CN105007943B - PGC‑1β蛋白的功能调整剂、线粒体功能的调节剂、抗肥胖剂及其筛检方法 - Google Patents

PGC‑1β蛋白的功能调整剂、线粒体功能的调节剂、抗肥胖剂及其筛检方法 Download PDF

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Abstract

提供一种对肥胖症的治疗或预防有效的线粒体功能的调节剂及其筛检方法。本发明的线粒体功能的调节剂为含有以滑膜蛋白为标的PGC‑1β蛋白的功能调整剂作为有效成份，又本发明的筛检方法在于包含以下工序：使脂肪组织的细胞或动物个体与被验物质作用；测定或检测脂肪组织的细胞中(1)滑膜蛋白的表达量，(2)滑膜蛋白与PGC‑1β蛋白的结合，或(3)滑膜蛋白对于PGC‑1β蛋白的泛素化，中的至少一者。

Description

PGC-1β蛋白的功能调整剂、线粒体功能的调节剂、抗肥胖剂及 其筛检方法
技术领域
本发明是关于一种PGC-1β蛋白的功能调整剂、线粒体功能的调节剂、抗肥胖剂及其筛检方法。
背景技术
包含细胞的呼吸或脂肪酸的β氧化的能量代谢或线粒体生物合成中，一般认为细胞核受体或该辅助激活因子扮演着中心的角色。过氧化物酶体增殖物活化受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs))形成细胞核受体超级家族，存在有PPARα、PARβ/δ及PPARγ3种异型体(参照非专利文献1)。PPAR的辅助激活因子已知有PGC-1α、PGC-1β及PGC-1关连辅助激活因子(PRC)3种(参照非专利文献2～4)。
若PGC-1β过表达，则培养细胞中线粒体的数量与呼吸功能会提升(参照非专利文献5)。又，有报告指出PGC-1β基因转殖小鼠具有对于高能量消耗与肥胖症的抗性(参照非专利文献6)。
PGC-1β已知与褐色脂肪决定及/或分化、细胞代谢、脂肪酸氧化、线粒体的功能及/或呼吸等的控制有关(参照专利文献1)。又，PGC-1β已知与脂质生合成及脂质输送的控制有关(参照专利文献2)。
先行技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特表2008-517931号公报
专利文献2:日本专利特表2005-514921号公报
非专利文献
非专利文献1:Viana Abranches,et al.(2011).Peroxisome proliferator-activatedreceptor:effects on nutritional homeostasis,obesity and diabetesmellitus.Nutr Hosp 26,271-279.
非专利文献2:AnderssonU.and Scarpulla RC.,(2001)Pgc-1-relatedcoactivator,a novel,serum-inducible coactivator of nuclear respiratory factor1-dependenttranscription in mammalian cells.Mol Cell Biol.21,3738-3749.
非专利文献3:Kressler,D.et al.,(2002).The PGC-1-related protein PERCis aselective coactivator of estrogen receptor alpha.J Biol Chem 277,13918-13925.
非专利文献4:Lin,J.(2001).Peroxisome Proliferator-activated ReceptorgammaCoactivator 1beta(PGC-1beta),A Novel PGC-1-related TranscriptionCoactivatorAssociated with Host Cell Factor.J Biol Chem 277,1645-1648.
非专利文献5:St-Pierre,J.,et al.,(2003).Bioenergetic analysis ofperoxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivators 1alpha and 1beta(PGC-1alphaand PGC-1beta)in muscle cells.J Biol Chem 278,26597-26603.
非专利文献6:Kamei,Y.,et al.,(2003).PPARgamma coactivator 1beta/ERRligand 1is an ERR protein ligand,whose expression induces a high-energyexpenditureand antagonizes obesity.Proc Natl Acad Sci U S A 100,12378-12383.
发明内容
发明所欲解决的课题
如上所述，PPAR辅助激活因子1(PGC-1)β具有各种功能。因此，目前期盼能够提供一种方法，筛检出提高PGC-1β活性的物质或像那样的物质。
本发明的目的在于提供一种方法，筛检出提高PGC-1β活性的物质或像那样的物质。
本发明的目的在于提供一种对于肥胖症的治疗或预防有效的线粒体功能调节剂及其筛检方法。
解决课题的手段
本发明人首次发现，滑膜蛋白的条件性基因剔除小鼠中β氧化及/或线粒体生合成相关的基因群有显著地上调，在白色脂肪细胞中线粒体的数量会显著增加，并且控制前述基因群的转录的辅助激活因子PGC-1β会因滑膜蛋白而被负调控，从而完成本发明。
本发明的第1方面是关于一种PGC-1β蛋白的功能调整剂(本发明的剂)。该PGC-1β蛋白的功能调整剂含有滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂来作为有效成分。此外，PGC-1β蛋白的功能调整剂，例如以提高PGC-1β蛋白的活性的方式进行调节，藉此促进脂肪酸β氧化，并促进线粒体的表达或活性。因此，本发明的PGC-1β蛋白的功能调整剂在例如PGC-1β蛋白关连的肥胖等症状的治疗或预防上是有效的。
亦即，本发明的剂透过抑制滑膜蛋白而可提高PGC-1β蛋白的活性，藉此可提高线粒体的活性，故在肥胖症的预防或治疗上是有益的。
本发明的第1方面相关的PGC-1β蛋白的功能调整剂的优选态样，其用于PGC-1β蛋白对于脂肪酸β氧化的促进，及线粒体的表达或活性促进的任一者或两者。
特别是，本发明的PGC-1β蛋白的功能调整剂可优选用于线粒体的活性化。因此，本发明亦可提供线粒体的活性化剂。该线粒体的活性化剂可用于例如导致线粒体表达数的增加及线粒体尺寸的增大的任一者或两者。
本发明的第2方面是关于一种筛检PGC-1β蛋白的功能调整剂的方法。该方法首先使脂肪组织的细胞或动物个体与被验物质作用。然后，对于脂肪组织的细胞中滑膜蛋白的表达量、滑膜蛋白与PGC-1β蛋白的结合、或滑膜蛋白对于PGC-1β蛋白的泛素化的至少一者进行测定或检测。如先前所述，本发明是根据抑制滑膜蛋白的活性会导致提高PGC-1β蛋白的活性的见解。因此，透过评价滑膜蛋白的表达或活性，可筛检出PGC-1β蛋白的功能调整剂(具有调节PGC-1β蛋白功能的作用的物质)。
本发明的第2方面的某一态样是关于一种线粒体的活性化剂的检测(筛检)方法，其使用了对于先前所述的PGC-1β蛋白的功能调整剂进行筛检的方法。
本发明的第2方面的某一态样是关于一种肥胖症的治疗剂或预防剂的检测(筛检)方法，其使用了对于先前所述的PGC-1β蛋白的功能调整剂进行筛检的方法。
发明功效
本发明可提供一种例如PGC-1β蛋白的功能调整剂及其筛检方法、对于肥胖症的治疗或预防有效的线粒体功能调节剂及其筛检方法。
附图说明
[图1]图1为表示来自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪细胞中β氧化及线粒体关连基因的转录水平的图；
[图2]图2为来自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪细胞中线粒体的电子显微镜照片，左侧的照片为作为对照的野生型小鼠(syno WT)，右侧为滑膜蛋白基因剔除小鼠(synocKO)，电子显微镜的倍率为5,000倍；
[图3]图3为表示体外中PGC-1β与滑膜蛋白结合的蛋白印迹法；
[图4]图4为表示PGC-1β及断片化PGC-1β的概念图及体外中断片化PGC-1β与滑膜蛋白的结合的蛋白印迹法，图4中的简称如下所述：AD：活性化结构域，LXXLL：LXXLL模体，E：麸酰胺酸富含结构域，SR：丝胺酸-精胺酸富含结构域，RRM：RNA识别模体；
[图5]图5为表示滑膜蛋白及断片化滑膜蛋白的概念图及体外中PGC-1β与断片化滑膜蛋白的结合的蛋白印迹法，图5中的简称如下所述：SP：讯息肽，TM：膜贯通结构域，SyU：滑膜蛋白中独特的结构域，RING：RING指结构域，PR：脯胺酸富含结构域；
[图6A]图6A为表示体内中PGC-1β与滑膜蛋白的结合的蛋白印迹法；
[图6B]图6B为表示体内中PGC-1β与滑膜蛋白的结合的其它蛋白印迹法；
[图7]图7为表示PGC-1β及滑膜蛋白的局部的荧光显微镜照片；
[图8A]图8A为表示体外时的滑膜蛋白对于PGC-1β的泛素化的蛋白印迹法；
[图8B]图8B为表示体内时的滑膜蛋白对于PGC-1β的泛素化的蛋白印迹法；
[图8C]图8C为表示体内时的滑膜蛋白基因剔除对于PGC-1β的蛋白水平的影响的蛋白印迹法；
[图8D]图8D为表示体内时的滑膜蛋白基因剔除对于PGC-1β蛋白分解的影响的蛋白印迹法；
[图9A]图9A为表示滑膜蛋白siRNA对于PGC-1β蛋白表达的影响的蛋白印迹法；
[图9B]图9B为表示滑膜蛋白siRNA对于PGC-1β的菜单达的影响的蛋白印迹法；
[图9C]图9C为表示滑膜蛋白的过表达对于PGC-1β的菜单达的影响的图；
[图9D]图9D为表示滑膜蛋白siRNA对于线粒体的形态变化的电子显微镜照片；
[图10]图10为表示滑膜蛋白的E3泛素连接酶活性抑制剂对于滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果的蛋白印迹法；
[图11-1]图11-1为表示被验物质349及348对于滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果的蛋白印迹法(上图)，及评价被验物质349及348的结合能力的图(下图)；
[图11-2]图11-2为表示被验物质槲皮素及351对于滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果的蛋白印迹法(上图)，及评价被验物质槲皮素及351的结合能力的图(下图左及右)；
[图11-3]图11-3为表示各种被验物质的结合抑制效果的蛋白印迹法；
[图11-4]图11-4为表示被验物质对于滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果的其它蛋白印迹法，结合的程度是将结合试验后的蛋白印迹法进行影像解析，以intensity的方式用图来表示；
[图12]图12为表示被验物质对于PGC-1β功能的效果的图；
[图13]图13为表示被验物质对于线粒体的形态变化的电子显微镜照片；
[图14]图14为表示滑膜蛋白基因剔除小鼠中脂肪细胞的氧消耗量的图；
[图15]图15为表示滑膜蛋白基因剔除小鼠中基础代谢量的图；
[图16]图16为表示替代野生型WT与滑膜蛋白KO的各组织中脂联素与滑膜蛋白的蛋白印迹法的图式的照片；
[图17]图17为表示用以测定PGC-1β的半衰期的蛋白印迹法的图；
[图18]图18为表示LS-102对于脂肪组织的线粒体的形态变化的电子显微镜照片；
[图19]图19为表示PGC-1β的半衰期的蛋白印迹法；
[图20]图20为表示体外泛素化试验的结果的图；
[图21]图21为表示受测物质348、349对于PGC-1β的泛素化抑制活性的浓度相关性的蛋白印迹法；
[图22]图22为多种中SyU结构域的胺基酸序列；
[图23]图23为SYVN1SyU突变体的蛋白印迹法；
[图24]图24为SYVN1266-270aa突变体的蛋白印迹法。
具体实施方式
本发明的第1方面是关于一种PGC-1β蛋白的功能调整剂(本发明的剂)。PGC-1β意指PPAR辅助激活因子1β。PGC-1β蛋白的功能调整剂为一种例如用以调节先前所述的PGC-1β蛋白的各种功能的药剂。PGC-1β蛋白具有各种功能。因此调节PGC-1β蛋白的功能在PGC-1β蛋白关连的各种活体功能的解析上是有益的。
该PGC-1β蛋白的功能调整剂含有滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂作为有效成分。滑膜蛋白的表达抑制剂及滑膜蛋白的活性抑制剂为公知。另一方面，滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂亦可利用后述筛检方法得到候选化合物，检讨是否具有滑膜蛋白的表达抑制活性或滑膜蛋白的活性抑制能力，藉此获得滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂。本发明的PGC-1β蛋白的功能调整剂是以提高PGC-1β蛋白的活性的方式进行调节，藉此促进脂肪酸β氧化，并促进线粒体的表达或活性。因此，本发明的PGC-1β蛋白的功能调整剂在例如PGC-1β蛋白关连的肥胖等症状的治疗或预防上是有效的。
人类滑膜蛋白基因的公共基因数据库Genbank中的注册编号为AB024690(序列编号：1)。
将人类滑膜蛋白的基因编码的碱基序列表示为序列编号：1。又即使是透过该碱基序列所编码的蛋白以外的蛋白，只要与其具有高度同源性(通常70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上)，且拥有滑膜蛋白蛋白所具有的功能的蛋白，亦包含在本发明的滑膜蛋白中。
本发明中“滑膜蛋白基因”包含例如由序列编号：1记载的碱基序列所构成的DNA对应的其它生物中的内源性基因(人类滑膜蛋白基因的同源物等)。
又，与由序列编号：1记载的碱基序列所构成的DNA对应的其它生物的内源性DNA一般而言具有与序列编号：1记载的DNA高度同源性。所谓高度同源性意指50％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，最优选为90％以上(例如95％以上，进而为96％、97％、98％或99％以上)的同源性。该同源性可藉由mBLAST算法(Altschul et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-7)来决定。又，该DNA当从活体内分离时，可认为会与序列编号：1记载的DNA在严密的条件下进行杂合。此处“严密的条件”可列举例如“2×SSC，0.1％SDS，50℃”，“2×SSC，0.1％SDS，42℃”，“1×SSC，0.1％SDS，37℃”，更严密的条件可列举例如“2×SSC，0.1％SDS，65℃”，“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”及“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”的条件。该领域技术人员可根据滑膜蛋白基因的碱基序列适当取得其它生物中的滑膜蛋白基因所相当的内源性基因。其中，本说明书中有时将相当于人类以外的生物中的滑膜蛋白蛋白(基因)的蛋白(基因)，或者与上述滑膜蛋白功能上同等的蛋白(基因)仅记载为“滑膜蛋白蛋白(基因)”。
本发明的“滑膜蛋白”除了天然蛋白之外，亦可调制成利用基因重组技术的重组蛋白。天然蛋白可透过例如对于被认为会表达滑膜蛋白蛋白的细胞(组织)的粹取液使用对滑膜蛋白蛋白具有抗性的抗体的亲和力色层分析的方法进行调制。另一方面，重组蛋白可透过培养经过转化编码滑膜蛋白蛋白的DNA的细胞来进行调制。本发明的“滑膜蛋白蛋白”可优选用于例如后述的筛检方法。
本发明中所谓“表达”包含从基因的“转录”或到多肽的“翻译”及蛋白的“分解抑制”。所谓“滑膜蛋白蛋白的表达”意指发生编码滑膜蛋白蛋白的基因的转录及翻译，或透过该转录·翻译而生成滑膜蛋白蛋白。
上述各种功能，该领域技术人员可使用一般的技术适当地评价(测定)。具体而言，可实施后述实施例记载的方法，或将该方法适当改变。
因此，所谓“滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂”意指与野生型滑膜蛋白基因或蛋白的量、功能或活性相比较，使其量、功能或活性降低或消失。上述“抑制”包含抑制功能与表达两者，及抑制其中任何一者当中的任一者。
泛素化具体而言意指：通过重复的泛素活性化酶(E1)、泛素结合酶(E2)及泛素连接酶(E3)等酶所协同的级联反应，作为基质的蛋白与泛素分子呈枝状结合而形成聚泛素链的过程。该聚泛素链透过泛素分子内第48号的丝胺酸残基ε‐胺基而形成，成为对26S蛋白酶体的分解信号，因而导致标的蛋白分解。
被验物质对于滑膜蛋白基因表达的影响或对于滑膜蛋白蛋白活性的影响的确认方法，可适当使用例如国际公开WO2006-137514号说明书所揭示的方法。
滑膜蛋白蛋白的自我泛素化的影响
例如日本专利特开2008-74753号公报(专利第5008932号)已揭示白花丹素(2-甲基-5-羟基-1,4-萘醌)及槲皮素(2-(3,4-二羟苯基)-3,5,7-三羟基-4H-1-苯并哌喃-4-酮)会抑制滑膜蛋白蛋白的自我泛素化。所谓滑膜蛋白的自我泛素化，如同日本专利特开2008-74753号公报所揭示，意指滑膜蛋白彼此的相互作用所产生的蛋白的泛素化。蛋白的泛素化是因蛋白上结合有滑膜蛋白而产生。
滑膜蛋白蛋白的自我泛素化的影响可使用日本专利特开2008-74753号公报(专利第5008932号)所揭示的方法来确认。例如将被验物质添加至MBP-SynoΔTM-His的体外自我泛素化反应液中，于37℃进行反应30分钟。反应后，藉由使用抗HA抗体的蛋白印迹法检测泛素化蛋白。MBP-SynoΔTM-His意指N末端侧融合有麦芽糖结合蛋白(MBP)，C末端侧融合有His标签的膜贯通结构域缺陷的滑膜蛋白。
滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂
滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂的示例为日本专利第5008932号所揭示的白花丹素(2-甲基-5-羟基-1,4-萘醌)及槲皮素(2-(3,4-二羟苯基)-3,5,7-三羟基-4H-1-苯并哌喃-4-酮)、其制药上可容许的盐或该水合物。
滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂的示例为包含一般式(I)所示的萘衍生物、其医药上可容许的盐、或其医药上可容许的溶剂合物的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。一般式(I)所示的化合物可利用公知的方法合成。
滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂意指用以抑制滑膜蛋白的自我泛素化活性的用剂。是否抑制泛素化活性如同实施例所示，可透过例如测定体外泛素化的蛋白量来进行评价。滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂如后所述，例如除了有效作为类风湿的治疗剂或预防剂之外，亦可有效作为肥胖症的治疗剂或预防剂。
所谓其医药上可容许的盐意指一般式(I)所示的萘衍生物的医药上可容许的盐。又，所谓其医药上可容许的溶剂合物意指一般式(I)所示的萘衍生物的医药上可容许的溶剂合物。医药上可容许的盐的示例为无机酸盐、有机酸盐、无机碱基盐、有机碱基盐、酸性或碱性胺基酸盐。无机酸盐的示例为盐酸盐、溴化氢酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐。有机酸盐的示例为酢酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、安息香酸盐、甲磺酸盐、及p-甲苯磺酸盐。无机碱基盐的示例为钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土类金属盐；铝盐、及铵盐。有机碱基盐的示例为二乙胺盐、二乙醇胺盐、甲葡胺盐、及N,N’-二苄基乙二胺盐。酸性胺基酸盐的示例为天门冬胺酸盐、及麸胺酸盐。碱性胺基酸盐的示例为精胺酸盐、离胺酸盐、及鸟胺酸盐。溶剂合物的示例为水合物。
本发明的化合物可适用粹取、浓缩、馏除、结晶化、过滤、再结晶、各种色层分析法等通常的化学操作，利用公知的方法分离纯化。
[化4]
式(I)中，
R1～R4可相同或相异，表示氢原子、羟基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、及卤原子的任一者。如后述实施例所证实，R1～R4的至少一者为羟基。
R5及R6可相同或相异，表示氢原子、C1-3烷基、及卤原子的任一者。
X1及X2可相同或相异，表示氧原子或硫原子。
A1-A2表示C-C(单键)、或C＝C(双键)。当A1-A2为C＝C(双键)时，式(I)如同式(II)般表示。
C1-3烷基意指碳数为1～3个的烷基。C1-3烷基的示例为甲基、乙基、n-丙基、及异丙基。C1-3烷基的优选例为甲基。
C1-3烷氧基意指碳数为1～3个的烷氧基。C1-3烷氧基的示例为甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、及异丙氧基。C1-3烷氧基的优选例为甲氧基。
卤原子的示例为氟原子、氯原子、溴原子、及碘原子。卤原子的优选例为氯原子。
本发明的优选态样是关于一种R1及R4的至少一者为羟基的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。
本发明的优选态样是关于一种一般式(I)中A1-A2表示C＝C的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。该萘衍生物为以下一般式(II)所示的萘衍生物。
[化5]
本发明的优选态样是关于一种一般式(I)中X1及X2皆表示氧原子，A1-A2表示C＝C的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。该萘衍生物为以下一般式(III)所示的萘醌衍生物。
[化6]
本发明的优选态样是一种一般式(I)中，
R1～R4可相同或相异，表示氢原子、羟基、甲基、甲氧基、或氯原子，此处，R1～R4的至少一者为羟基，
R5及R6可相同或相异，表示氢原子、或甲基，
X1及X2皆表示氧原子，
A1-A2表示C＝C，
的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。
本发明的优选态样是一种一般式(I)中，
R1及R4可相同或相异，表示氢原子、羟基、甲基、甲氧基、或氯原子，此处，R1～R4的至少一者为羟基，
R2及R3表示氢原子，
R5及R6皆表示氢原子，
X1及X2皆表示氧原子，
A1-A2表示C＝C，
的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。
本发明的优选态样是一种
一般式(I)所示的萘衍生物为
5,8-二羟基-4a,8a-二氢-[1,4]萘醌、
5-羟基-4a,8a-二氢-[1,4]萘醌、
5-羟基-2,3,4a,8a-四氢-[1,4]萘醌、
5-羟基-7-甲氧基-4a,8a-二氢-[1,4]萘醌、
5-羟基-8-甲氧基-4a,8a-二氢-[1,4]萘醌、及
5-氯-8-羟基-4a,8a-二氢-[1,4]萘醌的任一者或2个以上
的滑膜蛋白蛋白的泛素化活性抑制剂。
滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂的某一态样为，有效成分为滑膜蛋白的siRNA。具有RNAi效果造成的抑制作用的核酸一般而言称为siRNA或shRNA。RNAi是一种将与标的基因的mRNA相同的序列所构成的有义RNA和与其互补的序列所构成的反义RNA这两者所构成的短链双股RNA(以下，简称为“dsRNA”)导入细胞等中，藉此使其专一且选择性地与标的基因mRNA结合而引发破坏，并藉由切断该标的基因而有效地抑制标的基因表达的现象。例如，若dsRNA导入至细胞内，则与其RNA相同序列的基因的表达会被抑制。因此RNAi由于可抑制标的基因的表达，故其作为一种简单的基因剔除方法来取代以往繁杂且效率低的同源重组的基因破坏方法，或者，作为一种可应用在基因治疗的方法而受到瞩目。用于RNAi的RNA虽然没有绝对需要与滑膜蛋白基因或该基因的部分结构域完全相同，但以具有完全的同源性者为宜。
siRNA的设计可按照以下的方式进行。
(a)只要是编码滑膜蛋白的基因则无特别限定，可将任意结构域全作为标靶候选。例如在人类的情形中，可将GenBank注册编号AB024690(序列编号：1)的任意结构域作为候选。
(b)从所选的结构域选择以AA起始的序列，该序列的长度为19～25碱基，优选为19～21碱基。该序列的GC含量以选择例如40～60％为宜。
(a)在表达滑膜蛋白基因的细胞中使之与被验化合物接触的工序
(b)测定前述细胞中滑膜蛋白基因的表达量的工序
(c)与在不存在被验化合物时测定的情形相比，选择使表达量降低的化合物的工序
滑膜蛋白的siRNA的示例是从序列编号2～6选择的一段碱基序列、与该碱基序列互补的碱基序列、或具有其任一者的碱基序列中有1或2个碱基被取代、***、缺失或附加的碱基序列的RNA。具有序列编号2～4所示碱基序列的RNA为滑膜蛋白的siRNA，这在Izumi T,et al.,Arthritis Rheum.2009；60(1):63-72.，EMBO，Yamasaki S,et al.,EMBO J.2007；26(1):113-22.中已做实验而被揭示属于公知。具有序列编号5及6所示碱基序列的RNA为滑膜蛋白的siRNA，这在WO2005/074988号说明书中已做实验而被揭示属于公知。
序列编号2：5’-GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3’
序列编号3：5’-GGUGUUCUUUGGGCAACUG-3’
序列编号4：5’-GGUUCUGCUGUACAUGGCC-3’
序列编号5：5’-CGUUCCUGGUACGCCGUCA-3’
序列编号6：5’-GUUUTGGUGACUGGUGCUA-3’
“具有其任一者的碱基序列中有1或2个的碱基被取代、***、缺失或附加的碱基序列的RNA”是从序列编号2～6选择的一段碱基序列及与该碱基序列互补的碱基序列的任一者的碱基序列中，有1或2个碱基被取代、***、缺失或附加的碱基序列的RNA。取代、***、缺失或附加即使是发生任何1种类即可，亦可发生2种类以上。
例如，国际公开WO2005-018675号说明书、WO2005/074988号说明书中已揭示对于编码滑膜蛋白基因的siRNA及对于编码滑膜蛋白基因的siRNA的筛检方法及评价方法。本发明中可适当利用该公报所揭示的方法来评价对于编码滑膜蛋白基因的siRNA。
滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂的某一态样为有效成分是具有序列编号7所示的碱基序列或序列编号7所示的碱基序列中有1或2个碱基被取代、***、缺失或附加的碱基序列的滑膜蛋白的诱捕核酸。具有序列编号7所示碱基序列的核酸为滑膜蛋白的诱捕核酸，例如在Tsuchimochi K,et al.,Mol Cell Biol.2005；25(16):7344-56.中已有实施例而被揭示属于公知(序列编号7：5’-AUGGUGACUGGUGCUAAGA-3’)。
此外，滑膜蛋白的诱捕核酸及其确认方法如同例如国际公开WO2005-093067号说明书、及国际公开WO2005-074988号说明书所示属于公知。
滑膜蛋白的表达抑制剂或滑膜蛋白的活性抑制剂的某一态样为有效成分是滑膜蛋白的反义核酸。滑膜蛋白的反义核酸及筛检滑膜蛋白的反义核酸的方法例如揭示于日本专利特开2009-155204号公报、再表2006-137514号及再表2005-074988号。所谓滑膜蛋白的反义核酸意指具有与滑膜蛋白基因互补的序列，透过与该基因杂合，可抑制滑膜蛋白基因的表达的核酸。反义核酸可藉由将对于编码滑膜蛋白基因的部分碱基序列互补的核酸化合物以合成化学的手法等进行调制。为了评价该核酸化合物是否有效地抑制滑膜蛋白的产生，以进行基因表达量作为指标的筛检试验为宜。上述反义核酸化合物为可将例如滑膜蛋白的表达与对照组相比至少抑制在50％以下者。
在抑制特定的内源性基因的表达的方法方面，利用反义技术的方法已为该领域技术人员所熟知。在反义核酸抑制标的基因表达的作用上存在有如以下多个要因。也就是如以下所述各抑制：形成三链造成的转录起始抑制、由于RNA聚合酶而在局部致开环构造的部位间的杂合而形成造成的转录抑制、合成进行中RNA间的杂合形成造成的转录抑制、内含子与外显子的接合点中的杂合形成造成的剪接抑制、剪接体形成部位间的杂合形成造成的剪接抑制、mRNA间的杂合形成造成的核往细胞质的移动抑制、加盖部位或poly(A)附加部位间的杂合形成造成的剪接抑制、翻译起始因子结合部位间的杂合形成造成的翻译起始抑制、起始码附近的核糖体结合部位间的杂合形成造成的翻译抑制、mRNA的翻译结构域或核糖体结合位点的杂合形成造成的胜肽链的伸长抑制、及核酸与蛋白的相互作用部位间的杂合形成造成的基因表达抑制等。如上所述，反义核酸透过抑制转录、剪接或翻译等各种过程，来抑制标的基因的表达(平岛及井上,新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制与表达，日本生化学会编,东京化学同人,1993,319-347.)。
本发明所用的反义核酸亦可透过上述任一作用来抑制滑膜蛋白基因的表达及/或功能。一种态样是，只要设计与滑膜蛋白基因的mRNA的5'端附近的非翻译结构域互补的反义序列，则可有效果地抑制基因的翻译。又，亦可使用与编码结构域或3'侧的非翻译结构域互补的序列。如上所述，不仅滑膜蛋白基因的翻译结构域，非翻译结构域的序列中包含的反义序列的核酸亦包含在本发明利用的反义核酸中。使用的反义核酸是连结在适当的启动子的下游，优选为3'侧连结有包含转录结束信号的序列。像这样调制出的核酸可利用公知的方法藉此转化所需的动物(细胞)。反义核酸的序列优选为与转化的动物(细胞)所具有的内源性滑膜蛋白基因或其部分互补的序列，只要可尽量有效地抑制基因表达，亦可非完全互补。转录的RNA对于标的基因的转录产物优选为具有90％以上，最优选为95％以上的互补性。使用反义核酸来有效抑制标的基因(滑膜蛋白)的表达，反义核酸的长度优选为至少15碱基以上未达25碱基，本发明的反义核酸并非绝对局限于该长度，例如100碱基以上，或500碱基以上亦可。
又，滑膜蛋白基因的表达的抑制亦可利用核酶、或编码核酶的DNA来进行。所谓核酶意指具有触酶活性的RNA分子。核酶中存在有具有各种活性的，其中作为切断RNA的酶的核酶已被仔细研究，目前可以设计出将RNA部位特异性地切断的核酶。核酶中有Group I内含子型或RNase P所包含的如M1 RNA的400核苷酸以上的大小者，亦有称为锤头型或发夹型的具有40核苷酸左右的活性结构域者(小泉诚及大冢荣子,蛋白核酸酶,1990,35,2191.)。
例如，锤头型核酶的自我切断结构域是切断G13U14C15的序列的C15的3'侧，U14与A9之间的碱基对形成对于其活性很重要，亦可切断A15或U15来代替C15(Koizumi,M.etal.,FEBS Lett,1988,228,228.)。如果将核酶设计成基质结合部位与标的部位附近的RNA序列互补，则可作出识别标的RNA中的UC、UU或UA的序列的限制酶般的RNA切断核酶(Koizumi,M.et al.,FEBS Lett,1988,239,285.，小泉诚及大塚荣子,蛋白核酸酶,1990,35,2191.，Koizumi,M.et al.,Nucl Acids Res,1989,17,7059.)。
又，发夹型核酶亦可用于本发明的目的。该核酶被发现在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链(Buzayan,JM.,Nature,1986,323,349.)。目前已揭示从发夹型核酶亦可作出标的特异性的RNA切断核酶(Kikuchi,Y.&Sasaki,N.,Nucl Acids Res,1991,19,6751.，菊池洋,化学与生物,1992,30,112.)。因此，使用核酶来将本发明的滑膜蛋白基因的转录产物特异性地切断，藉此可抑制该基因的表达。
内源性基因表达的抑制亦可进一步藉由使用具有与标的基因序列相同或类似的序列的双股RNA的RNA干扰(以下亦称“RNAi”)进行。
本发明的治疗剂可为经口、非经口投予的任一者。非经口投予的情形可列举经肺剂型(例如使用吸入器等)、经鼻投予剂型、经皮投予剂型(例如软膏、乳剂)，注射剂型等。注射剂型的情形可藉由例如点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部性投予。
投予方法视患者的年龄、症状进行适当选择。有效投予量以一次来说体重1kg约为0.1μg～100mg，优选为1～10μg。然而，上述治疗剂并不局限于该投予量。当混合siRNA等核酸时，该核酸的用量的示例为0.01～10μg/ml，优选为0.1～1μg/ml。
本发明的治疗剂可依照例行方法进行制剂化，亦可包含医药上所容许的载体或添加物。像这样的载体及添加物可列举水、医药上所容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性聚葡萄糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、三仙胶、***胶、酪蛋白、洋菜、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人类血清蛋白素、甘露醇、山梨醇、乳糖、医药添加物所容许的界面活性剂等。
上述添加物是本发明的治疗剂的剂型而从上述之中单独或选择适当组合。例如，当用作注射用制剂时，可将纯化的ER压力诱发物质溶解于溶剂(例如生理食盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等)，并于其中添加Tween80、Tween20、明胶、人类血清蛋白素等。或者，为了成为使用前溶解的剂形亦可为冷冻干燥者。冷冻干燥用赋形剂可使用例如甘露醇，葡萄糖等糖醇或糖类。
本发明的第2方面是关于一种筛检PGC-1β蛋白的功能调整剂的方法。优选为使得PGC-1β蛋白的功能提升者。使得PGC-1β蛋白的功能提升者，优选为作用于抗肥胖者。该方法首先使脂肪组织的细胞或动物个体与被验物质作用。然后，对于脂肪组织的细胞中滑膜蛋白的表达量、滑膜蛋白与PGC-1β蛋白的结合、或滑膜蛋白对于PGC-1β蛋白的泛素化的至少一者进行测定或检测。如先前所述，本发明是根据抑制滑膜蛋白的活性会提高PGC-1β蛋白的活性的见解。因此，透过评价滑膜蛋白的表达或活性，可筛检出PGC-1β蛋白的功能调整剂(具有调节PGC-1β蛋白的功能的作用的物质)。亦即，筛检PGC-1β蛋白的功能调整剂的方法，只要筛检抑制滑膜蛋白的表达或活性的物质即可。抑制滑膜蛋白的表达或功能的物质的筛检方法，除了本说明书及实施例的记载之外，亦可适当使用例如日本专利特再表2006/137514号公报、特再表2006/135109号公报、特再表2005/118841号公报、特再表2005/019472号公报、及特再表02/052007号公报所揭示的方法。
本发明的第2方面的某一态样是关于一种线粒体的活性化剂的检测(筛检)方法，其使用了对于先前所述的PGC-1β蛋白的功能调整剂进行筛检的方法。
本发明的第2方面的某一态样是关于一种肥胖症的治疗剂或预防剂的检测(筛检)方法，其使用了对于先前所述的PGC-1β蛋白的功能调整剂进行筛检的方法。
实施例
以下列举实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明完全不局限于所述实施例。
＜材料：质粒及抗体＞
完全长度的mPPARα、mPPARγ、mPGC-1α及mPGC-1β基因所对应的编码序列是透过来自小鼠3T3-L1细胞的cDNA进行PCR增幅而得。PGC-1β的缺陷突变体系列的断片是透过进行PCR增幅而得。全长度的PGC-1β与PGC-1β的各缺陷突变体***至pcDNA3HA载体(invitrogen公司制的改良)中，用于GST pulldown试验或转染试验。其中，制作出的所有质粒的碱基序列藉由序列解析进行确认。PPRE×3-TK-luc是从addgene Inc.购入。滑膜蛋白质粒的系列使用已发表论文(Amano,T.et al.(2003).滑膜蛋白/Hrd1,an E3 ubiquitin ligase,as anovel pathogenic factor for arthropathy.Genes Dev 17,2436-2449.及Yamasaki,S.et al.(2007).Cytoplasmic destruction of p53 by the endoplasmic reticulum-resident ubiquitin ligase'滑膜蛋白'.EMBO J 26,113-122.)者。
抗体方面，抗FLAG抗体(M2)及抗微管蛋白抗体皆使用Sigma Chemical Co制，抗HA-tag抗体(12CA5及3F10)为使用Roche制，抗PGC-1β抗体为使用Sant cruze bio制。抗滑膜蛋白兔多克隆抗体使用已发表论文(Yamasaki,S.et al.2007)所记载的。
＜作制例1：滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠＞
滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠(syno cKO)利用以下方法制作。
标的载体构筑是使用从小鼠滑膜蛋白基因的外显子1的上游至外显子16的下游的结构域14.8kb的基因结构域。将FRT序列包夹的新霉素抗性基因***至外显子1与外显子2之间。又，在外显子2的上游及外显子14的下游导入loxP序列。将前述标的载体导入至ES细胞中。透过PCR产物的长度来确认Cre处理造成的loxP-外显子-loxP序列的去除及FLP处理造成的FRT-新霉素-FRT的去除，选拔具有目的的同源性重组有发生的对偶基因的克隆。将发生同源性重组的前述ES细胞的克隆透过如同公知的方法(例如EMBO J 16:1850-1857)导入小鼠胚中，藉此获得嵌合体小鼠。然后，将该嵌合体小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，获得新霉素序列被除去的小鼠。此外，并入目标载体的外显子-Long arm间的loxP序列在同源性重组时可能有缺陷，故以PCR确认其存在。
将所得的新霉素去除小鼠与CAG-Cre小鼠交配，获得CAG-Cre；synoflox/flox小鼠(具有同型组合型的在CMV强化子与鸡β-actin启动子的控制下导入有loxP的滑膜蛋白对偶基因与Cre-ER导入基因(参照Hayashi,S.,and McMahon,A.P.(2002).Efficientrecombination in diverse tissues by a tamoxifen(他莫昔芬)-inducible form ofCre:a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in themouse.Dev Biol 244,305-318.))。
前述小鼠可透过他莫昔芬(Tam)来诱发滑膜蛋白基因剔除。
他莫昔芬在CAG-Cre；synoflox/flox小鼠(syno cKO)及同型组合型synoflox/flox小鼠(syno WT)出生后、7～8周间后进行投予。为了使投予的他莫昔芬成为20mg/ml而使用溶解于玉米油(WAKO)者。他莫昔芬的投予量，一日约125mg/kg的他莫昔芬溶液于腹腔内连续5日投予。
其中，他莫昔芬投予让滑膜蛋白被基因剔除，是藉由对基因体上的滑膜蛋白进行PCR的方法、滑膜蛋白mRNA进行实时PCR的方法、滑膜蛋白蛋白进行蛋白印迹法的方法等来确认。
(实施例1：β氧化及线粒体生合成相关连的因子的转录)
为了研究滑膜蛋白使末梢性的能量消耗改变的可能性，使用微数组对于来自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪细胞彻底地进行基因表达解析。
其结果可知，与滑膜蛋白WT小鼠相比，滑膜蛋白基因剔除小鼠中Pparα、Cpt1b、Cpt、Acox2、Ehhadh、Acsl1、Acat2等β氧化相关的许多基因，及Pgc-1α、UCP3、cidea、cox8b等线粒体生合成相关的基因有显著的表达增大。
然后，使用实时RCR确认该基因的表达。具体而言，从来自滑膜蛋白基因剔除小鼠(syno cKO)的白色脂肪细胞中藉由例行方法粹取总RNA，进行实时PCR。实时PCR所使用的引物是使用下述表1所示的各种引物。
[表1]
F：前进，R：倒退
此外，对照是使用来自滑膜蛋白野生型小鼠(syno WT)的白色脂肪细胞以同样方式进行实时PCR。
其中，实时PCR的反应条件如下所述。
Stage1(聚合酶活性化)：95℃10min
Stage2(热变性)：95℃1sec
(黏合/延伸反应)60℃20sec
Stage3：将Stage2进行40cycle
又，即时PCR装置使用的是Step One Plus(Applied Biosystems公司制)。
其中，各测定值是利用作为内源性对照组的18s ribosomal RNA进行标准化，synoWT的平均值(n＝3)作为1并以此比例表示。结果示于图1。
从图1可知，β氧化及线粒体生合成相关的基因群的转录有增加。因此，教示白色脂肪细胞内的线粒体是滑膜蛋白基因剔除小鼠的标靶。
(实施例2：滑膜蛋白基因剔除小鼠中线粒体的观察)
对于实施例1所用的来自滑膜蛋白基因剔除小鼠(syno cKO)的白色脂肪细胞使用电子显微镜并藉由例行方法来观察线粒体。作为对照是将来自滑膜蛋白野生型小鼠(synoWT)的白色脂肪细胞以相同方式进行观察。结果示于图2左。
又，来自脂肪细胞特异性地将基因剔除滑膜蛋白的小鼠(syno Adipose KO)的白色脂肪细胞亦以相同方式进行观察。结果示于图2右。其中，脂肪特异性滑膜蛋白基因剔除小鼠的制作，首先是将Syvn1flox/flox小鼠与脂肪酸结合蛋白4(aP2)-Cre小鼠(JacksonImmunoresearch Laboratories)交配，获得包含aP2-Cre-ER；Syvn1flox/+小鼠等的复合异型合子，接着将aP2-Cre；Syvn1flox/+小鼠与Syvn1flox/flox小鼠交配作为二次交配，获得aP2-Cre；Syvn1flox/flox小鼠。其中，将具有Syvn1flox/flox的基因型，欠缺Cre转基因的小鼠作为对照小鼠。
从图2A及B可知，与滑膜蛋白来自野生型小鼠的白色脂肪细胞相比，来自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪细胞中线粒体的数量有显著地增加，此外线粒体的尺寸有显著地增大。
(实施例3：滑膜蛋白与PGC-1β在体外的结合)
至今，具有控制β氧化与线粒体的复制两者的活性的因子已知有与脂肪细胞的分化和活性密切相关的转录因子家族PPAR(PPARα、PPARγ)与它的转录辅助激活因子PGC家族(PGC-1α，PGC-1β，PRC)。因此，将前述各因子与滑膜蛋白蛋白的结合进行确认。
首先，将缺少膜贯通结构域的GST融合滑膜蛋白(GST synoΔTM)与谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B培养。前述GST融合蛋白与来自表达HA PPARγ、HA PPARα、HA PGC-1α或HA PGC-1β的HEK-293T的各种全细胞抽提物一起培养。将结合的蛋白溶出，用SDS-PAGE分离，再以抗HA抗体进行蛋白印迹法。对照是使用未与蛋白融合的GST。其结果示于图3。
图3中，对照的GST未与任何一种蛋白结合。另一方面，GST synoΔTM虽与HA PGC-1β结合，但未与HA PGC-1α、HA PPARγ及HA PPARα结合。因此，显示出PGC-1β与滑膜蛋白蛋白选择性结合。
(实施例4：滑膜蛋白与断片化突变PGC-1β在体外的结合)
为了鉴别与滑膜蛋白结合的PGC-1β的结合部位，使用PGC-1β的断片化突变的系列(参照图4)进行GST pulldown试验。
具体而言，是藉由已发表论文(Aratani,S.st al.,(2001).Dual roles of RNAhelicase A in CREB-dependent transcription.Mol Cell Biol 21,4460-4469.)所述的方法利用PCR法进行PGC-1β的断片化。各断片化PGC-1β突变体的概念图示于图4。使用在体外转录/翻译的带HA标签的PGC-1β断片化突变体和GST或GST-滑膜蛋白ΔTM进行体外结合试验。将该蛋白溶出，用SDS-PAGE分离，再以抗HA抗体进行蛋白印迹法。结果示于图4。
从图4可知滑膜蛋白会和PGC-1β中包含独特的LXXLL模体的PGC-1β结构域(195～367胺基酸结构域)结合。关于PGC-1β的195～367胺基酸结构域，是在PGC-1α、PRC中不存在的独特序列。
(实施例5：断片化突变滑膜蛋白与PGC-1β在体外的结合)
为了鉴别与PGC-1β结合的滑膜蛋白的结构域，使用滑膜蛋白的断片化突变的系列(参照图5及已发表论文Yamasaki et al.,2007)进行GST pulldown试验。以与实施例4相同的方式培养在体外转录/翻译所制作的HA PGC-1β和GST或与GST融合的滑膜蛋白断片化突变体，利用抗HA抗体进行蛋白印迹法。结果示于图5。
从图5可知PGC-1β会与包含滑膜蛋白中独特且保留的结构域(第236号～第270号的胺基酸序列，以下称“SyU结构域”)的滑膜蛋白的中央部分结合。又，可知在与PGC-1β的结合方面仅SyU结构域即已足够，以及从synoΔTM可知SyU结构域有缺陷的突变体(SynoΔTMΔSyU)无法与PGC-1β结合。由此可知，SyU结构域为与PGC-1β结合的最小结构域。
(实施例6：滑膜蛋白与PGC-1β在体内的结合)
对于滑膜蛋白与PGC-1β在体内是否会实际形成复合体进行验证。具体而言，首先将表达带有HA标签的PGC-1β(HA PGC-1β)的质粒与表达带有FLAG标签的滑膜蛋白(SYVN1/FLAG)或滑膜蛋白突变体(SYVN1ΔSyU/FLAG)的质粒转染至HEK-293T细胞中。从转染了前述表达质粒的HEK-293T细胞中准备全细胞抽提物，利用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。将与抗FLAG抗体结合的蛋白溶出，用SDS-PAGE分离，再以抗HA抗体及抗FLAG抗体进行蛋白印迹法。结果示于图6A。
图6A中，HA PGC-1β与SYVN1/FLAG共免疫沉淀，但未与SYVN1ΔSyU/FLAG共免疫沉淀。这显示在体内，滑膜蛋白(SYVN1)会经由SyU结构域而与PGC-1β结合。
为了进一步调查滑膜蛋白与PGC-1β的物理上的结合，将表达滑膜蛋白与PGC-1β的HEK-293T细胞的全细胞溶解液利用抗滑膜蛋白抗体进行沉淀，再利用抗PGC-1β抗体进行免疫印迹法。结果示于图6B。
图6B中，内源性的PGC-1β与抗滑膜蛋白抗体沈降而被检测出。另一方面，非免疫小鼠IgG则未检测出。这件事显示滑膜蛋白与PGC-1β在体内有物理上的结合。
(实施例7：滑膜蛋白及PGC-1β的细胞内定位)
目前已知滑膜蛋白为ER常在性的蛋白，PGC-1β会往核内移动，故调查滑膜蛋白及PGC-1β的细胞内定位。将HA PGC-1β及/或syno/FLAG、滑膜蛋白3S/FLAG或滑膜蛋白ΔSyU/FLAG表达质粒转染至HEK-293T细胞中，24小时后使用抗HA抗体及抗FLAG抗体进行由免疫荧光染色来调查滑膜蛋白及PGC-1β的细胞内定位。结果示于图7。
从图7可知，当仅使HA PGC-1β过表达时，如同目前为止的报告(Kelly et al.,2009)，HA PGC-1β主要是位于核中。另一方面，当HA PGC-1β与syno/FLAG一起表达时，HAPGC-1β并非位于核内，而主要是与syno/FLAG一起位于核周边结构域。此外，当令HA PGC-1β与滑膜蛋白ΔSyU/FLAG一起表达时，HA PGC-1β是位于核中。因此，该结果暗示，滑膜蛋白会在核周边结构域将PGC-1β进行捕捉，及体内中该隔离需要SyU结构域。
(实施例8：滑膜蛋白造成的PGC-1β的泛素化)
滑膜蛋白已知为一种E3泛素化酶(参照Amano,T.,et al.(2003).滑膜蛋白/Hrd1,an E3ubiquitin ligase,as a novel pathogenic factor for arthropathy.Genes Dev17,2436-2449.)，故对于PGC-1β是否为E3泛素化酶滑膜蛋白的基质进行了验证。使用在体外转录及翻译的PGC-1β(FLAG‐PGC)、泛素活性化酶E1(E1-His)、泛素结合酶E2(UBE2G2-His)、及泛素(PK-His-HA-Ub)和GST结合滑膜蛋白突变体(Syno(236-338))进行体外泛素化试验。结果示于图8A。
图8A中，ATP、PK-His-HA-Ub、E1-His、UBE2G2-His及Syno(236-338)皆存在的条件下有检测出聚泛素化的PGC-1β。这可确认出体外中PGC-1β是滑膜蛋白的基质。
接着，调查体内中PGC-1β的泛素化。将ubiquitin/FLAG、HA PGC-1、及滑膜蛋白或滑膜蛋白3S表达质粒转染至HEK-293T细胞中。然后将前述HEK-293T细胞的全细胞抽提物利用抗HA抗体进行免疫沉淀。将结合的蛋白溶出，用SDS-PAGE分离，再以抗FLAG抗体进行蛋白印迹法。结果示于图8B。
图8B中，表达滑膜蛋白WT的细胞中HA PGC-1β有被泛素化，但表达滑膜蛋白3S的细胞中并没有被泛素化。
该结果暗示PGC-1β在体外及体内是滑膜蛋白推定上的基质。
泛素化的蛋白会被蛋白酶体分解已为人熟知。因此，为了确认PGC-1β的蛋白水平受到滑膜蛋白控制而进行了以下试验。
对于新生后滑膜蛋白经基因剔除的小鼠(syno cKO)，利用蛋白印迹法调查睪丸上体及肠间膜中滑膜蛋白及PGC-1β的蛋白水平。
图8C中，来自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪细胞中PGC-1β的蛋白水平与来自野生型小鼠相比有戏剧性的升高。其中，PGC-1β的转录水平在滑膜蛋白基因剔除小鼠与野生型小鼠间几乎没有差异。
接着，调查新生后的小鼠皮肤纤维母细胞中PGC-1β的mRNA及蛋白水平。
用DMEM培养基培养来自syno CKO小鼠的皮肤纤维母细胞，并以他莫昔芬(Tam)或溶剂(DMSO)处理48小时。收集细胞抽提物或总RNA，分别进行蛋白印迹法及实时PCR。结果示于图8D。
当来自滑膜蛋白条件性基因剔除小鼠的皮肤纤维母细胞中经过Tam处理时PGC-1β的蛋白水平有显著(1.4倍)提升。其中，PGC-1β的mRNA水平并无如预期变化。
进而，为了调查细胞中由PGC-1β的滑膜蛋白所媒介而分解的相关问题，前述试验中在他莫昔芬或溶剂处理后添加10μM的蛋白酶体抑制剂MG-132处理2小时，并进行相同的试验。
图8D中，MG-132与经过他莫昔芬处理的细胞相同，溶剂(DMSO)处理后的皮肤纤维母细胞中PGC-1β的蛋白量较实际上调(1.6倍)。此外，他莫昔芬处理与MG-132添加之间未见相加效应(1.1倍)。
该结果暗示PGC-1β的蛋白水平是在转录后的过程中透过滑膜蛋白而被负调控。此外，这也强烈暗示滑膜蛋白是细胞内对于PGC-1β的主要E3。
(实施例9：滑膜蛋白siRNA对于PGC-1β功能的效果)
除了目前为止的基因缺失的效果之外，透过以下的试验确认针对滑膜蛋白的siRNA(Syno siRNA)的效果。
首先，进行HEK 293细胞中siRNA造成的滑膜蛋白敲减。针对滑膜蛋白的siRNA是依照已发表论文(参照Yamasaki,S.,et al.(2007).Cytoplasmic destruction of p53 bythe endoplasmic reticulum-resident ubiquitin ligase'滑膜蛋白'.EMBO J 26,113-122.)进行。siRNA的细胞的转染是使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司制)依照实验指南进行。结果示于图9A。
从图9A确认出Syno siRNA处理细胞中滑膜蛋白的表达几乎完全消失。又，SynosiRNA处理细胞中PGC-1β蛋白水平上升至2.5倍。另一方面，透过syno siRNA处理PGC-1βmRNA的表达并未变化。
PGC-1β已知作为PPARα或PPARγ等几个转录因子的转录辅助激活因子而发挥功能，与包含线粒体生合成、β氧化及体重调节的各种生物学的事件有关(参照Scarpulla,R.C.(2008).Transcriptional paradigms in mammalian mitochondrial biogenesisand function.Physiol Rev 88,611-638.)。因此，PGC-1β被认为是利用syno cKO小鼠所观察到的事件的原因因子。为了验证这个想法，对于syno cKO中被抑制的PGC-1β媒介的2个代表性的细胞内变化事件进行解析。一者为PGC-1β的辅助激活因子活性，另一者为线粒体的生合成。
具体而言，将对照的siRNA或Syno siRNA暂时性地转染至HEK-293细胞中。此外，将包含PPAR结合部位的报告质粒(PPRE×3-TK-luc)、CMV-β-gal表达建构或siRNA暂时性地转染至HEK-293细胞中。16小时后，以DMSO或Wy-14643处理6小时进行荧光素酶测定(图9B)。
其中，已知PPAR-荧光素酶(PPRE×3-TK-luc)包含3×PPAR结合部位，藉由PPAR、其配体及辅助激活因子而严格地被控制(参照Kim,J.B.,et al.(1998).ADD1/SREBP1activates PPARgamma through the production of endogenous ligand.ProcNatl Acad Sci U S A 95,4333-4337.)为已知。
又，为了调查使滑膜蛋白过表达后的效果，将滑膜蛋白表达载体的量阶段性地增加并且亦同时进行转染试验(图9C)。
转染16小时后，将细胞以溶剂(DMSO)或Wy-14643处理6小时，进行荧光素酶测定。
图9B中，如已发表论文(参照Lin,J.,et al.(2003).PGC-1beta in theregulation of hepatic glucose and energy metabolism.J Biol Chem 278,30843-30848.)所述，PPARα的激动促效剂之一的Wy-14643会诱发PPRE×3-TK-luc报导活性。在Wy-14643诱发条件下，形质移入的Syno siRNA使得前述报导活性大幅地增强，但对照的siRNA却未增强。Syno siRNA与同时形质移入的PGC-1β使得前述报导活性进一步增强。
从图9C可知，由滑膜蛋白过表达PGC-1β所媒介的辅助激活因子功能会被抑制。
该结果暗示滑膜蛋白的敲减会通过依存于PGC-1β的路径而增强PPARα所媒介的转录。
进而，为了验证滑膜蛋白敲减是否控制细胞中的线粒体生合成，以与上述相同的方式对于滑膜蛋白siRNA处理后的细胞利用电子显微镜进行观察。其照片示于图9D。
图9D中，与来自syno cKO的白色脂肪细胞的情形(图2)相同，与对照的siRNA处理细胞相比，Syno siRNA处理细胞中线粒体的数量及体积密度有增加。
(实施例10：滑膜蛋白的E3泛素连接酶活性抑制剂造成的滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制)
为了调查滑膜蛋白的E3泛素连接酶活性抑制剂对于PGC-1β功能的影响，首先调查滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果。具体而言，在使用MBP-PGC―1β-His蛋白与GST-SynoΔTM蛋白的例行方法的结合试验中，添加LS-102(PARMACOPIEA公司)结合12小时，然后进行胶体浓度12％的SDS-PAGE，接着进行蛋白印迹法。一次抗体是使用2500倍稀释的抗GST抗体，二次抗体是使用10000倍稀释的抗大鼠HRP。结果示于图10。
其中，LS-102为下述构造式所示的化合物，是一种对于滑膜蛋白的E3泛素连接酶活性具有选择性抑制的化学物质。
[化1]
图10中，LS-102中可见滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果。
(实施例11：抑制滑膜蛋白与PGC-1β的结合的物质的筛检)
为了得到抑制滑膜蛋白与PGC-1β的结合的物质，调查从E3泛素连接酶关连的筛检用文库中下述表2所示的物质对于滑膜蛋白与PGC-1β的结合的影响，故以与实施例3～6相同的方式进行体外结合试验。结果示于图11-1、图11-2、图11-3及图11-4。其中，本实施例中的蛋白使用了2μg的PGC-1βB(参照图4)，及2μg的GST-SynoΔTM(参照图6)。
图11-1为显示被验物质348及349造成的滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果的蛋白印迹法(上图)，及评价被验物质348及349的结合能的图(下图)。图11-2为显示被验物质槲皮素及351造成的滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果的蛋白印迹法(上图)，及评价被验物质槲皮素及351的结合能的图(下图左及右)。图11-3为显示各别的被验物质的结合抑制效果的蛋白印迹法。
[表2]
从图11-1～图11-4可知，在348、349、355、358、及槲皮素中可见滑膜蛋白与PGC-1β的结合抑制效果。可知351会增强结合。又，由图11-4与对照群(DMSO)相比，使用348及349时PGC-1β的聚泛素化会被抑制。
(实施例12：滑膜蛋白的E3泛素连接酶活性抑制剂及抑制滑膜蛋白与PGC-1β的结合的物质对于PGC-1β功能的影响)
实施例9中，除了使用5μM的LS-102、0.1μM及0.5μM的348、0.1μM及5μM的349、及5μM的351及355来取代Syno siRNA的转染以外，其余以与实施例9相同的方式进行荧光素酶测定。对照仅同体积添加各化合物的溶剂DMSO。结果示于图12。
图12中，以前述化合物进行处理时，仅以351处理时荧光素酶活性是降低的。该结果显示，藉由抑制滑膜蛋白与PGC-1β的结合可获得增强PGC-1β功能的物质。
此外，为了确认而调查PGC-1β蛋白水平，发现LS-102处理细胞中PGC-1β的蛋白水平约上升至2倍。另一方面，透过LS-102处理PGC-1βmRNA的表达并未变化。
(实施例13：抑制滑膜蛋白与PGC-1β的结合的物质对于线粒体功能的影响)
实施例9中，除了在细胞中添加1μM的348、349、351及355并于72小时后进行观察来取代Syno siRNA的转染之外，其余以与实施例9相同的方式观察线粒体。照片示于图13。图13中可观察到348、349、355中线粒体的增殖(数量增加)或线粒体尺寸的增大。以上暗示抑制滑膜蛋白会提升转录辅助激活因子PGC-1β的活性，活化线粒体，也就是可成为激动促效剂的全新的新药研发的分子标的。
(实施例14：滑膜蛋白的表达抑制及泛素化活性抑制地效果)
将小鼠的脂肪前驱细胞3T3-L1细胞利用含10％FBS(牛胎儿血清)的DMEM(杜尔贝克氏改良的伊格氏培养基；High Glucose)达到融合后培养3日。添加500μM IBMX(isobutyl-methylxanthine)、1μM Dexamethasone、5μg/mL Insulin诱发分化。同时添加10μM LS-102(滑膜蛋白的泛素化活性抑制剂)或DMSO。培养3日后，换成含4μg/mL Insulin的培养基并添加10μM LS-102或DMSO。培养3日后，换成含10％FBS的DMEM(High Glucose)培养3日。关于siRNA，是在分化诱发2日前将200pmol的siRNA Syno770(有义股是由下述序列编号2的序列所构成)透过Lipofectamine2000导入。
序列编号2：5’-GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3’
培养后的3T3-L1细胞以PBS(-)(Phosphate Buffered Saline溶液中去除镁与钙)清洗，然后以10％甲醛(马福林)固定。接着用PBS(-)洗净再以60％异丙醇取代。使用18mg/mL Oil Red O(溶剂为异丙醇)染色20分钟，然后以60％异丙醇及PBS(-)洗净再用显微镜观察。
因siRNA而使滑膜蛋白基因的活性受到抑制的细胞中，与对照相比，分化的脂肪细胞较少，分化有被抑制。此外，确认出非轮环状正常脂肪细胞的脂滴。以上的结果显示，滑膜蛋白基因的表达抑制及滑膜蛋白蛋白的自我泛素化有受到抑制。
(实施例15：滑膜蛋白基因剔除小鼠中脂肪细胞的氧消耗量)
为了调查CAG-Cre-ER；Syvn1flox/flox小鼠中线粒体的功能是否活性化，故测定脂肪细胞1个细胞的氧消耗量。
＜氧消耗量的测定方法＞
氧消耗量的测定方法如以下所述。从CAG-Cre-ER；Syvn1flox/flox小鼠及对照小鼠采取皮下脂肪，使用0.1％(w/v)胶原酶于37℃处理1小时进行单一细胞化。所得单一细胞的悬浊液使用MitoXpress(注册商标)-Xtra-HS(Luxcel Biosciences Ltd.Ireland)，依照试剂盒附属的说明书测定氧消耗量。其结果示于图14。图14为显示滑膜蛋白基因剔除小鼠中脂肪细胞的氧消耗量的图。将初代小鼠脂肪细胞分离，测定脂肪细胞1个细胞的氧消耗量。统计处理是进行非配对样品T检验。
从图14可知，来自CAG-Cre-ER；Syvn1flox/flox小鼠的脂肪细胞的氧消耗量比来自对照小鼠的脂肪细胞的氧消耗量显著地较多。
(实施例16：滑膜蛋白基因剔除小鼠中的基础代谢量)
为了调查CAG-Cre-ER；Syvn1flox/flox小鼠中线粒体的功能是否活性化，故测定CAG-Cre-ER；Syvn1flox/flox小鼠的基础代谢量(图15)。
＜基础代谢量的测定方法＞
基础代谢量的测定方法如以下所述。使用Tam投予后第7日的小鼠，绝食4小时并使其安静后，使用Oxymax Equal Flow System(Columbus Instruments,950N.Hague Ave；Columbus,OH USA)测定氧消耗量(VO2)及二氧化碳产生量(VCO2)。此外，运动活性(运动的数量)也一并使用DAS system(Neuro Science,Inc.,Japan)进行测定。图15为显示滑膜蛋白基因剔除小鼠中的基础代谢量的图。统计处理是进行非配对样品T检验。
如图15所示，CAG-Cre-ER；Syvn1flox/flox小鼠的基础代谢量比对照小鼠的基础代谢量显著地较多。
该结果暗示，SYVN1在体内会增强线粒体活性。
(实施例17：滑膜蛋白与脂肪燃烧的关系)
进行野生型WT小鼠与滑膜蛋白KO小鼠各组织中脂联素与滑膜蛋白的蛋白印迹法。图16为显示野生型WT与滑膜蛋白KO的各组织中脂联素与滑膜蛋白的蛋白印迹法的图式的替代照片。图中α-微管蛋白为内部标准。从图16可知藉由将滑膜蛋白基因剔除会增加脂联素的量，并促进脂肪酸燃烧。
(实施例18：PGC-1β的半衰期的测定)
为了确认SYVN1与PGC-1β的相互作用对于SYVN1媒介的PGC-1β的分解是否重要，故测定了PGC-1β的半衰期。
试验是对于以往公知的方法(Yamasaki,S.,et al.EMBO J.26,113-122(2007)及Bernasconi,R.,et al.J.Cell Biol.188,223-235(2010))进行了如以下的修正。在来自滑膜蛋白基因剔除小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF Syno-/-)上利用1μg的pcDNA3滑膜蛋白/FLAG、空的载体、或1.5μg的pcDNA3滑膜蛋白进行ΔSyU/FLAG和0.75μg pcDNA3 HAPGC-1β的转染。从转染开始48小时后，将细胞以40μM Cycloheximide处理0.5、1、2、或4小时，再将细胞以缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,1mM EDTA,1％NP-40,1mM DTT,proteaseinhibitors)进行溶解，然后使用抗PGC-1β、抗-SYVN1、或抗α微管蛋白抗体进行免疫印迹解析。各试验至少进行3次。结果示于图17。图17中，野生型的滑膜蛋白(SYVN1 WT)将PGC-1β的半衰期大幅地缩短，但SYVN1ΔSyU却没怎么促进PGC-1β的分解。因此，这显示PGC-1β的蛋白水平是在转录后的过程中受到与滑膜蛋白的结合所媒介的负调控。这也强烈暗示滑膜蛋白是PGC-1β的主要E3连接酶。
(实施例19：滑膜蛋白的泛素化活性抑制剂LS-102对线粒体功能的影响)
对7～8周龄的C57BL/6J小鼠于腹腔内投予1日约50mg/kg体重的LS-102或作为对照的溶剂(DMSO)，将第57日小鼠的脂肪组织切片利用电子显微镜观察。其结果示于图18。图18为显示LS-102造成的脂肪组织的线粒体的形态变化的电子显微镜照片。电子显微镜的倍率为2,500倍及10,000倍，反白的杠表示比例尺(2,500倍时为2μm，10,000倍时为500nm)。
从图18可知LS-102处理引发脂肪组织细胞中的线粒体的数量与体积密度的增加。这暗示若LS-102使得滑膜蛋白的E3连接酶活性被抑制时，会引起PGC-1β的超活性化而促进线粒体的生合成。
(实施例20：PGC-1β的半衰期)
在滑膜蛋白的KO小鼠所树立的MEF(mouse embryoinic fibriblasts)上PGC-1β的表达载体与空载体(对照组：CONT)、滑膜蛋白野生型(SYVN1 WT)、滑膜蛋白独特结构域(缺少β的结合结构域的突变型滑膜蛋白(SYVN1ΔSyU)分別依照的常规方法进行转染。经过48小时后，将代表性的蛋白翻译抑制剂放线菌酮(40μM)以图示的时间(0.5小时、1小时、2小时及4小时)处理，再针对各细胞抽提物进行蛋白印迹法。其结果示于图19。图19为显示PGC-1β的半衰期的蛋白印迹法。如图19所示，证明了PGC-1β在细胞内的半衰期分别为4.8小时、1.6小时、3.6小时。
该结果显示因滑膜蛋白的存在使得PGC-1β的半衰期、也就是分解受到控制，并且SyU结构域对于其控制是必须的。
(实施例21：泛素化的评价)
结合试验是使用以下的测定系。将2μgMBP-PGC-1βHis(1-367aa)、2μgGST滑膜蛋白突变体于缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl、1mM EDTA、0.1％NP-40、5％糖基化I、蛋白酶抑制剂)内结合12小时，藉由抗PGC-1β抗体检测PGC-1β。
泛素测定是使用以下的测定系。将E1-His 125ng、UbcH5C 150ng、MBP-SYVN1ΔTM-His 150ng、GST-PGC-1β(1-367aa；GST-P5)、HA-泛素(HA-Ub)750ng于缓冲液(50mM Tris-HCL pH7.5，5mM MgCl2，0.6mM DTT，2mM ATP)中30℃反应2小时进行泛素化。之后，于GST洗净缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，0.5M NaCl，1％聚乙二醇辛基苯基醚X，1mM EDTA，1mMDTT，蛋白酶抑制剂)中与谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose)结合。利用GST洗净缓冲液洗净后，透过使用抗PGC-1β抗体及抗HA抗体的蛋白印迹法检测PGC-1β的泛素化。图20为表示体外泛素化试验的结果。
图20显示滑膜蛋白(SYVN1)会将PGC-1β直接泛素化。
(实施例22：受测物质的泛素化抑制)
为了研究受测物质348、349造成的滑膜蛋白(SYVN1)对于PGC-1β的泛素化抑制活性的浓度相关性，进行了与实施例11相同的体外结合试验。图21为显示受测物质348、349对于PGC-1β的泛素化抑制活性的浓度相关性的蛋白印迹法。从图21可知，任何一个受测物质与1μM相比，10μM对于PGC-1β的泛素化抑制活性较高。亦即显示出受测物质的泛素化抑制活性是有浓度相关性的。
(实施例23：断片化突变滑膜蛋白与PGC-1β的结合)
实施例5显示滑膜蛋白(SYVN1)在第236～270号的结构域(SyU结构域)与PGC-1β结合的可能性很高。本实施例为了找出SyU结构域当中与PGC-1β结合的可能性高的部位而进行了以下的实验。
图22为多种中SyU结构域的胺基酸序列。进行滑膜蛋白(SYVN1)的236-240、241-245、246-250、251-255、256-260、261-265、266-270部位相当的每5个胺基酸被取代成丙胺酸的SYVN1SyU突变体与PGC-1β的结合。其结果示于图23。图23为SYVN1SyU突变体的蛋白印迹法。图23显示256-260、266-270aa部位对于PGC-1β的结合是重要的。
(实施例24：断片化突变滑膜蛋白与PGC-1β的结合)
266-270aa部位的胺基酸序列为RRAIR。准备胺基酸序列AAAAA者(对照)、第266号的R被取代成A者(R266A)、第267号的R被取代成A者(R267A)、第270号的R被取代成A者(R270A)、第266号及第267号的R被取代成A者(R266，267A)、第266号及第270号的R被取代成A者(R266，270A)、第267号及第270号的R被取代成A者(R267，270A)、3个R皆被取代成A者(3A)所构成的胜肽，以与实施例5相同的方式进行了蛋白印迹法。其结果示于图24。图24为SYVN1266-270aa突变体的蛋白印迹法。从图24可知，再SYVN1266-270aa媒介的PGC-1β的结合上理想的是至少有2个精胺酸残基。
产业上可利用性
本发明的线粒体功能的调节剂可增大线粒体的数量及尺寸，使脂肪酸β氧化及线粒体生合成增强，可适用在肥胖症的治疗或预防上。因此，本发明可利用在制药业。
独立文本的序列表
序列编号2：合成RNA
序列编号3：合成RNA
序列编号4：合成RNA
序列编号5：合成RNA
序列编号6：合成RNA
序列编号7：合成RNA
序列编号8：引物
序列编号9：引物
序列编号10：引物
序列编号11：引物
序列编号12：引物
序列编号13：引物
序列编号14：引物
序列编号15：引物
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序列编号17：引物
序列编号18：引物
序列编号19：引物
序列编号20：引物
序列编号21：引物
序列编号22：引物
序列编号23：引物
序列编号24：引物
序列编号25：引物
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序列编号34：引物
序列编号35：引物
序列编号36：引物
序列编号37：引物
序列编号38：引物
序列编号39：引物
序列编号40：引物
序列编号41：引物
序列编号42：引物
序列编号43：引物
序列编号44：引物

Claims (3)

1.一种筛检PGC-1β蛋白的功能调整剂的方法，其特征在于：
包含以下工序：使脂肪组织的细胞或动物个体与被验物质作用；测定或检测脂肪组织的细胞中
滑膜蛋白的表达量，
滑膜蛋白与PGC-1β蛋白的结合，或
滑膜蛋白对于PGC-1β蛋白的泛素化，
的至少一者。
2.一种线粒体的活性化剂的检测方法，其特征在于：
使用权利要求1所述的筛检方法。
3.一种肥胖症的治疗剂或预防剂的检测方法，其特征在于：
使用权利要求1所述的筛检方法。
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