PT1292671E - Processo de obtenção de populações celulares caracterizadas de origem muscular e utilizações - Google Patents
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DESCRIÇÃO "PROCESSO DE OBTENÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES CARACTERIZADAS DE ORIGEM MUSCULAR E UTILIZAÇÕES" A terapia celular é uma técnica com potencial significativo para o tratamento de várias patologias. 0 princípio da terapia celular reside na possibilidade de reconstituir um tecido danificado ou de restaurar uma função biológica perdida ou alterada dentro de um tecido, a partir de células específicas cultivadas ex vivo e transplantadas no tecido doente. Um outro interesse da terapia celular consiste na possibilidade de utilizar as células transplantadas como plataforma de distribuição de um produto biologicamente activo, se necessário, após a modificação genética das células antes do transplante. Estão descritos numerosos ensaios para a terapia celular a partir de culturas primárias de diferentes tipos celulares. Podem-se referir os transplantes de células neuronais realizados para o tratamento da doença de Huntington (1) ou da doença de Parkinson (2), transplantes de células de ilhéus de Langerhans realizados para o tratamento da diabetes (3) ou ainda transplantes de células mioblásticas realizados para o tratamento da distrofia muscular de Duchenne (4, 5, 6, 7) ou após modificação genética das células, para o tratamento do nanismo (8), da hemofilia (9) e da doença de Parkinson (10). A regeneração do músculo esquelético é assegurada pelas células satélite que são células mononucleadas miogénicas localizadas sob a lâmina basal das fibras musculares. Em 1 consequência de uma lesão, essas células saem do estado de quiescência para entrar numa fase da proliferação activa e tomar o nome de mioblastos. Em consequência, os mioblastos fundem-se para formar os miotubos. Foram realizados ensaio de transplante de mioblastos no homem, para tratar a distrofia muscular de Duchenne e a distrofia muscular de Becker (4, 6, 7, 11). Embora o efeito funcional dos transplantes descritos nesses estudos permaneça limitado, não foi descrito qualquer efeito secundário em termos de infecção ou de carcinogénese.
Além disso, foi considerada a utilização de células mioblásticas no tratamento de cardiopatias e em particular da insuficiência cardíaca pós-isquémica. De facto, ao contrário do tecido muscular, os tecidos miocárdicos são desprovidos de células estaminais capazes de formar cadiomiócitos e regenerar tecidos. 0 tratamento mais radical da insuficiência cardíaca pós-isquémica continua a ser, de momento, o transplante cardíaco. No entanto, a falta de enxertos limita esta utilização terapêutica. Foi consequentemente considerado o transplante de células provenientes de tecidos musculares no músculo cardíaco como uma alternativa ao transplante cardíaco. Foram realizados estudos de transplante de mioblastos em tecido enfartado do miocárdio em rato, coelho ou cão (12, 13, 14) . Os resultados desses estudos mostraram a exequibilidade e alguma eficácia funcional desses transplantes. Os ensaios de enxertos de cardiomiócitos fetais, num modelo da insuficiência cardíaca de origem iatrogénica no murganho, revelaram também algum benefício funcional. No entanto, a utilização de células fetais coloca, na perspectiva da aplicação clínica, numerosos problemas éticos, imunológicos e de aprovisionamento celular. A utilização de uma população de células mioblásticas provenientes do músculo esquelético constitui, consequentemente, uma alternativa 2 particularmente interessante para a preparação de produto de terapia celular para o tratamento da insuficiência cardíaca pós-isquémica ou, mesmo, para o tratamento de cardiopatias de diversas origens.
Um dos tipos celulares mais importantes contido no tecido muscular consiste na célula satélite, precursora do mioblasto. Este é o tipo celular que foi utilizado em vários estudos clínicos. No entanto, o tecido muscular contém outros tipos celulares. Em particular, podem ser também utilizadas algumas células de origem muscular para a reconstituição de um potencial hematopoiético (15, 16). Um estudo in vitro demonstrou, também, a presença no músculo humano de progenitores susceptíveis de se diferenciarem, a longo prazo, em tecidos cartilaginosos ou ósseos (17) . Estão descritos exemplos de meios permitindo a diferenciação em tecido adiposo, cartilaginoso ou ósseo para células estaminais mesenquimatosas (22).
Consequentemente, tendo em consideração as propriedades da diferenciação das células de origem muscular, a utilização dessas células em terapia celular parece ser interessante para o tratamento de numerosas lesões afectando os tecidos do sistema hematológico e imunológico, os tecidos ósseos, adiposos, cartilaginosos, musculares ou vasculares.
Uma das maiores dificuldades em terapia celular reside na obtenção de uma população celular suficientemente grande, homogénea e cujo grau da diferenciação esteja adaptado ao efeito pretendido.
No estado da técnica são descritos processos de preparação de células mioblásticas e sua utilização em terapia celular 3 (4, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27). A maioria dos processos compreende: uma etapa de recolha de tecidos musculares por biópsia, uma etapa de trituração, uma etapa de dissociação das fibras musculares por acção enzimática, uma etapa de separação das células individualizadas por filtração, uma etapa de selecção das células mioblásticas por clonagem ou por separação celular.
De modo a obter uma população suficientemente densa e rica ou mesmo populações puras em células mioblásticas, tem sido proposto seleccionar as células mioblásticas com base na expressão de marcadores específicos. Deste modo, a selecção das células mioblásticas pode ser realizada pela clonagem das células e a caracterização ulterior dos clones obtidos por citofluorimetria, seguida de selecção das células musculares esqueléticas expressando o antigénio CD56 (7). São também descritos no estado da técnica um método directo de separação das células mioblásticas expressando o antigénio CD56 por citofluorimetria de fluxo e as suas vantagens para obter uma cultura pura de mioblastos (21) . 4
As células conservadas são, seguidamente, cultivadas num meio de cultura modificado e especialmente adaptado à cultura de mioblastos (23). A presente invenção resulta da observação de que as células provenientes do tecido muscular esquelético apresentam um potencial de regeneração de numerosos tecidos de acordo com o seu grau da diferenciação. A invenção proposta permite consequentemente proporcionar populações celulares bem caracterizadas de origem muscular. A presente invenção proporciona um processo de obtenção de uma população celular compreendendo um tipo celular dominante, a partir de uma biópsia de tecido muscular, compreendendo o referido processo as etapas seguintes: a) recolha e trituração de uma biópsia muscular, b) dissociação enzimática das fibras e das células musculares e separação das células individualizadas por filtração, c) colocação em cultura das células de origem muscular, obtidas deste modo, num reactor de cultura de células aderentes na presença de um meio compreendendo MCDB 120 E D-valina substituída por L-valina seguido, se necessário, por uma ou mais fases de expansão, d) identificação dos tipos celulares presentes nas diferentes estádios de cultura por análise de marcadores celulares específicos, 5 e) selecção do estádio de cultura durante o qual o tipo celular pretendido está em proporção dominante na população celular, f) recolha de uma população celular no estádio de cultura seleccionado em e), g) se necessário, congelação das células recolhidas na etapa seleccionada. A etapa d) é facultativa na medida em que, quando o processo é utilizado várias vezes nas mesmas condições, o especialista conhece os tipos celulares presentes nos vários estádios da cultura e as suas proporções relativas sem necessidade de repetir a etapa da identificação.
Foi, de facto, constatado que a etapa da identificação (d) origina resultados praticamente idênticos quando foi repetido o mesmo processo.
Num modo de realização particular da invenção, o processo compreende, adicionalmente, a realização de técnicas de empobrecimento ou enriquecimento antes da etapa de cultura c) ou antes da expansão, para modificar as proporções de diferentes tipos celulares.
Os termos "população celular" ou "população de células" significam qualquer população de células não puras, contendo, em geral, um tipo celular dominante e um ou mais tipos celulares minoritários. 0 tipo celular dominante é o tipo celular cuja proporção na população celular é a mais elevada. De um modo preferido, um tipo celular dominante é o tipo celular cuja 6 proporção na população celular excede 50%. Um produto de terapia celular adequado para administração humana compreende uma solução isotónica na qual as células são ressuspensas. Esta solução deve ser isenta de componentes tóxicos presentes nos meios da congelação. Um desses componentes é, por exemplo, o DMSO. A invenção resulta, em particular, da constatação de que o processo permite obter uma população de células cuja composição está adaptada ao efeito terapêutico pretendido. Este permite obter uma população celular cujo tipo celular dominante expressa o marcador CD56+ e o marcador HLA da classe I sem clonagem prévia, nem selecção positiva de células expressando o marcador CD56+. A biópsia muscular é, em geral, realizada por recolha de cubos com 2 a 4 cm de lado. Podem-se recolher de 0,05 gramas até várias dezenas de gramas, de acordo com as necessidades. Uma das vantagens do processo é que permite obter um número muito elevado de células de um tipo celular em proporção dominante, variando de alguns milhares a vários biliões, de acordo com o tipo celular pretendido, o número de expansões realizadas e o tempo dispendido em cada passagem. A titulo de exemplo, o processo permite produzir até várias centenas de milhão de células expressando o antigénio CD56 no final de um período de duas a três semanas. O processo permite numerosas fases de expansão, este permite, nomeadamente, a obtenção teórica de, pelo menos, 100 biliões de células expressando o antigénio CD56+ e o antigénio hla da classe I no final de 8 a 9 expansões. O tecido muscular recolhido é um tecido muscular esquelético, de um modo preferido, recolhido de um adulto, adulto jovem, adolescente ou criança. Numa forma de realização da invenção, o 7 tecido muscular recolhido é um tecido muscular esquelético fetal. As células podem ser, nomeadamente, obtidas de vasto externo, vasto interno, bicepes, quadricepes, tibial, gastronémico, peronial, deltoide, grande dorsal, esternocleidomastoideu, intercostal, homo-hióide, grande recto ou psoas. A trituração consiste no corte da biópsia em secções com um tamanho, de um modo preferido, inferior a 0,5 mm colocadas num meio de cultura adaptado. A trituração é uma etapa essencial para permitir uma dissociação enzimática ulterior eficaz. A trituração pode ser realizada manualmente utilizando uma tesoura fina. No entanto, de um modo inesperado, foi verificado que, quando a etapa de trituração é realizada de um modo assistido, com auxilio por exemplo de homogeneizadores de facas eléctricos ou mecânicos, o processo da invenção no qual o meio de cultura está adaptado à diferenciação em mioblastos permite obter uma população cuja percentagem de células expressando o antigénio CD56 é particularmente elevada. Um exemplo desse triturador utilizável é o triturador Medimachine® (distribuído por Becton-Dickinson) .
Consequentemente, num modo da realização, o processo da invenção é caracterizado por a etapa de trituração ser assistida utilizando homogeneizadores de facas, mecânicos ou eléctricos.
Os tecidos musculares são constituídos por fibras musculares. As células satélite estão localizadas sob a lâmina basal das fibras musculares. A etapa da dissociação das fibras musculares e de separação das células satélite é, consequentemente, uma etapa necessária para o seu isolamento. A etapa da dissociação consiste na utilização de enzimas de 8 digestão da matriz extracelular, esta pode ser completada por uma dissociação mecânica por aspiração e expulsão da suspensão através de uma pipeta. A selecção das enzimas e as suas concentrações, utilizadas para a dissociação das fibras musculares e das células satélite do triturado, é guiada pelo estudo da sua eficácia enzimática, os critérios procurados são uma concentração de enzima o menos elevada possível e um tempo de incubação minimo para uma eficácia semelhante. 0 rendimento em células obtidas após a filtração depende, em parte, da qualidade da etapa de dissociação enzimática. As enzimas de digestão utilizáveis no processo da invenção isoladamente ou em associação são, por exemplo: todas as colagenases, incluindo os tipos IA, S e H parcialmente purificados, assim como a forma purificada comercializada sob o nome de Liberase por Roche-Boehringer, tripsinas, de qualquer origem, em solução em tampões contendo ou não EDTA, dispases (também conhecidas sob o nome de proteases), pronase, elastases, ou ainda, hialuronidases. 9
De um modo preferido, a etapa da dissociação é realizada em duas vezes; uma primeira incubação na presença de colagenase e uma segunda incubação na presença de tripsina. Quando é utilizada liberase, as concentrações particularmente eficazes para utilização no triturado situam-se entre 0,05 e 2 mg/mL. Os tempos de incubação a 37 °C para essas concentrações são seleccionados de uma gama de tempos que varia de 15 minutos a 2 horas. De um modo preferido, a actividade das enzimas de dissociação é neutralizada após dissociação ou separação da camada celular com o objectivo de evitar a danificação das células.
Após a neutralização da actividade enzimática, por adição, por exemplo, de soro do vitelo fetal, soro humano autólogo ou soro humano alólogo proveniente de um grupo compatível ou ainda de um inibidor da actividade enzimática, o produto de digestão é, seguidamente, filtrado num crivo, sob a pressão da gravidade para eliminar as fibras não dissociadas e recolher as células separadas das fibras musculares. De um modo preferido, uma etapa da filtração irá ser realizada em duas vezes: uma etapa de filtração num crivo de 100 μΜ, seguida de uma segunda etapa num crivo de 40 μΜ.
As células recolhidas após filtração são transferidas para um reactor da cultura, na presença de um meio cuja composição permita o seu crescimento ou/e a sua diferenciação. A composição do meio é seleccionada de acordo com o tipo celular dominante pretendido no final da cultura. Neste estádio, uma parte da preparação pode ser congelada. Esta pode ser parte da preparação inicial ou ser uma subpopulação proveniente de uma etapa de enriquecimento ou de empobrecimento. Os meios de cultura utilizados contêm um ou mais factores de crescimento e/ou de 10 diferenciação cujo papel consiste em direccionar as células progenitoras para uma via de diferenciação especifica e em fazê-las proliferar. A titulo de exemplo de factores de crescimento, podem-se referir factores de crescimento dos fibroblastos, bFGF, aFGF, FGF6, factor de crescimento dos hepatócitos, HGF/SF, da epiderme, EGF e vários factores caracterizados, tais como IGF-1, PDGF, LIF, VEGF, SCF, TGFb, TNFa, IL-6, IL-15, NGF, neuregulina, trombopoietina e a hormona do crescimento. Pode-se associá-los a várias hormonas ou moléculas activas que podem entrar na composição dos meios, tais como glucocorticóides (naturais ou semi-sintéticos, i. e., hidrocortisona, dexametasona, o prednisolona ou triamcinolona), progestagenos e derivados (progesterona), estrogénios e derivados (estradiol), androgénios e derivados (testosterona), mineralocorticóides e derivados (aldosterona), hormonas LH, LH-RH, FSH e TSH, hormonas da tiróide T3, T4, ácido retinóico e os seus derivados, calcitonina, prostaglandinas E2 e F2/alfa ou hormona paratiróide. A preparação pode ser objecto de enriquecimento ou de empobrecimento antes da colocação em cultura ou durante uma fase da expansão. Essas operações são realizadas pelo especialista na técnica utilizando várias técnicas propostas no estado da técnica para realizar uma separação selectiva. Essas técnicas baseiam-se na identificação de antigénios extracelulares caracteristicos desse ou desse tipo celular por reagentes específicos. A titulo de exemplo, podem ser utilizados os antigénios CD34 e CD56, expressos em determinadas células presentes dentro da população de células musculares. A separação inicial da população celular total de acordo com a expressão desses dois antigénios permite separar, deste modo, dois grupos. Em particular, esta permite separar os tipos celulares CD34+ dos 11 tipos celulares CD34-. Foi demonstrado que a população CD34+ produz um tipo celular dominante CD15+, CD56- não expressando desmina. A população CD34- produz um tipo celular dominante CD56+, CD15- expressando desmina. Em casos raros, a população CD34- produz uma população CD56-, CD15-. Em particular, o processo da invenção compreende uma etapa de empobrecimento das células CD34- ou CD34+ originando, respectivamente, uma população compreendendo um tipo celular dominante CD15+ ou CD56+.
Uma forma de realização do processo da invenção refere-se, consequentemente, a um processo de obtenção de uma população celular cujo tipo celular dominante é o tipo celular mioblástico caracterizado por este compreender uma etapa de empobrecimento de células CD34+ antes da colocação em cultura das células ou durante uma das fases de expansão. As células são, seguidamente, colocadas em cultura num reactor adaptado para a cultura de células aderentes. Para evitar os constrangimentos do controlo da velocidade de agitação , da sua regularidade e da homogeneidade das preparações, o reactor da cultura é, de um modo preferido, estático. Este deve apresentar uma grande superfície da cultura em comparação com os suportes normais (caixas de Petri, frascos) de forma a reunir em alguns dias uma população celular significativa. Um exemplo de um desses reactores de cultura é o dispositivo de cultura em placas (simples, duplo e/ou de vários níveis). 0 dispositivo de cultura utilizada no processo permite, adicionalmente, a recolha das células de um modo estéril para realizar as amostragens necessárias à identificação dos tipos 12 celulares presentes nos diferentes estádios da cultura por análise de marcadores específicos. Este permite a drenagem dos meios, a lavagem e a separação das células e, finalmente, a sua recolha de uma forma estéril.
De um modo preferido, são utilizadas bolsas e tubuladuras estéreis especialmente adaptadas ligam as bolsas ao reactor para permitir as transferências dos meios ou a recolha de células. Este dispositivo permite, deste modo, realizar um grande número de operações em sistema fechado. De acordo com a população celular pretendida, o número de dias de cultura varia de 0 a 45 dias.
Além disso, a cultura pode ser realizada por técnicas normais de expansão ou de perfusão durante um período que pode chegar a vários meses. São possíveis uma ou mais fases de expansão para aumentar o número de células recolhidas. As fases de expansão compreendem uma etapa de separação das células, de lavagem das células e recolocação em cultura numa maior superfície de cultura, sendo as soluções e enzimas utilizadas para realizar essas etapas bem conhecidas do especialista na técnica. Em particular, num modo de realização preferida utilizando um meio de cultura adequado para a diferenciação em mioblastos, o processo da invenção inclui, pelo menos, três fases de expansões de células. Esse processo permite multiplicar o número de células sem modificar significativamente as proporções dos tipos celulares obtidos no final da cultura de cada expansão. 13 É realizada uma cinética da diferenciação no processo da invenção pela identificação dos tipos celulares presentes nas populações de células obtidas nos diferentes estádios da cultura. No texto que se segue, designar-se-á a etapa de identificação dos tipos celulares presentes nos diferentes estádios da cultura pelo termo "caracterização das populações celulares". Esta caracterização é realizada a partir de amostras recolhidas no momento da colocação em cultura, durante a cultura e durante a recolha das células. A caracterização das populações celulares pode ser também realizada numa cultura de células realizada paralelamente a uma menor escala mas em condições idênticas ou equivalentes em termos de meio de cultura e de processo de realização de fases da expansão. A caracterização refere-se às células aderentes ou às células presentes no sobrenadante. Os diferentes estádios de cultura são contados em dias a partir do dia da colocação em cultura em reactor até ao aparecimento das primeiras células diferenciadas ou à obtenção de um grau de confluência das células de, pelo menos, 20 a 50%. A caracterização das populações de células tem como função a identificação do todo os tipos celulares e as suas proporções em função do estádio da cultura. Esta permite evidenciar em particular os tipos celulares dominantes em função do estádio da cultura. O processo da invenção propõe, deste modo, um meio de selecção de uma população celular em função das caracteristicas dos diferentes tipos celulares presentes na população.
Esta caracterização é realizada pela análise de marcadores celulares por citofluorimetria de fluxo ou FACS, após marcação dos antigénios de superfície ou de qualquer antigénio específico dos diferentes tipos celulares a analisar. No presente texto, o termo "marcadores celulares" indica qualquer antigénio celular permitindo obter informação isoladamente ou em combinação com 14 outros marcadores num tipo celular. Pode ser utilizado qualquer tipo de marcador celular pelo processo, a selecção dos marcadores utilizados irá ser guiada pela selecção dos tipos celulares que se pretende caracterizar.
No processo da invenção pode ser realizada qualquer técnica adequada para caracterizar um antigénio celular. Pode-se referir a titulo de exemplo sem ser limitante, Western Blot ou imunocitoquimica. As técnicas permitindo a caracterização dos mensageiros de arn codificando os referidos antigénios são utilizáveis de uma forma equivalente.
Os marcadores celulares analisados para a identificação dos tipos celulares são seleccionados especificamente dos marcadores seguintes: CD10, CD13, CD15, CD16, CD34, CD38, CD40, CD44, CD45, CD56, CD71, CD80, CD117 ou ainda as estruturas seguintes, CD138, HLA-classe I, HLA-classe II, VLA3, VLA5, vla6, lcam-1, vcam e desmina. De um modo preferido, são utilizados os marcadores CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD56, CD117 e HLA Classe I e desmina. Esses marcadores são identificados pela utilização de anticorpos monoclonais específicos. A tabela 1, seguinte proporcionada na parte experimental, indica, para cada um dos marcadores, os tipos celulares expressando normalmente os antigénios correspondentes. Deve ser observado que esses marcadores celulares foram desenvolvidos inicialmente para a caracterização do sistema imuno-hematológico. Uma originalidade da invenção consiste na utilização desses marcadores para a caracterização das células de origem muscular em vários estádios da cultura ou da expansão. 0 processo da invenção é, consequentemente, realizado utilizando a análise de marcadores celulares não normalmente 15 utilizados na caracterização das células provenientes de tecidos musculares. Esses marcadores celulares são, por exemplo, CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD45, CD117 e HLA Classe I.
Foi efectivamente observado que a realização do processo da invenção permite a observação de uma evolução ao longo do tempo do tipo celular dominante presente na cultura. De um modo surpreendente, nos estádios precoces da colocação em cultura das células de tecido musculares e num meio adaptado para a diferenciação mioblástica, as populações maioritárias são as expressando os marcadores de células progenitoras da medula óssea e as células do sistema linfoblastóide. Mais precisamente, foi observado nos DO e Dl, uma maioria de células de fenótipo CD34+/45- assim como a presença de um tipo celular minoritário CD117+ na população de células não-aderentes. A evolução é seguidamente marcada por um aumento crescente na proporção de células CD15+ e/ou CD56+ e por uma redução das populações CD34+. No entanto, do DO ao D5 o tipo celular dominante permanece o CD34+. É observada uma transição progressiva da população de um tipo celular dominante CD34+ para CD56+. Para além disso, a proporção dos tipos celulares CD13+, CD44+, CD71+ aumenta com o tempo. São também observadas populações minoritárias CD138+, HLA-classe 11+ e CD38+. No final da cultura, o tipo celular dominante é do fenótipo CD56+, em particular a partir do estádio D5 até ao final da cultura. As células CD56+ expressam também CDl0, CD13, CD44, desmina, HLA-classe I, CD44, VLA-3, VLA-5 e VLA-6. Esses marcadores caracterizam as células mioblásticas. Um segundo tipo celular dominante consiste em células expressando CD15, CDlO, CD13 e HLA-classe I. Está também presente uma população CD56-/CD15-/CD13+ em proporções variáveis constituindo um terceiro tipo celular dominante. Nesta população, uma parte expressa desmina e uma parte não a expressa. A realização do 16 processo da invenção permitiu deste modo distinguir três tipos celular presente nas populações de células, cujas respectivas proporções evoluem de forma significativa durante a cultura, células CD34+, células CD15+ e células CD56+.
Numa forma de realização preferida do processo da invenção, a caracterização das populações celulares consiste na determinação da percentagem respectiva de três tipos celulares CD34+, CD15+ e CD56+ nas diferentes etapas da cultura.
Numa forma de realização da invenção, um tipo celular pretendido numa população celular é separado após a selecção do estádio da cultura durante a qual o tipo celular pretendido está no estado qualitativo ou quantitativo, em particular, após a selecção do estádio da cultura durante o qual o tipo celular pretendido é dominante. A presença em proporção dominante das células a serem separadas facilita a sua preparação. A invenção proporciona deste modo um processo de obtenção de uma população celular de elevado grau da pureza. Entende-se por população celular de elevado grau da pureza, uma população celular na qual o tipo celular dominante é superior a 50% em proporção na população celular. Irá ser óbvio que o especialista na técnica poderá realizar as diferentes técnicas propostas no estado da técnica para fazer uma separação selectiva das referidas células. A titulo de exemplo, referem-se as técnicas de separação por clonagem, citofluorimetria de fluxo ou ainda por colunas de imunoafinidade ou imunomagnéticas utilizando anticorpos específicos para as células em questão.
Pelo contrário, numa outra forma de realização, o processo da invenção é caracterizado por este não compreender etapas de purificação, selecção positiva ou clonagem de um tipo celular 17 específico. Por selecção positiva, deve-se entender qualquer etapa permitindo separar as células com base em, pelo menos, uma característica particular e nomeadamente na expressão de um marcador celular. Foi demonstrado em particular, que o processo da invenção, ao contrário dos processos descritos no estado da técnica, permite obter um produto de terapia celular compreendendo um tipo celular dominante do tipo mioblástico, sem a etapa de selecção preferida do tipo celular mioblástico. A ausência de etapas de clonagem, purificação ou selecção positiva, permite melhorar significativamente o rendimento final obtido no final dos processos de expansão em termos do número de células obtido.
No processo da invenção, após a inactivação da cultura no estádio de cultura seleccionado, pode ser recolhida uma aliquota de células e ser recolocada em cultura separadamente. 0 meio pode ser o mesmo ou ter composição diferente. Os meios de cultura são seleccionados em função da via de diferenciação pretendida. Um exemplo de meio que permite a diferenciação em mioblastos, células endoteliais, células musculares lisas ou em miof ibroblastos é o meio MCDB 120 suplementado com soro de vitelo fetal (23) que compreende, em particular, um glucocorticóide tal como a dexametasona e bFGF. Outro exemplo do meio preferido é o meio MCDB 120 modificado por substituição de L-valina por D-valina. Foi de facto observado que essa modificação permite obter um meio particularmente selectivo para a diferenciação das células em mioblastos. Esse meio permite obter, com o processo da invenção, uma população compreendendo um número muito elevado de células cuja maioria é do tipo CD56 + ou HLA Classe 1. 18
Um meio de diferenciação em tecido adiposo contém em particular dexametasona, isobutil-metilxantina e se necessário, soro de vitelo fetal, indometacina e insulina. A manutenção da diferenciação é obtida num meio contendo soro de vitelo fetal a 10% e insulina. Para obter uma diferenciação de tecidos cartilaginosos, as células são centrifugadas em micromassas e são cultivadas em meio sem soro mas contendo TGF-beta3. Um meio da diferenciação em tecidos ósseos contém dexametasona, beta-glicerolfosfato, ascorbato e se necessário, soro de vitelo fetal. A recolha das células é realizada no estádio da cultura seleccionado em função da população celular cuja obtenção é pretendida. As células não-aderentes presentes no sobrenadante ou/e as células aderentes pode ser recolhidas por este processo. As populações de células presentes no sobrenadante e de células aderentes podem ter composição diferente. Consequentemente, o modo de recolha das células irá ser função da população celular pretendida. A recolha das células aderentes é realizada por dissociação enzimática das células e separação da camada celular por técnicas conhecidas do especialista na técnica. A recolha das células não-aderentes é realizada por aspiração. A realização do processo acima, incluindo o estabelecimento de uma cinética da diferenciação a partir de células provenientes de biópsias de tecidos musculares, permite obter populações celulares caracterizadas.
As populações de células podem ser obtidas por um processo semelhante ao processo de obtenção de populações de células descritas mais acima, mas não compreende uma etapa de identificação de tipos celulares nos diferentes estádios 19 celulares. De facto, é necessária a etapa da identificação dos tipos celulares para a selecção do estádio de recolha. A partir dai, tendo realizado, pelo menos uma vez, o processo da invenção, o especialista na técnica conhece o estádio óptimo para a recolha das células em função da população pretendida, este pode obter os mesmos tipos de populações limitando o número de marcadores utilizados para a caracterização das populações de células e os estádios ao longo dos quais este realiza esta caracterização. Deste modo, por "populações de células susceptiveis de serem obtidas", é consequentemente necessário incluir uma população de células obtida pelo processo da invenção não compreendendo necessariamente uma etapa de caracterização das populações de células no âmbito da invenção, tal como descrito acima. 0 estádio óptimo de recolha é conhecido pela realização de uma cinética de diferenciação numa cultura prévia, realizada nas mesmas condições.
As diferentes populações celulares susceptiveis de serem obtidas pelo processo da invenção, com ou sem etapa de identificação são de diferentes tipos de acordo com o estádio de cultura seleccionado.
Em particular, nos estádios precoces de cultura das células, a invenção proporciona uma população celular cujo tipo celular dominante expressa o marcador CD34. Quando são apenas recolhidas células não-aderentes no estádio precoce da cultura, a população celular compreende, também, um tipo celular minoritário de fenótipo CD117+.
Pela realização do processo descrito acima, no qual o meio de cultura está adaptado à diferenciação mioblástica, a invenção 20 proporciona uma população celular cujo tipo celular dominante expressa o marcador CD15.
Finalmente, pela realização do processo descrito acima e utilizando um meio de cultura adaptado para a diferenciação mioblástica, uma forma de realização preferida da invenção proporciona uma população celular cujo tipo celular dominante é constituído por células mioblásticas. As células mioblásticas são caracterizadas por análise da expressão do marcador CD56. Estas são caracterizadas, de um modo preferido, pela análise da expressão do marcador CD56 em combinação com a análise dos marcadores CD10, CD13, CD44, HLA Classe I e desmina. A análise da expressão da desmina, proteína intracelular do citoesqueleto específica das células mioblásticas e das células musculares diferenciadas necessita de um protocolo adaptado de marcação e de análise por FACS, detalhado na parte experimental. A população celular compreende adicionalmente uma população duplamente negativa CD56”/CD15”. A invenção proporciona, em particular, uma população celular proveniente de uma mesma biópsia muscular e compreendendo de 50 x 106 a 800 x 109 células, de um modo preferido, pelo menos, 500 x 106 células das quais, pelo menos, 50% das células e, de um modo preferido, pelo menos, 60% e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos 70%, são CD56+. A invenção refere-se à utilização de uma população celular CD56+, obtida de acordo com os processos descritos acima na preparação de um produto de terapia celular para o tratamento da insuficiência cardíaca pós-isquémica ou para a reparação dos tecidos cardíacos no homem. De facto, a realização do processo permite a obtenção de um grande número de células rapidamente e 21 as populações celulares obtidas têm a vantagem de serem homogéneas e, consequentemente, serem particularmente adaptadas à preparação de um produto de terapia celular.
Esta refere-se, também, à utilização de uma população de células provenientes da mesma biópsia muscular e compreendendo 500 x 106 a 800 X 109 células, em que, pelo menos 50% e, de um modo preferido, pelo menos 60%, são CD56+ ou HLA Classe 1 na preparação de um produto de terapia celular para o tratamento da insuficiência cardiaca pós-isquémica ou de qualquer cardiopatia de origem genética, virai, medicamentosa, infecciosa ou parasitária no homem. O tratamento das cardiopatias consiste, em particular, na injecção, utilizando uma agulha, de uma população celular, cujo tipo dominante tem as caracteristicas de células mioblásticas, obtida e é preparada como produto de terapia celular, directamente no tecido miocárdico (12) ou indirectamente na circulação arterial (24).
De um modo preferido, são injectadas, pelo menos, 600 X 106 células provenientes da mesma biópsia. A insuficiência cardiaca é presentemente gerida pelo tratamento com inibidores da enzima conversora da angiotensina (ACEI). As experiências descritas abaixo sugerem um efeito de melhoria inquestionável do transplante de células mioblásticas in situ na zona enfartada quando este transplante é realizado concomitantemente com o tratamento com ACEI. A invenção refere-se, consequentemente, também à utilização de populações celulares de origem muscular obtidas de acordo com 22 os processos descritos acima como transplante para potenciar os tratamentos farmacológicos da insuficiência cardiaca. A parte experimental do presente texto descreve a realização de transplantes autólogos de células de origem muscular em ratos demonstrando a exequibilidade desta técnica. De facto, os resultados mostram que o transplante dessas células em ratos melhora significativamente os parâmetros de avaliação funcional demonstrando deste modo a exequibilidade desses transplantes. Estes demonstram, também, que a melhoria da função do miocárdio está relacionada com o número de células enxertadas. A parte experimental descreve, igualmente, os resultados obtidos em ratos, durante a utilização conjunta de células musculares autólogas e de tratamento farmacológico da insuficiência cardiaca.
Pode ser realizada uma etapa de modificação genética das células durante as fases de cultura e expansão das células nos processos proporcionados pela invenção, por transfecção de um ácido nucleico heterólogo. 0 ácido nucleico é seleccionado de forma a permitir a expressão de um polipéptido ou de uma proteína nas células transfectadas. As células transfectadas são, seguidamente, transplantadas e permitem a distribuição do polipéptido ou da proteína expressa a partir do ácido nucleico heterólogo, sendo o referido polipéptido ou proteína um produto biologicamente activo. A invenção refere-se, deste modo, à utilização de uma população de células como produto de terapia celular como uma plataforma de distribuição de um produto biologicamente activo. 23 A parte experimental que se segue compreende três partes: A primeira parte apresenta os exemplos de realização do processo permitindo de acordo com o estádio de cultura seleccionado obter populações celulares cujo tipo celular dominante é CD34+ ou CD15+ ou CD56+ (mioblásticas) ou duplamente negativo CD56-/CD15-.
Os resultados apresentados na segunda parte mostram a eficácia da técnica de transplante de células mioblásticas em tecidos cardíacos enfartados em ratos. Esta permite, também, determinar os critérios necessários para uma boa eficácia.
Finalmente, uma terceira parte apresenta os ensaios clinicos de transplante de células de origem muscular realizados no homem para reconstituição do tecido miocárdico, reparação dos tecidos miocárdicos, produção de tecido metabolicamente activo, produção de tecido apresentando uma actividade funcional inexistente antes da reconstituição realizada. Esta mostra, além disso, que as células musculares podem também desempenhar um papel na remodelação de tecido cardíaco no homem.
PARTE EXPERIMENTAL
Legenda das figuras:
Figura 1: Gráfico indicando os valores de LVEF entre o grupo tratado e o grupo de controlo. 24
Figura 2:
Gráfico indicando os valores de LVEDV entre o grupo tratado e o grupo de controlo.
Figura 3A 3B: Gráfico indicando os valores de LVEF a 1 mês (3A) e LVEF a 2 meses (3B) de acordo com as categorias de risco.
Figura 4:
Regressão linear apresentando a correlação entre a melhoria funcional e o número de células injectadas.
Figura 5:
Ecocardiografias pré-operatória (A) e pós-operatória (B) : Verifica-se de um modo evidente o espessamento sistólico da parede posterior inicialmente aquimética.
Figura 6:
Vista horizontal dos dois ventrículos por imagem por tomografia com emissão de positrões apresentando a parede posterior do ventrículo esquerdo (zona enxertada no fundo do rastreio). As fotografias 6A e 6B (acima) apresentam uma actividade metabólica homogénea nas paredes septais e anteriores com uma redução da actividade metabólica na parede posterior antes da operação. As fotografias 6C e CD (abaixo) mostram a assimilação de desoxiglicose 2fluoro18 na parede posterior após a operação. 25
Figura 7:
Estabilidade das características das populações celulares (CD56+) de acordo com as expansões sucessivas
A. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES PROVENIENTES DE TECIDOS MUSCULARES ESQUELÉTICOS A.l Materiais, soluções e meios utilizados
Meio A: Meio MCDB120 (23) modificado: substituição de L-Valina por D-Valina, eliminação do vermelho de fenol, eliminação da timidina.
Meio B: Meio A + soro de vitelo fetal irradiado a 20% + antibióticos (a 100 UI/mL de penicilina e 100 pg/mL do estreptomicina).
Meio C: Meio B + bFGF (10 ng/mL) + dexametasona (1 μΜ). Solução D: PBS
Meio E: Meio A + bFGF (10 ng/mL) + dexametasona (1 μΜ) + albumina de soro humano estéril (0.5%).
Solução F: solução salina estéril isotónica de NaCl a 0,9%.
Solução G: Solução F + albumina de soro humano a 4% e 7,5% de DMSO (dimetilsulfóxido) final.
Solução H: Solução de injecção F + 0,5% de albumina de soro humano 26 0 processo de obtenção de populações celulares descrito abaixo compreende 6 etapas: recolha e trituração da biópsia dissociação enzimática e separação das células indivualizadas por filtração colocação em cultura das células e fases de expansão das culturas identificação dos tipos celulares presentes nos diferentes estádios da cultura pela análise de marcadores celulares específicos recolha das células preparação e/ou manutenção em sobrevivência e/ou congelação das células preparação do produto de terapia celular
No processo, a centrifugação das células é realizada a 160 g durante 5 minutos. A contagem das células e a análise das populações é realizada utilizando um hemacitómetro de Neubauer. Nas fases da expansão, as células são incubadas a 37 °C numa incubadora de ar-C02 (95%—5%) saturada em humidade. A observação das células é realizada utilizando um microscópio invertido com contraste da fase. 27 A.2 Resultados A.2.1 Recolha e trituração da biópsia A recolha é realizada no bloco operatório, em meio estéril, em sistema aberto. É realizada uma biópsia de cerca de 10-16 gramas de tecido muscular esquelético pela equipa cirúrgica. A biópsia é, seguidamente, cortada em pequenos cubos com 2 a 4 mm de lado, seguidamente é triturada utilizando uma tesoura fina em meio A. O triturado é colocado num frasco estéril contendo 25 mL de meio A. A etapa de trituração é também realizada de um modo assistido, utilizando homogeneizadores de facas Medimachine® (distribuído por Becton-Dickinson) . Neste dispositivo, os fragmentos da massa inferior a 0,2 g são dissociados em receptáculos Medicon estéreis, após homogeneização controlada por um motor eléctrico, com uma duração inferior a 5 minutos. A repetição da operação utilizando vários receptáculos Medicon permite preparar, finalmente, vários gramas do músculo. A tabela abaixo apresenta as proporções dos tipos celulares CD56+, CD15+ e CD34+ obtidos durante vários estádios da cultura DO, D15, D20 e D26 (sendo a proporção de células CD34 quase nula em D15, esta não é indicada na tabela para as etapas seguintes à colocação em cultura DO). É observado que, de um modo inesperado, a etapa de trituração da biópsia constitui uma etapa crucial para obter uma rapidamente população compreendendo um tipo celular dominante do tipo mioblasto CD56+. 28 TABELA A:
COMPARAÇÃO ENTRE TRITURAÇÃO COM TESOURA/HOMOGENEIZAÇÃO MECÂNICA BIÓPSIA 1 BIÓPSIA 2 TRITURAÇÃO COM TESOURA HOMOGENEIZAÇÃO MECÂNICA TRITURAÇÃO COM TESOURA HOMOGENEIZAÇÃO MECÂNICA DO PESO 0, 8 g 0,8 g 1, 2 g 1,4 g CNT 10*5 2,6 2,4 6,4 4,8 %CD34+ 7,4 4,7 2,6 1 %CD56+ 0,4 0 1,2 0,4 %CD15+ 0 0 0,9 3,3 PASSAGEM 1 DIA D15 D15 D7 D15 CNT 10*5 11,7 18,4 16, 3 16, 3 %CD56+ 51,6 90,5 35,1 77, 9 %CD15+ 1,8 0,9 44,1 2, 6 PASSAGEM 2 DIA D20 D20 D21 D21 %CD56+ 58 93,4 15 89, 6 %CD15+ 20,9 4,4 20 7,3 PASSAGEM 3 DIA D26 D26 D27 D27 %CD56+ 43,6 75,8 49, 7 60, 2 %CD15+ 30,1 1,7 10, 9 1,1
Foram testados vários tamanhos de amostragem para a realização do processo da invenção, abrangendo uma gama de pesos de 0,13 g a 14,9 g. Os resultados apresentados nas tabelas seguintes mostram que a evolução das proporções dos diferentes tipos de população e a amplificação do número de células evoluem de forma comparável para tamanhos de biópsias inferiores a 1 g (tabela B) a mais de 10 g (tabela C). 29 TABELA Β: Culturas a partir de biópsias com peso superior a 10 g
DO £ PRIMEIRA PASSAGEM 3 Ο
,'VAViW.W/AVAV
5 5 DOENTE VWAVAW/AVíVAVAVAW#AVAVAW/AV'«WMVAVtóW//AV/A7tW/AV,AVAV/AVWAV/AV'MVAViiWiV«V/AVAWA7AVA\VAVAVAy/A7ÂVAyAVAVi c í í i PESO (q) v. NOME v. IDADE .JxY 0 0 0 BIOPSIA 1 I I CNT(*) 10*6 % CD56+ % CD15+ % CD34+ % CD10+ \ CD45+ 7 % j; DIA HLADR+1 CNT (*) 10*6 % CD56+ % CD15+ % CD34+ % CD10+ % HLA CL1+ *; * 5 DESMINA+ i. 7 £í»>: e*x>xq <, MYOO 01 \ 73 í 14,9 * % \ 10 3,2 0,9 12,2 5,3 6,3 ND \ D8 19,46 48 49,8 3,4 76,5 ND ND Í7' 7 7 7 7MY0003 7 63 7 10,4 I I 3 4,32 3,4 0,1 4,4 ND 0,1 ND \ D9 14,25 67,7 29 U 45,4 79 í ND í í > MYO004 1 67 \ 13,9 7 7 7 10,25 32,4 1,5 9,2 ND 4 ND \ D9 3,4 76,9 33 13 42 64 s 23,1 J 7 ?MYO005 f 39 í 11,6 7 7 7 11,69 22,1 0,9 16 ND 3,9 ND \ D7 % 31 71,5 28,5 11,2 8,1 91,7 80,8 í | MYO006 \ 55 j 12 A,ãxaxaxxxAxãxaxíxxxOax«axíxãxxa 16,4 28,7 AAAXAX», 0,16 A/AAAW 8,9 m»AA»,A ND xaxaw:/, 2,6 AXA«AA« 7,8 \ D8 *.’/} f.WJxL·. 26,45 82 AAWAXA 18,9 AAXWAX 5 ΑΑΧ/ΑΑΛΑ 4,5 95,6 IVu/R/rAÃAVxA/ ND J AA4AKWJX/À J: SEGUNDA PASSAGEM |j RECOLHA FINAL í >DIA CNI10*6 %CD56+ %CD15+ 7DESMINA+ > HLA+7CL1 vi DIA 7 CNI10*6 %CD56+ %CD15+ 1DESMINA+ HLA+1CL1 7 AAXíCXXAXi 7 «MYOOOUD13 315 58,3 34,1 ND 63 ?D16 7 890 67,3 31,6 70,5 ND \ i 'MY0003 |iD13 156 87,1 11,3 87,5 ND v D18 7 921,7 91,3 6,2 64,6 í ND < 7MY00047D15 « 7 115,2 97,5 5,4 88,3 95,5 tD20 í 656,9 97,1 15,5 58,2 94 * 5 7 7 MYOO 05 7 D10 * 7 244,4 89,9 9,2 85,9 94,3 |D14 7 992,7 95,2 4,3 78,2 i 95,8 \ tMY0006 ζ D13 * X w/twxxawvw 483,6 AWA//A7' 91,3 ftvaw 10,5 ;xwvv//a 82,4 AXXXW.*VV«X 96,5 Í*D16 xxw/xvxxxxIw/A 1210 WW////.V, 84,9 WA//AAV 10,5 mmmi 84,8 AXW/TVXXXX* 96,4 »! i ΜΜΦΜ**·Μ-Μ$. (*) CNT: número de células
Tabela C : Culturas a partir de biópsias com peso inferior a 0,5 g 3 1 PASSAGEM 1 PASSAGEM 2 PASSAGEM 3 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D10 D14 D16 5007 CNI 10*5 1,2 11,2 64 266 % CD34+ 28,8 ND ND 0 0,23 g % CD56+ 1,95 68,6 87,6 89,5 % CD15+ ND 30,9 17,3 28,8 % VIABILIDADE 88,9 96 100 98,7 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D7 D10 D15 5008 CNI 10*5 2,04 7 21,6 586,6 % CD34+ 34 ND ND 0 0,23 g % CD5 6+ 6,1 47,1 66,3 92,9 % CD15+ ND 44,6 30,1 9,5 % VIABILIDADE 85,1 92 88 97,9 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D7 D10 D14 5011 CNI 10*5 2,1 9,8 35 285 % CD3 4+ 26,2 ND ND ND 0,2 g % CD56+ 3,5 24,1 29,9 38 % CD15+ ND 70,8 63,8 60,5 % VIABILIDADE 85,5 98 98 99 PASSAGEM 1 PASSAGEM 2 PASSAGEM 3 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D6 Dll D17 5054 CNI 10*5 2,8 6,6 7,1 370 % CD34+ 10,7 ND ND ND 0,45 g % CD56+ 25,7 62,3 69,1 84,6 % CD15+ ND 31 26,9 14,5 % VIABILIDADE 88,7 100 96 87 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D7 D8 D15 5058 CNI 10*5 7,7 9,4 13,6 534 % CD34+ 44,3 21,4 ND ND 0,19 g % CD56+ 8,4 23,2 27,5 72,2 % CD15+ ND 63,2 63,6 18,9 % VIABILIDADE 95 82,1 100 97 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D6 D13 D15 5060 CNI 10*5 5,2 9 18,8 663 % CD34+ 48,7 ND ND ND 0,33 g %CD56+ 7,9 42,3 52,8 89,7 % CD15+ ND 46,8 48,6 11,9 % VIABILIDADE 94,4 100 99 98 73 anos seguinte idade do
As biópsias foram recolhidas a partir de doentes com 15 a de idade. Os resultados apresentados na tabela D mostram que o processo é aplicável independentemente da doente do qual a biópsia é recolhida. 32 de células de origem muscular a partir de biópsias provenientes o 1(0o (0 M (0d 0) M Cl
P (0 I-1 Q>b (0 H c0 O b (0 b -H m (0 H M b > d) bo QJ b C QJ O b QJ b
Terceira passagem % CD56+ 67,3 91,3 97,1 95,2 84,9 "M1 (M CO 92,9 93, 7 68, 7 Número 10*6 890 922 657 993 1210 56 59 565 548 Segunda passagem % CD56+ 58, 3 87,1 97,5 Οϊ co 91,3 75, 4 66,3 96,4 63, 7 Número 10*6 315 156 115 244 483 r- CM CS] 240 120 Primeira passagem % CD56+ 48 67,7 76, 9 71,5 82 64,3 47, 1 93,4 51,8 Número 10*6 LO (Η CM (Η co 31 LO Ό cm CO (—1 r- o 75 42 O H Ω % CD56+ CM CO CO 32,3 22,1 28, 7 ND rH CO ND ND Número 10*5 100 43 102 117 164 (—1 CM 110 45 Idade do doente (anos) 73 63 67 39 55 15 45 84 51 Peso (g) 14,9 10,4 13, 9 11,6 12 (—1 o CS] o CO CO 3, 0 Nome MYOl CO O O LΓ) O S CO O S 4929 co o o LD MOS CEL 33
As biópsias podem ser conservadas durante 90 h a 4 °C ou serem congeladas numa solução salina equilibrada antes da sua colocação em cultura. As tabelas E e F abaixo mostram que a viabilidade das células e a evolução das proporções dos diferentes tipos de população não é significativamente afectada após 90 h da conservação da biópsia a 4 °C ou após congelação.
Tabela E: Colocação em cultura de uma biópsia conservada durante 90 h a +4 °C numa solução salina equilibrada e preparação das células musculares de acordo com o processo PESO: 1,05 g D0 PASSAGEM 1 (D7) CNT 10*6 O co 4,9 % CD34+ 7,7 NS %CD56+ 6, 5 58, 7 %CD15+ oo 37, 7 % VIABILIDADE 90,5 95 NS: não significativo
Tabela F: Cultura a partir de uma biópsia descongelada PASSAGEM 1 PASSAGEM 2 PASSAGEM 3 BIÓPSIA D TRATAMENTO D0 D18 D20 D25 4929 CNT 10*5 0,97 16, 2 47,3 55?7 descongelado % CD34+ 20,5 ND 0, 04 0 músculo não % CD56+ 44,9 64,3 75,4 82, 4 patológico % CD15+ ND 27, 1 24,5 24, 5 PESO: 0,19 g % VIABILIDADE 90,8 100 96,8 96, 7 34 0 processo da cultura pode ser realizado a partir de biópsias de indivíduos saudáveis ou de doentes com uma patologia. Os resultados seguintes apresentados na tabela G mostram em particular que o processo da invenção pode ser realizado para a preparação de células de origem muscular provenientes de um doente com distrofia muscular de Duchenne.
Tabela G: Cultura a partir de uma biópsia descongelada proveniente de um doente com distrofia muscular de Duchenne PASSAGEM 1 PASSAGEM 2 PASSAGEM 3 PASSAGEM 4 PASSAGEM 5 BIÓPSIA ESTÁDIO DO D7 D14 D21 D26 D29 4964 CNT 10*5 1,58 1, 78 11,6 473,6 2411,2 6397 DE 24 H % CD34+ 53,9 ND 0,3 0 ND 0 músculo estriado % CD56+ 5 24, 6 78,1 73, 7 60 52,5 paravertebral % CD15+ 0,4 30,4 12, 7 15,5 26,4 36,1 PESO: 0,136 g % VIABILIADE ND 94 82,5 91,2 95,6 98
Os resultados apresentados abaixo mostram que o processo pode ser realizado a partir de qualquer tipo de biópsias musculares. Em particular, de biópsias que foram obtidas de diferentes músculos, paravertebral, tibial anterior, peronial longo, extensor comum dos dedos do pé, peronial lateral longo, tibial posterior e solhar. Na tabela H são apresentados os resultados obtidos em função de diferentes biópsias. 35
+ H (D r- LO W Q CM v v Q Ω Ω Ω Ω Ω Ω s r- LO ϊ—1 LO s s s s s s S 1-1 0Ϊ 0Ϊ u d° + LO co LO o\ rH (J\ LO CO CM C0 S—1 Ω u V CM CO V v v V ϊ—1 v V £ 0Ϊ (MJ CO co CO r- O o CO CO LO (L) CM CM CO Γ- LO tP d° rd CO CO + (d M1 CO (MJ a co Ω U rH CO LO Ω Ω Ω Ω Ω Ω fd co ϊ—1 ϊ—1 11 s s s s s 21 S μ H Φ d° g + H U 1¾ LO LO Ω U co r- o\ LO CM CO LO rH rH CO CM C0 r- LO ϊ—1 CO CO r- (MJ CO CM co Γ- Γ- LO LO CM LO CM d° LO * O I—1 LO CM LO LO rH r- LO OM ΟΜ 0 μ d) 19, 14, CO co 26, rH rH o I—1 O o Ο g '2 £ + CM LO (MJ LO LO CO CM r- co Γ- Ω U CO LO CO CM r-1 v O CO co LO o C0 ϊ—1 CO (MJ (MJ (MJ ϊ—1 cA° + LO LO (MJ CO ϊ—1 r- < 95 rH LO r- ΟΜ U CO CO 32 22 28 s rH LO CO 25 co Γ- d° LO K O I—1 O CO (MJ r- (MJ rH CO r- CM 0 O O rH LO rH < CM < < < μ (MJ (Ml r- ΙΟ d) h '2 O (d £ H Q CO 0 1—1 μ 0 0 0 0 0 i—1 0 ronial longo Ti (d 0 Origem sto extern sto extern sto extern sto extern sto extern (d μ rQ d) -μ μ φ > (d μ H μ d) +j μ (d 1—1 (d isor comum edos do pé miai latei longo μ φ -μ CO 0 Ω ι—1 <d Solhar (d (d (d (d (d (d 12 m ti > > > > > a H +J <u Η P-i Η ω tn o\ o\ LO σ\ CO CM LO σ\ C0 s. s. s. s. CM rH CM CM rH co 0 o co rH rH o O O O o Ο ο d) Ω d) ϊ—1 co LO LO (J\ r- co rH 'T C0 ο H o o o o o CM o o rH LO ΙΟ L0 0 >H >H >H >H >H OM o o O o ο ο 13 s S s S S LO LO LO LO LO LO 36
Terceira passagem + rti G H e 10 φ Q o\° 70, 5 64,6 58, 1 78, 2 CO co ND ND ND ND ND ND ND % Classe 1+ ND ND 94 95, 8 96,4 ND ND ND ND ND ND ND % CD15+ 31,5 <MJ 15, 5, 4, 3 10,5 24,5 28,8 LO (J\ 60,5 14,5 18,9 11,9 % CD56+ 67,3 91,3 97,1 95,2 0Ϊ co 82,4 89,5 92,9 38 CO 72,2 89,7 Número 10*6 890 922 657 993 1210 56 27 59 28 37 53 99 Segunda passagem % Desmina+ ND LO Γ ΟΟ co co co LO CO CM CO ND ND ND ND ND ND ND % Classe 1+ 63 ND 95,5 94,3 96,5 ND ND ND ND ND ND ND % CD15+ 34, 1 11,3 5, 4 OJ (J\ LO O I—1 24, 5 17,3 66,3 63,8 26, 9 63,6 CO % CD56+ 58, 3 87,1 97,5 CTi CO 91,3 75, 4 87,6 66,3 29,9 69,1 9 ‘ LZ 52, 8 Número 10*6 315 156 115 244 483 r- 6, 4 CM (M 3, 5 r- o 1, 4 0^ rH Nome MYOl MY03 MY04 LO O ÍH o ÍH 4929 5007 CO O O LO 5011 5054 5058 O L£) O LO 37 A. 2.2 Dissociação Enzimática e separação das células individualizadas por filtração 0 frasco contendo o triturado é centrifugado à temperatura ambiente. 0 sobrenadante é eliminado por aspiração. 0 peso do triturado é obtido por pesagem sobre uma balança tarada utilizando um frasco vazio. 0 triturado é lavado com 25 mL de meio A. Após a sedimentação do triturado, o sobrenadante é eliminado por aspiração.
Foi preparada uma solução de liberase (Rock-Boehringer) de acordo com as instruções do fabricante seguidamente é recondicionada e é congelada na concentração de 10 mg/mL. A liberase é descongelada extemporaneamente e, seguidamente, é adicionada ao triturado na concentração de i—1 O mg/mL, sob um volume de 10 mL por grama de tecido. 0 frasco é colocado na estufa a 37 °C durante 60 minutos. 0 frasco é agitado manualmente cada 5 a 10 minutos (difusão da enzima e dissociação mecânica suaves). A suspensão é seguidamente centrifugada. O sobrenadante é eliminado por aspiração com uma pipeta. Este primeiro produto de digestão é seguidamente incubado numa solução de tripsina a 0,25%. Utilizam-se 10 mL da solução enzimática por grama de tecido inicial. A suspensão é digerida durante 20 minutos a 37 °C em estufa, com agitação manual cada 5 minutos. Esta é, seguidamente, aspirada e expulsa através de uma pipeta de 25 mL. É seguidamente adicionado soro de vitelo fetal irradiado a 10% (Hyclone) para a neutralização das actividades enzimáticas. O produto de digestão é filtrado através de um crivo de 100 μΜ, seguido de 40 pm, sob a pressão da gravidade, para separar as células dissociadas dos tecidos residuais. É 38 utilizado um crivo por grama de tecido (Cell strainer de Falcon). 0 filtrado é centrifugado a 300 g durante 5 minutos. Após a eliminação do sobrenadante, os sedimentos são lavados utilizando o meio B, seguidamente são centrifugados. O sobrenadante é eliminado por aspiração. O sedimento é seguidamente retomado em 10 mL de meio C. São recolhidos 100 pL de volume para contagem. A aliquota é reservada para estimativa da viabilidade por citofluorimetria (iodeto de propidio). A. 2.3 Colocação em cultura das células e fases de expansão das culturas
Após o acondicionamento, as células são transferidas para o dispositivo de cultura. O dispositivo da cultura consiste uma placa de cultura (Nunc Single Tray) com uma superfície de 600 cm2. O enchimento da placa é realizado através de um orifício previsto com esta finalidade e fechado com uma rolha estéril descartável. As culturas são incubadas a 37 °C num contentor saturado em humidade em atmosfera controlada ar-C02 (95%-5%).
No dia após a colocação em cultura, é realizada uma primeira drenagem para eliminar as células mortas e os detritos musculares. É ligada uma bolsa vazia a um dos dois orifícios do dispositivo da cultura. O meio é eliminado por gravidade e é substituído por 120 mL de meio C que é adicionado à cultura. O meio C é renovado ao final de 12 0 a 192 horas. A expansão é decidida quando o grau de confluência das células atinge 20% a 50% ou quando aparecem os primeiros miotubos (cerca de 8 dias após a colocação em cultura). 39
Após drenagem do meio, as células são lavadas por agitação manual suave utilizando 50 mL da solução D. A solução D é
drenada e, seguidamente, são adicionados 20 mL de solução de tripsina irradiada (0,25%). O frasco é colocado em incubação durante 5 minutos a 37 °C. As células são recolhidas numa bolsa de 40 mL. A acção de tripsina é neutralizada por adição de soro de vitelo fetal a 10%. O soro é injectado no interior da bolsa utilizando uma seringa. As células são centrifugadas. O sobrenadante é eliminado por transferência para outra bolsa de drenagem, ligada por uma ligação estéril. O sedimento é suspenso em 30 mL de meio C por lavagem das células, seguidamente as células são centrifugadas. O sobrenadante é eliminado por transferência para outra bolsa de drenagem, ligada por uma ligação estéril. O sedimento celular é ressuspenso em 20 mL de meio C. É recolhida uma aliquota para numeração e análise das populações. A viabilidade é estimada utilizando um citofluorimetro. As células são, seguidamente, transferidas para uma bolsa contendo 500 ou 750 mL de meio C, seguidamente são inoculadas em duas ou três unidades de placas duplas (double-tray de Nunc) com uma superfície total de 1200 ou 1800 cm2. As células são colocadas em incubação. É decidida uma terceira expansão quando o grau de confluência das células atinge 60% a 70% ou quando aparecem os primeiros miotubos. São utilizadas caixas de vários níveis com 10 placas (multi-tray de Nunc), para esta série de expansões. Após a drenagem do meio, as células são lavadas utilizando 100 mL da solução D. A separação da camada celular e a dissociação enzimática das células são realizadas após a drenagem da solução da lavagem por adição de 50 mL (0,25%) de tripsina irradiada em cada placa. As preparações são colocadas em incubação durante 5 minutos a 37 °C. As células são recolhidas em bolsas estéreis com 300 a 600 mL. A acção de tripsina é neutralizada por adição de soro de 40 vitelo fetal a 10% em volume. As células são centrifugadas e o sobrenadante é eliminado por ligação a uma bolsa de drenagem. O sedimento celular é ressuspenso em 50 mL de meio C, seguidamente é transferido para um ou dois frascos contendo 1200 ou 2400 mL de meio C através de uma ligação estéril, são inoculadas uma ou duas caixas da cultura de 10 placas em vários níveis (multi-tray de Nunc) com 1200 a 2400 mL da preparação celular. A monitorização visual do crescimento em placas em vários níveis é impossível. Consequentemente, é também inoculada uma placa de cultura Nunc estéril de placa simples (single-tray) com 110 mL da preparação celular. Esta última placa permite uma monitorização visual diária da cultura e do estado de ligação das células. As células são, seguidamente, colocadas a incubar. A cultura decorre durante 3 a 5 dias. No dia de recolha das células, o meio é eliminado por drenagem numa bolsa estéril e é substituído por um volume equivalente de meio E. A recolha final é decidida quando o grau de confluência das células atinge 90% ou quando aparecem os primeiros miotubos. A.2.4 identificação dos tipos celulares presentes nos diferentes estádios da cultura por análise de marcadores celulares específicos A caracterização é baseada na análise por citofluorimetria de fluxo (FACS). Foram utilizados os seguintes anticorpos dirigidos contra os antigénios humanos de superfície celular: CD5, CD10, CDl1, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD40, CD40-ligando, CD44, CD45, CD56, CD62, CD71, CD80, CD86, CD90, CD105, CD117, CD138. Foram também utilizados anticorpos dirigidos contra as seguintes estruturas 41 antigénicas: CD138, HLA-classe I, HLA-DR, ELAM, ICAM, LECAM, Stro-1, S-endo-1, VCAM, VLA2, VLA3, VLA4, VLA5, VLA6. A análise da expressão da desmina, proteína intracelular é realizada de modo seguinte:
Após colocação em suspensão em PBS, as células são fixadas e permeabilizadas por adição de 10 volumes de metanol a 4 C° durante 5 minutos, seguidamente são centrifugadas. Após lavagem do metanol residual e centrifugação, as células são incluídas em PBS contendo o anticorpo dirigido contra a desmina (Dako, clone D33, 1/100) e são incubadas durante 15 minutos. Após lavagem e centrifugação, as células são incubadas durante 15 minutos na presença do anticorpo secundário dirigido contra o anticorpo primário, ligado a um fluóforo. Após lavagem e centrifugação, as células são analisadas por FACS. A tabela I abaixo apresenta as características dos principais marcadores utilizados e dos tipos celulares correspondentes (tipos celulares).
CARACTERÍSTICAS CONVENIONAIS DOS MARCADORES UTILIZADOS
MARCADOR TIPOS CELULARES CD10 linfócitos préB. neutrófilos CD13 monócitos, células mielóides CD15 monócitos, macrófagos, granulócitos, eosinófilos CD16 NK, sub pop. linfócitos T, neutrófilos CD34 progenitores CD38 Actividades LT, células estaminais, sub pop. L T, B, NK 42 (continuação) MARCADOR TIPOS CELULARES CD40 linfócitos T CD4 + activado CD44 Anti HCAM CD45 leucócitos CD56 NK, sub pop. Linfócitos T CD71 células proliferantes CD117 progenitores HLA CLl antigénio MHC classe 1 HLA CL2 antigénio MHC classe 2 VLA3 linfócitos B VLA5 linfócitos T memória, monócitos, plaquetas VLA6 timócitos, linfócitos T memória, monócitos DESMINA células musculares
Tabela I: Apresentação de alguns marcadores celulares utilizados no processo e os tipos celulares que os expressam. A análise das populações celulares é realizada em diferentes estádios da cultura: - No dia DO correspondente à colocação em cultura da população preparada de novo.
Foram realizadas várias séries em frascos unitários colocados em cultura paralelamente à unidade de placa simples no DO, para ser possivel seguir diariamente a evolução das culturas recolhendo um ou mais frascos por dia. 43 - No dia 1 (Dl), a fracção não-aderente (sobrenadante) e a fracção aderente (obtida por tripsinação) foi analisada independentemente. De uma forma interessante, foi demonstrado que essas duas fracções contêm populações com características diferentes. - Do D2 ao D9, as células aderentes foram analisadas cada dia para seguir a evolução dos tipos celulares ao longo do tempo.
Paralelamente, as células obtidas por produção em massa foram analisadas em cada etapa de expansão e seguidamente no momento da recolha final. Os resultados mostraram que na data da recolha equivalente, as características obtidas nas placas e nos frascos independentes são idênticas.
Os dados provenientes da identificação dos tipos celulares durante a cinética da diferenciação são apresentados nas tabelas JA e JB seguintes e as características essenciais são descritas abaixo.
Cinética de diferenciação (percentagens)
MARCADORES DO Dl SN Dl D2 D3 CD34 + 38,5 (25-75) 77 (69-79) 39 (25-67) 74 (64-75) 74 (51-75) CD34- 61,5 (25-75) 23 (20-30) 61 (33-75) 26 (25-30) 26 (25-49) CD34+CD10+ 14 (10-18) 27 (25-29) 2,5 (2-3) 24 (20-40) 11 (7-17) CD34+CD10- 25 (23-31) 47 (40-54) 30,5 (24-37) 39 (36-54) 59 (44-63) CD34+CD45+ <5 ND 0,5 (0-1) ND ND CD34+CD56+ 0 0 0 0,3 (0,3-0,3) 0,7 (0,4-2) CD34+DR+ 14 ND 21,5 (16-27) ND ND CD34+DR- 28 ND 12 (12-12) ND ND 44 (continuação)
MARCADORES DO Dl SN Dl D2 D3 CD34+CD 15+ ND ND ND ND ND CD56 + 4,7 (0-26) 4,4 (0,3-15) 1 (0-5) 11 (7,7-20) 14 (12-35) CD15 + 1,5 (0-6) 3 (1,5-6) 3,6 (0,1-12) 20,5 (20-21) 25 (24-33) CD56+CD15+ 0,02 (0-0,3) 0 0 4 (4-4) 10 (6-14) CD13 + ND ND ND ND ND CD44 + 0 ND ND ND ND CD117+ 1,7 (0,16-1,7) ND 1,7 (0,2-2) ND ND
Tabela JA: Identificação dos tipos celulares ao longo do tempo (em percentagem na população celular total) dos estádios DO a D3 da cultura.
MARCADORES D4 D5 D6 D7 D8 CD34 + 56 (36-67) 35 (26-50) 23 (13-47) 2,7 (0,6-10) 1,7 (0,4-3,4) CD34- 44 (33-63) 65 (50-73) 76 (53-87) 97 (90-99) 98 (96-100) CD34+CD10+ 9 (8-22) 16,5 (3-34) 16,8 (0,6-33) 1,7 (0,2-2,7) 0,4 (0,2-7,6) CD34+CD10- 35 (27-59) 25 (15-35) 14 (14-14) 5,1 (0,4-9) 1,3 (0,2-7,6) CD34+CD45+ ND ND ND ND ND CD34+CD56+ 3 (1,5-6) 7,5 (1,5-12) 3 (0,1-12) 0,35 (0,2-0,6) 0,4 (0,4-2,1) CD34+DR+ ND ND ND ND ND CD34+DR- ND ND ND ND ND CD34+CD15+ ND ND ND ND ND CD56 + 34 (28-55) 61 (50-68) 73 (57-74) 64 (52-87) 68,4 (50,3-91) CD15 + 48 (46-48) 48 (47-63) 51 (29-64) 36 (20-55) 29 (12-54) CD56+CD15+ 19 (17-21) 13 (9-25) 10 (5-13) 3,6 (2,6-6) 1,4 (1-3) CD13 + ND ND 96 (76-97) 99 (94-99) 99 (96-99) CD44 + ND ND ND ND ND CD117+ ND ND ND ND ND
Tabela JB: Identificação dos tipos celulares ao longo do tempo (em percentagem na população celular total) dos estádios D4 em D8 da cultura. 45
A.2.4.1 Características das preparações celulares no DO 0 processo permite obter no DO 3 x 105 a 4 x 106 células por grama de tecido. A maioria dos tipos celulares é CD34+. Os tipos celulares CD34+ são CD34+/CD10+ a 14%; CD34+/CD10- a 25%; CD34+/CD56+ a 0%; CD34+/DR+ a 14% e CD34+/DR- a 28%. As populações CD34+ são CD45- em maioria. As populações minoritárias expressam CD44, CD45, CD56, CD117, HLA-classe II. De um modo surpreendente, a caracterização de um número significativo de células progenitoras (em quantidades absolutas e relativas na população) permite considerar, por uma recolha de células neste estádio, a sua utilização como produto para terapia celular da reconstituição de numerosos tecidos, não apenas musculares mas também hematopoiéticos, ósseos, adiposos, cartilaginosos ou vasculares. A.2.4.2 Características das preparações celulares aderentes no Dl A maioria das células é CD34+. A população é constituída por CD34+/CD10+ (27%) e CD34+/CD10- (47%). Estão presentes CD13. A preparação é negativa para CD117 e CD45. Os tipos celulares CD15+ e CD56+ são minoritários. A.2. 4.3 Características das preparações celulares presentes no sobrenadante no Dl.
Uma proporção significativa das células é CD34+. A população é constituída principalmente por CD34+/CD10-. Está presente uma população CD117+ (<5%) e expressa CD45+. Estão presentes algumas populações minoritárias: CD38+ (15%), CD45+ pouco CD15+ e CD56+, HLA-classe II+. A.2. 4. 4 Características das evoluções dos marcadores durante a cultura A evolução é caracterizada por um aumento crescente da proporção de células CD15+ e/ou CD56+ e uma redução das populações CD34+. Pode-se observar ao longo do tempo a transição progressiva de uma população de CD34+ para CD15+. A proporção das populações CD13+, CD44+, CD71+ aumenta com o tempo. Observam-se populações minoritárias CD138+, HLA-classe II+, CD38+.
No final da expansão, observam-se três populações dominantes: CD56+, CD15+ e CD56-/CD15-. A população CD56+ expressa CD10, CD13, CD44, desmina e HLA-Classe I. Esses marcadores são específicos para células mioblásticas. A população CD15+ expressa CD13, Classe I e parcialmente CD10. Na população CD56-/CD15-, uma fracção expressa desmina e a outra fracção não a expressa. Alguns marcadores são expressos mais fracamente e de um modo variável: CD71, VLA3, VLA5, VLA6, CD16+ e CD40L. As populações CD34+, CD38+, CD45+ e HLA-classe 11+ desapareceram ou são extremamente minoritárias. A.2.4.5 Características das células após empobrecimento da fracção CD34+ A tabela K abaixo representa as características das células obtidas, no final da primeira passagem, comparando diferentes 47 condições iniciais. Estão representadas oito experiências independentes. Após empobrecimento da fracção CD34+, o processo permite obter rapidamente uma população celular muito maioritariamente constituída por células expressando CD56. Em particular, a proporção de células expressando CD56 é mais elevada do que a obtida a partir de uma biópsia não empobrecida. 48
Tabela K. Empobrecimentos ou enriquecimentos em células CD34+ presentes na biópsia
49 A.2.5
Recolha das células 0 protocolo seguinte descreve a recolha das células no estádio final para obter uma população mioblástica maioritária. No entanto, o protocolo permite ao especialista na técnica implementá-lo qualquer que seja o estádio de diferenciação seleccionado para a recolha das células e isto, em função da população celular pretendida.
Após a drenagem do meio, as células são lavadas utilizando 500 mL da solução D (para as unidades multi-placas), 50 mL para a unidade simples e 100 mL para as unidades duplas. A solução de lavagem é drenada e são adicionados 200 mL de solução de tripsina irradiada (0,25%) às unidades multi-placas (20 mL para a unidade simples, 40 mL para as unidades duplas). A preparação é colocada a incubar durante 5 minutos a 37 °C. As células são recolhidas por drenagem numa bolsa de 500 mL. A acção da tripsina é neutralizada por adição de 10% de soro de vitelo fetal injectado com uma seringa. As células são lavadas do modo seguinte: as células são centrifugadas. O sobrenadante é eliminado, seguidamente as células são suspensas em 300 mL de solução F, seguidamente são centrifugadas. Os sobrenadantes são eliminados. São realizadas duas outras etapas de lavagens como anteriormente descrito. O objectivo dessas lavagens sucessivas consiste em eliminar a tripsina, as proteínas animais ainda presentes e o bFGF recombinante. Durante a terceira lavagem, é reservada uma alíquota para contagem celular, estimativa da viabilidade e da qualidade celular, controlos da qualidade microbiológica. As células podem ser concentradas na solução H de forma a obter uma suspensão adequada para a utilização clínica pretendida. 50
Após a centrifugação, as células são incluídas num volume de solução isotónica para uma concentração de 1,5 x 108 células/mL. Estas são finalmente aspiradas numa seringa de 10 mL. As células são recolhidas para injecção em seringas estéreis. O tipo da agulha utilizado para a injecção depende do tecido visado. Para a injecção intramiocárdica directa, é utilizada especificamente uma agulha dobrada a 90° de medida 25 a 30. A.2.6 Rendimentos de produção e características dos tipos celulares A Tabela L abaixo recapitula os resultados obtidos na realização do processo da invenção a partir de diferentes biópsias obtidas a partir de três doentes diferentes.
As células foram produzidas inicialmente nas unidades de placas simples, duplas e múltiplas até à terceira expansão incluída. Seguidamente, as expansões foram realizadas por desdobramento das populações e repicagem em frascos de cultura de 25 cm2. Em cada passagem, a maioria das células foi utilizada para a caracterização e contagem, enquanto foi utilizado um número conhecido de células para a inoculação do desdobramento. O número de desdobramento acumulado permite, por cálculo, obter cerca de 100 biliões de células entre a oitava e a nona expansão. A Tabela L apresenta os rendimentos em termos de número de células obtidas e em termos de proporção de células do tipo CD56+ ou desmina+ na população, nas diferentes fases de expansão para os três doentes denominados MYO 003, MYO 004 e MYO 005. 51
Tabela L:
RENDIMENTO DO PROCESSO ESTABELECIDO EM
FUNÇÃO DO NÚMERO DE EXPANSÕES
MY0003 PASSAGEM D0 1 2 3 4 5 6 7 8 % CD56+ 3,4 67, 7 87,1 91,3 87 89, 8 89, 7 71,1 76,5 % DESMINA+ ND ND 87,5 64,6 86,2 88,2 88,5 66 64 CNT CULTIVADOS (10*6) 4,32 4, 32 14,25 156 3,4 0,3 1,2 0,59 0,35 CNT OBTIDOS (10*6) * 14,25 156 921 5,9 3, 96 1,78 1,06 0,35 PROLIFERAÇÃO * X3,3 X10,9 X5, 9 XI, 73 X13,2 XI, 48 XI,79 XI NÚMERO TEÓRICO DE CÉLULAS APÓS 8 PASSAGENS 55,46 x 10*9 MY0004 PASSAGEM D0 1 2 3 4 5 6 7 8 % D56 + 32, 4 76, 9 97,5 97, 1 96 88, 7 72,2 75 85 % DESMINA+ ND 23,1 88,3 58,2 88,1 68 ND 79,4 70,4 CNT CULTIVADOS (10*6) 10,25 * 3,4 115,2 0,18 0,5 0,22 0,11 0,32 CNT OBTIDOS (10*6) * 3,4 115,2 656,9 1,58 0,66 0,34 0,96 1,14 PROLIFERAÇÃO * * X33,9 X5,7 co r- co X XI,32 XI,55 X8,73 X3,56 NUMERO TEORICO DE CÉLULAS APOS 8 PASSAGENS 366,8 x 10*9 MY0005 PASSAGEM DO 1 2 3 4 5 6 7 8 % CD56+ 22,1 71,5 89,9 95,2 96, 4 89,1 91,5 68,8 82,7 % DESMINA+ ND 80,8 85,9 78,2 74,1 89 89, 6 88,7 83,2 CNT CULTIVADOS (10*6) 11,69 11,69 31 244, 4 0,2 0, 45 0,46 0,4 0,53 CNT OBTIDOS (10*6) * 31 244, 4 993 1,36 1,7 1,84 1,6 1,13 PROLIFERAÇÃO * X2,65 X co co CO o X X6, 8 X3, 8 X4 X3,5 X2,13 NÚMERO TEÓRICO DE CÉLULAS APÓS 8 PASSAGENS: 763,7 x 10*9 O histograma na figura 7 apresenta os valores medianos da expressão de CD56 e CD15 em 8 amostras durante várias fases de expansões.
Os resultados apresentados na figura 7 mostram que as proporções de tipos celulares CD56+ e CD15+ obtidos são relativamente homogéneos de acordo com as diferentes biópsias e não são modificados ao longo das diferentes expansões. Em particular, constata-se que as células do tipo CD56+ permanecem em proporção dominante durante as fases de expansão. 52
Esses resultados mostram, além disso, que após a identificação dos estádios óptimos de recolha de acordo com os tipos celulares pretendidos, o especialista na técnica pode reproduzir o processo da invenção não realizando a etapa celular de caracterização tal como definida no processo da invenção e multiplicando as fases da expansão para obter um grande número de células compreendendo um tipo celular especifico em proporção dominante e nomeadamente o tipo celular CD56+. A.2.7 Congelação do produto de terapia celular
De modo a permitir a utilização ao longo do tempo das células preparadas deste modo, pode ser vantajoso congelá-las em condições em que a descongelação ulterior permita uma sobrevivência suficiente das células, de um modo preferido superior a 90%. A titulo de exemplo, as células são suspensas em meio de congelação (solução G) e são transferidas para duas bolsas de congelação estéreis, com uma concentração compreendida entre 107 e 2 x 107 células/mL ou em tubos de criocongelação a uma concentração compreendida entre 1 X 106 e 5 X 106/mL. A congelação é realizada utilizando um dispositivo (Digicool ou Nicool) assegurando uma descida progressiva em temperatura controlada. As células são armazenadas em azoto liquido até o momento da descongelação. A descongelação das células é realizada em banho maria a 37 °C. As preparações celulares são lavadas duas vezes utilizando uma solução salina isotónica. As lavagens são realizadas por ligação estéril às bolsas de solução isotónica e 53 às bolsas de drenagem. É reservada uma alíquota para a estimativa da viabilidade e da qualidade celular.
B. FACTORES AFECTANDO A FUNCIONALIDADE DO TRANSPLANTE DE CÉLULAS DE ORIGEM MUSCULAR AUTÓLOGAS PARA O TRATAMENTO DE MODELOS DE ISQUEMIAS MIOCÁRDICAS B.1 Materiais e métodos B.l.l Modelo de isquemia miocárdica
Foram anestesiados ratos Wistar do sexo masculino, pesando 280 g com cetamina (50 mg/kg) e xilasina (10 mg/kg) e foram ventilados pela traqueia. Foi realizada uma toracotomia. O enfarte do miocárdio é obtido por ligação coronária esquerda utilizando um fio de polipropileno 7/0. B.1.2 Testes de funcionalidade A função ventricular esquerda foi estudada por ecocardiografia bi-dimensional (2D) uma semana após o enfarte do miocárdio e um ou dois meses após o transplante.
As medições 2D (e M-mode) são realizadas sob anestesia geral com cetamina (50 mg/kg) e xilasina (10 mg/kg), com um aparelho comercial de 15 MHz (15L8) "linear array transducer" (Sequoia, Acuson Corp., Mountain View, CA, EUA) autorizando uma frequência máxima de 160 Hz. São obtidas perspectivas longitudinais parasternais, de forma a que as válvulas mitral e 54 aórtica e o ápice possam ser correctamente visualizados e serem deste modo registados. São realizadas as medições dos comprimentos (L) do eixo grande do ventrículo esquerdo e o traçado das zonas de endocardíacas (A) . Foi calculado o volume no final da diástole do ventrículo esquerdo (LVEDV) e o volume no final da sístole do ventrículo esquerdo (LVESV) com a fórmula seguinte: V = 8 x A2/ (3 x π x L) . As fracções da ejecção do ventrículo esquerdo (LVEF) são calculadas deste modo: LVEF = (LVEDV - LVESV)/LVEDV. Todas as medições foram realizadas a partir de, pelo menos, três batimentos e utilizando dois experimentadores tratando vários grupos cegos. B.1.3 Cultura das células
Durante o processo do enfarte miocárdio, os músculos anteriores dos tibiais direito e esquerdo são dissecados de forma a separar o tendão e o tecido aponeurótico do tecido muscular. Estes são triturados, pesados e dissociados com enzimas utilizando colagenase IA (2 mg/mL, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, EUA) durante uma hora e tripsina-EDTA (0,25%, GIBCO BRL, Gaithersbueg, MD, EUA) durante 20 minutos.
As células são recolhidas por sedimentação (7 min a 1200 rpm) e a reacção enzimática é neutralizada por adição de soro de vitelo fetal a 10%. Após passagem por um crivo de 100 μΜ e centrifugação, o sobrenadante é eliminado e as células são ressuspensas num meio constituído por F12 (HAM) com soro de vitelo fetal a 20%, (vol/vol) penicilina-estreptomicina a 1% (10000 UI/mL-10000 pg/mL, GIBCO BRL) e bFGF 5 ng/mL (Sigma). 55 A inoculação inicial é realizada em frascos da cultura de 75 cm2 e as células são incubadas em ar saturado em humidade com CO2 a 5%.
No dia do transplante, após 7 dias de cultura e após avaliação funcional do nivel base das fracções de ejecção ventricular por ecocardiografia, as células foram recolhidas por tripsinação, foram lavadas e foi testada a viabilidade. Foi inoculada uma amostra em caixas de 12 poços em 2,0 mL de meio de cultura para contagem. As células são lavadas em meio de injecção (meio de cultura + BSA a 0,5%, Fracção V) e são guardadas em gelo antes do transplante. As células são centrifugadas, são ressuspendidas em 150 pL de meio de injecção e são administradas por via sub-epicárdica na zona enfartada. B.1.4 Transplante de células na zona enfartada
Fizeram parte deste estudo quarenta e quatro ratos e foram divididos em dois grupos: um grupo de controlo e um grupo tratado.
Todos os ratos foram reoperados uma semana após o enfarte do miocárdio, sob anestesia geral e ventilação da traqueia. Todos os ratos receberam 150 pL de meio de injecção administrado na zona enfartada utilizando uma agulha Medida 30. No grupo de controlo (n = 23), os ratos receberam apenas o meio de injecção. O grupo tratado (n = 21) recebeu a suspensão de células miogénicas cultivadas.
Foram estudadas quatro categorias de risco em cada grupo, em relação à fracção da ejecção de base LVEF: < 25% (n = 15), 56 25-35% (η = 15) e > 40% (η = 16). Esta estratificação permite obter números homogéneos de animais em cada sub-grupo para tornar os resultados estatísticos mais precisos. B.1.5 Estudos imuno e histoquímicos
Um dia após o transplante, as células inoculadas em caixa de 12 poços são fixadas em metanol e são arrefecidas a -20 °C durante 5 minutos. A marcação não-específica é neutralizada utilizando uma mistura de soro de cavalo (HS) a 5% e soro de vitelo fetal a 5% em PBS durante 20 minutos. As células são incubadas com um anticorpo de murganho dirigido contra a desmina (1/200 dako, A/S-Denmark) durante 1 hora seguidamente com um anticorpo anti-murganho conjugado com o marcador Cy3 (1/200, Jackson Imuno Research Laboratories, Inc.) durante uma hora no escuro.
As células são observadas utilizando um microscópio invertido com contraste de fase e iluminação fluorescente. Foram obtidas várias fotografias de um modo aleatório. A proporção de mioblastos é calculada dividindo o número de células positivas para a desmina pelo número total de células observadas.
Nos três meses seguintes à última ecocardiografia (2 meses após o transplante), os ratos são sacrificados com uma sobredose de cetamina e de xilasina. Os ventrículos são isolados e são seccionados em duas partes ao longo do seu eixo longitudinal. As duas partes são colocadas em isopentano e são congeladas com azoto. São preparadas secções finas com 8 pm utilizando um criostato e são realizados estudos histológicos convencionais por coloração com hematoxilina e eosina. 57 Β.1.6 Análise estatística
Todos os dados são a média ± 1 SEM. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa informático adequado (Statview 5.0, SAS Institute Inc, Cary, NC, EUA). O limiar crítico α para as análises foi seleccionado a p<0,05.
As comparações das variáveis contínuas entre os grupos controlo e tratados e cada categoria de risco foram realizadas utilizando análise de variância (método anova) seguida do teste post-hoc (Scheffé). Foram realizados estudos longitudinais comparando os dados ecocardiográficos para cada grupo, antes e um e dois meses após a injecção intramiocárdica utilizando o teste de emparelhamento.
Foram criadas duas variáveis para testar as relações entre o número de células injectadas e a função cardíaca após o transplante: (LVEF com 1 mês/LVEF) e (LVEF com 2 mês/LVEF). A correlação foi estudada pelo cálculo da proporção F da regressão ANOVA e do coeficiente R2 ajustado para as análises de regressão linear.
Além disso, foi observada a variabilidade dentro de cada grupo dos testes ecocardiográficos a partir de dois lotes de medições realizadas em 10 ratos seleccionados de um modo aleatório utilizando uma análise de Bland e Altman. 58 Β.2 Resultados Β.2.1 Caracterização da suspensão injectada
Em 10000 células contadas no dia do transplante, 50% são positivas para a expressão da desmina. O número de células injectadas é de 3500000 ± 500000 estendendo-se de 700000 a 6,5 x 106. B. 2.2 Teste de funcionalidade após transplante das células de origem muscular
Os parâmetros ecocardiográficos do nível de base não são significativamente diferentes entre os grupos. Pelo contrário, são observadas diferenças significativas entre os grupos após o transplante. Deste modo, no grupo tratado, a função cardíaca é melhorada, como é demonstrado pela comparação entre LVEF e os grupos de controlo (Figura 1) . São observadas diferenças significativas entre os dois grupos (37,52 ± 1,92% em comparação com 25,49 ± 2,47%, p 0,0005) um mês após a injecção miocárdica. Este resultado é confirmado após 2 meses após a injecção ( 40,92 ± 2,17% em comparação com 25 ,83 ± 2,39%, p < 0, 0001) . Esta melhoria da LVEF no grupo tratado está principalmente relacionada com um menor aumento da lvesv em relação à dilatação ventricular, representada pela variável LVEDV, que aumenta de um modo semelhante nos dois grupos (Figura 2) .
As análises longitudinais em cada grupo revelaram uma melhoria substancial da função do ventrículo esquerdo no grupo tratado (Figura 3). São observadas diferenças significativas 59 comparando LVEF em um mês e LVEF em 2 meses com a variável LVEF do nível de base. As diferenças são também significativas comparando LVEF com um mês com LVEF com 2 meses. Enquanto LVEDV e LVESV são aumentadas num mês em comparação com os valores de base (respectivamente, p < 0,0001 e p = 0, 0003) e em 2 meses (respectivamente, p < 0,0001 e p = 0, 029), são verificadas uma estabilização e uma redução quando os valores em 2 meses são comparados com os valores num 1 mês (respectivamente, p = 0,78 e p = 0,12). Nos grupos de controlo, é já visível uma redução significativa da LVEF com um aumento significativo da LVEDV num mês (respectivamente, p = 0,0066 e p < 0,0001 em comparação com os valores de base). Os dois parâmetros indicam valores semelhantes em 2 meses.
Quando a função cardíaca (LVEF) é analisada por categorias de risco de acordo com os valores de base LVEF, são observadas diferenças entre os grupos de controlo e tratados num mês em dois sub-grupos intermediários 25-35% e 35-40%. Esta melhoria de LVEF é confirmada em 2 meses após a injecção nos dois sub-grupos mas, de um modo interessante, é observado também um efeito benéfico, comparando o grupo tratado com o grupo de controlo no grupo de risco < 25%.
Finalmente, o estudo de regressão mostra uma correlação significativa entre o número de mioblastos enxertados e as proporções LVEF num mês (R2 = 0,675, p < 0, 0001) e em 2 meses (R2 = 0,714, p < 0,0001) (Figura 4). Quando os dados são analisados por grupo de risco, o impacto do número de células injectadas em 2 meses é também significativo nos sub-grupos <25%, 25-35% e 35-40% (respectivamente, R2 = 0, 836, p = 0,0106; R2 = 0, 928, p = 0, 0083 e R2 = 0, 985, p = 0, 0076). 60 Β. 2.3 Efeitos acumulados do transplante das células de origem muscular e de um tratamento com um inibidor da enzima de conversão da angiotensina (ACEI) A gestão da insuficiência cardíaca consiste, actualmente, na administração de inibidores da ACE. Foi consequentemente interessante estudar se poderia existir uma sinergia entre o transplante de células de origem muscular obtidas de acordo com o processo da invenção e o efeito protector produzido pelos inibidores da ACE.
Foi produzido um enfarte do miocárdio em 39 ratos por ligação das artérias coronárias. Foi iniciado um tratamento com perindoprilato um inibidor da ACE a 1 mg/kg por dia, imediatamente após o enfarte e foi continuado sem interrupção até ao sacrifício do animal. Uma semana após o enfarte, os animais foram operados novamente e foram seleccionados, de um modo aleatório, para receber uma injecção sub-epicárdica de 150 pL de meio de cultura apenas (grupo de controlo, n = 21) ou um volume equivalente contendo as células de origem muscular, ou seja, cerca de 3 x 106 células cultivadas a partir de uma biópsia de músculo da tíbia anterior e recolhidas no momento do enfarte (grupo tratado, n = 18) . A função ventricular esquerda foi testada por ecocardiografia um mês após o transplante. O nível de base do valor da fracção da ejecção é semelhante entre os animais de controlo (24 ± 2%) e os animais tratados (28 ± 1%) (p = 0,11). Um mês após o transplante, os valores das fracções da ejecção aumentaram nos dois grupos e são 32% ± 2% para o controlo e 38% ± 2% para o grupo tratado. No entanto, constata· -se um aumento mais significativo no grupo tratado (p < 0, 0001 em comparação com o nível de base) em relação ao grupo de controlo (p = 0,004 em comparação com o nível de base), 61 sendo o valor da fracção de ejecção significativamente mais elevado nos ratos tratados (p = 0,04 em comparação com os grupo de controlo). A análise dos dados do volume mostrou que a melhoria funcional produzida pelo transplante de células de origem muscular está principalmente ligada a um aumento da contractibilidade e não a uma modificação do ventrículo esquerdo.
Esses dados mostram que existe um efeito adicional do transplante de células de origem muscular e do tratamento com inibidores da ACE.
C ENSAIOS CLÍNICOS DE TRANSPLANTE DE CÉLULAS DE ORIGEM MUSCULAR PARA A RECONSTITUIÇÃO DE TECIDOS MIOCÁRDICOS NO HOMEM
Foram realizados ensaios clínicos de transplantes de células de origem muscular preparados de acordo com o processo da invenção no homem para tratar a insuficiência cardíaca. C.l Métodos
Foram realizados ensaios entre 6 doentes, para os quais, no momento da sua inclusão, a idade se situava entre 18 e 75 anos. Esses doentes foram todos objecto de indicações clínicas para ligação aorto-coronária com possibilidade técnica de revascularisação cirúrgica. A sua fracção de ejecção global ventricular esquerda (medida por ecocardiografia e/ou angiografia e/ou isótopos) foi inferior ou igual a 35%. Estes tinham todos antecedentes de enfarte do miocárdico transmural. Finalmente, os doentes tiveram uma hipo ou acinesia segmentar 62 afectando dois ou mais segmentos contíguos (para além de um aneurisma) relacionada com o enfarte. A actividade metabólica residual nesta zona foi inferior a 50%, foi detectada por tomografia por emissão de positrões (TEP) e não se verificou qualquer aumento na cinética na ecografia com Dobutamina com uma dose baixa (10 gama/Kg/min). São recolhidos dez a dezoito gramas de tecidos autólogos ao nível do vastus lateralis no doente. A incisão é realizada na vertical do vasto externo. O protocolo de colocação em cultura e de expansão das células é descrito na parte A do presente texto. A cultura celular a injectar é seguidamente depositada numa taça em aço inoxidável estéril para ser aspirada numa seringa de 1 mL. Uma ligação coronária é inicialmente realizada sob circulação extracorporal de acordo com a técnica convencional. Após a análise da extensão do enfarte e marcação dos limites da zona necrosada, a suspensão celular com cerca de 650 a 1200 milhões de células (1,5 x 108 células/mL) é injectada, na zona enfartada e nos seus limites, utilizando uma seringa de 1 mL. São necessárias várias injecções para depositar a totalidade das células. Este tempo de operação é realizado sob circulação extracorporal e pinçagem. C.2 Métodos de avaliação e resultados funcionais
Esses testes permitiram mostrar a exequibilidade e a segurança da técnica no homem. Além disso, são realizados ensaios de funcionalidade por medição da função ventricular esquerda (segmentar e global) e da remodelação ventricular, ligada à medição da actividade celular metabólica. Essas 63 medições são obtidas por métodos ultrasónicos tais como a ecocardiografia de Doppler convencional (medição dos diâmetros, volumes e fracções da ejecção ventricular esquerda), Doppler tecidular na zona enfartada e ecocardiografia com Dobutamina para a pesquisa de isquemia e viabilidade. Estas são também obtidas por métodos isotópicos como a Tomografia por Emissão de Positrões (capatação de desoxifluoroglicose na zona enfartada).
Essas medições são realizadas no pré-operatório e no pós-operatório no Io mês ± 8 dias e no 3o mês ± 8 dias. São apresentados abaixo os resultados obtidos após o transplante de mioblastos num doente. 0 doente é um homem de 72 anos, hospitalizado por insuficiência cardíaca (classe III da NYHA), consequente a um enfarte extensivo do miocárdio inferior e refractário ao tratamento médico, para o qual os beta-bloqueantes e os inibidores da enzima da conversão foram interrompidos, por não serem tolerados. A avaliação extracardiaca identificou, além disso, insuficiência renal moderada (creatinina: 200 mmol/L) e uma oclusão bilateral carótida sem repercussão funcional por Doppler intracraniano e consequentemente sem relevância para uma intervenção vascular autónoma.
Na ecocardiografia, a fracção da ejecção ventricular esquerda apresenta uma acinesia extensa da parede inferior a 20% e uma hipocinesia antero-lateral severa. A ausência de viabilidade nesta parede inferior é demonstrada pela persistência da acinesia sob dobutamina em dose baixa. Por outro lado, a parede antero-lateral apresenta uma resposta bifásica à dobutamine (dose baixa, seguida de dose elevada) demonstrando viabilidade e isquemia. Esses dados são confirmados por tomografia de emissão de positrões (TEP) com 2fluoro18desoxiglicose (FDG) que mostra a ausência total de viabilidade na parede inferior, mas que esta está presente nas porções anterior e lateral do ventrículo esquerdo.
Na coronarografia, verifica-se uma oclusão completa, proximal, da artéria interventricular anterior, com uma opacificação tardia da cama do leito distai através dos colaterais homolaterais, uma estenose apertada de um ramo diagonal elevado e uma oclusão proximal da artéria coronária direita. A artéria coronária direita apresenta apenas irregularidades não significativas. Consequentemente o presente doente apresenta em resumo: (1) uma alteração significativa da função ventricular esquerda, (2) uma cicatriz de enfarte acinético e metabolicamente não viável, (3) uma indicação electiva de ligação em artérias além das do enfarte. É recolhido um fragmento do vasto externo do doente por incisão curta (5 cm), sob anestesia local. Os mioblastos são produzidos de acordo com o processo da invenção descrito na parte A. O número de células é multiplicado utilizando várias expansões em placas em vários níveis permitindo obter 800 x 106 células em duas semanas, incluindo células CD56+ a 65%. A proporção de células viáveis é superior a 96%. 65
Duas semanas após a biópsia, o doente é novamente hospitalizado no serviço de cirurgia cardiaca tendo em perspectiva a sua ligação. Tendo em consideração a precariedade do estado hemodinâmico após a indução anestésica (débito cardíaco a 1,5 L/min com uma saturação venosa em oxigénio de 55%) é introduzida uma contrapulsação de forma profiláctica através de um balão intra-aórtico. As artérias diagonal e interventricular anteriores são ligadas utilizando, respectivamente, um enxerto venoso safeno e a artéria mamária interna esquerda, sob circulação extracorporal e cardioplegia sanguínea quente, retrógrada, contínua. A zona enfartada da parede inferior é facilmente identificada após a realização de anastosomes coronárias. São realizadas trinta e três injecções de células, suspensas em 5 mL de albumina e em redor dos focos necróticos esbraquiçados utilizando uma agulha 27 G de ângulo recto especialmente concebida para permitir a criação de canais sub-epicárdicos com um aspecto praticamente flictenular. A duração da pinçagem aórtica é de 56 min, incluindo 16 dedicados às injecções das células. Não se verifica qualquer hemorragia a partir dos locais de injecção e a circulação extracorporal pode ser inactivada sem dificuldades. O doente é retirado da contrapulsação e do suporte farmacológico com dobutamina durante os 3 primeiros dias pós-operatórios e sai no 8o dia após sequelas simples.
Oito meses mais tarde, o seu estado clínico melhorou e encontra-se actualmente na classe II de NYHA, enquanto que o tratamento médico permaneceu inalterado. Um Holter de 24 horas não mostrou qualquer distúrbio do ritmo. Os estudos de 4 ecocardiografias realizadas todos os meses após a operação cirúrgica mostram que a fracção da ejecção do ventrículo esquerdo aumentou em 30%. Como 0 mostra a figura 5, a 66 contractibilidade segmentar é demonstrada não apenas na parede anterior, mas também na zona posterior enfartada e enxertada que se contraiu (a percentagem de espessamento sistólico passou de valores pré-operatórios quase não detectáveis para 40%.
Um novo facto, esta contractibilidade melhorou ainda sob dobutamina. Além disso, uma imagem de Doppler tecidular mostra o aparecimento de um gradiente de velocidade transmiocárdica na sistole. Uma nova tomografia com emissão de positrões com FDG mostra, claramente, a captação do traçado na parede inferior, com uma proporção da actividade entre a parede e o septo (tido como controlo), que aumenta de 0,5 antes da operação para 0,7, o que reflecte uma nova actividade metabólica na zona enfartada desprovida de viabilidade no pré-operatório (Figura 6). Esta última observação não pôde ter sido influenciada pela revascularização miocárdica associada e, confrontada com os dados ecocardiográficos, sugere que a melhoria funcional na zona enfartada esteja realmente relacionada com a presença dos mioblastos enxertados.
Tomados no seu conjunto, esses resultados mostram que a função da zona enfartada foi melhorada pelo transplante de mioblastos obtidos de acordo com o processo da invenção.
Foi ainda realizada a injecção de células musculares autólogas, preparadas de acordo com o processo, em 5 outros doentes. As tabelas seguintes resumem os dados do seguimento clinico em 4 de 5 doentes (denominados respectivamente MY03, MY04, MY05 e MY06). A continuação clinica do sexto doente está em curso. 67
Nome do doente D. MYO 3 Idade 62 Sexo M Tipo de Patologia Insuficiência cardíaca pós-isguémica, angor instável Fracção de ejecção 25% Estádio classificação nyha III PET-Scan Presença de uma zona não viável Ecografia inicial Acinesia anterior, discinesia apical, hipocinesia lateral Avaliação virológica Negativa Duração da cultura 18 D Células: número, caracteristicas 922 X 106. CD56+: 91%; CD15+: 6%; Desmina+: 65%; Viabilidade: 98%; Formação de miotubos (teste funcional): +. Local de injecção Anterior; 900 X 106 células injectadas Complicações infecciosas Ausência de complicações infecciosas pós-operatórias Avaliação funcional: - Estádio NYHA - Fracção de ejecção - Contractibilidade segmentar - III-> II - 25%-> 35% - Aumento (+/-) Evolução da viabilidade segmentar Melhoria (+) 68
Nome do doente E. MYO 4 Idade 67 Sexo M Tipo de Patologia insuficiência cardíaca pós-isquémica Fracção de ejecção 31% Estádio classificação NYHA III PET-Scan Presença de uma zona não viável Ecografia inicial Acinesia apical, acinesia posterior, hipocinesia lateral Avaliação virológica Negativa Duração da cultura 20 D Células: número, caracteristicas 657 X 106. CD56+: 97%; CD15+: 15%; Desmina+: 58%; HLA Classel: 94%; Viabilidade: 98%; Formação de miotubos (teste funcional): +. Local de injecção Posterior; 620 X 106 células injectadas Complicações infecciosas Ausência de complicações infecciosas pós-operatórias Avaliação funcional: - Estádio NYHA - Fracção de ejecção - Contractibilidade segmentar - III-> II - 31%-> 50% - Aumento (+/-) Evolução da viabilidade segmentar Melhoria (+) 69
Nome do doente F. MYO 5 Idade 39 Sexo M Tipo de Patologia Insuficiência cardíaca pós-isquémica Fracção de ejecção 22% Estádio classificação nyha III PET-Scan Presença de uma zona não viável Ecografia inicial Acinesia apical, acinesia posterior, hipocinesia anterior, hipocinesia lateral Avaliação virológica Negativa Duração da cultura 14 D Células: número, caracteristicas 993 X 10b. CD56+: 95%; CD15+: 4%; Desmina+: 78%; HL A Classel: 96%; Viabilidade: 98%; Formação de miotubos (teste funcional): +. Local de injecção Postero-lateral; 950 X 106 células injectadas Complicações infecciosas Ausência de complicações infecciosas pós-operatórias Avaliação funcional: - Estádio NYHA - Fracção de ejecção - Contractibilidade segmentar - III-> II - 22%-> 36% - Aumento (+) Evolução da viabilidade segmentar Melhoria (+) 70
Nome do doente G. MYO 6 Idade 55 Sexo M Tipo de Patologia insuficiência cardíaca pós-isquémica Fracção de ejecção 34% Estádio classificação NYHA IV PET-Scan Presença de uma zona não viável Ecografia inicial Acinesia anterior, acinesia lateral, discinesia apical, hipocinesia septal Avaliação virológica Negativa Duração da cultura 16 D Células: número, características 1210 X 106. CD56+: 85%; CD15+: 10%; Desminat: 85%; HLA Classel: 96%; Viabilidade: 97%; Formação de miotubos (teste funcional): +. Local de injecção Anterior; 1150 X 106 células injectadas Complicações infecciosas Antes da injecção, doente num estado de choque cardiovascular, sob adrenalina e noradrenalina. Ausência de complicações infecciosas pós-operatórias (24 h) após injecção. Avaliação funcional: - Estádio NYHA - Fracção de ejecção - Contractibilidade segmentar 0 doente morreu em 28/04/01. Causa de morte não imputável à injecção celular (choque cardiovascular seguido de isquemia mesentérica provável) Evolução da viabilidade segmentar Sem objecto 71
Em resumo, esses testes mostraram a possibilidade de obter o número de células pretendido dentro de um tempo limitado de 2 a 4 semanas. Estes mostraram, além disso, que a recolha, a preparação e o transplante de células musculares autólogas humanas podem ser realizados de acordo com a invenção sem dificuldades e complicações, pré, per ou pós-cirúrgicas.
Finalmente, esses testes permitiram além disso observar uma melhoria clinica, um aumento da contractibilidade regional (ecografia) associada a um aumento da superfície da zona viável (PET-Scan) entre esses doentes.
Em conclusão, os estudos apresentados nas partes B e C permitem produzir os diferentes resultados seguintes: a) estes mostram que o transplante de células de origem muscular melhora significativamente a função ventricular esquerda após um enfarte miocárdio, b) que a melhoria está claramente dependente do número de células injectadas, c) que este transplante potência um tratamento farmacológico, nomeadamente por uma inibição da ACE. d) E, finalmente, que o processo da invenção está adaptado ao tratamento da insuficiência cardíaca no homem. 72 1. Emerich, D. F. (1993). Cell transplantations of Huntington's disease. Cell transplantation 4: 348. 2. Borlongan, C. V. e Sandberg, P. (1993). Microtransplantation of nigral dopamine neurons in a rat model of ParkinsorTs disease. Cell Transplantation 4: 347. 3. Hering, B. J., Browatzki, C.C., Schultz, A., Bretzel, R.G. e
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Lisboa, 29 de Janeiro de 2010 76
Claims (23)
- REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de uma composição destinada à terapia celular no homem, compreendendo o referido processo as etapas seguintes: a) trituração de uma biópsia de tecido muscular esquelético, b) dissociação enzimática de fibras e células musculares e separação das células individualizadas por filtração, c) cultura das células obtidas na etapa b) num reactor de cultura de células aderentes na presença de um meio compreendendo MCDB 120 e a D-valina substituída por L-valina, até á obtenção de uma população de células compreendendo células CD56+ como tipo celular dominante, sendo o referido tipo celular dominante quando a proporção deste tipo celular na referido população de células excede 50%, compreendendo a referida cultura uma ou mais fases de expansão se necessário, d) recolha da população de células obtida na etapa c), e) se necessário, congelação da população de células recolhida na etapa d).
- 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a população de células recolhidas compreender de 50 x 106 células a 800 x 109 células, de um modo preferido, pelo menos, 500 x 106 células, de entre as quais as células 1 mioblásticas expressando o marcador CD56 constituem o referido tipo celular dominante.
- 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a população celular recolhida compreender, pelo menos 50%, de um modo preferido, 60% e, de um modo mais preferido, 70% de células mioblásticas expressando o marcador CD56.
- 4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 3, caracterizado por o referido meio conter um glucocorticóide e bFGF.
- 5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 4, caracterizado por a composição se destinar à reconstituição de um tecido muscular esquelético, cardiaco ou visceral no homem.
- 6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 5, caracterizado por a composição se destinar ao tratamento, da insuficiência cardíaca pós-isquémica no homem.
- 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado por a composição se destinar ao tratamento de uma distrofia muscular inata ou adquirida.
- 8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 7, caracterizado por a referida etapa de trituração ser auxiliada pela utilização de homogeneizadores com facas, mecânicos ou eléctricos. 2
- 9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 8, caracterizado por este compreender, adicionalmente, uma etapa de empobrecimento de células CD34+.
- 10. Produto de terapia celular para a sua utilização no tratamento de uma patologia cardíaca no homem, compreendendo uma população de 500.106 a 800.109 células, compreendendo a referida população, pelo menos, 50% de células CD56+.
- 11. Produto de terapia celular de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida população compreender, pelo menos, 60% de células CD56+.
- 12. Produto de terapia celular de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida população compreender, pelo menos, 70% de células CD56+.
- 13. Produto de terapia celular de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, caracterizado por o referido tratamento de uma patologia cardíaca ser um tratamento para reparação de um tecido cardíaco no homem.
- 14. Produto de terapia celular de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 13, caracterizado por a referida patologia cardíaca ser uma insuficiência cardíaca pós-isquémica.
- 15. Produto de terapia celular de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido tratamento de uma insuficiência cardíaca pós-isquémica ser realizado 3 concomitantemente com um tratamento com um inibidor da enzima de conversão da angiotensina (ACEI).
- 16. Produto de terapia celular de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 15, caracterizado por o referido tratamento de uma patologia cardiaca ser um tratamento por transplante autólogo.
- 17. Utilização de uma população celular como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, para a produção de um produto de terapia celular destinado ao tratamento de uma patologia cardiaca.
- 18. Meio de cultura compreendendo MCDB 120 e a D-valina substituída por L-valina.
- 19. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 18, que não compreende vermelho de fenol e não compreende timidina.
- 20. Utilização in vitro do meio de cultura de acordo com a reivindicação 18 ou 19, para a diferenciação de células do tecido muscular esquelético em mioblastos.
- 21. Utilização in vitro do meio de cultura de acordo com a reivindicação 18 ou 19, para obter uma população celular compreendendo um tipo celular dominante seleccionado de células CD34+, células CD15+, células CD56+, células HLA Classe 1, sendo o referido tipo celular dominante quando a proporção deste tipo celular excede 50%. 4
- 22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por o referido tipo celular dominante ser seleccionado de entre células CD34+, células CD15+, células CD56+.
- 23. Utilização in vitro do meio de cultura de acordo com a reivindicação 18 ou 19, para a produção de um produto de terapia celular compreendendo uma população de células compreendendo células CD56+ como tipo celular dominante, sendo o referido tipo celular dominante quando a proporção deste tipo celular na referida população de células excede 50%. Lisboa, 29 de Janeiro de 2010 5
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