CN107513518A - 一种脐带间充质干细胞体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞体外培养方法，其步骤如下：取脐带近胎段5cm；将脐带组织放入预先装有含量90U/ml青霉素和90U/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中；将组织剪切过程中滴加DMEM/F12培养液保持组织湿润；使用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素洗涤3次，取用15ml的离心管将脐带组织离心5min备用；消化酶的制备；分别在消化后1h、2h、3h用含10％FBS、90U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，得到脐带间充质干细胞；将分离的脐带间充质干细胞以1×106/ml细胞密度接种到涂覆有壳聚糖薄膜的培养皿内；将培养皿放置在37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养48h，使用加样枪小心沿培养皿壁吸取旧的培养液，再加热新的培养液，培养至第5天，本发明提高干细胞分离和制备的效率。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，更具体地说，尤其涉及一种脐带间充质干细胞体外培养方法。
背景技术
干细胞即为起源细胞，是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力(Self-renewing)，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞是自我复制还是分化功能细胞，主要由于细胞本身的状态和微环境因素所决定。包括调节细胞周期的各种周期素(Cyclin)和周期素依赖激酶(Cyclin－DependentKinase)、基因转录因子、影响细胞不对称***的细胞质因子。微环境因素，包括干细胞与周围细胞，干细胞与外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotentstemcell，TSC)、多能干细胞(pluripotentstemcell)和单能干细胞(unipotentstemcell)。干细胞(StemCell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并最终通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗，现有的干细胞培养过程中医衰老，活性降低。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种脐带间充质干细胞体外培养方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞体外培养方法，该脐带间充质干细胞体外培养方法具体步骤如下：
S1：无菌状态下取正常足月剖腹产的脐带近胎段5cm，将脐带组织均分为5等分；
S2：将S1等分好的脐带组织放入预先装有含量90U/ml青霉素和90U/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中，在4℃下保存，并且在2小时内采用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素进行洗涤剔除组织中残余的血渍和静脉组织；
S3：将脐带组织剪成2mm×2mm×2mm大小的碎片状组织，在剪切过程中滴加DMEM/F12培养液保持组织湿润；
S4：使用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素洗涤3次，取用15ml的离心管将脐带组织离心5min备用；
S5：消化酶的制备，配置Ⅱ型胶原酶0.1-0.3w/v％、胰酶0.1-0.3w/v％、EDTA0.03w/v％、透明质酸酶0.2w/v％和DNA酶0-0.2w/v％混合在灭过菌的培养基内，将S4中处理好的脐带组织混合在消化酶培养基内，37.5℃震荡消化；
S6：分别在消化后1h、2h、3h用含10％FBS、90U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，1200r/min离心5分钟，弃上清，得到脐带间充质干细胞；
S7：将分离的脐带间充质干细胞以1×106/ml细胞密度接种到涂覆有壳聚糖薄膜的培养皿内；
S8：将培养皿放置在37℃、体积分数为5％的食品级二氧化碳培养箱中培养48h，使用加样枪小心沿培养皿壁吸取旧的培养液，再加热新的培养液，培养至第5天。
优选的，所述将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养皿的表面，在超净台中放置12h吹干，形成壳聚糖薄膜。
优选的，所述的人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV。
优选的，所述脐带按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源病毒的检测，保证脐带安全可靠和溯源。
本发明的技术效果和优点：本发明提供的一种脐带间充质干细胞体外培养方法，与传统技术相比，本发明明显提高间充质干细胞的活性具有一定的抗衰老性，提高间充质干细胞的培养的效率，可以在更短的时间获得更多的间充质干细胞，方便临床研究。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种脐带间充质干细胞体外培养方法，该脐带间充质干细胞体外培养方法具体步骤如下：
S1：无菌状态下取正常足月剖腹产的脐带近胎段5cm，将脐带组织均分为5等分；
S2：将S1等分好的脐带组织放入预先装有含量90U/ml青霉素和90U/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中，在4℃下保存，并且在2小时内采用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素进行洗涤剔除组织中残余的血渍和静脉组织；
S3：将脐带组织剪成2mm×2mm×2mm大小的碎片状组织，在剪切过程中滴加DMEM/F12培养液保持组织湿润；
S4：使用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素洗涤3次，取用15ml的离心管将脐带组织离心5min备用；
S5：消化酶的制备，配置Ⅱ型胶原酶0.1w/v％、胰酶0.3w/v％、EDTA0.03w/v％、透明质酸酶0.2w/v％和DNA酶0w/v％混合在灭过菌的培养基内，将S4中处理好的脐带组织混合在消化酶培养基内，37.5℃震荡消化；
S6：分别在消化后1h、2h、3h用含10％FBS、90U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，1200r/min离心5分钟，弃上清，得到脐带间充质干细胞；
S7：将分离的脐带间充质干细胞以1×106/ml细胞密度接种到涂覆有壳聚糖薄膜的培养皿内；
S8：将培养皿放置在37℃、体积分数为5％的食品级二氧化碳培养箱中培养48h，使用加样枪小心沿培养皿壁吸取旧的培养液，再加热新的培养液，培养至第5天。
具体的，所述将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养皿的表面，在超净台中放置12h吹干，形成壳聚糖薄膜。
具体的，所述的人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV。
具体的，所述脐带按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源病毒的检测，保证脐带安全可靠和溯源。
实施例2
一种脐带间充质干细胞体外培养方法，该脐带间充质干细胞体外培养方法具体步骤如下：
S1：无菌状态下取正常足月剖腹产的脐带近胎段5cm，将脐带组织均分为5等分；
S2：将S1等分好的脐带组织放入预先装有含量90U/ml青霉素和90U/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中，在4℃下保存，并且在2小时内采用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素进行洗涤剔除组织中残余的血渍和静脉组织；
S3：将脐带组织剪成2mm×2mm×2mm大小的碎片状组织，在剪切过程中滴加DMEM/F12培养液保持组织湿润；
S4：使用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素洗涤3次，取用15ml的离心管将脐带组织离心5min备用；
S5：消化酶的制备，配置Ⅱ型胶原酶0.3w/v％、胰酶0.1w/v％、EDTA0.03w/v％、透明质酸酶0.2w/v％和DNA酶0.1w/v％混合在灭过菌的培养基内，将S4中处理好的脐带组织混合在消化酶培养基内，37.5℃震荡消化；
S6：分别在消化后1h、2h、3h用含10％FBS、90U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，1200r/min离心5分钟，弃上清，得到脐带间充质干细胞；
S7：将分离的脐带间充质干细胞以1×106/ml细胞密度接种到涂覆有壳聚糖薄膜的培养皿内；
S8：将培养皿放置在37℃、体积分数为5％的食品级二氧化碳培养箱中培养48h，使用加样枪小心沿培养皿壁吸取旧的培养液，再加热新的培养液，培养至第5天。
具体的，所述将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养皿的表面，在超净台中放置12h吹干，形成壳聚糖薄膜。
具体的，所述的人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV。
具体的，所述脐带按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源病毒的检测，保证脐带安全可靠和溯源。
实施例3
一种脐带间充质干细胞体外培养方法，该脐带间充质干细胞体外培养方法具体步骤如下：
S1：无菌状态下取正常足月剖腹产的脐带近胎段5cm，将脐带组织均分为5等分；
S2：将S1等分好的脐带组织放入预先装有含量90U/ml青霉素和90U/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中，在4℃下保存，并且在2小时内采用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素进行洗涤剔除组织中残余的血渍和静脉组织；
S3：将脐带组织剪成2mm×2mm×2mm大小的碎片状组织，在剪切过程中滴加DMEM/F12培养液保持组织湿润；
S4：使用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素洗涤3次，取用15ml的离心管将脐带组织离心5min备用；
S5：消化酶的制备，配置Ⅱ型胶原酶0.2w/v％、胰酶0.2w/v％、EDTA0.03w/v％、透明质酸酶0.2w/v％和DNA酶0.2w/v％混合在灭过菌的培养基内，将S4中处理好的脐带组织混合在消化酶培养基内，37.5℃震荡消化；
S6：分别在消化后1h、2h、3h用含10％FBS、90U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，1200r/min离心5分钟，弃上清，得到脐带间充质干细胞；
S7：将分离的脐带间充质干细胞以1×106/ml细胞密度接种到涂覆有壳聚糖薄膜的培养皿内；
S8：将培养皿放置在37℃、体积分数为5％的食品级二氧化碳培养箱中培养48h，使用加样枪小心沿培养皿壁吸取旧的培养液，再加热新的培养液，培养至第5天。
具体的，所述将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养皿的表面，在超净台中放置12h吹干，形成壳聚糖薄膜。
具体的，所述的人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV。
具体的，所述脐带按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源病毒的检测，保证脐带安全可靠和溯源。
本发明提供的一种脐带间充质干细胞体外培养方法，本发明明显提高间充质干细胞的活性具有一定的抗衰老性，提高间充质干细胞的培养的效率，可以在更短的时间获得更多的间充质干细胞，方便临床研究。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种脐带间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：该脐带间充质干细胞体外培养方法具体步骤如下：
S1：无菌状态下取正常足月剖腹产的脐带近胎段5cm，将脐带组织均分为5等分；
S2：将S1等分好的脐带组织放入预先装有含量90U/ml青霉素和90U/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中，在4℃下保存，并且在2小时内采用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素进行洗涤剔除组织中残余的血渍和静脉组织；
S3：将脐带组织剪成2mm×2mm×2mm大小的碎片状组织，在剪切过程中滴加DMEM/F12培养液保持组织湿润；
S4：使用90U/ml青霉素和90U/ml链霉素洗涤3次，取用15ml的离心管将脐带组织离心5min备用；
S5：消化酶的制备，配置Ⅱ型胶原酶0.1-0.3w/v％、胰酶0.1-0.3w/v％、EDTA 0.03w/v％、透明质酸酶0.2w/v％和DNA酶0-0.2w/v％混合在灭过菌的培养基内，将S4中处理好的脐带组织混合在消化酶培养基内，37.5℃震荡消化；
S6：分别在消化后1h、2h、3h用含10％FBS、90U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，1200r/min离心5分钟，弃上清，得到脐带间充质干细胞；
S7：将分离的脐带间充质干细胞以1×106/ml细胞密度接种到涂覆有壳聚糖薄膜的培养皿内；
S8：将培养皿放置在37℃、体积分数为5％的食品级二氧化碳培养箱中培养48h，使用加样枪小心沿培养皿壁吸取旧的培养液，再加热新的培养液，培养至第5天。
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：所述将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养皿的表面，在超净台中放置12h吹干，形成壳聚糖薄膜。
3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：所述的人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV。
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：所述脐带按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源病毒的检测，保证脐带安全可靠和溯源。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171226 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |