WO2014103863A1 - 肥満症の予防及び治療作用を有する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2014103863A1
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syvn1
mice
gene
flox
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中島　利博
英俊 藤田
聡子 荒谷
尚子 八木下
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Nakajima Toshihiro
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    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound having an action for preventing and treating obesity.
  • Non-Patent Document 1 Obesity causes excessive accumulation of adipose tissue and increases various health risks such as diabetes, cardiovascular diseases, and depression (see Non-Patent Document 1). This problem causes tremendous economic and social losses in modern society. The molecular mechanism of adipocyte metabolism has been extensively studied (see Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Synoviolin is a protein discovered as a membrane protein that is overexpressed in synovial cells derived from rheumatic patients (see Patent Document 1). Studies using genetically modified animals revealed that synoviolin is an essential molecule for the development of rheumatoid arthritis.
  • synoviolin has a ring finger motif. This motif is often found in an enzyme called E3 ubiquitin ligase, which plays an important role in protein ubiquitination. And it has been proved that cioviolin has self-ubiquitination activity which is one of the characteristics of E3 ubiquitin ligase (see Patent Document 1).
  • the present inventor has obtained knowledge based on Examples that when a Synoviolin gene is disrupted using a Synoviolin gene conditional knockout mouse, weight loss of the subject and differentiation induction inhibition of adipocytes are caused. Therefore, the present inventor screens a compound having an adipocyte differentiation induction regulating action, an adipose tissue quantity regulating action, and a body weight regulating action by screening a compound that inhibits the expression of Synoviolin or inhibits the activity of Synoviolin. We have found that this is possible and have completed the present invention.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for screening a substance having an anti-obesity action.
  • This method includes a step of bringing a test substance into contact with a Synoviolin gene-expressing cell, and a step of confirming the influence of the test substance on the expression of Synoviolin gene or the activity of Synoviolin protein.
  • Examples of the effect on the expression of the Synoviolin gene are the effect on the Synoviolin mRNA level and the effect on Synoviolin protein self-ubiquitination.
  • the screening method for substances having anti-obesity action is a method for searching for candidates for substances having anti-obesity action.
  • the anti-obesity action is a fat tissue mass reduction action or an adipocyte differentiation induction inhibitory action. That is, in this embodiment, a compound having an effect of reducing the amount of adipose tissue or suppressing the induction of adipocyte differentiation can be screened.
  • the second aspect of the present invention relates to an anti-obesity drug.
  • This anti-obesity drug contains synoviolin siRNA, synoviolin decoy nucleic acid or synoviolin antisense nucleic acid as an active ingredient.
  • This anti-obesity agent has, for example, an adipose tissue amount reducing action or an adipocyte differentiation induction inhibiting action.
  • the active ingredient is that of siRNA having synoviolin.
  • Synoviolin siRNA are one base sequence selected from SEQ ID NO: 2 to 6, base sequence complementary to these base sequences, or substitution or insertion of one or two bases from any of these base sequences , RNA having a deleted or added base sequence.
  • the fact that the RNA having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 is a synoviolin siRNA indicates that Izumi T, et al. , Arthritis Rheum. 2009; 60 (1): 63-72., Yamazaki S, et al. , EMBO J. 2007; 26 (1): 113-22. It is known that RNA having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 is Synoviolin siRNA, as disclosed in WO 2005/074988 using experiments.
  • RNA having a base sequence in which one or two bases have been substituted, inserted, deleted or added from any of these base sequences refers to one base sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 6 and these bases RNA having a base sequence in which one or two bases are substituted, inserted, deleted or added from any base sequence of the base sequence complementary to the sequence. Any one kind of substitution, insertion, deletion or addition may occur, or two or more may occur.
  • the active ingredient is substituted, inserted, deleted or added with one or two bases from the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • Synoviolin decoy nucleic acid having a base sequence The nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 is a Synoviolin decoy nucleic acid, for example, using Examples in Tsuchimochi K, et al., Mol Cell Biol. 2005; 25 (16): 7344-56. As shown.
  • the active ingredient is a synoviolin antisense nucleic acid.
  • FIG. 1A is a design drawing of a gene targeting vector used for the production of Synoviolin conditional knockout mice (syvn1 cKO). Exons indicate black boxes, black arrows indicate neomycin (Neo), and open arrows indicate diphtheria toxin gene subunit A. Open triangles indicate loxP sites and black circles indicate FRT sites.
  • loxP was introduced adjacent to upstream and downstream of exons 2 to 12, and FRT adjacent to upstream and downstream of the neomycin cassette. A chromosome into which is introduced is obtained. “Flox Allele” shows the allele with loxP introduced after neomycin removal.
  • FIG. 1B shows (CAG) -Cre-ER; syvn1 + / + mice, (CAG) -Cre-ER; syvn1 flox / + mice and (CAG) -Cre-ER; syvn1 flox / flox mice after tamoxifen treatment. It is the photograph which carried out PCR analysis of the genomic DNA derived. Wild type allele is detected as a 70 bp fragment (lower band) and target allele is detected as a 100 bp fragment (upper band).
  • FIG. 1C is a graph showing real-time PCR analysis of adipocytes derived from syvn1 flox / flox mice (syvn1 WT) and (CAG) -Cre-ER; syvn1 flox / flox mice (syvn1 cKO) after tamoxifen treatment.
  • FIG. 1D is a Western blot of tail proteins derived from syvn1 WT mice and syvn1 cKO mice using an anti-synoviolin antibody.
  • FIG. 1E is a graph showing the survival rate in newborn Synoviolin conditional knockout mice.
  • FIG. 2A is a graph showing changes in body weight in newborn Synoviolin conditional knockout mice.
  • FIG. 2B is a graph showing food intake of Synoviolin knockout mice (male and female).
  • FIG. 2C is a photograph showing the state of subcutaneous fat in a newborn Synoviolin conditional knockout mouse. White arrows indicate subcutaneous fat.
  • FIG. 2D is a photograph showing epididymal adipose tissue of syvn1 WT (left side) and syvn1 cKO (right side).
  • FIG. 2E is a photomicrograph showing the state of fat droplets of visceral fat in a newborn Synoviolin conditional knockout mouse. Black arrows indicate fat droplets. The magnification is 400 times.
  • FIG. 2F is a photomicrograph showing the appearance of lipid droplets of the epididymis (upper figure) and subcutaneous fat (lower figure) in a newborn Synoviolin conditional knockout mouse. Black arrows indicate fat droplets. The magnification is 400 times.
  • FIG. 3A is a graph showing changes in body weight due to post-natal synoviolin knockout in syvn1vncKO: ob / ob mice.
  • FIG. 3B is a photograph showing the appearance of subcutaneous fat by newborn synoviolin knockout in syvn1 cKO: ob / ob mice. Black arrows indicate subcutaneous fat.
  • FIG. 3A is a graph showing changes in body weight due to post-natal synoviolin knockout in syvn1vncKO: ob / ob mice.
  • FIG. 3B is a photograph showing the appearance of subcutaneous fat by newborn synoviolin knockout in syvn1 cKO: ob
  • FIG. 3C is a graph showing changes in body weight due to newborn synoviolin knockout in syvn1 cKO: db / db mice.
  • FIG. 3D is a photograph showing the appearance of subcutaneous fat by newborn synoviolin knockout in syvn1 cKO: db / db mice. Black arrows indicate subcutaneous fat.
  • FIG. 4 is a photograph showing the effect of synoviolin gene suppression on the induction of adipocyte differentiation in the 3T3-L1 cell line.
  • ⁇ Differentiated fat cells
  • ⁇ lipid droplets that are not normal fat cells.
  • FIG. 5A shows the results of PCR showing that a fat-specific synoviolin knockout mouse could be produced.
  • FIG. 5B is a graph showing the survival rate of fat-specific synoviolin knockout mice.
  • aP2-Cre; Syvn1 flox / flox mice and control mice were subjected to survival analysis, and the Kaplan-Meier curve shows the survival rate with respect to age.
  • FIG. 5C is a graph showing changes in body weight of fat-specific synoviolin knockout mice.
  • Adipose KO aP2-Cre; Syvn1 flox / flox (fat-specific knockout) mouse.
  • Contorol Syvn1 flox / flox and Syvn1 flox / + mice.
  • Adipose heterozygous aP2-Cre; Syvn1 flox / + mouse. Results are expressed as mean ⁇ SD. * P ⁇ 0.01: Comparison between aP2-Cre; Syvn1 flox / flox mice and other mice was performed by ANOVA post hoc test (Tukey-Kramer method).
  • FIG. 5D is a photograph of a 19-day-old control mouse and aP2-Cre; Syvn1 flox / flox (fat-specific knockout) mouse.
  • FIG. 5E is a photograph of abdominal subcutaneous fat in the mouse of FIG. 5D.
  • White arrows indicate subcutaneous fat.
  • FIG. 5F is a photograph of the epididymis in the mouse of FIG. 5D.
  • FIG. 5G is a photograph of dorsal subcutaneous fat in the mouse of FIG. 5D. aP2-Cre; decrease of WAT in Syvn1 flox / flox mice (BAT does not decrease).
  • FIG. 6A is a graph showing the influence of the LS-102 treatment on the weight change rate.
  • C57BL / 6J mice were treated daily by intraperitoneal injection of DMSO or 50 mg / kg LS-102, and body weight was measured. Results are shown as mean ⁇ SD. * P ⁇ 0.05: Comparison between C57BL / 6J DMSO-treated mice and C57BL / 6J LS-102-treated mice was performed by Student ’s t test.
  • FIG. 6A is a graph showing the influence of the LS-102 treatment on the weight change rate.
  • C57BL / 6J mice were treated daily by intraperitoneal injection of DMSO or 50 mg / kg LS-102, and body weight was measured. Results are shown as mean ⁇ SD.
  • * P ⁇ 0.05 Comparison between C57BL / 6J DMSO-treated mice and C57BL / 6J LS-102-treated mice was performed by Student ’s t test.
  • FIG. 6B is a graph showing the effect of LS-102 treatment on food intake. The average daily food intake was measured. The results are shown as mean ⁇ SD and the Student ’s test was performed.
  • FIG. 6D is a photograph showing that fat droplets are reduced by LS-102 treatment.
  • Fig. 7 shows Wester blot (left figure) and image analysis of the expression level of synoviolin protein in syvn1WT (WT), syvn1 cKO (KO), ob / + mouse, and subcutaneous fat white adipose tissue of ob / ob mouse. It is a graph (right figure) which shows the degree of the expression level based on.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for screening a substance having an anti-obesity action.
  • This method includes a step of bringing a test substance into contact with a Synoviolin gene-expressing cell, and a step of confirming the influence of the test substance on the expression of Synoviolin gene or the activity of Synoviolin protein.
  • the screening method for substances having anti-obesity action is a method for searching for candidates for substances having anti-obesity action.
  • Body weight control means that body weight is changed significantly before and after treatment.
  • the body weight regulating action acts through, for example, adipose tissue volume regulation and adipocyte differentiation induction regulation.
  • accession number in the public gene database Genbank of human synoviolin gene is AB024690 (SEQ ID NO: 1).
  • the base sequence of the gene encoding Synoviolin in human is shown in SEQ ID NO: 1. Even proteins other than the protein encoded by the nucleotide sequence have high homology (usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more). And the protein which has the function which Synoviolin protein has is contained in Synoviolin of this invention.
  • “Synoviolin gene” in the present invention includes, for example, an endogenous gene (such as a homolog of a human synoviolin gene) in another organism corresponding to the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the endogenous DNA of other organisms corresponding to the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 generally has high homology with the DNA described in SEQ ID NO: 1.
  • High homology means 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95% or more, or 96%, 97%, 98% or 99% or more).
  • mBLAST algorithm Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7 ) Can be determined.
  • stringent conditions for example, “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.”, “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” More stringent conditions include “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”, “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” and “0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” Can do.
  • synoviolin protein (gene)
  • the “Synoviolin” of the present invention can be prepared not only as a natural protein but also as a recombinant protein using a gene recombination technique.
  • the natural protein can be prepared by, for example, a method using affinity chromatography using an antibody against synoviolin protein against an extract of a cell (tissue) considered to express synoviolin protein.
  • the recombinant protein can be prepared by culturing cells transformed with DNA encoding synoviolin protein.
  • the “Synoviolin protein” of the present invention is suitably used, for example, in the screening method described below.
  • “expression” includes “transcription” from a gene or “translation” into a polypeptide and “degradation inhibition” of a protein. “Expression of Synoviolin protein” means that transcription and translation of a gene encoding Synoviolin protein occurs, or Synoviolin protein is generated by transcription and translation thereof.
  • “inhibiting the expression and / or function of Synoviolin protein” refers to reducing or eliminating the amount, function or activity of the wild-type Synoviolin gene or protein compared to the amount, function or activity of the wild-type Synoviolin gene or protein.
  • the “inhibition” includes both inhibition of both function and expression, and inhibition of either one.
  • ubiquitination is achieved by repeating a cascade reaction of enzymes such as ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2), and ubiquitin ligase (E3), so that the ubiquitin molecule is transferred to the substrate protein.
  • enzymes such as ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2), and ubiquitin ligase (E3), so that the ubiquitin molecule is transferred to the substrate protein.
  • a method for confirming the influence of the test substance on the expression of the synoviolin gene or the influence of the activity of the synoviolin protein for example, a method disclosed in International Publication WO 2006-137514 may be used as appropriate.
  • the test compound is brought into contact with cells expressing the Synoviolin gene.
  • “cells” used in this case are cells derived from humans, mice, or rats. It is also possible to use microbial cells such as Escherichia coli and yeast transformed to express Synoviolin.
  • a cell expressing a synoviolin gene a cell expressing an endogenous synoviolin gene or a cell into which an exogenous synoviolin gene is introduced and expressing the gene can be used.
  • a cell in which an exogenous synoviolin gene is expressed can be usually prepared by introducing an expression vector into which a synoviolin gene has been inserted into a host cell.
  • the expression vector can be prepared by general genetic engineering techniques.
  • test compound used in this method is not particularly limited.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides and other single compounds compound libraries, gene library expression products, cell extraction Product, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract and the like.
  • the “contact” of the test compound to the cell expressing the synoviolin gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of the cell expressing the synoviolin gene, but is not limited to this method.
  • the test compound is a protein or the like
  • the “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
  • the expression level of the synoviolin gene is then measured.
  • gene expression includes both transcription and translation.
  • the gene expression level can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • mRNA is extracted from cells expressing the Synoviolin gene according to a standard method, and the transcription amount of the gene is measured by performing Northern hybridization method, RT-PCR method, DNA array method, etc. using this mRNA as a template. be able to.
  • the amount of translation of the gene can be measured by collecting a protein fraction from cells expressing the synoviolin gene and detecting the expression of synoviolin protein by electrophoresis such as SDS-PAGE.
  • it is also possible to measure the translation amount of a gene by detecting the expression of the protein by carrying out Western blotting using an antibody against Synoviolin protein.
  • the antibody used for the detection of synoviolin protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • a compound that reduces the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • the compound that lowers becomes a drug for anti-obesity.
  • a compound that reduces (suppresses) the activity of the protein is selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • a compound that lowers (suppresses) becomes a drug for cancer treatment.
  • An example of the effect of synoviolin protein on the activity is the effect of synoviolin protein on self-ubiquitination.
  • JP 2008-74753 A Patent No. 5008932 discloses plumbagin (2-methyl-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone) and quercetin (2- (3 , 4-dihydroxyphenyl) -3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyrano-4-one) is disclosed to inhibit the self-ubiquitination of synoviolin protein.
  • Synoviolin self-ubiquitination means ubiquitination of a protein caused by interaction between synoviolins, as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-74753. Protein ubiquitination occurs by synoviolin binding to the protein.
  • MBP-Syvn1 ⁇ TM-His in Add to in vitro self-ubiquitination reaction solution and react at 37 ° C for 30 minutes. After the reaction, ubiquitinated protein is detected by Western blotting using an anti-HA antibody.
  • MBP-Syvn1 ⁇ TM-His means synoviolin deficient in the transmembrane region in which maltose binding protein (MBP) is fused on the N-terminal side and His tag is fused on the C-terminal side.
  • the anti-obesity action is a fat tissue mass reduction action or an adipocyte differentiation induction inhibitory action. That is, in this embodiment, a compound having an effect of reducing the amount of adipose tissue or suppressing the induction of adipocyte differentiation can be screened.
  • the second aspect of the present invention relates to an anti-obesity drug.
  • This anti-obesity drug contains synoviolin siRNA, synoviolin decoy nucleic acid or synoviolin antisense nucleic acid as an active ingredient.
  • This anti-obesity agent has, for example, an adipose tissue amount reducing action or an adipocyte differentiation induction inhibiting action.
  • the active ingredient is that of siRNA having synoviolin.
  • a nucleic acid having an inhibitory action due to the RNAi effect is generally also called siRNA or shRNA.
  • RNAi is a short double-stranded RNA (hereinafter abbreviated as “dsRNA”) consisting of a sense RNA consisting of a sequence homologous to the mRNA of the target gene and an antisense RNA consisting of a complementary sequence to the cells. This is a phenomenon that induces destruction by specifically and selectively binding to the target gene mRNA, and efficiently inhibiting (suppressing) the expression of the target gene by cleaving the target gene.
  • dsRNA short double-stranded RNA
  • RNAi when dsRNA is introduced into a cell, expression of a gene having a sequence homologous to that RNA is suppressed (knocked down). Since RNAi can suppress the expression of target genes in this way, it can be used as a simple gene knockout method instead of the conventional complicated and low-efficiency gene disruption method using homologous recombination, or a method applicable to gene therapy. It is attracting attention as.
  • the RNA used for RNAi is not necessarily completely identical to the Synoviolin gene or a partial region of the gene, but preferably has perfect homology.
  • siRNA can be designed as follows.
  • (a) There is no particular limitation as long as it is a gene encoding Synoviolin, and any region can be a target candidate.
  • any region can be a target candidate.
  • an arbitrary region having GenBank accession number AB024690 (SEQ ID NO: 1) can be used as a candidate.
  • (b) A sequence beginning with AA is selected from the selected region, and the length of the sequence is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the GC content of the sequence should be selected, for example, 40-60%.
  • Synoviolin siRNA are one base sequence selected from SEQ ID NO: 2 to 6, base sequence complementary to these base sequences, or substitution or insertion of one or two bases from any of these base sequences , RNA having a deleted or added base sequence.
  • the RNA having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 is a Synoviolin siRNA that Izumi T, et al., Arthritis Rheum. 2009; 60 (1): 63-72., EMBO, Yamasaki S, et al., EMBO J. 2007; 26 (1): 113-22.
  • RNA having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 is Synoviolin siRNA, as disclosed in WO 2005/074988 using experiments.
  • RNA having a base sequence in which one or two bases have been substituted, inserted, deleted or added from any of these base sequences refers to one base sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 6 and these bases RNA having a base sequence in which one or two bases are substituted, inserted, deleted or added from any base sequence of the base sequence complementary to the sequence. Any one kind of substitution, insertion, deletion or addition may occur, or two or more may occur.
  • WO2005-018675 and WO2005 / 074988 disclose siRNAs for genes encoding synoviolin and siRNA screening and evaluation methods for genes encoding synoviolin. Also in the present invention, siRNA against a gene encoding synoviolin can be evaluated by appropriately using the method disclosed in this publication.
  • the active ingredient is substituted, inserted, deleted or added with one or two bases from the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • Synoviolin decoy nucleic acid having a base sequence The nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 is a Synoviolin decoy nucleic acid, for example, using Examples in Tsuchimochi K, et al., Mol Cell Biol. 2005; 25 (16): 7344-56. As shown.
  • Synoviolin decoy nucleic acids and methods for confirming them are known as disclosed in, for example, International Publication WO 2005-093067 and International Publication WO 2005-074988.
  • the active ingredient is a synoviolin antisense nucleic acid.
  • Methods for screening for Synoviolin antisense nucleic acid and Synoviolin antisense nucleic acid are disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-155204, Table No. 2006-137514, and Table No. 2005-074988.
  • Synoviolin antisense nucleic acid means a nucleic acid having a sequence complementary to the synoviolin gene and capable of inhibiting the expression of the synoviolin gene by hybridizing to the gene.
  • An antisense nucleic acid can be prepared by a synthetic chemical method or the like by a nucleic acid compound complementary to a partial base sequence of a gene encoding synoviolin.
  • a screening test using the gene expression level as an index may be performed.
  • said antisense nucleic acid compound for example, the expression of Synoviolin can be suppressed to at least 50% or less as compared with the control.
  • antisense nucleic acids inhibit the expression of target genes by inhibiting various processes such as transcription, splicing or translation (Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Kenkyu 2 Lecture and Expression of Nucleic Acid IV Genes, Japan Biochemicals) Society, Tokyo Chemistry, 1993, 319-347.).
  • the antisense nucleic acid used in the present invention may inhibit the expression and / or function of the synoviolin gene by any of the actions described above.
  • an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the Synoviolin gene mRNA is designed, it is considered effective in inhibiting gene translation.
  • a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
  • the nucleic acid containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region is included in the antisense nucleic acid used in the present invention.
  • the antisense nucleic acid used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal (cell) by using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous synoviolin gene or a part thereof possessed by the animal (cell) to be transformed. However, as long as the gene expression can be effectively suppressed, May not be complementary.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense nucleic acid is preferably at least 15 bases and less than 25 bases. It is not necessarily limited to this length, and may be, for example, 100 bases or more, or 500 bases or more.
  • ribozymes refers to an RNA molecule having catalytic activity. Although ribozymes have various activities, research focusing on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. Ribozymes include group I introns and M1 contained in RNase P.
  • RNA Some have a size of 400 nucleotides or more, such as RNA, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1990, 35, 2191.).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves 3 ′ of C15 in the sequence G13U14C15, and base pairing between U14 and A9 is important for its activity.
  • C15, A15 or U15 it has been shown that it can be cleaved (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.).
  • a ribozyme whose substrate binding site is complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA (Koizumi, M.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention.
  • This ribozyme is found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot virus satellite RNA (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). It has been shown that target-specific RNA-cleaving ribozymes can also be produced from hairpin ribozymes (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751., Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1992, 30, 112.). Thus, the expression of the gene can be inhibited by specifically cleaving the synoviolin gene transcript in the present invention using a ribozyme.
  • RNA interference using double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence. interference, hereinafter abbreviated as “RNAi”).
  • the therapeutic agent of the present invention can be administered either orally or parenterally.
  • parenteral administration pulmonary dosage forms (for example, those using a nephriser etc.), nasal dosage forms, transdermal dosage forms (for example, ointments, creams), injection dosage forms and the like can be mentioned.
  • an injection type it can be administered systemically or locally by intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method is appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • the effective dose is 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably 1 to 10 ⁇ g per kg body weight at a time.
  • the therapeutic agent is not limited to these doses.
  • an example of the dosage of the nucleic acid is 0.01 to 10 ⁇ g / ml, preferably 0.1 to 1 ⁇ g / ml.
  • the therapeutic agent of the present invention can be formulated according to a conventional method and may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • Such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl.
  • acceptable surfactants include additives.
  • a purified ER stress inducer is dissolved in a solvent (eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.), and Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. are added thereto.
  • a solvent eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. are added thereto.
  • it may be lyophilized to obtain a dosage form that dissolves before use.
  • sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
  • the present invention has been found to be effective in the treatment of obesity by producing knockout mice of the synoviolin gene, thereby inhibiting the expression of synoviolin or inhibiting the activity of synoviolin.
  • Synoviolin gene knockout mice mean that the synoviolin gene region has been artificially altered to inhibit its normal expression, and as a result, synoviolin is not functioning normally in the body. To do.
  • synoviolin gene can be partially or wholly altered or deleted.
  • all refers to the region from the 5 ′ end of exon 1 to the 3 ′ end of the last exon of Synoviolin genomic DNA.
  • part means a part of this region and a length necessary for inhibiting normal expression of the synoviolin gene.
  • modification means that the nucleotide sequence of the target region in genomic DNA is altered to another nucleotide sequence by replacing, deleting, inserting, and / or transposing single or multiple nucleotides. .
  • a knockout animal in which a part or all of the Synoviolin gene is altered or deleted can be produced by a known method. For example, it can be prepared using a gene targeting method as described in the Examples below. In this method, normal expression of Synoviolin can be inhibited by substituting a region containing at least the start codon of exon 1 of Synoviolin gene with another base sequence by homologous recombination. Moreover, the knockout animal used for the screening method of the present invention includes not only the knockout animal produced by the same method but also its offspring.
  • the animal that is the target of the knockout animal of the present invention is a non-human animal and is not particularly limited.
  • mammals such as cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are exemplified.
  • rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, and rats are preferred for use as experimental animals, of which rodents are more preferred, and many inbred strains have been produced.
  • mice and rats are particularly preferable.
  • a part of the Synoviolin gene of the target animal is isolated.
  • a synoviolin gene is screened from a mouse genomic DNA library.
  • genomic DNA clone Using the obtained genomic DNA clone, a targeting vector for homologous recombination is constructed.
  • the genomic DNA clone need not be the full length of the gene, but only the region necessary for disrupting the synoviolin gene and suppressing the expression of synoviolin.
  • a targeting vector can be prepared by a known method. For example, using a commercially available plasmid as a backbone, each fragment such as the genomic DNA clone, a marker for positive selection, and a marker for negative selection is appropriately linked. Can be produced.
  • the targeting vector prepared by the above method is introduced into a cell having an individual forming ability (differentiating totipotency) such as a fertilized egg, early embryo, or embryonic stem cell (ES cell) by electroporation, etc.
  • a cell having an individual forming ability such as a fertilized egg, early embryo, or embryonic stem cell (ES cell) by electroporation, etc.
  • Cells that have undergone homologous recombination are selected. Sorting can be done using drugs by a positive-negative selection method. After selection, the cells in which the desired homologous recombination has occurred are confirmed by Southern blotting or PCR.
  • the cells finally confirmed to have the desired homologous recombination are introduced into 8-cell embryos or blastocysts (blast cysts) collected from the oviduct or uterus during pregnancy.
  • the above 8-cell embryo or blastocyst is transferred to a temporary parent according to a conventional method.
  • a germline chimeric animal preferably male
  • a wild type animal preferably female
  • the first generation (F1) is obtained on the homologous chromosome.
  • a heterozygote can be obtained in which one of the synv1 genes is disrupted by homologous recombination or can be deleted under certain conditions or in a site-specific manner.
  • F2 second generation
  • both synv1 genes on the homologous chromosome are disrupted, or can be deleted under certain conditions or site-specifically. That is, the synv1 knockout animal of the present invention can be obtained.
  • Homozygotes can be identified by cutting a part of the body (for example, the tail), extracting the DNA, and examining the genotype by Southern blotting or PCR.
  • FIG. 1A shows a design diagram of the gene targeting vector used for the production of the Synoviolin knockout mouse (syvn1 cKO mouse) of this Example.
  • a normal synoviolin gene Wild allele
  • a targeting vector for creating Synoviolin knockout mice and an allele that has undergone homologous recombination (Targeted) allele
  • an allele introduced with a loxP sequence Flox Allele
  • an allele from which loxP-Exon2 to 14-loxP have been removed Deleted Allele
  • the gene region of 14.8 kb which is the region downstream of exon 16 from the upstream of exon 1 of the mouse synoviolin gene, was used for the construction of the targeting vector.
  • a Neo resistance gene sandwiched between FRT sequences was inserted between exon 1 and exon 2.
  • a loxP sequence was introduced upstream of exon 2 and downstream of exon 14.
  • the above targeting vector was introduced into ES cells. Clones having the allele in which the desired homologous recombination occurred were selected by confirming the removal of the loxP-exon-loxP sequence by Cre treatment and the removal of FRT-neomycin-FRT by FLP treatment by the length of the PCR product. .
  • ES cell clone in which homologous recombination occurred was introduced into a mouse embryo according to a known method (for example, EMBO J 16: 1850-1857) to obtain a chimeric mouse. Furthermore, this chimeric mouse was crossed with a wild type C57BL / 6 mouse to obtain a mouse from which the neomycin sequence was removed.
  • loxP sequence between exon and Long arm incorporated in the targeting vector may be deleted during homologous recombination, its presence was confirmed by PCR.
  • mice The obtained neomycin-removed mice were crossed with CAG-Cre-ER mice to obtain CAG-Cre-ER; syvn1 flox / flox mice.
  • Example 1 Postnatal Synoviolin Knockout Phenotype
  • CAG-Cre-ER Synoviolin knockout mice
  • Tamoxifen Tamoxifen
  • CAG-CreER (+) syvn1 flox / flox loxP-exon-loxP Induced
  • CAG-CreER (+) syvn1 flox / flox C57BL / 6J
  • CAG-CreER (-) syvn1 flox / flox ) solvent control, tamoxifen administration
  • syvn1 flox / flox mice 7 to 8 weeks after birth, C57BL / 6J mice, homozygous syvn1 flox / flox mice lacking the Cre transgene (syvn1 WT) and CAG-Cre-ER; syvn1 flox / flox mice (syvn1 cKO ), 125 mg / kg tamoxifen solution per day was administered for 5 consecutive days.
  • Synoviolin knocked out by tamoxifen administration was confirmed by synoviolin PCR on the genome, real-time PCR of synoviolin mRNA, and Western blotting of synoviolin protein (FIGS. 1B to 1D).
  • the syvn1 flox / flox mouse is the control.
  • Syvn1 cKO mice could not survive, and all of them died by 21 days after Tam administration. On the other hand, C57BL / 6J mice and syvn1 WT mice were alive (FIG. 1E).
  • Example 2-1 Change in body weight by synoviolin knockout
  • 7-8 weeks after birth 125 mg / kg per day in the abdominal cavity of C57BL / 6J mice, homozygous syvn1 flox / flox mice (syvn1 WT) and CAG-Cre; syvn1 flox / flox mice (syvn1 cKO) Tamoxifen (Tam) solution or vehicle as control was administered for 5 consecutive days.
  • FIG. 2A From FIG.
  • Example 2-2 Effect on food intake by Synoviolin knockout
  • Daily food intake was measured to determine whether the weight loss in the syvn1 cKO mice was due to decreased food intake.
  • FIG. 2B shows the average food intake per day after 1 day and 11 days after tamoxifen treatment. From FIG. 2B, it was found that there was no difference in food intake between syvn1 cKO mice and control mice. These results suggested that weight loss in syvn1 cKO mice was not due to eating disorders or mere weakness.
  • Example 2-3 Effects on nutrition, liver and kidney function by Synoviolin knockout
  • biomarkers for nutrition, liver and kidney function including total protein, albumin, blood glucose, triglycerides, total cholesterol, AST, ALT, BUN, and Cr, were examined by serum biochemistry experiments. As shown in Table 1 below, the results were not significantly different between the two groups.
  • Example 2-4 Effect on adipose tissue by Synoviolin knockout
  • adipose tissue was analyzed with the naked eye and microscope in syvn1 cKO mice. Laparotomy was performed on syvn1 WT mice (left side) and syvn1 cKO mice (right side) 16 days after tamoxifen administration, and adipose tissue was observed. The results are shown in FIGS. 2C and D. From FIG. 2C, there was a considerable amount of food residue in the intestine of syvn1 cKO mice, and no histological abnormality was observed. It was also found that subcutaneous fat decreased in syvn1 cKO mice. Moreover, from FIG. 2D, it was found that white adipose tissue (WAT) was significantly reduced in syvn1 cKO mice. In particular, white adipose tissue of the epididymis was not observed.
  • WAT white adipos
  • Example 2-5 Effect on lipid droplets by Synoviolin knockout
  • visceral adipose tissues of syvn1 WT mice and syvn1 cKO mice were stained with hematoxylin and eosin and observed. Histological analysis was performed using the adipose tissue barely remaining in the syvn1 cKO mouse. The result is shown in FIG. 2E. From FIG. 2E, it was found that lipid droplets decreased in syvn1 cKO. This decrease in lipid droplets was observed only in syvn1 cKO mice, but not in syvn1 WT mice.
  • FIG. 2F is a photomicrograph showing the appearance of lipid droplets of the epididymis (upper figure) and subcutaneous fat (lower figure) in a newborn Synoviolin conditional knockout mouse. Black arrows indicate fat droplets. The magnification is 400 times.
  • mice Using obese mice, we examined whether knockout of Synoviolin induces weight loss in these mice under conditions of constant high-fat diet intake.
  • ob / ob abnormal leptin gene
  • db / db abnormal leptin receptor gene mice
  • mice both obesity, diabetes, metabolic syndrome mice
  • mice were bred with Synoviolin conditional knockout mice using the above-mentioned general-purpose models and the like, and mice that were homozygous for the ob or db gene and the synoviolin gene, respectively, that were completely knocked out were created.
  • mice The genotypes of these mice are as follows: CAG-Cre-ER; syvn1 flox / flox : ob / ob mouse (syvn1 cKO: ob / ob mouse), syvn1 flox / flox : ob / ob mouse (syvn1 WT: ob / ob mouse), CAG-Cre-ER; syvn1 flox / flox : db / db mouse (syvn1 cKO: db / db mouse) and syvn1 flox / flox : db / db mouse (syvn1 WT: db / db mouse).
  • CAG-Cre-ER syvn1 flox / flox : ob / ob mouse and CAG-Cre-ER; syvn1 flox / flox : db / db syvn1 flox / flox mice were bred with ob / + and db / + mice.
  • CAG-Cre-ER syvn1 flox / + : ob / + mice were mated by secondary mating, and CAG-Cre-ER; syvn1 flox / flox : ob / ob mice (syvn1 cKO: ob / ob) and syvn1 flox / flox : ob / ob mice (syvn1 WT: ob / ob) were prepared.
  • CAG-Cre-ER syvn1 flox / + : db / + mice are mated by secondary mating
  • CAG-Cre-ER syvn1 flox / flox : db / db mice
  • syvn1 cKO db / db
  • syvn1 flox / flox : db / db mice syvn1 WT: db / db mice
  • the body weight of syvn1 WT: ob / ob and syvn1 WT: db / db mice increased to about 130% after tamoxifen administration.
  • the body weight of syvn1 cKO: ob / ob and syvn1 cKO: db / db mice was significantly reduced to about half of the body weight at the start of the study. In other words, the newborn Synoviolin knockout decreased the weight of ob / ob and db / db mice.
  • FIGS. 3B and 3D show that fat volume is reduced in syvn1 cKO: ob / ob and syvn1 cKO: db / db mice compared to syvn1 cKO: ob / ob mice and syvn1 WT: db / db mice.
  • the newborn Synoviolin knockout decreased white fat cells in ob / ob and db / db mice.
  • FIG. 2B shows that obesity induced by inactivation of leptin signals and / or high energy intake at the central nervous system level.
  • Suggesting that weight loss due to Synoviolin deficiency is dominant tolerance.
  • synoviolin deficiency is thought not to affect the central nervous system but to affect energy consumption in peripheral adipocytes.
  • 3T3-L1 cells which are mouse fat precursor cells, were cultured for 3 days after reaching confluent in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; High Glucose) containing 10% FBS (fetal bovine serum). Differentiation was induced by adding 500 ⁇ M IBMX (isobutyl-methylxanthine), 1 ⁇ M dexamethasone, and 5 ⁇ g / mL Insulin. Simultaneously, 10 ⁇ M LS-102 (inhibitor of synoviolin ubiquitination activity) or DMSO was added.
  • IBMX isobutyl-methylxanthine
  • 1 ⁇ M dexamethasone 1 ⁇ M dexamethasone
  • siRNA 200 pmol of siRNA Syvn1770 (sense strand consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2) was introduced by Lipofectamine 2000 2 days before differentiation induction. SEQ ID NO: 5'-GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3 '
  • the cultured 3T3-L1 cells were washed with PBS ( ⁇ ) (Phosphate Buffered Saline solution excluding magnesium and calcium) and then fixed with 10% formalin.
  • the plate was washed with PBS ( ⁇ ) and replaced with 60% Isopropanol.
  • the cells were stained with 18 mg / mL Oil Red O (solvent: Isopropanol) for 20 minutes, washed with 60% Isopropanol and PBS ( ⁇ ), and observed with a microscope. The results are shown in FIG.
  • FIG. 4 suggests that the cells in which the activity of the synoviolin gene was inhibited by siRNA had fewer differentiated adipocytes than the control, and differentiation was suppressed. In addition, lipid droplets that were not normal ring-shaped adipocytes were observed. From the above results, it was shown that suppression of synoviolin gene expression and suppression of synoviolin protein self-ubiquitination are effective in the prevention and treatment of obesity.
  • Example 5 Fat reduction in mice knocked out of Synoviolin specifically for fat
  • aP2-Cre a fat-specific synoviolin knockout mouse
  • Syvn1 flox / flox mouse a fat-specific synoviolin knockout mouse
  • aP2 -Cre mouse fatty acid binding protein 4 (aP2) -Cre mouse
  • Example 7 Applicability of Synoviolin as a biomarker
  • body weight and white adipocytes were decreased by knocking out synoviolin in ob / ob mice, which are obese mice.
  • Synoviolin could be used as a biomarker for obesity.
  • Cell extracts obtained from white adipose tissue (WAT) in the subcutaneous fat of syvn1 WT mice, syvn1 cKO mice, ob / + mice, and ob / ob mice were prepared.
  • Western blotting was performed using an anti-sinoviolin (SYVN1) antibody and an anti-beta-actin antibody (for internal standard).
  • FIG. Figure 7 shows ob / + and ob / ob 1 is a Wester blot (left figure) showing the expression of Synoviolin protein in the subcutaneous fat white adipose tissue of mice and a graph (right figure) showing the degree of expression based on image analysis.
  • syvn1 Synoviolin protein expression was not confirmed in cKO mice.
  • ob / ob mice showed increased expression of Synoviolin protein compared to syvn1 WT mice. Since the expression level of Synoviolin was increased in obese mice, Synoviolin could be used as a biomarker.
  • the screening method of the present invention can select a pharmaceutical composition effective for the prevention or treatment of obesity by using as an index suppression of synoviolin function.
  • the anti-obesity drug of the present invention can suppress adipocyte differentiation without restricting food intake by regulating the expression of Synoviolin or self-ubiquitination of Synoviolin protein, and adjusts the amount of adipose tissue and body weight. Yes, it is useful as a new type of anti-obesity drug, which is different from conventional appetite suppressants and digestion and absorption inhibitors.
  • Synthetic RNA Sequence number 3 Synthetic RNA Sequence number 4: Synthetic RNA Sequence number 5: Synthetic RNA Sequence number 6: Synthetic RNA Sequence number 7: Synthetic RNA

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Abstract

【課題】抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法及び抗肥満薬の提供。 【解決手段】被験物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させる工程，及び前記被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する工程，を含むスクリーニング方法。抗肥満作用の例は，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用である。シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸を有効成分として含む抗肥満薬。

Description

肥満症の予防及び治療作用を有する化合物のスクリーニング方法
　本発明は，肥満症の予防及び治療作用を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
　肥満は，脂肪組織の過剰な蓄積を引き起こし，糖尿病，循環器系疾患，うつ病などの様々な健康上のリスクを高める（非特許文献１参照）。この問題は，現代社会において非常に大きな経済的及び社会的損失を生じさせる。脂肪細胞代謝の分子メカニズムは広範囲に研究されている（非特許文献２及び３参照）。
　シノビオリンは，リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見されたタンパク質である（特許文献１参照）。そして，遺伝子改変動物を用いた研究により，シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。
　タンパク質構造予測システムにより，シノビオリンはリングフィンガー（RING finger）モチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のユビキチン化に重要な役割を果たすＥ３ユビキチンライゲースという酵素に多く見出されている。そして，シオビオリンがＥ３ユビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ユビキチン化活性を有することが証明されている（特許文献１参照）。
国際公開第０２／０５２００７号パンフレット
Wickelgren, I. (1998). Obesity: how big aproblem? Science 280, 1364-1367. Lefterova, M.I., and Lazar, M.A. (2009).New developments in adipogenesis. Trends Endocrinol Metab 20, 107-114. Rosen, E.D., and MacDougald, O.A. (2006).Adipocyte differentiation from the inside out. Nat Rev Mol Cell Biol 7,885-896.
　肥満症の予防及び治療作用を有する物質又は候補化合物をスクリーニングする方法の開発が望まれている。
　本発明者は，シノビオリン遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを用いて，シノビオリン遺伝子を破壊すると，対象の体重減少及び脂肪細胞の分化誘導阻害を惹き起こすという実施例に基づく知見を得た。このため，本発明者は，シノビオリンの発現を阻害するか，シノビオリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることで，脂肪細胞分化誘導調節作用，脂肪組織量調節作用及び体重調節作用を有する化合物をスクリーニングできることを見出し，本発明を完成させた。
　本発明の第１の側面は，抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。この方法は，被験物質をシノビオリン遺伝子発現細胞と接触させる工程と，被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する工程と，を含む。シノビオリン遺伝子の発現への影響の例は，シノビオリンｍＲＮＡ量への影響や，シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響である。抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法とは，抗肥満作用を有する物質の候補を探す方法である。
　第１の側面の好ましい態様は，抗肥満作用が，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用である。すなわち，この態様では，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用のある化合物をスクリーニングすることができる。
　本発明の第２の側面は，抗肥満薬に関する。この抗肥満薬は，シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸を有効成分として含む。この抗肥満薬は，例えば，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用を有する。
　本発明の第２の側面のある態様は，有効成分がシノビオリンのｓｉＲＮＡのものである。シノビオリンのｓｉＲＮＡの例は，配列番号２～６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。配列番号２～４に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，Ｉｚｕｍｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａl．,　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ. ２００９; ６０(１):６３－７２.，Ｙａｍａｓａｋｉ　Ｓ,　ｅｔ　ａｌ．, ＥＭＢＯ　Ｊ.　２００７;　２６(１):　１１３－２２.に実験を用いて開示されるとおり公知である。配列番号５及び６に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットに実験を用いて開示されるとおり公知である。
　配列番号２：５’－ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ－３’
　配列番号３：５’－ＧＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＧ－３’
　配列番号４：５’－ＧＧＵＵＣＵＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＣＣ－３’
　配列番号５：５’－ＣＧＵＵＣＣＵＧＧＵＡＣＧＣＣＧＵＣＡ－３’
　配列番号６：５’－ＧＵＵＵＴＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡ－３’
　「これらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡ」は，配列番号２～６から選択される一の塩基配列及びこれらの塩基配列と相補の塩基配列のいずれかの塩基配列から，１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。置換，挿入，欠失又は付加は，いずれか１種類が生じていても良いし，２つ以上が生じていても良い。
　本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である。配列番号７で示される塩基配列を有する核酸がシノビオリンのデコイ核酸であることは，例えば，Tsuchimochi　K,　et　al.,　Mol　Cell　Biol.　2005;25(16):7344-56.に実施例を用いて示されているとおり公知である。
配列番号７：５’－ＡＵＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡＡＧＡ－３’
　本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，シノビオリンのアンチセンス核酸である。
　本発明によって，肥満症の予防及び治療作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供することができる。
図１Ａは，シノビオリンコンディショナルノックアウトマウス（syvn1 cKO）の作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図である。エキソンは黒色の箱，黒色矢印はネオマイシン(Neo)，白抜き矢印はジフテリア毒素遺伝子サブユニットＡを示す。白抜き三角形はloxP部位を示し，黒丸はFRT部位を示す。内在性シノビオリン遺伝子座とターゲッティングベクターとの間で相同遺伝子組換えを行うことで，エキソン2～12の上流及び下流に隣接してloxPが導入され，更にネオマイシンカセットの上流及び下流に隣接してFRTが導入された染色体が得られる。「Flox Allele」には，ネオマイシンを除去した後の，loxPが導入されたアリルを示す。欠損アリルは，タモキシフェン(Tam)によって誘導される，Creリコンビナーゼを介して除去されたものを示す。 図１Ｂは，タモキシフェン処理後の，(CAG)-Cre-ER;syvn1+/+マウス，(CAG)-Cre-ER;syvn1flox/+マウス及び(CAG)-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス由来のゲノムDNAをPCR解析した写真である。野生型アリルは，70bpのフラグメント（下側のバンド）として検出され，標的アリルは，100bpのフラグメント（上側のバンド）として検出される。 図１Ｃは，タモキシフェン処理後のsyvn1flox/floxマウス(syvn1 WT)及び(CAG)-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス(syvn1 cKO)由来の脂肪細胞をリアルタイムPCR解析したグラフである。 図１Ｄは，syvn1 WT mice及びsyvn1 cKO mice由来の尾部蛋白質の，抗シノビオリン抗体を用いたウエスタンブロットである。 図１Ｅは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける生存割合を示すグラフである。 図２Ａは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける体重変化を示すグラフである。 図２Ｂは，シノビオリンノックアウトマウス（雄及び雌）の食物摂取量を示すグラフである。 図２Ｃは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける皮下脂肪の様子を示す写真である。白色矢印は皮下脂肪を示す。 図２Ｄは，syvn1 WT(左側)及びsyvn1 cKO(右側)の精巣上体脂肪組織を示す写真である。 図２Ｅは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける内臓脂肪の脂肪滴の様子を示す顕微鏡写真である。黒色矢印は脂肪滴を示す。倍率は400倍である。 図２Ｆは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける精巣上体（上図）及び皮下脂肪（下図）の脂肪滴の様子を示す顕微鏡写真である。黒色矢印は脂肪滴を示す。倍率は400倍である。 図３Ａは，syvn1 cKO:ob/obマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる体重変化を示すグラフである。 図３Ｂは，syvn1 cKO:ob/obマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる皮下脂肪の様子を示す写真である。黒矢印は皮下脂肪を示す。 図３Ｃは，syvn1 cKO:db/dbマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる体重変化を示すグラフである。 図３Ｄは，syvn1 cKO:db/dbマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる皮下脂肪の様子を示す写真である。黒矢印は皮下脂肪を示す。 図４は，３Ｔ３－Ｌ１細胞株の脂肪細胞分化誘導に対する，シノビオリン遺伝子抑制の影響を示す写真である。○：分化した脂肪細胞，□：正常な脂肪細胞でない脂肪滴。 図５Ａは，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスを作製できたことを示すPCRの結果である。aP2-Cre;Syvn1flox/flox（脂肪特異的ノックアウト）マウスとSyvn1flox/floxマウス（対照）のWAT及びBATから単離したゲノムDNAを増幅したPCR産物を常法のゲル電気泳動で分離した。 図５Ｂは，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスの生存率を示すグラフである。aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスと対照マウス（Syvn1flox/flox及びSyvn1flox/+マウス）生存分析を行ったものであり，カプラン・マイヤー曲線は日齢に対する生存率を示す。 図５Ｃは，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスの体重変化を示すグラフである。生後３日目から体重を測定した。Adipose KO：aP2-Cre;Syvn1flox/flox（脂肪特異的ノックアウト）マウス。Contorol：Syvn1flox/flox及びSyvn1flox/+マウス。Adipose heterozygous：aP2-Cre;Syvn1flox/+マウス。結果は，平均 ± SDで示す。* P < 0.01：aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスと他のマウスとの比較はANOVAのpost hoc検定（Tukey-Kramer法）で行った。 図５Ｄは，生後19日目の対照マウスとaP2-Cre;Syvn1flox/flox（脂肪特異的ノックアウト）マウスの写真である。 図５Ｅは，図５Ｄのマウスにおける腹部の皮下脂肪の写真である。白い矢印は皮下脂肪を示す。 図５Ｆは，図５Ｄのマウスにおける精巣上体の写真である。 図５Ｇは，図５Ｄのマウスにおける背部の皮下脂肪の写真である。aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスにおけるWATの減少（BATは減少しない）。 図５Ｈは，生後18日目の対照マウス（左）及びaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウス（右）における脂肪組織の顕微鏡写真である。倍率：400倍。スケールバー：50μm。黒矢印：脂肪滴。 図６Ａは，LS-102処理の体重変化率への影響を示すグラフである。C57BL/6JマウスにDMSO又は50 mg/kg LS-102を腹腔内注射する処理を毎日行い，体重を測定した。結果は平均値±SDで示した。*P < 0.05：C57BL/6J DMSO処理マウスとC57BL/6J LS-102処理マウスとの比較はStudent’s t検定で行った。 図６Ｂは，LS-102処理の食物摂取への影響を示すグラフである。一日の食物摂取の平均を測定した。結果は平均値±SDで示し，Student’s t検定を行った。 図６Ｃは，LS-102処理によって精巣上体の脂肪量の減少することを示す写真とグラフである。DMSO（左）又は50 mg/ kg LS-102（右）で57日間処理したC57BL/6Jマウスの精巣上体の脂肪組織である。結果は平均値±SDで示し，Student’s t検定を行った（n=4）。 図６Ｄは，LS-102処理によって脂肪滴が減少することを示す写真である。DMSO（左）及び50 mg/ kg LS-102（右）で処理されたC57BL/6Jマウスの精巣上体の脂肪組織をHEで染色した。倍率：400倍。スケールバー：50μm。黒い矢印：脂肪滴。 図７は，syvn1WT（WT），syvn1 cKO（KO），ob/+マウス，ob/obマウスの皮下脂肪白色脂肪組織におけるシノビオリンタンパク質の発現量を観察したウエスタブロット（左図），及ぶび画像解析に基づく発現量の度合いを示すグラフ（右図）である。
　本発明の第１の側面は，抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。この方法は，被験物質をシノビオリン遺伝子発現細胞と接触させる工程と，被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する工程と，を含む。抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法とは，抗肥満作用を有する物質の候補を探す方法である。
　抗肥満作用のひとつが体重調節作用である。体重調節作用とは，処置の前後で，体重を有意差をもって変化させることを意味する。体重調節作用は，例えば脂肪組織量調節や脂肪細胞分化誘導調節を通して作用する。
　ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号は，AB024690（配列番号１）である。
　ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また該塩基配列によってコードされるタンパク質以外のタンパク質であっても，これと高い相同性（通常70％以上，好ましくは80％以上，より好ましくは90％以上，最も好ましくは95％以上）を有し，かつ，シノビオリンタンパク質が有する機能を持つタンパク質は，本発明のシノビオリンに含まれる。
　本発明における「シノビオリン遺伝子」には，例えば，配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトのシノビオリン遺伝子のホモログ等）が含まれる。
　また，配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは，一般的に，配列番号１に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは，50％以上，好ましくは70％以上，さらに好ましくは80％以上，より好ましくは90％以上(例えば，95％以上，さらには96％，97％，98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は，mBLASTアルゴリズム(Altschul　et　al.(1990)　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA 87:　2264-8;Karlin　and　Altschul　(1993)　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　90: 5873-7)によって決定することができる。また，該DNAは，生体内から単離した場合，配列番号１に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては，例えば「2×SSC，0.1％SDS，50℃」，「2×SSC，0.1％SDS，42℃」，「1×SSC，0.1％SDS，37℃」，よりストリンジェントな条件として「2×SSC，0.1％SDS，65℃」，「0.5×SSC，0.1％SDS，42℃」および「0.2×SSC，0.1％SDS，65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては，他の生物におけるシノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を，シノビオリン遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお，本明細書においては，ヒト以外の生物におけるシノビオリンタンパク質（遺伝子）に相当するタンパク質（遺伝子），あるいは，上述のシノビオリンと機能的に同等なタンパク質（遺伝子）を，単に「シノビオリンタンパク質（遺伝子）」と記載する場合がある。
　本発明の「シノビオリン」は，天然のタンパク質のほか，遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は，例えばシノビオリンタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し，シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方，組換えタンパク質は，シノビオリンタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。本発明の「シノビオリンタンパク質」は，例えば，後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
　本発明において「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「シノビオリンタンパク質の発現」とは，シノビオリンタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること，またはこれらの転写・翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。
　上述の各種機能は，当業者においては，一般的な技術を用いて，適宜，評価（測定）することが可能である。具体的には，後述の実施例に記載の方法，あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
　従って，「シノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する」とは，野生型シノビオリン遺伝子またはタンパク質の量，機能または活性と比較して，その量，機能または活性を低下または消失させることをいう。上記「阻害」には，機能と発現の両者を阻害すること，およびどちらか一方を阻害することのいずれもが含まれる。
　ユビキチン化は，具体的には，ユビキチン活性化酵素（E1），ユビキチン結合酵素（E2）およびユビキチンリガーゼ（E3）などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返すことにより，基質となるタンパク質にユビキチン分子を枝状に結合させてポリユビキチン鎖を形成する過程をいう。このポリユビキチン鎖は，ユビキチン分子内の４８番目のリシン残基のε‐アミノ基を介して形成され，26Sプロテアソームへの分解シグナルとなり，標的タンパク質を分解に導く。
　被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する方法は，例えば国際公開ＷＯ２００６－１３７５１４号パンフレットに開示されている方法を適宜用いればよい。
　被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響
　シノビオリン遺伝子を発現する細胞に，被検化合物を接触させる。この際に用いられる「細胞」の例は，ヒト，マウス，又はラットに由来する細胞である。シノビオリンを発現するように形質転換された大腸菌，酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「シノビオリン遺伝子を発現する細胞」の例は，内在性のシノビオリン遺伝子を発現している細胞，または外来性のシノビオリン遺伝子が導入され，該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のシノビオリン遺伝子が発現した細胞は，通常シノビオリン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは，一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
　本方法に用いる被検化合物としては，特に制限されないが，例えば，天然化合物，有機化合物，無機化合物，タンパク質，ペプチドなどの単一化合物，並びに，化合物ライブラリー，遺伝子ライブラリーの発現産物，細胞抽出物，細胞培養上清，発酵微生物産生物，海洋生物抽出物，植物抽出物等が挙げられる。
　シノビオリン遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は，通常シノビオリン遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが，この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には，該タンパク質を発現するDNAベクターを，該細胞へ導入することにより，上記「接触」を行うことができる。
　本方法においては次いで，シノビオリン遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には，転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は，当業者に公知の方法によって行うことができる。
　例えば，シノビオリン遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し，このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法，RT-PCR法，DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また，シノビオリン遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し，シノビオリンタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより，遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに，シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いて，ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより，遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。シノビオリンタンパク質の検出に用いる抗体としては，検出可能な抗体であれば特に制限はないが，例えばモノクローナル抗体，またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
　本方法においては，次いで，被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して，該発現量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は抗肥満のための薬剤となる。
　さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して，該タンパク質の活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。シノビオリン蛋白質の活性への影響の例は，シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響である。
　シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響
　例えば，特開２００８－７４７５３号公報（特許第５００８９３２号）には，プルムバギン（２－メチル－５－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン）及びケルセチン（２－(３,４－ジヒドロキシフェニル)－３,５,７－トリヒドロキシ－４Ｈ－１－ベンゾピラノ－４－オン）がシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化を阻害することが開示されている。シノビオリンの自己ユビキチン化とは，特開２００８－７４７５３号公報に開示されるように，シノビオリン同士の相互作用により生じるタンパク質のユビキチン化を意味する。タンパク質のユビキチン化は，タンパク質にシノビオリンが結合することにより生じる。
　シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響は，特開２００８－７４７５３号公報（特許第５００８９３２号）に開示された方法を用いて確認すればよい。例えば，被験物質をＭＢＰ－Syvn1　ΔＴＭ-Ｈｉｓのin
vitro自己ユビキチン化反応液に添加し，３７℃で３０分間反応を行う。反応後，抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット法によりユビキチン化タンパク質を検出する。ＭＢＰ－Syvn1　ΔＴＭ-Ｈｉｓは，N末端側にマルトース結合タンパク質（MBP），C末端側にHisタグを融合させた膜貫通領域欠損させたシノビオリンを意味する。
　第１の側面の好ましい態様は，抗肥満作用が，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用である。すなわち，この態様では，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用のある化合物をスクリーニングすることができる。
　本発明の第２の側面は，抗肥満薬に関する。この抗肥満薬は，シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸を有効成分として含む。この抗肥満薬は，例えば，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用を有する。
　本発明の第２の側面のある態様は，有効成分がシノビオリンのｓｉＲＮＡのものである。RNAi効果による阻害作用を有する核酸は，一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは，標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下，「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより，標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し，当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば，dsRNAを細胞内に導入すると，そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは，標的遺伝子の発現を抑制し得ることから，従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として，または，遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは，シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが，完全な相同性を有することが好ましい。
　siRNAの設計は，以下の通り行うことができる。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく，任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば，ヒトの場合では，GenBank アクセッション番号 AB024690（配列番号１）の任意の領域を候補にすることができる。
(b) 選択した領域から，AAで始まる配列を選択し，その配列の長さは19～25塩基，好ましくは19～21塩基である。その配列のGC含量は，例えば40～60%となるものを選択するとよい。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に，被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して，発現量を低下させる化合物を選択する工程
　シノビオリンのｓｉＲＮＡの例は，配列番号２～６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。配列番号２～４に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，Izumi　T,　et al.,　Arthritis　Rheum.　2009;60(1):63-72.，　ＥＭＢＯ，Yamasaki　S,　et　al.,　ＥＭＢＯ　J.　2007;　26(1):113-22.に実験を用いて開示されるとおり公知である。配列番号５及び６に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットに実験を用いて開示されるとおり公知である。
　配列番号２：５’－ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ－３’   
　配列番号３：５’－ＧＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＧ－３’
　配列番号４：５’－ＧＧＵＵＣＵＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＣＣ－３’
　配列番号５：５’－ＣＧＵＵＣＣＵＧＧＵＡＣＧＣＣＧＵＣＡ－３’ 
　配列番号６：５’－ＧＵＵＵＴＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡ－３’ 
　「これらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡ」は，配列番号２～６から選択される一の塩基配列及びこれらの塩基配列と相補の塩基配列のいずれかの塩基配列から，１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。置換，挿入，欠失又は付加は，いずれか１種類が生じていても良いし，２つ以上が生じていても良い。
　例えば，国際公開ＷＯ２００５－０１８６７５号パンフレット，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットには，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及び，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡのスクリーニング方法及び評価方法が開示されている。本発明においても，この公報に開示された方法を適宜用いて，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡを評価することができる。
　本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である。配列番号７で示される塩基配列を有する核酸がシノビオリンのデコイ核酸であることは，例えば，Tsuchimochi　K,　et　al.,　Mol　Cell　Biol.2005;25(16):7344-56.に実施例を用いて示されているとおり公知である。
配列番号７：５’－ＡＵＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡＡＧＡ－３’
　また，シノビオリンのデコイ核酸及びその確認方法は，例えば国際公開ＷＯ２００５－０９３０６７号パンフレット，及び国際公開ＷＯ２００５－０７４９８８号パンフレットに開示されるとおり公知である。
　本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，シノビオリンのアンチセンス核酸である。シノビオリンのアンチセンス核酸及びシノビオリンのアンチセンス核酸をスクリーニングする方法は，例えば，特開２００９－１５５２０４号公報，再表２００６－１３７５１４号及び再表２００５－０７４９８８号に開示されている。シノビオリンのアンチセンス核酸とは，シノビオリン遺伝子に相補的な配列を有し，当該遺伝子にハイブリダイズすることにより，シノビオリン遺伝子の発現を阻害することができる核酸を意味する。アンチセンス核酸は，シノビオリンをコードする遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物を合成化学的手法などにより調製することができる。当該核酸化合物がシノビオリンの産生を効率的に阻害するかどうかを評価するためには，遺伝子の発現量を指標としたスクリーニング試験を行えばよい。上記アンチセンス核酸化合物としては，例えばシノビオリンの発現を，コントロールと比較して少なくとも50％以下に抑えることができるものである。
　特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては，アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては，以下のような複数の要因が存在する。即ち，三重鎖形成による転写開始阻害，RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害，合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害，イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害，スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害，mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害，キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害，翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害，開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害，mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害，および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は，転写，スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで，標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人,
1993, 319-347.）。
　本発明で用いられるアンチセンス核酸は，上記のいずれの作用によりシノビオリン遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては，シノビオリン遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば，遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また，コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように，シノビオリン遺伝子の翻訳領域だけでなく，非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も，本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は，適当なプロモーターの下流に連結され，好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は，公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は，形質転換される動物（細胞）が有する内在性のシノビオリン遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが，遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて，完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上，最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子（シノビオリン）の発現を効果的に阻害するには，アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが，本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず，例えば100塩基以上，または500塩基以上であってもよい。
　また，シノビオリン遺伝子の発現の阻害は，リボザイム，またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが，中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により，RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには，グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1
RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが，ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
　例えば，ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは，G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが，その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ，C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば，標的RNA中のUC，UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al.,
FEBS Lett, 1988, 239, 285.，小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.，Koizumi, M. et al., Nucl
Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
　また，ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは，例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986,
323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも，標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi,　Y.&　Sasaki,　N.,　Nucl　Acids　Res,　1991,　19,　6751.，菊池洋,　化学と生物,　1992,　30,　112.）。このように，リボザイムを用いて本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで，該遺伝子の発現を阻害することができる。
　内在性遺伝子の発現の抑制は，さらに，標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA
interference，以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
　本発明の治療剤は，経口，非経口投与のいずれでも可能である。非経口投与の場合は，経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの），経鼻投与剤型，経皮投与剤型（例えば軟膏，クリーム剤），注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は，例えば点滴等の静脈内注射，筋肉内注射，腹腔内注射，皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
　投与方法は，患者の年齢，症状により適宜選択する。有効投与量は，一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１００ｍｇ，好ましくは１～１０μｇである。但し，上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。ｓｉＲＮＡ等の核酸を混合する場合，当該核酸の用量の例は，０．０１～１０μｇ／ｍｌ，好ましくは０．１～１μｇ／ｍｌである。
　本発明の治療剤は，常法にしたがって製剤化することができ，医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として，水，医薬的に許容される有機溶剤，コラーゲン，ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン，カルボキシビニルポリマー，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリアクリル酸ナトリウム，アルギン酸ナトリウム，水溶性デキストラン，カルボキシメチルスターチナトリウム，ペクチン，メチルセルロース，エチルセルロース，キサンタンガム，アラビアゴム，カゼイン，寒天，ポリエチレングリコール，ジグリセリン，グリセリン，プロピレングリコール，ワセリン，パラフィン，ステアリルアルコール，ステアリン酸，ヒト血清アルブミン，マンニトール，ソルビトール，ラクトース，医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
　上記添加物は，本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば，注射用製剤として使用する場合，精製されたＥＲストレス誘導物質を溶剤（例えば生理食塩水，緩衝液，ブドウ糖溶液等）に溶解し，これにＴｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０，ゼラチン，ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは，使用前に溶解する剤型とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては，例えば，マンニトール，ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
　本発明は，シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスを産生し，それによりシノビオリンの発現を阻害するかシノビオリンの活性を阻害することで，肥満症の治療に有効であることを見出した。シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスとは，シノビオリン遺伝子領域の配列が人為的に改変されたことによって，その正常な発現が阻害されていること，その結果，生体においてシノビオリンが正常に機能していないことを意味する。
　また，シノビオリン遺伝子は，一部又は全部を改変又は欠損することができる。ここで，「全部」とは，シノビオリンゲノムＤＮＡのエクソン１の５'端から最後のエクソンの３'端までの領域をいう。また，「一部」とは，この領域の一部であって，シノビオリン遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な長さの領域をいう。さらに，「改変」とは，単一または複数のヌクレオチドを置換，欠失，挿入，及び／又は転位させることにより，ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
　シノビオリン遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損しているノックアウト動物は，公知の方法で作製することができる。例えば，下記実施例の記載のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において，シノビオリン遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することにより，シノビオリンの正常な発現を阻害できる。また，本発明のスクリーニング方法に用いるノックアウト動物は，同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず，さらにその子孫をも含む。
　本発明のノックアウト動物の対象となる動物は，非ヒト動物であり，特に限定されない。例えば，ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，イヌ，ネコ，モルモット，ハムスター，マウス，ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち，実験動物として用いるには，ウサギ，イヌ，ネコ，モルモット，ハムスター，マウス，ラットが好ましく，なかでも齧歯目がさらに好ましく，近交系が多数作出されており，受精卵の培養，体外受精等の技術を考慮するとマウス及びラットが，特に好ましい。
　ターゲッティングベクター構築のため，対象となる動物のシノビオリン遺伝子の一部を単離する。例えば，ノックアウトマウスを作製する場合は，マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからシノビオリン遺伝子をスクリーニングする。得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて，相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく，シノビオリン遺伝子を破壊し，そしてシノビオリンの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。また，ターゲッティングベクターは，公知の方法により作製することができ，例えば市販のプラスミドをバックボーンとして，上記ゲノムＤＮＡクローン，ポジティブセレクション用のマーカー及びネガティブセレクション用のマーカーなどの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。
　上記方法により作製したターゲッティングベクターを，受精卵，初期胚，又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し，その後，目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は，ポジティブ－ネガティブ選択法により薬剤を用いて選択できる。選択後，目的とする相同組換えが起こった細胞を，サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を，妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。
　上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と，野生型ｓｙｎｖ１遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより，第１世代（Ｆ１）として，相同染色体上の一方のｓｙｎｖ１遺伝子が相同組換えにより破壊された，又は一定条件下或いは部位特異的に欠失させ得るヘテロ接合体を得ることができる。さらに，これらヘテロ接合体同士を交配させることにより，第２世代（Ｆ２）として，相同染色体上の双方のｓｙｎｖ１遺伝子が破壊された，又は一定条件下或いは部位特異的に欠失させ得るホモ接合体，即ち本発明のｓｙｎｖ１ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は，体の一部（例えば尻尾）を切断し，ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが，本発明は実施例によって限定されるものではない。
　＜作製例１：シノビオリンノックアウトマウスの作製＞
　本実施例のシノビオリンノックアウトマウス（syvn1 cKOマウス）の作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図を図１Ａに示した。図中，上から順に，正常のシノビオリン遺伝子（Wild allele），シノビオリンノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting Vector），相同組換えを起こしたアレル（Targeted
allele），ｌｏｘＰ配列が導入されたアレル（Flox Allele），ｌｏｘＰ－Ｅｘｏｎ２～１４－ｌｏｘＰが除去されたアレル（Deleted Allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。
　マウスシノビオリン遺伝子のエクソン１の上流からエクソン１６の下流の領域である１４．８ｋｂの遺伝子領域をターゲッティングベクター構築のために使用した。ＦＲＴ配列で挟んだＮｅｏ耐性遺伝子をエクソン１とエクソン２との間に挿入した。また，エクソン２の上流及びエクソン１４の下流にｌｏｘＰ配列を導入した。
　上記ターゲッティングベクターを，ＥＳ細胞に導入した。目的の相同組換えが起こったアレルを有するクローンを，Ｃｒｅ処理によるｌｏｘＰ－エクソン－ｌｏｘＰ配列の除去及びＦＬＰ処理によるＦＲＴ－ネオマイシン－ＦＲＴの除去をＰＣＲ産物の長さで確認することによって，選抜した。
　相同組換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを，公知の方法（たとえば，EMBO J 16:1850-1857）のとおりに，マウス胚に導入することにより，キメラマウスを得た。さらに，このキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させ，ネオマイシン配列が除去されたマウスを獲得した。また，ターゲッティングベクターに組み込まれているエクソン－Long arm間のｌｏｘＰ配列は，相同組換え時に欠損している可能性があるため，その存在をＰＣＲで確認した。
　得られたネオマイシン除去マウスをＣＡＧ－Ｃｒｅ-ＥＲマウスと掛け合わせ，CAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウスを得た。
　（実施例１：新生後のシノビオリンノックアウトの表現型）
　新生後のシノビオリンの機能を解明するため，タモキシフェン(Tam)で誘導可能なシノビオリンノックアウトマウス（CAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス）にタモキシフェンを投与することでｌｏｘＰ－エクソン－ｌｏｘＰの除去を誘導した（ＣＡＧ－ＣｒｅＥＲ（＋）syvn1flox/flox）。また，対照として，C57BL／6J（溶媒対照，タモキシフェン投与）及び（ＣＡＧ－ＣｒｅＥＲ（－）syvn1flox/flox）（溶媒対照，タモキシフェン投与）の各群を設けた。
　具体的には，生後7-8週間後，C57BL/6Jマウス，Cre導入遺伝子を欠くホモ接合型のsyvn1flox/floxマウス(syvn1 WT)及びCAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス(syvn1 cKO)の腹腔内に，一日当たり125mg/kgのタモキシフェン溶液を５日間連続して投与した。タモキシフェン投与によってシノビオリンがノックアウトされていることは，ゲノム上のシノビオリンのPCR，シノビオリンmRNAのリアルタイムPCR及びシノビオリン蛋白質のウエスタンブロッティングで確認した（図１Ｂ～Ｄ）。syvn1flox/floxマウスはコントロールである。
　タモキシフェン投与後のC57BL/6Jマウス(n=3)，syvn1
WTマウス(n=10)，及びsyvn1 cKOマウス(n=10)における日齢に対する生存割合を示すKaplan-Meier曲線を作成した。結果を図１Ｅに示す。
　syvn1 cKOマウスは生存できず，Tam投与後２１日後までに全頭が死亡した。一方，C57BL/6Jマウス及びsyvn1 WTマウスは生存していた（図１Ｅ）。
　（実施例２－１：シノビオリンノックアウトによる体重変化）
　生後7-8週間後，C57BL/6Jマウス，ホモ接合型のsyvn1flox/floxマウス(syvn1 WT)及びCAG-Cre;syvn1flox/floxマウス(syvn1 cKO)の腹腔内に，一日当たり125mg/kgのタモキシフェン(Tam)溶液又は対照としての溶媒を５日間連続して投与した。結果を図２Ａに示す。
　図２Ａから，syvn1 cKOマウスの群では，Tam投与後１週間で体重の顕著な減少が観察され，syvn1 WTマウス群の体重のおよそ半分まで飼育日数依存的に体重の減少が認められた。一方，いずれの対照群においても，体重の減少は，認められなかった。
　syvn1 cKOマウスが吸収段階で摂食障害及び／又は栄養障害をもっていないかを調べるため，次の三つの試験を行った。
　（実施例２－２：シノビオリンノックアウトによる食物摂取量への影響）
　前記syvn1 cKOマウスにおける体重の減少が食物摂取の減少によるものか否かを調べるため，毎日の食物摂取量を測定した。図２Ｂでは，タモキシフェン処理後１日間後及び11日間後に一日当たりの平均食物摂取量を示す。
　図２Ｂから，syvn1 cKOマウスと対照マウスとで食物摂取量に差はないことがわかった。この結果から，syvn1 cKOマウスにおける体重の減少は摂食障害や単なる脱力によるものではないことが示唆された。
　（実施例２－３：シノビオリンノックアウトによる栄養，肝臓及び腎臓機能への影響）
　更に，血清の生物化学実験によって，総蛋白質,アルブミン,血糖, トリグリセリド, 総コレステロール, AST, ALT, BUN，及びCrを含む，栄養，肝臓及び腎臓機能に対するいくつかのバイオマーカーについて調べた。結果は，下記表１に示す通り，二つの群で顕著な変化はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例２－４：シノビオリンノックアウトによる脂肪組織への影響）
　次に，syvn1 cKOマウスにおいて肉眼及び顕微鏡での脂肪組織の解析を行った。タモキシフェン投与後16日間後におけるsyvn1 WTマウス(左側)及びsyvn1 cKOマウス(右側)について開腹手術を施し，脂肪組織の観察を行った。結果を図２Ｃ及びＤに示す。
　図２Ｃから，syvn1 cKOマウスの腸には相当量の食物残渣があり，組織学的に異常は見られなかった。また，syvn1 cKOマウスにおいて，皮下脂肪が減少していることが分かった。
　また，図２Ｄから，syvn1 cKOマウスでは白色脂肪組織(WAT)が顕著に減少していることが分かった。特に精巣上体の白色脂肪組織は観察されなかった。
　（実施例２－５：シノビオリンノックアウトによる脂肪滴への影響）
　シノビオリンノックアウトによる脂肪組織内への影響を調べるため，syvn1 WTマウス及びsyvn1 cKOマウスの内臓脂肪組織をヘマトキシリン・エオシン染色して観察した。上記syvn1 cKOマウスにおいてかろうじて残っている脂肪組織を用いて組織学的解析を行った。結果を図２Ｅに示す。
　図２Ｅから，syvn1 cKOにおいて，脂肪滴が減少していることが分かった。また，この脂肪滴の減少は，syvn1 cKOマウスにおいてのみ観察され，syvn1 WTマウスでは観察されなかった。
　次にsyvn1 WTマウス及びsyvn1
cKOマウスの精巣上体及び皮下脂肪についても同様にして観察を行った。その結果を図２Ｆに示す。図２Ｆは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける精巣上体（上図）及び皮下脂肪（下図）の脂肪滴の様子を示す顕微鏡写真である。黒色矢印は脂肪滴を示す。倍率は400倍である。
　脂肪細胞のサイズの増大及び前駆脂肪細胞の分化による脂肪細胞数の増加は，肥満の進行において最初に観察される事象であること(Ｆａｕｓｔ　ｅｔ　ａｌ。，　１９７８; Ｊｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２００９)，及び脂肪組織において過剰なエネルギーを蓄えられないことが，インシュリン耐性や代謝性の合併症に関わっていること(Ｔａｎ ａｎｄ Ｖｉｄａｌ－Ｐｕｉｇ, ２００８; Ｖｉｒｔｕｅ ａｎｄ Ｖｉｄａｌ－Ｐｕｉｇ, ２００８)から，シノビオリンの発現抑制又は機能抑制による抗肥満作用が強く示唆された。
　（実施例３：ob/obマウス及びdb/dbマウスにおけるシノビオリンノックアウトの効果）
　肥満マウスを用いて，恒常的に高脂肪食を摂取させる条件下でシノビオリンのノックアウトがこれらのマウスの体重減少を誘導するか否かを検証した。
　まずは，代表的な肥満マウスであるｏｂ/ｏｂ(レプチン遺伝子の異常)，ｄｂ/ｄｂ（レプチン受容体遺伝子の異常）マウス（いずれも中枢性に摂食が効かなくなり過食となり肥満，糖尿病，メタボリック症候群などのモデルとして汎用）を用いて，これらのマウスとシノビオリンのコンディショナルノックアウトマウスとを交配し，それぞれｏｂ又はｄｂ遺伝子ホモ，かつシノビオリン遺伝子もホモ，すなわち完全にノックアウトできるマウスを作出した。これらのマウスの遺伝子型としては次の通り。CAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 cKO:ob/obマウス)，syvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 WT:ob/obマウス)，CAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 cKO:db/dbマウス)，及びsyvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 WT:db/dbマウス)。
　具体的な手順としては，まずCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:ob/obマウス及びCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:db/dbマウスを作製するため，CAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウスをob/+及びdb/+マウスと交配させた。
　二次交配でCAG-Cre-ER;syvn1flox/+:ob/+マウスを交配させてCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 cKO:ob/ob)及びsyvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 WT:ob/ob)を作製した。同様にして，二次交配でCAG-Cre-ER;syvn1flox/+:db/+マウスを交配させてCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 cKO:db/db)及びsyvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 WT:db/db)を作製した。
　生後7-8週間後の前記マウス（syvn1 cKO:ob/ob，syvn1 WT:ob/ob，syvn1 cKO:db/db及びsyvn1 WT:db/db）の腹腔内に，一日当たり125mg/kgのタモキシフェン(Tam)溶液を５日間連続して投与した。タモキシフェン投与後の体重測定を毎日行い，体重変化率を求めた。結果を図３Ａ及びＣに示す。また，タモキシフェン投与後２５日目のsyvn1 WT:ob/obマウス及びsyvn1 WT:db/dbマウスと，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 cKO:db/dbマウスの脂肪組織を解剖により観察した。結果を図３Ｂ及びＤに示す。
　図３Ａ及びＣから，タモキシフェン投与後，syvn1 WT:ob/obマウス及びsyvn1 WT:db/dbマウスの体重は，約130％まで増加した。一方，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 cKO:db/dbマウスの体重は，試験開始時の体重の約半分まで顕著に減少した。つまり，新生後のシノビオリンノックアウトがob/obマウス及びdb/dbマウスの体重を減少させることが分かった。
　図３Ｂ及びＤから，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 WT:db/dbマウスに比べ，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 cKO:db/dbマウスでは脂肪の体積が減少していることが明らかとなった。つまり，新生後のシノビオリンノックアウトがob/obマウス及びdb/dbマウスの白色脂肪細胞を減少させることが分かった。
　上記の摂食量に変化ないというデータ（図２Ｂ）と併せて考えると，これらの結果は，中枢神経系レベルでのレプチンシグナルの不活性化及び／又は高エネルギー摂取によって誘導される肥満に対して，シノビオリン欠失による体重の減少が優性耐性であることを示唆している。すなわち，シノビオリンの欠失は，中枢神経系に対する作用ではなく，末梢の脂肪細胞におけるエネルギー消費に作用していると考えられる。
　（実施例４：シノビオリンの発現抑制及びユビキチン化活性阻害による肥満症への効果）
　マウスの脂肪前駆細胞である３Ｔ３－Ｌ１細胞を，１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地；Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）でｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達した後３日間培養した。５００μＭ　ＩＢＭＸ（isobutyl-methylxanthine），１μＭ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，５　μｇ／ｍＬ　Ｉｎｓｕｌｉｎを添加し分化を誘導した。同時に１０μＭ　ＬＳ－１０２（シノビオリンのユビキチン化活性阻害剤）もしくはＤＭＳＯを添加した。３日間培養後，４μｇ／ｍＬ　Ｉｎｓｕｌｉｎを含む培地に置換し１０μＭ　ＬＳ－１０２もしくはＤＭＳＯを添加した。３日間培養後，１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）に置換し３日間培養した。ｓｉＲＮＡに関しては，分化誘導２日前に２００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ　Syvn1７７０（センス鎖が下記配列番号２の配列からなる）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００により導入した。
　配列番号２：５’－ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ－３’
　培養後の３Ｔ３－Ｌ１細胞をＰＢＳ（－）（Phosphate Buffered Saline溶液からマグネシウムとカルシウムを除いたもの）で洗ったのち，１０％ｆｏｒｍａｌｉｎで固定した。ＰＢＳ（－）で洗浄し６０％Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌに置換した。１８ｍｇ／ｍＬ　Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ（溶媒はＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）で２０分間染色し，６０％Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ及びＰＢＳ（－）で洗浄し顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。
　図４から，ｓｉＲＮＡでシノビオリン遺伝子の活性を阻害した細胞では，対照と比較して，分化した脂肪細胞が少なく，分化が抑制されていることが示唆された。また，輪環状の正常な脂肪細胞ではない脂肪滴が認められた。以上の結果から，シノビオリン遺伝子の発現抑制及びシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化抑制が，肥満症の予防及び治療に有効であることが示された。
　（実施例５：脂肪特異的にシノビオリンをノックアウトしたマウスでの脂肪減少）
　シノビオリン遺伝子（SYVN1）のノックアウトが白色脂肪組織を直接標的にしているか否かを確認するため，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウス（aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウス：ａｄｉｐｏｓｅ　ＫＯ）を作製した。
　脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスを作製するため，まずはSyvn1flox/floxマウスと脂肪酸結合蛋白質4（aP2）-Creマウス(Jackson Immunoresearch Laboratories)とを交配させてaP2-Cre-ER;Syvn1flox/+マウスなどを含む複合ヘテロ接合体を得た。次に二次交配としてaP2-Cre;Syvn1flox/+マウスをSyvn1flox/floxマウスと交配させ，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスを得た。なお，Syvn1flox/flox又はSyvn1flox/+の遺伝子型を持つ，Creトランスジーンを欠いたマウスを対照マウスと呼ぶ。
　得られたaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスのWAT（白色脂肪組織）及びBAT（褐色脂肪組織）においてCreリコンビナーゼを介したSyvn1ノックアウトが起きていることは，PCRで確認した（図５Ａ）。
　aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの生存率を確認したところ，200を超える同腹仔のうち，ほとんど全てのaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスが生後24日までに死亡した（図５Ｂ）。
　また，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの体重変化を観察したところ，対照マウス（Syvn1flox/flox及びSyvn1flox/+マウス）及びaP2-Cre;Syvn1flox/+マウス（Syvn1ヘテロ接合体）と比較し，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスでは，体重がほぼ半減することが分かった（図５Ｃ及びＤ）。
　更に，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの脂肪組織を観察したところ，WATの顕著な減少が観察された（図５Ｅ及びＦ）。一方，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスにおいてBATの減少は見られなかった（図５Ｇ）。
　また，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの組織切片を観察するため，ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行ったところ，対照マウスと比較してaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスでは多数の脂肪滴が減少することが示された（図５Ｈ）。
　これらの結果は，体重調節においてシノビオリンがWATを直接の標的としていることを示唆している。
　（実施例６：シノビオリンの選択的阻害剤LS-102による体重増加及び脂肪量減少）
　LS-102がシノビオリン（SYVN1）のE3ユビキチンリガーゼ活性の選択的阻害剤であることはこれまでに示されてきた（Yagishita, N., et al. Int. J. Mol. Med. 30, 1281-1286 (2012).）。そこで，SYVN1の薬理学的な阻害が肥満を改善するか否かを調べた。
　まず，C57BL/6Jマウスに，対照としての溶媒（DMSO）又は50 mg/kg体重のLS-102を投与し，約２ヵ月間体重を測定した（図６Ａ）。その結果，LS-102で処理したマウスでは食物摂取によって生じる体重増加が抑制された。なお，LS-102の食物摂取への影響はなかった（図６Ｂ）。
　また，LS-102で処理したマウスを解剖して，精巣上体のWATにおける脂肪を観察し，計量したところ，脂肪量の減少が認められた（図６Ｃ）。
　更に，マウスの組織切片を観察したところ，対照マウスと比較してLS-102処理したマウスでは脂肪滴も減少していた（図６Ｄ）。
　これらの結果から，ＬＳ－１０２はＳＹＶＮ1の阻害を通じて肥満を抑制することが強く示唆された。
　（実施例７：シノビオリンのバイオマーカーとしての利用可能性）
　実施例３から肥満マウスであるob/obマウスでシノビオリンをノックアウトさせたことにより体重や白色脂肪細胞を減少することがわかった。このことから，次にシノビオリンを肥満のバイオマーカーとして利用できるかどうかを確認した。syvn1 ＷＴマウス，syvn1 ｃＫＯマウス，ｏｂ/＋マウス，ｏｂ/ｏｂマウスの皮下脂肪にある白色脂肪組織（ＷＡＴ）から得た細胞抽出液を用意した。抗シノビオリン（SYVN1）抗体及び抗-beta-actin抗体（内部標準用）を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果を図７に示す。図７は，ob/+ 及びob/ob
マウスの皮下脂肪白色脂肪組織におけるシノビオリン蛋白質の発現を示すウエスタブロット（左図）及び画像解析に基づく発現量の度合いを示すグラフ（右図）である。
　syvn1
cKOマウスではシノビオリンタンパク質の発現は確認されなかった。一方，ob/obマウスはsyvn1 WTマウスに比べてシノビオリンタンパク質の発現量が増加した。肥満マウスでシノビオリンの発現量が増加していたことから，シノビオリンをバイオマーカーとしての利用できる可能性が見出された。
　本発明のスクリーニング方法は，シノビオリン機能を抑制することを指標とすることで，肥満症の予防又は治療に有効な医薬組成物を選択することができる。
　また，本発明の抗肥満薬は，シノビオリンの発現又はシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化を抑制することで，摂食制限することなく脂肪細胞の分化を抑制でき，脂肪組織量及び体重を調整するものであり，従来の食欲抑制剤や消化吸収阻害剤と異なる，新たな種類の抗肥満薬として有用である。
　配列番号２：合成ＲＮＡ
　配列番号３：合成ＲＮＡ
　配列番号４：合成ＲＮＡ
　配列番号５：合成ＲＮＡ
　配列番号６：合成ＲＮＡ
　配列番号７：合成ＲＮＡ

Claims (5)

  1. 　抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法であって，
    　被験物質をシノビオリン遺伝子発現細胞と接触させる工程と，
    　前記被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する工程と，
    　を含む，抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法。
  2. 　請求項１に記載の抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法であって，
    　前記抗肥満作用が，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用である請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. 　シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸を有効成分として含む，抗肥満薬。
  4. 　請求項３に記載の抗肥満薬であって，
    　前記有効成分が，
    　　配列番号２～６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有する，シノビオリンのｓｉＲＮＡである，
    　抗肥満薬。
  5. 　請求項３に記載の抗肥満薬であって，
    　前記有効成分が，
    　　配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である，
    　抗肥満薬。

     
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