CN104988117A

CN104988117A - 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法

Info

Publication number: CN104988117A
Application number: CN201510386692.2A
Authority: CN
Inventors: 黄慈波
Original assignee: Shenzhen Zhongji Hengrun Investment Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Zhongji Health Science Co.,Ltd.
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: HK1212148A2; CN104988117B

Abstract

一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其中，从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化。本发明所提供的方法可从脐带中分离和培养间充质干细胞，并将获得的间充质干细胞进行进一步诱导转化，可以用于间充质干细胞的大规模生产，在再生困难的受损组织的治疗方面具有重大的意义。

Description

从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法

【技术领域】

本发明涉及间充质干细胞技术领域，尤其涉及一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法。

【背景技术】

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)被称作“不死的癌症”，其是一种随年龄增长而发生率上升的以关节软骨退变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节疾病，主要侵害关节软骨、骨和滑膜组织，导致关节疼痛、畸形和功能障碍，是引起中老年人疼痛的最常见原因，且该病有一定的致残率，严重影响了患者的生活质量。目前骨关节炎的治疗主要包括：运动及生活指导、物理治疗、药物治疗(非甾体类抗炎药、氨基葡萄糖口服，局部注射玻璃酸钠及激素等)、外科关节置换术等，在一定程度上改善了患者的生活质量，但仍没有理想的治疗方法，迫切需要寻求新的治疗方法及技术。该病最终会导致关节软骨的损伤，若能修复受损的软骨将会明显改善患者病情，因此，如何修复受损的软骨并保持其功能，是骨关节炎的治疗目标。但是由于关节软骨细胞难以再生和修复，是制约骨关节炎治疗进一步发展的瓶颈。

利用诱导干细胞分化为软骨细胞，是促使关节软骨细胞再生和修复的新的治疗方法，该治疗方法是将体外培养的功能相关的干细胞种植于天然或人工合成的，具有良好生物相容性，可降解和具有一定三维结构的聚合物支架上，从而形成了细胞支架复合物，再将其移植入人体组织缺损部位，从而形成关节软骨，实现软骨的再生与修复。其中，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)为常用的细胞之一。

迄今为止，骨髓是间充质干细胞的主要来源，但骨髓采集是一项侵入性技术，有时需要穿刺数次进行采集，且手术时需进行全身麻醉，手术过程复杂且困难，因此给患者带来严重的精神和身体负担。

脐带是胚胎形成过程中由滋养层细胞形成的连接胚胎脐部与胎盘件的索状结构，外覆羊膜，内含粘液性***。其中***内除油闭锁的卵黄囊和脐尿管外，还有一条静脉和两条动脉。脐带是干细胞形成和经过的通道。因此，由脐带来源的间充质干细胞在适当的条件下也具有自我更新能力，因此在不分化为特定细胞的时候可以进行扩大培养。和来源于骨髓、肌肉和皮肤组织的间充质干细胞相比，脐带来源的间充质干细胞具有更为卓越的分化能力。此外，与骨髓间充质干细胞相比脐带来源的间充质干细胞具有以下优势：脐带资源丰富，对供者(母婴)无不良影响，对HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)配型相合的要求相对降低，可扩大供者范围等。

如专利CN 103266081A中公开了从脐带中分离培养间充质干细胞的方法，其具体公开了将脐带进行消化后采用间充质干细胞培养基进行培养，得到间充质干细胞的具体方法，但是采用此方法获得的间充质干细胞的获得率较低。现有技术中间充质干细胞分离与培养的成本高、间充质干细胞转化率低、操作复杂，无法实现间充质干细胞的大规模生产。

【发明内容】

为克服目前从脐带中分离培养间充质干细胞，并将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞过程成本高、转化率低的问题，本发明提供一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法。

本发明提供一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞；

从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化，该消化液为DMEM(Dulbecco minimumessential medium)培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0.5-1.5mg/ml胶原酶、4.5-5.5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成；

原代细胞培养中包括采用细胞培养液进行培养，该细胞培养液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10％胎牛血清；

细胞传代培养获得间充质干细胞包括在原代细胞培养中待细胞长至70％-85％融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，采用PBS洗涤后，再加入5-10ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，于37℃下消化并观察细胞，待细胞胞体趋于变圆时，立即加入等量的细胞培养液终止消化；用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮，离心获得所需细胞；用细胞培养液制成单细胞悬液，原代细胞按1:2进行传代培养获得第1代传代细胞；使用同样的方法重复进行第2代及第3代传代细胞的培养；

将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞包括将第3代(P3)细胞以7×10⁴/ml-1×10⁷/ml接种至培养板中，培养板中预置消毒的盖玻片，培养24h后更换为含诱导因子的诱导转化培养液，将培养板置于5％CO₂、饱和湿度80％、37℃培养箱中培养，每周换液2-3次；

其中，该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)、βⅠ、6-6.5μg/ml胰岛素、98-100μmol/ml***、0.5-1.5μmol/ml丙酮酸钠及6-6.5μg/ml转铁蛋白。

优选地，在脐带处理过程中，采用双抗盐水冲洗脐带外表面，该双抗盐水为含100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的生理盐水；脐带处理过程中包括去除脐带与脐血管表面的凝血块，并更换容器，将表面处理干净的脐带置于双抗盐水中浸泡15-18min；取出脐带，更换容器，再重复用双抗盐水浸泡2-4次，每次15-18min；更换无菌容器，脐带切段，再次更换无菌容器，沿两侧纵向剖开脐带表面的羊膜，纵向撕开脐带，去除脐动脉和脐静脉及其它血管淤血后，在双抗盐水中洗涤至盐水无色清澈。

优选地，从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养包括将已完成淤血处理的脐带和脐血管分别转移至无菌消化容器中，用无菌剪刀将组织剪碎；然后将剪碎的组织及PBS混合并离心获得沉淀物，将配好的消化液加入沉淀物中，吹起沉淀后转移至另一无菌培养皿中，并放入无菌培养箱37°消化4-7h；将消化好的溶液及组织离心后获得沉淀物；沉淀物用细胞培养液重悬，接种于10cm培养皿中，此时的细胞称为原代细胞，置于37℃、饱和湿度、含5％CO₂孵箱中培养；24h全量换液，并每2-3天更换培养液。

优选地，上述消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0.5-1mg/ml胶原酶、4.5-5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成。

优选地，细胞传代培养获得间充质干细胞还可在原代细胞培养中待细胞长至70％-80％融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，并采用PBS洗涤后，再加入5ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化；而第3代(P3)细胞还可以2×10⁵/ml-1×10⁶/ml接种至培养板后进行间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的培养。

优选地，该消化液还可为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入1mg/ml胶原酶、5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成。

优选地，该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6-6.5μg/ml胰岛素、98-100μmol/ml***、0.5-1.5μmol/ml丙酮酸钠、6-6.5μg/ml转铁蛋白、0-2μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0-1.5μmol/ml维生素D₃。

进一步优选地，该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、98μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、1.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml维生素D₃。

优选地，该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、99μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、0.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml维生素D₃。

优选地，该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、98μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、2μmol/ml的β-甘油磷酸钠。

相对于现有技术，首先本发明中从脐带中分离和培养间充质干细胞，并将获得的间充质干细胞进行进一步诱导转化，可以用于所谓多能细胞的间充质干细胞的大规模生产，在再生困难的受损组织的治疗方面具有重大的意义。

其次，采用本发明中所述的方法，从同一个供体的脐带中分离和培养间充质干细胞的存活率达到98-99％以上，远高于采用现有技术中分离培养获得间充质干细胞的获得率。

最后，采用本发明中所述的制备方法，从脐带中分离和培养间充质干细胞强表达的特异性标记包括CD44、CD105、CD90和CD73，而CD45、CD34、CD14、CD19及HLA-DR表达阴性，采用本发明所述的方法分离培养获得的间充质干细胞的免疫表型与间充质干细胞的免疫表型相同，这说明通过本发明中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法分离培养获得的细胞具有间充质干细胞的特征。

综上，采用本发明所述的方法制备获得的软骨细胞可用于人体软骨缺损的治疗中，且可利于间充质干细胞的大规模生产，具有较大的应用前景。

【附图说明】

图1a是本发明中病例1治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图1b-1e是采用结合本发明实施例2中实验组11所述方法对病例1进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图2a是本发明中病例1治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图2b-2e是采用结合本发明实施例2中实验组11中所述方法对病例1进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图3a是本发明中病例2治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图3b是采用结合本发明实施例2中实验组14中所述方法对病例2进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图4a是本发明中病例2治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图4b是采用结合本发明实施例2中实验组14中所述方法对病例2进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图5a是本发明中病例3治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图5b是采用结合本发明实施例2实验组11中所述方法对病例3进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图6a是本发明中病例3治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图6b是采用结合本发明实施例2实验组11中所述方法对病例3进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图7a是本发明中病例4治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图7b是采用结合本发明实施例2实验组14中所述方法对病例4进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图8a是本发明中病例4治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图8b是采用结合本发明实施例2实验组14中所述方法对病例4进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图9a是本发明中病例4治疗前关节的核磁共振(MRI)情况示意图；

图9b是采用结合本发明实施例2实验组14中所述方法对病例4进行治疗后关节的核磁共振(MRI)情况示意图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的，技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1、根据本发明中所述方法从脐带中分离和培养间充质干细胞

脐带及脐带血来源：取自健康产妇脐带24根，进行有效冻存。

实验组1：

从脐带中分离和培养间充质干细胞，其具体分离、培养方法如下：

(1)脐带处理：

选择健康产妇的脐带，用双抗盐水冲洗脐带外表面，去除表面的凝血块。更换容器，将表面处理干净的脐带置于双抗盐水中浸泡15min；取出脐带，更换容器，再重复用双抗盐水浸泡两次，每次15min。更换无菌容器，切取5cm长的一段，再次更换无菌容器，沿两侧纵向剖开脐带表面的羊膜，纵向撕开脐带，去除脐动脉和脐静脉，如遇无法去除者，则剖开有淤血的血管，将淤血去除干净，最后在双抗盐水中洗涤至盐水无色清澈。去除的脐动脉和脐静脉剖开，去除淤血，在双抗盐水中洗涤至盐水无色清澈。

其中，所述的双抗盐水为含100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的生理盐水。

(2)细胞分离及原代细胞培养：

将处理好的脐带和脐血管分别转移至无菌消化容器中，用无菌剪刀将组织剪碎；然后将剪碎的组织及PBS培养基加入离心管中，常温下离心1000r/min，维持5min。去掉上清，将配好的消化液加入沉淀中，吹起沉淀，用移液管转移至另一无菌培养皿中，放入无菌培养箱37°消化6h。

该消化液包括DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入胶原酶、透明质酸酶、青霉素及链霉素混合配置而成；

将消化好的溶液及组织转移至离心管，300g，离心5min，弃上清。沉淀用细胞培养液重悬，接种于10cm培养皿中。标记组织名称、日期及细胞代数，此时的细胞称为原代细胞(P0)，置于37℃，饱和湿度80％，含5％CO2孵箱中培养。24h全量换液，以后每2-3天更换培养液。

其中，所述细胞培养液为DMEM培养基与F12培养基1:1配置为80ml溶液后，再加入100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10％胎牛血清。

(3)细胞传代：

待细胞长至约70％融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，采用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2次，以洗去残留细胞培养液。洗涤完毕后，再加入5ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，于37℃下消化约2min。

在细胞消化过程中随时在显微镜下观察细胞是否离壁，细胞胞质回缩，细胞胞体趋于变圆时，立即加入等量含10％胎牛血清的细胞培养液终止消化。用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮，吸取细胞悬液移入15ml离心管，常温下离心1000r/min，并维持离心5min。离心完毕后，弃上清液，底部即为所需细胞。

用细胞培养液制成单细胞悬液，原代细胞按1:2进行传代培养。标记组织名称，日期及细胞代数，此时的细胞称为第1代传代细胞(P1)。

使用同样的方法重复进行第2代及第3代传代细胞的培养。

实际上实验组1参数可以进行一定范围内的调整，具体调整范围如下：

将表面处理干净的脐带置于双抗盐水中的单次时间不限定在15min，其也可以浸泡15-16min或16-17min或17-18min，并可重复用双抗盐水浸泡2-3次或3-4次。

上述剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化时间不限定于6h，其可以是4-7h，或进一步为4-6h，还可为5-6h或4-5h。

上述原代细胞培养过程中可以待细胞长至约70-80％融合时，再进行下一步骤的操作，其融合程度还可为70-75％或75％-80％，可具体为71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。

消化液中的胶原酶的含量可调整为0.5-1.5mg/ml、0.5-1mg/ml及1-1.5mg/ml，透明质酸酶的含量也还可为4.5-5.5μg/ml、4.5-5μg/ml及5-5.5μg/ml。

除实验组1之外，申请人采用不同参数值的消化液以及0.25胰蛋白酶-EDTA溶液实施了实验组2-10，具体实验参数参见如下表1：

表1，从脐带分离和培养间充质干细胞的方法中消化液与0.25胰蛋白酶-EDTA溶液所含组分及其含量

注：

1、表1中DMEM培养基与F12培养基的份数仅表示DMEM：F12＝1:1。2、表1中胶原酶的单位为mg/ml，透明质酸酶与链霉素的单位为μg/ml，青霉素的单位为100u/ml，0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液的单位为ml。

此外，还可采用实验组1中所述的消化液的组分及其比例，对实验过程中如脐带组织浸泡及消化时间、接种细胞密度、清洗及离心的时间进行变形，具体的变形实验组如下：

实验组11：将表面处理干净的脐带置于双抗盐水中浸泡18min，并重复用双抗盐水浸泡4次，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组12：将表面处理干净的脐带置于双抗盐水中浸泡15min，并重复用双抗盐水浸泡1次，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组13：剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化的时间为4h，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组14：剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化的时间为7h，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组15：剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化的时间为5h，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组16：剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化的时间为5.5h，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组17：剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化的时间为20h，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组18：剪碎的脐带组织加入PBS溶液进行洗涤后，加入实验组1中消化液，并在37°温度下进行消化，消化的时间为1小时，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组19：原代细胞培养过程中需要待细胞长至约80％融合时，再进行下一步骤的操作，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组20：原代细胞培养过程中需要待细胞长至约60％融合时，再进行下一步骤的操作，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组21：原代细胞培养过程中需要待细胞长至约90％融合时，再进行下一步骤的操作，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组22：原代细胞培养过程中需要待细胞长至约75％融合时，再进行下一步骤的操作，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组23：原代细胞培养过程中需要待细胞长至约85％融合时，再进行下一步骤的操作，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

对采用上述实验组1-23中所述的方法从脐带中分离培养获得的间充质干细胞或其制备过程与对照组进行对照试验，对细胞生长形态变化、细胞培养成活率进行测定，并进对所获得的间充质干细胞进行特征分析。

本发明的对照组为采用专利CN 1630717A中所公开的从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞方法分离培养获得的间充质干细胞。

具体检测方法如下：

1、细胞生长形态变化的测定

实验方法：上述实验组1-23及对照组在从脐带及脐带血中分离培养间充质干细胞的过程中，注意观察培养基颜色变化，并且在获得原代细胞后，每24h、48h及72h将培养皿或载有所需观察的细胞的玻片置放在显微镜下观察细胞形态及其生长情况。

实验结果：

(1)实验组1-23中的细胞形态及生长情况如下：

实验组1-23中细胞生长的过程可以大致为：原代细胞形态为长梭型，6天后去掉组织块，在显微镜下可见分布、大小不等且贴壁生长的细胞集落，10天左右细胞达到60％以上融合；

细胞传代后，贴壁速度增快，24h后可见有细胞贴壁，细胞形态向梭形变化；48h后，贴壁的单核细胞数量增多，细胞呈具有一定排列方向的多角形；72h后，贴壁细胞中可见有细胞集落形成，胞质中颗粒明显，随着细胞***增殖，集落的体积变大，其数量也增多。其中实验组1的在传代培养72h后，细胞***增殖明显。

由于组分配比及实验方法的不同，实验组1-23之间有一定的细胞生长状态及其情况差异，具体的差异如下：

实验组1-5之间细胞形态及其生长情况无太大差异，可见当胶原酶用量为0.5-1.5mg/ml,透明质酸酶的用量为4.5-5.5μg/ml，胶原酶与透明质酸酶在上述范围内用量的浮动对于从脐带中分离和培养间充质干细胞的细胞形态及生长情况的并无太大影响。

实验组6-7由于DMEM培养基与F12培养基比例的调整，其细胞生长速度略慢于实验组1的细胞生长速度。

实验组8-9中，为0.25胰蛋白酶-EDTA溶液用量的调整，相对而言，实验组9的细胞生长速度较慢于实验组1、实验组8及实验组10，而实验组1、8与10之间的细胞生长速度之间差异并不大，可见，当0.25胰蛋白酶-EDTA溶液用量为5-10ml时，其细胞生长速度最优。

实验组12中，只采用双抗盐水浸泡1次，其获得的细胞生长速度略低于实验组1与实验组11，其中实验组1与实验组11的细胞生长速度的差异并不大。

实验组13-17与实验组1相比，其细胞形态变化与生长速度差异不大，而实验组18由于消化时间仅为1h，其细胞形态变化与生长速度明显差于实验组1、13-16，而实验组1、13-16之间的细胞形态变化与生长速度差异并不大，实验组17的消化时间为20h，消化时间明显多于实验组13-16的4-6h，其培养的细胞的数量有明显的减少。

实验组1，实验组19与实验组22中细胞分别为长至70％、80％及75％融合后，再进行下一步骤的操作，其细胞的生长速度及其形态明显优于实验组20、实验组21、实验组23(细胞分别长至60％、90％、85％融合)，在实验组20、21与23中，实验组23细胞形态与其生长速度明显优于实验组20及实验组21。即，当细胞达到70-80％融合时，其细胞形态变化与生长速度最佳，而细胞融合程度变大或变小，均会对其细胞形态与其生长速度造成不良的影响。

(2)对照组中的细胞形态及生长情况如下：

原代细胞形态为纺锤形，2周后去掉组织块，3周后细胞可达到60％以上的融合。细胞传代后，24h观察未见明显的细胞贴壁，细胞形态变化未见明显差异；48h后，细胞出现贴壁，但是贴壁范围不大；72h后，细胞出现明显贴壁，细胞呈小区域纤维细胞样集落形的形式生长，但胞质中颗粒不明显。

结果分析：从上述的结果可以看出采用本发明实验组1-23中所述方法从脐带中分离培养间充质干细胞，其细胞形态变化及其速度优于对照组。

2、细胞培养成功率的测定

实验方法：采用台盼蓝(Trypan Blue)对实验组1-23与对照组的细胞进行测定，以评价其原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4％台盼蓝直接对所需检测的细胞进行染色，并在显微镜下观察，以判断细胞的生存能力。

实验结果：

本发明实验组1-23中台盼蓝染色并不明显，实验组1-23中所分离细胞的存活率可达到99％以上。

对照组所分离细胞的存活率为97-98％。

结果分析：本发明实验组1-23中细胞分离后的存活率略高于对照组的细胞存活率。

3、对从脐带分离和培养间充质干细胞进行特征分析

实验方法：为了验证通过本发明获得的脐带来源的细胞是否具有间充质干细胞的特征，将上述获得的第3代(P3)细胞培养至接近融合时，用含0.25％胰蛋白酶-EDTA将细胞消化下来，采用PBS洗涤1次，制成单细胞悬液，将细胞密度调整为l×l0⁶/ml。用PBS(磷酸盐缓冲液)再次洗涤细胞，室温下与CD44、CD105、CD90、CD45、CD34等单克隆抗体孵育15min。再以PBS洗涤细胞后重悬细胞于0.5ml含1％多聚甲醛的PBS中固定。以同型对照单克隆抗体确定背景标记。流式细胞仪进行分析。

实验结果：

实验组1-23中，所获得的细胞均显示强表达间充质干细胞的特异性标记如CD44、CD105、CD90和CD73，并对CD45、CD34、CD14、CD19及HLA-DR表达阴性。

对照组中所获得的细胞显示强表达的特异性标记包括CD44、CD54、CD29、CD29e，并对CN64、CD106、CD51、CD61的抗体显示为阴性反应。

结果分析：目前国际公认的MSCs表型特征为：细胞表面CD73、CD90、CD105等抗原呈阳性，而CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等造血谱系分子表达阴性。进一步地，骨髓、脂肪组织、脐带组织和脐带血来源的MSCs在传代扩增过程中形态基本一致，流式细胞术检测传代扩增细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166、CD146阳性标记出现单峰，CD3、CD14、CD19、CD34、CD117、CD133、CD45、CD235a、HLA-DR均表达阴性。

可见，本发明实验组1-23中从脐带来源的细胞的免疫表型与间充质干细胞的免疫表型相同，这说明通过本发明中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法分离培养获得的细胞具有间充质干细胞的特征。

进一步地，本发明实验组1-23中所获得的间充质干细胞表达CD44，而不表达造血细胞及其它细胞表面标识，如CN34，也证明采用本发明所述的方法分离培养的细胞为单一的间充质干细胞。

实施例2：本发明的脐带来源的间充质干细胞向软骨细胞的分化

本实施例中采用实施例1中的实验组1中所述的方法所获得的间充质干细胞向软骨细胞的分化

具体地，本实施例的实验组1如下：

将第3代(P3)细胞以一定的细胞密度接种至六孔培养板中，六孔板中预置消毒的盖玻片，培养24h后更换为含诱导因子的诱导转化培养液，将六孔板置于5％CO₂、饱和湿度80％、37℃培养箱中培养，每周按需换液2-3次。

该诱导转化培养液的组分包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、100μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠及6.25μg/ml转铁蛋白。

***的含量范围可为98-99μmol/ml、98.5-99.5μmol/ml、98-99.5μmol/ml及98.5-99μmol/ml等。

在本实施例的诱导转化培养液中还可进一步加入β-甘油磷酸钠及维生素D₃；其中，上述的β-甘油磷酸钠的含量范围可为0.01-1μmol/ml、0.01-0.5μmol/ml、0.01-1.5μmol/ml、0.01-2μmol/ml、0.5-2μmol/ml及1-2μmol/ml等；上述的维生素D₃的含量范围可为0.01-1μmol/ml、0.5-1.5μmol/ml、1-1.5μmol/ml、0.01-1.5μmol/ml、0.01-2μmol/ml及0.5-2μmol/ml等。

在本发明其它具体的实验组中，优选的接种细胞密度为2×10⁵/ml-1×10⁶/ml之间，还可进一步优选为2×10⁵/ml-1×10⁶/ml之间的任一个区间或单一数值，具体地，接种密度还可为7×10⁴/ml-1×10⁷/ml，还可以7×10⁴/ml-5×10⁶/ml，还可进一步以7×10⁴/ml-1×10⁶/ml或7×10⁴/ml-7×10⁵/ml或7×10⁴/ml-5×10⁵/ml或2×10⁵/ml-1×10⁶/ml或5×10⁵/ml-5×10⁶/ml或7×10⁷/ml-1×10⁷/ml等细胞密度范围接种至六孔培养板中。

上述的间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为20-24天，获得软骨细胞，具体天数还可为20-22天或21-23天或22-24天或22-23天。

除实验组1之外，申请人采用不同参数值的诱导转化培养液实施了实验组2-19，具体实验参数参见如下表2：

其中，从脐带分离和培养间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导转化培养液体组分及其含量如表2中所示：

表2，从脐带分离和培养间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导转化培养液体组分及其含量列表

注：

1、表2中DMEM/F12培养液表示为DMEM培养基与F12培养基的混合比例为1:1。DMEM/F12培养液中含5％胎牛血清。

2、表2中转化生长因子βⅠ的单位为ng/ml，胰岛素及转铁蛋白的单位为μg/ml，***、β-甘油磷酸钠、丙酮酸钠及维生素D₃的单位为μmol/ml。

此外，还可采用实验组1中实验步骤及其条件要求，对实验过程中的接种细胞密度进行变形，具体的变形实验组如下：

实验组20：第3代细胞以1×10⁶/ml接种至六孔培养板中，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组21：第3代细胞以8×10⁵/ml接种至六孔培养板中，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组22：第3代细胞以5×10⁶/ml接种至六孔培养板中，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组23：第3代细胞以1×10⁷/m l接种至六孔培养板中，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组24：第3代细胞以2×10⁵/ml接种至六孔培养板中，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组25：第3代细胞以7×10⁴/ml接种至六孔培养板中，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组26：间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为22天，获得软骨细胞，并进行软骨细胞冻存处理，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组27：间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为23天，获得软骨细胞，并进行软骨细胞冻存处理，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组28：间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为24天，获得软骨细胞，并进行软骨细胞冻存处理，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组29：间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为20天，获得软骨细胞，并进行软骨细胞冻存处理，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

实验组30：间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为30天，获得软骨细胞，并进行软骨细胞冻存处理，其它实验条件与实验组1的实验条件相同。

上述实验组中各组分的特点及其作用机理具体如下：

转化生长因子β是一类多功能的细胞调节蛋白，在哺乳动物组织中有三种形式，即转化生长因子βⅠ、转化生长因子βⅡ及转化生长因子βⅢ，其中，转化生长因子βⅠ、βⅡ与βⅢ均有参与胚胎形成和发育并调控MSCs分化与增值、参与创伤愈合等多种功能，并能显著刺激软骨细胞的增生，***，和分化。转化生长因子βⅠ不但上调软骨相关基因的表达(蛋白聚糖和II型胶原)，还增加了内源性转化生长因子βⅠ和相应受体的表达。此外，转化生长因子βⅠ还可增加³ H-胸腺嘧啶的整合。在体外，转化生长因子βⅠ对MSCs的作用是以剂量的依赖方式，在2-10ng/ml范围内就能有效地刺激软骨细胞的形成。而且，在培养条件下短期给予转化生长因子βⅠ就能诱导MSCs分化，提高软骨细胞的数量。

如本实施例中转化生长因子βⅠ浓度以及所加入的其它诱导因子的影响下，转化生长因子βⅠ的诱导效果有所增强，并优于转化生长因子βⅢ的诱导分化效果。

在胚胎软骨形成的过程中，转化生长因子βⅠ还可以诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨细胞，并可以进一步促进软骨细胞增殖和成熟，增加软骨细胞合成和分泌蛋白多糖的作用。

***是人工合成的糖皮质激素，可以通过增强***受体与基因组靶序列的亲和性，从而可以调控受体细胞中分化基因的表达，从而提高碱性磷酸酶的活性以及软骨基质标记分子的蛋白质水平，尤其是Ⅱ型胶原的水平，将***与转化生长因子βⅠ结合使用，可以使从脐带分离的间充质干细胞向软骨分化。

胰岛素可以刺激软骨细胞集落形成和细胞的增殖。

含5％胎牛血清与10ng/ml转化生长因子βⅠ联合作用也可诱导间充质干细胞向软骨细胞分化。

β-甘油磷酸钠可以被碱性磷酸酶水解，还可以诱导骨矿物质的形成，并促进乳酸的产生，增强碱性磷酸酶的活性，增强蛋白质和磷脂的合成。

维生素D₃是一种开环甾体化合物，在细胞周期中可以抑制细胞增殖，从而骨形成和骨吸收达到一个平衡的状态。

在部分实验组中，虽然只加入了少量的β-甘油磷酸钠与维生素D₃，但加入的0.5-1.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠与0.1-1μmol/ml维生素D₃与10ng/ml转化生长因子βⅠ、98-99μmol/ml***及6.25μg/ml胰岛素的协同作用，成功诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，相较于加入转化生长因子βⅢ的诱导转化培养液，具有更好的转化效果。

对采用本实施例中实验组1-30中所述的方法将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，对软骨细胞进行免疫化学检测分析。具体检测方法如下：

1、苯胺蓝染色分析

实验方法：取出载有采用实施例2中实验组1-30中所述方法制备获得的细胞的玻片，分别进行PBS漂洗2次，并采用4％多聚甲醛室温固定20min，甲苯胺蓝液作用30min，水洗，冰醋酸液分化数秒钟，脱水、透明，中性树脂封片。并以以软骨细胞作为阳性对照

实验结果具体如表3中所示。

结果分析：

从上述的结果可以看出，采用实施例2中实验组1-30所述的方法分析培养获得的间充质干细胞诱导分化为软骨细胞分泌多糖物质，可以充分地认为本发明的细胞能够充分实现软骨细胞的功能。

2、免疫组化II型胶原鉴定

实验方法：取出载有采用实施例2中实验组1-30中所述方法制备获得的细胞的玻片，PBS漂洗2次，4％多聚甲醛室温固定20min，新鲜配制0.5％H₂O₂室温浸泡30min以灭活内源性过氧化物酶，滴加封闭液室温作用20min封闭非特异性结合位点，滴加1:150的兔抗人II型胶原抗体(一抗)，37℃孵育1-2h，滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育20min，DAB显色15min，苏木素轻度复染，脱水、透明，中性树脂封片。用PBS代替一抗作为空白对照，以软骨细胞作为阳性对照。

实验结果具体如表3中所示。

表3，本发明实施例2中实验组1-30免疫化学检测分析结果列表

注：“○”表示表征免疫化学检测结果，“×”表示未表征免疫化学检测结果。

结果分析：

从上述的结果可以看出，采用本发明实施例2中实验组1、5-22、24、26-29所述的方法分析培养获得的间充质干细胞诱导分化为软骨细胞分泌II型胶原，也可以认为本发明的细胞能够充分实现软骨细胞的功能。因此本发明中脐带来源的间充质干细胞可以在适当条件下分化成软骨细胞。

结合表2与表3中可以看出，本发明实施例2中实验组2-4中表征免疫化学检测结果出现异常的原因是：转化生长因子βⅠ的用量修改为5ng/ml、15ng/ml、20ng/ml。由于，10ng/ml的转化生长因子βⅠ在本实施例2中提供了适当的外源信号，其可与细胞内源性因子结合，共同诱导间充质干细胞向软骨细胞方向分化，如转化生长因子βⅠ还可与***联合作用，诱导全部的间充质干细胞向软骨细胞分化。当转化生长因子βⅠ的用量增加或较少，其诱导的效果变差，不利于间充质干细胞向软骨细胞的转化分化。

本发明实施例2中实验组23及25表征免疫化学检测结果出现异常的原因是：接种的细胞密度变化过大，由于在体外培养软骨细胞，在不同的细胞的接种密度下，会对软骨细胞分化造成一定的影响，其甚至可以反分化或向肥大软骨细胞转化。如在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度过大或过小，软骨细胞的生长***经过和形态功能完全不同，因此，免疫化学检测结果出现了异常。

在本发明实施例2中实验组30表征免疫化学检测结果也出现异常，其原因是：间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的时间为30天，诱导分化时间过长，导致软骨细胞分化出现异常。

在本发明实施例2中实验组9-19均能将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，与本发明实施例2中实验组1相比，实验组9-19中从间充质干细胞向软骨细胞分化的细胞增殖能力优于实验组1。在本发明中采用³H-TdR((³H-Thymidine,胸腺嘧啶核苷)掺入细胞分析来反应软骨细胞的增殖能力。本发明实施例2中实验组9-19由于加入的0.5-1.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠与0.1-1μmol/ml维生素D₃与10ng/ml转化生长因子βⅠ、98-99μmol/ml***及6.25μg/ml胰岛素的协同作用，对将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞起到调控并促进软骨细胞增殖，从而降低了细胞内cAMP的水平，使S/G₂M期细胞比例的增加的作用。而本发明实施例2的实验组1中，虽然也可以将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，但是其诱导分化效果及软骨细胞的增殖能力明显差于实验组9-19。因此，实验组9-19相对于实验组1具有更优的诱导分化及细胞增殖效果。

以实验组11为例，与本发明实验组1中所不同的是，在加入转化生长因子βⅠ以及***的基础上，实验组11中加入了2μmol/ml的β-甘油磷酸钠，并将***的浓度调整为98μmol/ml。在实验组11中，2μmol/ml的β-甘油磷酸钠与10ng/ml转化生长因子βⅠ及98μmol/ml***协同作用并促进间充质干细胞向软骨分化及软骨细胞的增殖。

以实验组14为例，与本发明实验组1中所不同的是，在加入转化生长因子βⅠ以及***的基础上，实验组14中加入了0.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml的维生素D₃，并将***的浓度调整为99μmol/ml。实验组14中各组分协同作用并促进间充质干细胞向软骨分化及软骨细胞的增殖。

实施例3：采用本发明实施例2中的实验组12、14中所制备获得的间充质干细胞治疗骨关节炎

将本发明实施例2中的实验组12、14中所述的方法将采用本发明实施例1中实验组1的方法分离培养获得的间充质干细胞的第3代细胞加入实施例2中的实验组12、14中的诱导分化培养液中，形成1×10⁸/ml的间充质干细胞-培养液混合物。以无菌注射器取1ml细胞悬浮液(含1×10⁸/ml的间充质干细胞)，并直接将其转移到冻干的具有一定三维形态的透明质酸钠结构中，使其形成均匀的混合物。

(1)轻度骨关节炎患者：局部麻醉后，以无菌注射直接注射入关节腔内。

(2)中度骨关节炎患者：局部麻醉后，通过关节镜进行软骨损伤清创，使用3-5mm的钻头钻出间隔2-3厘米的孔，将混合物填充软骨损伤部位上的孔。

(3)重度骨关节炎患者：施用麻醉剂后，通过关节切开术进行软骨损伤清创，在软骨表面形成“碗”状凹槽，将混合物填充软骨损伤部位上的凹槽中。

在使用本发明的组合物治疗关节软骨损伤的方法中,要治疗的关节软骨区域优选通过关节内窥手术迸行观察,损伤区域处理成便于手术的状态,然后将本发明的组合物应用到损伤区域,优选通过关节内窥镜来确认其是否稳固。本发明的组合物可以在应用到损伤区域之前预先配制成适合进入损伤区域的形式,或者在其应用到损伤区域之后改变成适合状态。

以悬浮在合适的培养基中的状态,或者在与聚合物混合以后,上述培养的细胞可以直接移植到关节软骨损伤区域，即可以使用将悬浮在培养基中的没有与聚合物混合的细胞注射到软骨损伤区域相应的生物膜(比如骨膜)形成的空间的方法,封闭它们以使悬浮的细胞不会从骨膜的裂缝渗出,缝合手术的切口。

具体的治疗实施例如下所示：

1、治疗前后对比

病例1：女性，65岁，ICRS(国际软骨修复协会软骨损伤分级***)评分II；软骨缺损面积2.25cm ² 。

具体采用本发明实施例2的实验组11中所述的培养条件进行分离培养并形成1×10⁸/ml的间充质干细胞-培养液混合物。

该诱导转化培养液由含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、98μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白及2μmol/ml的β-甘油磷酸钠组成。

病例1治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图1a、2a中所示。

病例1治疗后关节的核磁共振(MRI)情况如图1b、1e及图2b-2e中所示。

对比上述附图可以看出，在病例1采用本发明中所述方法制备的软骨细胞治疗前软骨缺损区域较明显，在采用本发明中所述的制备方法制备获得的软骨细胞进行治疗后，软骨缺损区域明显减少。具体地，图1b-1e及图2b-2e为分别相对于图1a及图2a中所示的关节处治疗后，每隔两月一次对进行相同手术部位进行相同的检查后所获得的关节处的核磁共振(MRI)图。

病例2：男性，52岁，ICRS评分II；软骨缺损面积3.6cm ² 。

具体采用本发明实施例2的实验组14中所述的培养条件进行分离培养并形成1×10⁸/ml的间充质干细胞-培养液混合物。

该诱导转化培养液由含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子βⅠ、6μg/ml胰岛素、50μmol/ml***、2μmol/ml丙酮酸钠、6μg/ml转铁蛋白、0.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml维生素D₃组成。

病例2治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图3a、4a中所示。

病例2治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图3b、4b中所示。

对比上述附图可以看出，在病例2采用本发明中所述方法制备的软骨细胞在治疗前(如图3a与图4a中所示)，软骨下骨囊腔内病变严重、软骨缺损区域较大，在采用本发明中所述的制备方法制备获得的软骨细胞进行治疗后，如图3b与图4b中所示，病变部位及软骨缺损区域明显减少。

病例3：女性，32岁，ICRS评分II；软骨缺损面积3.74cm ² 。

该诱导转化培养液由含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、2μmol/ml丙酮酸钠、6μg/ml转铁蛋白及2μmol/ml的β-甘油磷酸钠组成。

病例3治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图5a、6a中所示。

病例3治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图5b、6b中所示。

如图5a与图6a中所示，病例3在进行治疗前，软骨区域具有明显的缺陷部分，在采用本发明中所述的制备方法制备获得的软骨细胞进行治疗后，如图5b与图6b中所示，治疗前软骨的缺陷部分已经基本再次形成具有完整弧面的软骨。

病例4：男性，57岁，ICRS评分II；软骨缺损面积6cm ² 。

该诱导转化培养液由含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、100μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、0.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml维生素D₃组成。

病例4治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图7a、9a中所示。

病例4治疗前关节的核磁共振(MRI)情况如图7b、9b中所示。

如图7a、图8a及图9a中所示，病例3在进行治疗前，软骨缺陷区域明显，在采用本发明中所述的制备方法制备获得的软骨细胞进行治疗后，如图7b、图8b及图9b中所示，治疗前软骨缺陷区域部分已经基本愈合。

如上所述,采用本发明中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法所获得的软骨细胞用于治疗骨关节炎,具有较好的治疗效果。

其次，采用本发明中所述的方法，从同一个供体的脐带中分离和培养间充质干细胞的分离的成活率达到99％以上，远高于采用现有技术中分离培养获得间充质干细胞的获得率。

综上，采用本发明所述的方法制备获得的软骨细胞可用于人体软骨缺损的治疗中，且可利于间充质干细胞及软骨细胞的大规模生产，具有较大的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等均应包含本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其特征在于：

从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化，该消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0.5-1.5mg/ml胶原酶、4.5-5.5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成；

将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞包括将第3代细胞以7×10⁴/ml-1×10⁷/ml接种至培养板中，培养板中预置消毒的盖玻片，培养24h后更换为含诱导因子的诱导转化培养液，将培养板置于5％CO₂、饱和湿度80％、37℃培养箱中培养，每周换液2-3次；

其中，其该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子βⅠ、6-6.5μg/ml胰岛素、98-100μmol/ml***、0.5-1.5μmol/ml丙酮酸钠及6-6.5μg/ml转铁蛋白。

2.如权利要求1中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

脐带处理过程中，采用双抗盐水冲洗脐带外表面，该双抗盐水为含100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的生理盐水；

脐带处理过程中包括去除脐带与脐血管表面的凝血块，并更换容器，将表面处理干净的脐带置于双抗盐水中浸泡15-18min；取出脐带，更换容器，再重复用双抗盐水浸泡2-4次，每次15-18min；更换无菌容器，脐带切段，再次更换无菌容器，沿两侧纵向剖开脐带表面的羊膜，纵向撕开脐带，去除脐动脉和脐静脉及其它血管淤血后，在双抗盐水中洗涤至盐水无色清澈。

3.如权利要求2中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养包括将已完成淤血处理的脐带和脐血管分别转移至无菌消化容器中，用无菌剪刀将组织剪碎；然后将剪碎的组织及PBS混合并离心获得沉淀物，将配好的消化液加入沉淀物中，吹起沉淀后转移至另一无菌培养皿中，并放入无菌培养箱37°消化4-7h；将消化好的溶液及组织离心后获得沉淀物；沉淀物用细胞培养液重悬，接种于10cm培养皿中，此时的细胞称为原代细胞，置于37℃、饱和湿度、含5％CO₂孵箱中培养；24h全量换液，并每2-3天更换培养液。

4.如权利要求3中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：该消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0.5-1mg/ml胶原酶、4.5-5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成；

细胞传代培养获得间充质干细胞还包括在原代细胞培养中待细胞长至70％-80％融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，采用PBS洗涤后，再加入5ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化；

而第3代细胞以2×10⁵/ml-1×10⁶/ml接种至培养板后进行间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的培养。

5.如权利要求4中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

该消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入1mg/ml胶原酶、5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成。

6.如权利要求5中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6-6.5μg/ml胰岛素、98-100μmol/ml***、0.5-1.5μmol/ml丙酮酸钠、6-6.5μg/ml转铁蛋白、0-2μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0-1.5μmol/ml维生素D₃。

7.如权利要求6中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、98μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、1.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml维生素D₃。

8.如权利要求6中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、99μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、0.5μmol/ml的β-甘油磷酸钠及0.5μmol/ml维生素D₃。

9.如权利要求6中所述的从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其特征在于：

该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液及10ng/ml转化生长因子βⅠ、6.25μg/ml胰岛素、98μmol/ml***、1μmol/ml丙酮酸钠、6.25μg/ml转铁蛋白、2μmol/ml的β-甘油磷酸钠。