CN111690599A - 一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法。是要解决现有间充质干细胞分化成软骨细胞的方法软骨细胞数量少，繁殖能力低的问题。方法：一、复苏P8代脐带来源间充质干细胞，采用含维生素D、维生素A和EGF的完全培养基培养，消化，传代，获得P10代脐带间充质干细胞；二、取P10代脐带间充质干细胞，清洗，取样进行细胞计数，采用含维生素D、维生素A和EGF的完全培养基进行培养；次日更换培养基，进行分化培养；用含维生素D、维生素A和TGF‑β1的分化基础培养基；培养13‑15天，即完成。本发明应用于间充质干细胞分化成软骨细胞领域。

Description

一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层，其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤，临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液***疾病、心血管疾病。
软骨细胞在诱导过程分三个阶段：第一阶段MSCs形成高密度的细胞聚集体，停止增殖，分泌丰富的透明质酸和I型胶原，组织特异性的转录因子如Sox-9和结构蛋白开始积累；第二个阶段MSCs分化为软骨前体祖细胞，聚集的细胞重新增殖，产生初期胞外基质，开始软骨分化，此过程受到Sox-9、Sox-5、Sox-6、FGF、TGF-β1信号途径的调控；第三阶段称为去分化阶段，在这个阶段会形成软骨基质，表达II胶原、IX胶原和XI胶原。
在多数的实验中，间充质干细胞分化为软骨细胞要求间充质干细胞的代次较低，而且分化后的软骨细胞数量并不多，并且高代次间充质干细胞分化成软骨细胞的过程中细胞的增殖功能降低，导致分化后的软骨细胞数量减少。
发明内容
本发明是要解决现有间充质干细胞分化成软骨细胞的方法软骨细胞数量少，繁殖能力低的问题，提供一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法。
本发明促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，包括以下步骤：
一、干细胞扩增培养：
复苏P8代脐带来源间充质干细胞，采用无血清培养基进行培养，次日进行换液，换液所用培养基为含有终浓度0.8-1.5mol/L维生素D、1.5-2.5mol/L维生素A和90-110ng/mlEGF的完全培养基，消化，传代，最终获得P10代脐带间充质干细胞；
二、成软骨细胞的分化：
取步骤一培养得到的P10代脐带间充质干细胞，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度至1×104个/ml；
在24孔板中按照细胞浓度1×104个/孔接种P10代脐带间充质干细胞，采用含有终浓度0.8-1.5mol/L维生素D、1.5-2.5mol/L维生素A和90-110ng/ml EGF的完全培养基进行细胞培养；
次日更换培养基，即为第一次换液，进行分化培养；第一次换液所用培养基为含有终浓度1.8-2.2mol/L维生素D、3.5-4.5mol/L维生素A和190-210ng/ml TGF-β1的分化基础培养基；
之后每3天换一次液，第二次换液所用培养基为含有终浓度1.8-2.2mol/L维生素D、3.5-4.5mol/L维生素A和390-410ng/ml TGF-β1的分化基础培养基，之后换液所用培养基均与第二次换液所用培养基相同；
培养13-15天，即完成成软骨细胞的分化培养。
进一步的，步骤一中待细胞融合度达到70％以上，进行消化，获取单个细胞。
进一步的，步骤一中按照1×106个细胞/T175瓶接种，待细胞融合度达到90％以上后进行传代。
进一步的，对步骤一获得的P10代脐带间充质干细胞进行免疫标记检测。
进一步的，步骤一和步骤二中所述完全培养基是在基础培养基中添加肝素钠，每560mL基础培养基中添加120-160μl肝素钠。
进一步的，步骤二中所述分化基础培养基是在MesenCultMT OsteogenicDifferentiation Kit中添加肝素钠，每560mL MesenCultMT Osteogenic DifferentiationKit中添加120-160μl肝素钠。
进一步的，步骤二在24孔板中接种细胞之前，加入玻片，加入450-500μl生理盐水，30-35min弃去生理盐水。
本发明的原理：
本发明通过细胞培养及分化过程中向培养基中加入维生素D、维生素A、EGF、TGF-β1促进间充质干细胞增殖和间充质干细胞分化骨细胞。
维生素A对视力变化、骨骼发育、***生成和胚胎发育都有重要影响，维持着机体的多种生理功能。维生素A可维持***的形态并保持其活力，还能促进多种细胞的增殖。维生素A更有利于干细胞的体外増殖，对干细胞的发育和减数***等方面具有促进作用，也有利于干细胞全能性的维持。维生素A可能对细胞增殖有一定的促进作用，通过MTT检测发现在培养液中添加适量浓度的维生素A培养细胞，细胞数目明显增多、细胞増殖速率也显著加快。
维生素D(vitamin D，VitD)脂溶性维生素，属于一种类固醇激素，其生理作用非常广泛，除了广为人知的参与体内钙磷代谢外，VitD也具有调节免疫力、控制细胞生长与存活、细胞分化、保护DNA等多种作用，还对各个胚层的干细胞的增殖和分化有重要影响，特别是在干细胞向神经、成骨、造血等方向的分化。
表皮生长因子(EGF)是一类重要的生长因子，是类EGF大家族的一个成员，能够促进细胞的增殖分化，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促***作用。
软骨组织只含有单一软骨细胞，在MSCs的培养过程中加入TGF-β1，能够促进细胞的增殖和胞外基质的产生，下调I型胶原，上调II型胶原和糖胺蛋白聚糖(glycosaminoglycan)表达。软骨细胞主要合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等细胞外基质成分，且在固体基质内，50％-75％是胶原和15％-30％是蛋白聚糖。
本发明的有益效果：
本发明通过在间充质干细胞扩增过程中增加细胞的增殖功能，保护细胞的分化功能，在分化成软骨细胞过程能够增加细胞的分化功能和速度。
本发明细胞培养阶段，添加维生素D、维生素A和EGF后培养的间充质干细胞增殖功能比未添加的对照组干细胞扩增细胞数量显著增加，干细胞的增殖功能显著增强；
本发明分化培养阶段，添加维生素D、维生素A和TGF-β1后诱导的间充质干细胞比未添加的对照组间充质干细胞II型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达显著增高；
添加维生素D，维生素A和TGF-β1后诱导的高代次间充质干细胞可分化为成软骨细胞，间充质干细胞诱导分化为成软骨细胞周期短，诱导15天即可分化为成软骨细胞。
本发明使用培养间充质干细胞的方法也可应用于其他不同来源的间充质干细胞的培养；
本发明的方法可用于主细胞库和工作细胞库间充质干细胞的建立，应用于临床试验。
附图说明
图1为P10代间充质干细胞增殖功能测定；其中●表示对照组，■表示实验组1，▲表示实验组2，▼表示实验组3，◆表示实验组4，○表示实验组5；
图2为分化诱导后的间充质干细胞糖胺蛋白聚糖mRNA的表达情况；
图3为分化诱导后的间充质干细胞II型胶原mRNA的表达情况。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，包括以下步骤：
一、干细胞扩增培养：
复苏P8代脐带来源间充质干细胞，采用无血清培养基进行培养，次日进行换液，继续进行细胞培养，换液所用培养基为含有终浓度0.8-1.5mol/L维生素D、1.5-2.5mol/L维生素A和90-110ng/ml EGF的完全培养基，消化，传代，最终获得P10代脐带间充质干细胞；
本步骤进行细胞培养所用培养基的作用是促进复苏后的细胞贴壁，提高细胞的活性。
二、成软骨细胞的分化：
取步骤一培养得到的P10代脐带间充质干细胞，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度至1×104个/ml；
在24孔板中按照细胞浓度1×104个/孔接种P10代脐带间充质干细胞，采用含有终浓度1mol/L维生素D、2mol/L维生素A和100ng/ml EGF的完全培养基进行细胞培养；本步骤进行细胞培养所用培养基的作用是促进复苏后的细胞贴壁，提高细胞的活性。
次日更换培养基，即为第一次换液，进行分化培养，第一次换液所用培养基为含有终浓度2mol/L维生素D、4mol/L维生素A和200ng/ml TGF-β1的分化基础培养基；分化培养所用培养基的作用是提高干细胞分化功能。
之后每3天换一次液，第二次换液所用培养基为含有终浓度2mol/L维生素D、4mol/L维生素A和400ng/ml TGF-β1的分化基础培养基，之后换液所用培养基均与第二次换液所用培养基相同；第二次换液及以后换液提高了TGF-β1的浓度，有利于促进分化培养。
培养15天，即完成成软骨细胞的分化。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中待细胞融合度达到70％以上，进行消化，获取单个细胞。其它与具体实施方式一相同。
细胞融合度达到70％以上再进行消化，是为了使细胞达到足够的数量。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中按照1×106个细胞/T175瓶接种，待细胞融合度达到90％以上后进行传代。其它与具体实施方式一或二相同。
待细胞融合度达到90％以上后进行传代，是为了使细胞达到足够的数量。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：对步骤一获得的P10代脐带间充质干细胞进行免疫标记检测。其它与具体实施方式一至三之一相同。
免疫标记检测表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，目的是判断细胞扩增过程中细胞是否发生变异，是否符合间充质干细胞的特性。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一和步骤二中所述完全培养基是在基础培养基中添加肝素钠，每560mL基础培养基中添加120-160μl肝素钠。其它与具体实施方式一至四之一相同。
在基础培养基中添加肝素钠的作用是防止细胞聚团，能够使细胞散在分布生长。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中所述分化基础培养基是在MesenCultMT Osteogenic Differentiation Kit中添加肝素钠，每560mL MesenCultMT Osteogenic Differentiation Kit中添加120-160μl肝素钠。其它与具体实施方式一至五之一相同。
在MesenCultMT Osteogenic Differentiation Kit中添加肝素钠的作用是防止细胞聚团，能够使细胞散在分布生长。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二在24孔板中接种细胞之前，加入玻片，加入450-500μl生理盐水，30-35min弃去生理盐水。其它与具体实施方式一至六之一相同。
本实施方式在孔板里面加玻片，细胞爬在玻片上，染色后，便于保存和镜下观察。生理盐水可以去掉玻片与孔板之间的气体，这样玻片紧贴在孔板底部。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一、干细胞扩增培养：
复苏P8代脐带来源间充质干细胞，在无菌工作台内，采用无血清培养基进行培养，将细胞分为实验组和对照组，其中实验组又分为实验组1～实验组5。次日进行换液，继续进行细胞培养，待细胞融合度达到70％以上后，通过0.125％胰酶进行消化，获取单个细胞，按照1×106个细胞/T175瓶接种，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，最终获取P10代细胞。其中实验组各组进行细胞培养所用培养基与对照组不同，具体见表2所示。
通过脐带MSCs的免疫标记检测，证明获得的P10代细胞均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性，此P10代脐带间质干细胞即为用于成骨分化的种子细胞。
二、成软骨细胞的分化：
取步骤一培养得到的P10代脐带间充质干细胞，用生理盐水清洗2遍，取样进行细胞计数，调整细胞浓度至1×104个/ml。在24孔板中加入玻片，加入500μl生理盐水，30min后弃去生理盐水，按照细胞浓度1×104个/孔接种，进行细胞培养。实验组各组进行细胞培养所用培养基与对照组不同，具体见表2所示。本步骤各组中细胞培养的培养基与步骤一中细胞培养用的培养基相同。
次日更换培养基(即为第一次换液)，进行分化培养。实验组进行分化培养所用培养基与对照组不同，具体见表2所示。之后每3天换一次液。
实验组和对照组均培养至21天，将细胞用PBS轻缓漂洗一次，进行甲苯胺蓝染色30min，三蒸水清洗干净，苏木精染核，无水乙醇脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，镜下观察。
实施例2：Ⅱ型胶原和糖胺蛋白聚糖的定量检测：
收集实施例1中软骨诱导7，10，13，16，19，21d的培养液及细胞分别进行Ⅱ型胶原和糖胺蛋白聚糖的定量检测。对照组用培养天数相同的P10代人脐带间充质干细胞。Ⅱ型胶原定量检测采用羟脯氨酸法，各组标本均按照羟脯氨酸试剂盒说明书(消化法)步骤进行操作。糖胺蛋白聚糖定量采用阿利新蓝法，各组标本用木瓜蛋白酶消化，消化产物加入阿利新蓝，在酶标仪600nm波长处测定吸光度值。
实施例3：实时定量PCR检测：
对P10代人脐带间充质干细胞及诱导分化的软骨细胞进行实时定量PCR检测。取300ng总RNA反转录为cDNA作为q PCR的模板。实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、糖胺蛋白聚糖的mRNA表达，用GADPH为内参。
诱导后的间充质干细胞qRT-PCR鉴定：TRIzol提取诱导后间充质干细胞总RNA，反转录获得cDNA，进行qRT-PCR反应。引物序列如表1所示：
表1
Figure BDA0002590101800000071
在PCR反应中，将正常的间充质干细胞作为对照组。根据Ⅱ型胶原和糖胺蛋白聚糖基因的扩增效率和qRT-PCR由荧光定量PCR仪给出的Ct值，以GADPH为内参基因，对RT-PCR结果运用2-ΔΔCt法进行分析，各个基因的表达量根据公式计算：
ΔΔCt＝处理组(Ct目的基因-CtGAPDH)-对照组(Ct目的基因-CtGAPDH)
目的基因表达水平差异倍数＝2-ΔΔCt
表2
分组 细胞培养 分化培养
对照组 完全培养基 分化基础培养基
实验组1 完全培养基+V<sub>D</sub>+V<sub>A</sub>+EGF 分化基础培养基+V<sub>D</sub>+V<sub>A</sub>+TGF-β1
实验组2 完全培养基+V<sub>D</sub>+V<sub>A</sub> 分化基础培养基+V<sub>D</sub>+V<sub>A</sub>
实验组3 完全培养基+V<sub>D</sub>+EGF 分化基础培养基+V<sub>D</sub>+TGF-β1
实验组4 完全培养基+V<sub>A</sub>+EGF 分化基础培养基+V<sub>A</sub>+TGF-β1
实验组5 完全培养基+EGF 分化基础培养基+TGF-β1
细胞培养：对照组进行细胞培养所用培养基为完全培养基；所述完全培养基是在基础培养基中添加肝素钠，每560mL基础培养基中添加160μl肝素钠。实验组1-5组分别根据表2中分组，添加组分，分别添加入培养基中，含有维生素D的终浓度为1mol/L，含有维生素A的终浓度为2mol/L，含有EGF的终浓度为100ng/ml。
分化培养：对照组使用分化基础培养基培养；所述分化基础培养基是在MesenCultMT Osteogenic Differentiation Kit中添加肝素钠，每560mL MesenCultMTOsteogenic Differentiation Kit中添加160μl肝素钠。实验组1-5组分别根据表2中分组，添加组分，分别添加入培养基中，第一次换液的实验组中软骨培养基中含有维生素D的终浓度为2mol/L，含有维生素A的终浓度为4mol/L，含有TGF-β1的终浓度为200ng/ml。第二次换液及以后换液，实验组1-5组的培养基含有维生素D的终浓度为2mol/L，维生素A的终浓度为4mol/L，TGF-β1的终浓度为400ng/ml。
实验结果：
干细胞扩增培养获得的P10代细胞的免疫表型表达率如表3所示。
流式细胞仪检测的结果表明，各实验组在培养基内添加成份后在细胞扩增过程中细胞未发生变异，符合间充质干细胞的特性。
表3免疫表型表达率(％)：
细胞 CD34 CD45 CD73 CD90 CD105
对照组 0.58±0.06 0.29±0.08 99.43±0.02 99.92±0.03 99.71±0.02
实验组1 0.29±0.09 0.31±0.01 99.71±0.05 99.98±0.06 99.86±0.04
实验组2 0.19±0.06 0.34±0.08 99.61±0.09 99.65±0.03 99.34±0.09
实验组3 0.22±0.02 0.29±0.06 99.39±0.06 93.97±0.09 99.65±0.05
实验组4 0.30±0.01 0.21±0.03 99.54±0.08 95.37±0.05 99.62±0.04
实验组5 0.24±0.03 0.34±0.04 99.32±0.06 96.34±0.04 99.34±0.06
不同培养基培养的细胞的倍增时间检测如表4所示。P10代间充质干细胞增殖功能检测结果如图1所示。通过实验数据可知，不同培养基培养后的细胞增殖的倍增时间不同，时间越短说明细胞的倍增越快，增殖功能强。其中实验组1是倍增时间最短，说明实验组1细胞培养的培养基中同时添加维生素D、维生素A和EGF，有利于细胞增殖功能的增强。维生素D、维生素A和EGF三种成分之间相互作用，协同增效，缺一不可。
表4细胞增殖功能检测
细胞 倍增时间(DT)
对照组 27.8±2.2
实验组1 21.2±2.3
实验组2 23.8±2.1
实验组3 26.8±1.9
实验组4 24.5±1.8
实验组5 24.6±2.2
进行成软骨细胞分化培养，诱导21天后，间充质干细胞糖胺蛋白聚糖mRNA和II型胶原mRNA表达变化如表5所示。糖胺蛋白聚糖和II型胶原是软骨细胞分化过程中不断产生的蛋白，实验结果表明，在5个实验组中，培养基内分别添加不同因子后，实验组1中细胞的分化功能最好，表达量最高。说明实验组1分化培养的培养基中同时添加维生素D、维生素A和EGF，有利于细胞增殖功能的增强。维生素D、维生素A和TGF-β1三种成分之间相互作用，协同增效，缺一不可。
表5诱导后的间充质干细胞糖胺蛋白聚糖mRNA和II型胶原mRNA表达变化
Figure BDA0002590101800000091

Claims (7)

1.一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、复苏P8代脐带来源间充质干细胞，采用无血清培养基进行培养，次日进行换液，换液所用培养基为含有终浓度0.8-1.5mol/L维生素D、1.5-2.5mol/L维生素A和90-110ng/mlEGF的完全培养基，消化，传代，最终获得P10代脐带间充质干细胞；
二、取步骤一培养得到的P10代脐带间充质干细胞，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度至1×104个/ml；
在24孔板中按照细胞浓度1×104个/孔接种P10代脐带间充质干细胞，采用含有终浓度0.8-1.5mol/L维生素D、1.5-2.5mol/L维生素A和90-110ng/ml EGF的完全培养基进行细胞培养；
次日更换培养基，即为第一次换液，进行分化培养；第一次换液所用培养基为含有终浓度1.8-2.2mol/L维生素D、3.5-4.5mol/L维生素A和190-210ng/ml TGF-β1的分化基础培养基；
之后每3天换一次液，第二次换液所用培养基为含有终浓度1.8-2.2mol/L维生素D、3.5-4.5mol/L维生素A和390-410ng/ml TGF-β1的分化基础培养基，之后换液所用培养基均与第二次换液所用培养基相同；
培养13-15天，即完成成软骨细胞的分化培养。
2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于步骤一中待细胞融合度达到70％以上，进行消化，获取单个细胞。
3.根据权利要求1或2所述的一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于步骤一中按照1×106个细胞/T175瓶接种，待细胞融合度达到90％以上后进行传代。
4.根据权利要求3所述的一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于对步骤一获得的P10代脐带间充质干细胞进行免疫标记检测。
5.根据权利要求1或2所述的一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于步骤一和步骤二中所述完全培养基是在基础培养基中添加肝素钠，每560mL基础培养基中添加120-160μl肝素钠。
6.根据权利要求1或2所述的一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于步骤二中所述分化基础培养基是在MesenCultMT Osteogenic Differentiation Kit中添加肝素钠，每560mL MesenCultMT Osteogenic Differentiation Kit中添加120-160μl肝素钠。
7.根据权利要求5所述的一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法，其特征在于步骤二在24孔板中接种细胞之前，加入玻片，加入450-500μl生理盐水，30-35min弃去生理盐水。
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