预处理的秸秆中，在50℃的条件下，酶解4天后接种重组运动发酵单胞菌，在32℃的摇床中厌氧、静置发酵，发酵时间60h即得；所述纤维素酶粗酶液：秸秆=12ml：1g。
所述里氏木霉菌和黑曲霉菌培养、活化和发酵的操作方法一样，方法如下：将里氏木霉菌或黑曲霉菌接种在PDA固体培养基中，在28℃恒温条件下密封培养3-5天后，用灭菌处理过的生理盐水将其生成的孢子从培养基上洗涤下来，并用移液枪将成团状存在的孢子打碎，使之完全分散，并稀释至至107个/ml的浓度，得到里氏木霉孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液；然后将里氏木霉孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液以10%的接种量接种于种子培养基中，在摇床中培养48h后得到活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液；所述培养条件为：温度28℃，转速150rpm；（2）将上述活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液按10%的接种量接种到发酵培养基中发酵7天得到里氏木霉发酵液或黑曲霉菌发酵液，所述发酵条件为：温度28℃，转速150rpm。
所述重组运动发酵单胞菌的培养方法如下：用普通ZM种子培养基活化运动发酵菌：将运动发酵菌按10%的接种量接入种子培养基，置于32℃的恒温摇床中，静置活化10h，取生长10h后的种子液1.4ml按10%的接种量（v/v）接种ZM种子培养基，置于32℃的恒温摇床中，二次静置活化，生长24h，测量OD600吸光度，当OD600吸光度达到10时，即得到活化运动发酵菌，取活化运动发酵菌菌种，依次采用离心、水洗的方式去除含有的葡萄糖以及乙醇，同时用不含葡萄糖的普通ZM种子培养基将离心、水洗后的活化运动发酵菌菌种悬起并混匀即得到重组运动发酵单胞菌。
所述种子培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的秸秆10g/L，麸皮5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4.8的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。
所述发酵培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的绝干秸秆30g/L，麸皮25g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4.8的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。
本发明的作用机理为：运动发酵单胞菌作为乙醇生产菌株具有一定优良的特性：如较高的乙醇产率，较强的乙醇耐受性,但是，运动发酵单胞菌也有自身的局限性，底物利用范围较窄，不能直接作用于纤维素。本发明中利用黑曲霉和木酶水解混合发酵秸秆产生纤维素酶粗酶液，并对秸秆进行酶解产生还原糖。并对纤维素酶粗酶液的发酵过程进行优化。通过将传统的黑曲霉和木霉混合发酵产纤维素酶改进为分别发酵再对粗酶液进行混合，有效地改善了因纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑制现象，提高纤维素酶的活性和产量。再将运动发酵单胞菌作用于还原糖，产生乙醇。并对发酵过程进行优化，进而提高运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的效率。解决了运动发酵单胞菌利用底物单一狭窄的问题。
本发明的有益技术效果为：1.提高了黑曲霉和木酶混合发酵产纤维素酶的产量，里氏木霉菌株虽然产生的内切型和外切型葡聚糖酶活力较高，但是β-葡萄糖苷酶的活力比较低，分解纤维二糖的能力不够强。而黑曲霉产生的β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力，之前通过使用里氏木霉和黑曲霉共同培养，会出现因纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑制现象。本发明中将黑曲霉和木霉分别发酵得到的纤维素酶粗酶液按1:1混合，有效地控制了产物反馈抑制，从而得到活性和产量更高的纤维素酶粗酶液。2.将运动发酵单胞菌接种于酶解后的含还原糖的发酵液中，大大提高了运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的效率，解决了运动发酵单胞菌底物利用范围狭窄，不能有效利用秸秆的弊端，通过本发明中的方法运动发酵单胞菌利用秸秆转化为乙醇的转化率为5%，即100g秸秆产生5g的乙醇。
具体实施方式
一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，包括如下步骤：
（1）氨爆预处理秸秆。
（2）纤维素酶的发酵和纤维素粗酶液的制备，取发酵结束的发酵液，在4℃下，于8000rpm的转速下离心10min。将上清转移到另一离心管中在相同条件下进行第二次离心。取上清，即得纤维素酶粗酶液。
（3）纤维素酶粗酶液对秸秆进行降解产生还原糖。
（4）用重组运动发酵单胞菌发酵酶解后的还原糖，用普通ZM活化培养基活化重组运动发酵菌，取活化好的菌种1.4ml，采用离心、水洗的方式去除含有的葡萄糖以及乙醇。同时用不含葡萄糖的普通ZM活化培养基将离心、水洗后的菌种悬起并混匀。将菌种接种于酶解后的含还原糖的发酵液中。在32℃摇床中厌氧、静置发酵，发酵时间60h。发酵结束后，用气相色谱测乙醇含量。
步骤（1）中所述的秸秆经机械粉碎至200目细微粉末状。将50g秸秆与20g水混匀，加热搅拌，使温度维持在130-150℃之间，压力维持在0.4Mpa左右，反应6-8min，进行氨爆处理。反应结束后，瞬间将放气阀打开。
步骤（2）中将单孢子悬浮液作为菌种，按10%（V/V）的接种量接种于活化培养基。在摇床中培养，培养条件为：温度28℃，转速150rpm，活化时间48h。
步骤（2）中的活化种子液的制备是于250ml的摇瓶中，分别接种黑曲霉孢子悬浮液2.5ml，里氏木霉孢子悬浮液2.5ml，总装液量为50ml，发酵条件为：温度28℃，转速150rpm，发酵时间天7d。并将发酵液进行1:1混合。
步骤（3）中酶解液总体积为50ml。酶解条件为：温度50℃，酶解时间4d。
本发明用里氏木霉发酵得到的纤维素酶粗酶液和黑曲霉发酵得到的纤维素酶粗酶液按1:1混合，将混合后的粗酶液，按料液比为12:1，即12ml的粗酶液添加1g的秸秆，在50℃的条件下，酶解4d。接种重组运动发酵单胞菌，发酵产乙醇。得到乙醇浓度为5g/L。秸秆转化为乙醇的转化率为5%，即100g秸秆产生5g的乙醇。
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、材料
（1）菌种：里氏木霉：T.reeseiRUTC30，黑曲霉：Aspergillusniger，运动发酵单胞菌:Z.mobilis
（2）PDA固体培养基：PDA即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将马铃薯洗净去皮，称取马铃薯200g切成小块，加入烧杯中，加水蒸煮30min，知道马铃薯能被玻璃杯轻轻戳破。用纱布过滤，添加葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。115高压灭菌30min，倒固体平板。
（3）种子培养基：氨爆预处理的秸秆10g/L，麸皮5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4.8的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。115高压灭菌30min，备用。
（4）发酵培养基：氨爆预处理的绝干秸秆30g/L，麸皮25g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4.8的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。115高压灭菌30min，备用。
（5）ZM种子培养基：葡萄糖100g/L，尿素0.05g/L，酵母提取物1g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0.05g/L，加去离子水定容至1000ml。调节pH为6.0，在115℃灭菌30min。
2、具体步骤
（1）分别用接种环挑取少量保存的里氏木霉和黑曲霉的孢子，在不同PDA固体平板划线，封口膜密封，在28℃恒温箱中培养3-5天。
（2）在恒温箱中培养3-5天后，里氏木霉和黑曲霉会产生一层孢子，用灭菌处理过的生理盐水将孢子从固体平板上洗涤下来，用移液枪将成团状存在的孢子打碎，使之完全分散，并稀释至107个/ml的浓度，分别得到里氏木霉孢子悬浮液和黑曲霉孢子悬浮液。
（3）分别将上述里氏木霉孢子悬浮液和黑曲霉孢子悬浮液作为菌种，按10%（V/V）的接种量接种于不同的种子培养基，在摇床中培养，得到活化的里氏木霉菌液和活化的黑曲霉菌液；培养条件为：温度28℃，转速150rpm，活化时间48h。
（4）将上述活化的里氏木霉菌液和活化的黑曲霉菌液分别按10%的接种量接种到不同的发酵培养基中，得到里氏木霉发酵液或黑曲霉菌发酵液，发酵条件为：温度28℃，转速150rpm，发酵时间天7d。发酵液总体积为50ml；
将里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液按照体积比为1:1的条件进行混合，将两者的混合液在4℃下，于8000rpm的转速下离心10min，取其上清液并将其转移到另一离心管中在相同条件下进行第二次离心，取上清液，即得纤维素酶粗酶液；
（5）用普通ZM种子培养基活化重组运动发酵菌，按10%的接种量接入ZM种子培养基，置于32℃的恒温摇床中，静置活化10h，取生长10h后的种子液1.4ml按10%的接种量（v/v）接种种子培养基，置于32℃的恒温摇床中，二次静置活化，生长24h，测量OD600吸光度。当OD600吸光度达到10时，即可作为菌种接种于不同的发酵培养基中，即为活化的运动发酵菌，取活化的运动发酵菌菌种1.4ml，采用离心、水洗的方式去除含有的葡萄糖以及乙醇，同时用不含葡萄糖的普通ZM种子培养基将离心、水洗后的菌种悬起并混匀。将菌种接种于酶解后的含还原糖的发酵液中，在32℃摇床中厌氧、静置发酵，发酵时间60h。发酵结束后，用气相色谱测乙醇含量。
3、发酵条件优化
主要考察酶解温度、时间、料液比（ml/g）对糖得率的影响。
其中，。
（1）温度对糖得率的影响
选取酶解的温度梯度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。按料液比为12，即12ml粗酶液HM对应1g的秸秆，酶解时间为3d。用DNS法测还原糖浓度，计算糖得率。
（2）时间对糖得率的影响
选取酶解的时间梯度为1d、2d、3d、4d、5d。按料液比为12，即12ml粗酶液HM对应1g的秸秆，酶解温度为50℃。用DNS法测还原糖浓度，计算糖得率。
（3）料液比对糖得率的影响
选取酶解的料液比梯度为4:1、8:1、12:1、16:1。在55℃酶解3d。用DNS法测还原糖浓度，计算糖得率。
4、结果
（1）几种粗酶液酶活的比较
接种里氏木霉得到的粗酶液标记为M，接种黑曲霉得到的粗酶液标记为H，里氏木霉和黑曲霉混合发酵的标记为H/M，将发酵结束后得到的粗酶液M和粗酶液H按体积比为1:1进行混合得到的粗酶液即为HM。测量这四种粗酶液的CMC酶活和FPA酶活。单独接种黑曲霉和里氏木霉的酶活都较低。而用分开接种的粗酶液按1:1混合得到的粗酶液HM，CMC酶活和FPA酶活都是最高的。其中CMC酶活为67IU/ml，FPA酶活为2.3IU/ml。
（2）温度对糖得率的影响
在不同温度下的糖得率，温度由40℃升高至50℃时，糖得率逐渐升高，当由50℃升高到60℃时，糖得率开始降低。这可能是因为水解温度越高，越利于纤维素的糖苷键断裂，越利于水解过程的进行，化学反应越充分。但在50℃以后，可溶性糖产量有所下降，这可能是因为随着水解温度不断升高，高温使部分酶失活导致预处理过程中降解的纤维素量减少所致。因此，最佳的酶解温度为50℃。
（3）时间对糖得率的影响
时间对糖得率的影响。酶解过程中，随着碱水解时间增加，糖得率提高，呈逐渐升高的趋势。当酶解时间为4d时，糖得率达到最高，为12%左右，随着时间的逐渐增加，糖得率逐渐基本不再变化。因此，最佳的酶解时间为4d。
（4）料液比对糖得率的影响
料液比对糖得率的影响。酶解过程中，随着料液比增加，糖得率呈逐渐升高的趋势。当料液比为12:1时，即12ml的粗酶液添加1g秸秆，糖得率达到最高，为13%。再增加料液比，糖得率逐渐基本不再变化。
根据上述方法，用里氏木霉发酵得到的纤维素酶粗酶液和黑曲霉发酵得到的纤维素酶粗酶液按1:1混合，将混合后的粗酶液，按料液比为12:1，即12ml的粗酶液添加1g的秸秆，在50℃的条件下，酶解4d。接种重组运动发酵单胞菌，发酵产乙醇。得到乙醇浓度为5g/L。秸秆转化为乙醇的转化率为5%，即100g秸秆产生5g的乙醇。

Claims (5)

1.一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，其特征在于：步骤如下：一、氨爆预处理秸秆:将秸秆粉碎至200目细微粉末状，将粉碎后的秸秆与水按照重量比为秸秆：水=5:2的比例混匀，在密封条件下加热搅拌，使其在温度为130-150℃之间，压力在0.4Mpa条件下反应6-8min，反应结束后，瞬间放气，待其冷却后，即得到预处理的秸秆；
二、纤维素粗酶液的制备:（1）分别对里氏木霉菌和黑曲霉菌进行培养、活化、发酵后得到里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液；（2）将里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液按照体积比为1:1的条件进行混合，将两者的混合液在4℃下，于8000rpm的转速下离心10min，取其上清液并将其转移到另一离心管中在相同条件下进行第二次离心，取上清液，即得纤维素酶粗酶液；
三、酶解秸秆：将上步所得纤维素酶粗酶液加入到预处理的秸秆中，在50℃的条件下，酶解4天后接种重组运动发酵单胞菌，在32℃的摇床中厌氧、静置发酵，发酵时间60h即得；所述纤维素酶粗酶液：秸秆=12ml：1g。
2.如权利要求1所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，其特征在于：所述里氏木霉菌和黑曲霉菌培养、活化和发酵的操作方法一样，方法如下：将里氏木霉菌或黑曲霉菌接种在PDA固体培养基中，在28℃恒温条件下密封培养3-5天后，用灭菌处理过的生理盐水将其生成的孢子从培养基上洗涤下来，并用移液枪将成团状存在的孢子打碎，使之完全分散，并稀释至至107个/ml的浓度，得到里氏木霉孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液；然后将里氏木霉孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液以10%的接种量接种于种子培养基中，在摇床中培养48h后得到活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液；所述培养条件为：温度28℃，转速150rpm；（2）将上述活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液按10%的接种量接种到发酵培养基中发酵7天得到里氏木霉发酵液或黑曲霉菌发酵液，所述发酵条件为：温度28℃，转速150rpm。
3.如权利要求2所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，其特征在于：所述重组运动发酵单胞菌的培养方法如下：用普通ZM种子培养基活化运动发酵菌：将运动发酵菌按10%的接种量接入种子培养基，置于32℃的恒温摇床中，静置活化10h，取生长10h后的种子液1.4ml按10%的接种量（v/v）接种ZM种子培养基，置于32℃的恒温摇床中，二次静置活化，生长24h，测量OD600吸光度，当OD600吸光度达到10时，即得到活化运动发酵菌，取活化运动发酵菌菌种，依次采用离心、水洗的方式去除含有的葡萄糖以及乙醇，同时用不含葡萄糖的普通ZM种子培养基将离心、水洗后的活化运动发酵菌菌种悬起并混匀即得到重组运动发酵单胞菌。
4.如权利要求2或3所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，其特征在于：所述种子培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的秸秆10g/L，麸皮5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4.8的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。
5.如权利要求2或3所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法，其特征在于：所述发酵培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的绝干秸秆30g/L，麸皮25g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4.8的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。
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