CN109825469A - 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法 - Google Patents

一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109825469A
CN109825469A CN201910177646.XA CN201910177646A CN109825469A CN 109825469 A CN109825469 A CN 109825469A CN 201910177646 A CN201910177646 A CN 201910177646A CN 109825469 A CN109825469 A CN 109825469A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
umbilical cord
mesenchymal stem
culture
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910177646.XA
Other languages
English (en)
Inventor
赵进军
谷广其
杨桂花
赵宇飞
李张鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hecai Science And Technology (beijing) Co Ltd
Original Assignee
Hecai Science And Technology (beijing) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hecai Science And Technology (beijing) Co Ltd filed Critical Hecai Science And Technology (beijing) Co Ltd
Priority to CN201910177646.XA priority Critical patent/CN109825469A/zh
Publication of CN109825469A publication Critical patent/CN109825469A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤；所述干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用无血清培养基将传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞重悬制成P7代干细胞悬液，P7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。本发明能将人源脐带间充质干细胞分化为软骨细胞，在修复人体软骨组织、治疗骨损伤方面具有重要意义。

Description

一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说，它涉及一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法。
背景技术
膝关节软骨损伤是运动医学临床工作的主要研究领域之一，是体育科学研究的热点与重点。关节软骨损伤的早期可引起损伤关节的疼痛和关节功能的受限，晚期关节可能出现退行性病变，发生非炎性骨关节炎，将严重降低患者生活质量。关节软骨损伤后，软骨细胞主要靠关节滑液及细胞周围的基质供给营养，以无氧酵解供能，其自身的修复能力很有限，甚至依靠自身是无法再修复。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)的出现，为软骨损伤的修复治疗带来了希望。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，具有自我更新，高度增殖及多向分化潜能。在体内外特定的诱导条件下，MSC可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复与治疗，具有广阔的临床应用前景。
MSCs最初在骨髓中发现，由于对骨髓来源的MSCs细胞采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制，获取大量骨髓细胞十分困难。此外骨髓来源的MSCs细胞免疫原性较强，而且随着供者年龄的增大，其细胞数量及分化潜能出现明显下降趋势，病毒感染率较高，长期以来人们一直在致力于寻找一种替代骨髓来源的间充质干细胞。
脐带间充质干细胞，是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，主要分布在华通氏胶和脐带血管周围。研究发现，脐带组织来源的MSCs极好地保持了间充质干细胞的生物学特性及多向分化的能力。此外与骨髓及脂肪来源的MSCs相比，脐带组织在取材及免疫原性上表现出很强的优势，主要包括：a.脐带中的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力；b.免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；c.干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染；d.潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低；e.采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤；6.来源广泛，采集方便，易于保存和运输，伦理争议较少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其能将人源脐带间充质干细胞分化为软骨细胞，在修复人体软骨组织、治疗骨损伤方面具有重要意义。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤；所述干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成P7代干细胞悬液，P7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。
进一步地，所述含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括DMEM高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、TGF-β1、铁蛋白、抗坏血酸、***和丙酮酸钠；DMEM高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10ng/mL的TGF-β1，5μg/mL转铁蛋白，50μg/mL抗坏血酸，10-7mol/L***，6.25μg/mL丙酮酸钠。
进一步地，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1 mm×1 mm的脐带组织块。
进一步地，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代干细胞悬液。
进一步地，所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代干细胞悬液，将Pn代干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代干细胞。其中，n=1、2、3、4、5。
进一步地，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存；所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代干细胞悬液，将Pm代干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得Pm+1代干细胞。
进一步地，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
进一步地，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
进一步地，所述干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、通过本发明一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，P7代干细胞可以向软骨细胞分化。且在修复人体软骨组织、治疗骨损伤方面具有重要意义。
第二、经过干细胞的冻存步骤以及干细胞的复苏与培养步骤后，对人源脐带间充质干细胞的增殖能力和分化能力无影响，人源脐带间充质干细胞仍然具有向软骨细胞分化的能力。
第三、采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
附图说明
图1是实施例1所得到的P6代干细胞进行培养7天的生长曲线以及对实施例2所得到的P6代干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，顺次包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1mm×1 mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代干细胞悬液，调整P1代干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代干细胞悬液，调整Pn代干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代干细胞，其中，n=1、2、3、4、5、6。
干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成P7代干细胞悬液，调整P7代干细胞悬液浓度为1×107个/mL，P7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括DMEM高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、TGF-β1、铁蛋白、抗坏血酸、***和丙酮酸钠；DMEM高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10ng/mL的TGF-β1，5μg/mL转铁蛋白，50μg/mL抗坏血酸，10-7mol/L***，6.25μg/mL丙酮酸钠。
实施例2
一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，顺次包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1mm×1 mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代干细胞悬液，调整P1代干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代干细胞悬液，调整Pn代干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代干细胞；其中，n=1、2、3、4、5。
干细胞的冻存步骤包括待P6代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P6代干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P6代干细胞浓度为1×107个/mL，将P6代干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P6代干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P6代干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P6代干细胞悬液，将P6代干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得P7代干细胞。
干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成P7代干细胞悬液，调整P7代干细胞悬液浓度为1×107个/mL，P7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括DMEM高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、TGF-β1、铁蛋白、抗坏血酸、***和丙酮酸钠；DMEM高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10ng/mL的TGF-β1，5μg/mL转铁蛋白，50μg/mL抗坏血酸，10-7mol/L***，6.25μg/mL丙酮酸钠。
对实施例1和实施例2所得到软骨细胞，采用4%多聚甲醛室温固定15分钟后执行阿利新蓝染色鉴定，检测得到的细胞是否为软骨细胞。
阿利新蓝染色鉴定是吸去多聚甲醛，用PBS漂洗2次后，加入pH 2.5的阿利新蓝染液染色30分钟，蒸馏水冲洗2分钟，在倒置相差显微镜下观察染色情况，如果显微镜下可见有细胞小球生成，且被阿利新蓝染液染为蓝色，即为细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性，表现出了软骨细胞的生物学特性。
结果表明，不管是实施例1得到的软骨细胞，还是实施例2得到的软骨细胞，均在显微镜下可见有细胞小球生成，且细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性(被阿利新蓝染液染为蓝色)，表现出了软骨细胞的生物学特性。
对实施例1所得到的P6代干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的P6代干细胞的增殖情况进行对比。绘制实施例1所得到的P6代干细胞进行培养7天的生长曲线图以及对实施例2所得到的P6代干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线图，结果如图1所示。本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果，复苏后的干细胞的增殖能力略差于未经冻存的干细胞的增殖能力。由此可知，相较于现有技术，复苏后的干细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。
对实施例1所得到的P6代干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的P6代干细胞的表面标记表达率的结果对比。人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分别对实施例1所得到的P6代干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的P6代干细胞，在培养3天后消化收集后制成干细胞悬液，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行人源脐带间充质干细胞表面标记物的流式检测，加入的特异性抗体分别为 CD34(呈阴性表达)、CD45(呈阴性表达)、CD44(呈阳性表达)、CD90(呈阳性表达)。实施例1所得到的P6代干细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.9%，CD45-CD90+表达率为99.9%；实施例2进行复苏后得到的P6代干细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.5%，CD45-CD90+表达率为98.7%。由此可知，经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后，人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
由此可知，通过本发明一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，P7代干细胞可以向软骨细胞分化。而且，经过干细胞的冻存步骤以及干细胞的复苏与培养步骤后，对人源脐带间充质干细胞的增殖能力和分化能力无影响，人源脐带间充质干细胞仍然具有向软骨细胞分化的能力。这是由于采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤；所述干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成P7代干细胞悬液，P7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。
2.根据权利要求1所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括DMEM高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、TGF-β1、铁蛋白、抗坏血酸、***和丙酮酸钠；DMEM高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10ng/mL的TGF-β1，5μg/mL转铁蛋白，50μg/mL抗坏血酸，10-7mmol/mL***，6.25μg/mL丙酮酸钠。
3. 根据权利要求1所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1 mm×1 mm×1 mm的脐带组织块。
4. 根据权利要求1所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代干细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代干细胞悬液，将Pn代干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代干细胞。
6.根据权利要求1所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存；所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代干细胞悬液，将Pm代干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得Pm+1代干细胞。
7.根据权利要求6所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
8. 根据权利要求1或5或6或7所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
9.根据权利要求1或4或5或6所述的一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其特征在于，所述干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。
CN201910177646.XA 2019-03-09 2019-03-09 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法 Pending CN109825469A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910177646.XA CN109825469A (zh) 2019-03-09 2019-03-09 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910177646.XA CN109825469A (zh) 2019-03-09 2019-03-09 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109825469A true CN109825469A (zh) 2019-05-31

Family

ID=66867886

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910177646.XA Pending CN109825469A (zh) 2019-03-09 2019-03-09 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109825469A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690599A (zh) * 2020-07-17 2020-09-22 天晴干细胞股份有限公司 一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法
CN111826343A (zh) * 2020-07-23 2020-10-27 北京中卫医正科技有限公司 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用
CN112708593A (zh) * 2021-01-27 2021-04-27 朱灏 一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法
CN115044545A (zh) * 2022-07-11 2022-09-13 睿博斯(北京)生物科技有限公司 一种间充质干细胞及其制备方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102899287A (zh) * 2012-10-24 2013-01-30 天津和泽干细胞科技有限公司 一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用
CN104531614A (zh) * 2014-12-26 2015-04-22 哈尔滨壹加壹再生医学科技有限公司 保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法
CN104988117A (zh) * 2015-07-03 2015-10-21 深圳中基恒润投资有限公司 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法
CN104983742A (zh) * 2015-04-22 2015-10-21 南京康雅生物科技有限公司 一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法
CN105647856A (zh) * 2016-02-04 2016-06-08 关节动力安达（天津）生物科技有限公司 促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
CN105970300A (zh) * 2016-05-11 2016-09-28 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法
CN106282104A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法
CN106635968A (zh) * 2016-10-14 2017-05-10 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法
CN108220229A (zh) * 2017-12-18 2018-06-29 北京康亿瑞生物科技有限公司 一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102899287A (zh) * 2012-10-24 2013-01-30 天津和泽干细胞科技有限公司 一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用
CN104531614A (zh) * 2014-12-26 2015-04-22 哈尔滨壹加壹再生医学科技有限公司 保留脐带血管获得间充质干细胞的制备方法
CN104983742A (zh) * 2015-04-22 2015-10-21 南京康雅生物科技有限公司 一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法
CN104988117A (zh) * 2015-07-03 2015-10-21 深圳中基恒润投资有限公司 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法
CN105647856A (zh) * 2016-02-04 2016-06-08 关节动力安达（天津）生物科技有限公司 促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
CN105970300A (zh) * 2016-05-11 2016-09-28 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法
CN106282104A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法
CN106635968A (zh) * 2016-10-14 2017-05-10 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法
CN108220229A (zh) * 2017-12-18 2018-06-29 北京康亿瑞生物科技有限公司 一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李田等: "不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响", 《器官移植》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690599A (zh) * 2020-07-17 2020-09-22 天晴干细胞股份有限公司 一种促进间充质干细胞分化为成软骨细胞的方法
CN111826343A (zh) * 2020-07-23 2020-10-27 北京中卫医正科技有限公司 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用
CN112708593A (zh) * 2021-01-27 2021-04-27 朱灏 一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法
CN115044545A (zh) * 2022-07-11 2022-09-13 睿博斯(北京)生物科技有限公司 一种间充质干细胞及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109825469A (zh) 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
Toupadakis et al. Comparison of the osteogenic potential of equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and umbilical cord tissue
KR100494265B1 (ko) 관절연골손상 치료용 조성물
WO2017096611A1 (zh) 一种从脐带华通氏胶组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法
CN106982821A (zh) 脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途
CN109957542A (zh) 一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法
CN106434557B (zh) 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法
CN106635968A (zh) 人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法
CN104770363A (zh) 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法
CN103396990A (zh) 一种制备间充质干细胞的方法
CN105062959A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法
CN111690601A (zh) 一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法
CN109777767A (zh) 一种促进人源脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导方法
CN108795855A (zh) 一种间充质干细胞的无血清培养基
CN101591644A (zh) 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存
CN104983742A (zh) 一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法
CN104531617A (zh) 一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞
CN105238749A (zh) 一种复苏骨髓间充质干细胞的方法
CN104673748A (zh) 一种从人脐带中提取间充质干细胞的方法
CN111346051A (zh) 一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法
CN102154200A (zh) 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存
CN106701682A (zh) 由脐血分离造血干细胞并扩增cd34阳性细胞的方法
CN109820869A (zh) 一种用于腔隙注射治疗骨关节炎的人源脐带间充质干细胞注射液的制备方法
CN113201489A (zh) 一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法
CN105695401B (zh) 一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190531