CN108220229A - 一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养与细胞分离技术领域，具体公开了一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法。在传统华通氏胶组织块一次性贴壁培养分离间充质干细胞的基础上，在培养后期不同时间精细地收集华通氏胶组织块并重复贴壁，可在不同的时间连续收集P0代间充质干细胞，该方法通过间充质干细胞不断从华通氏胶组织中游离出生长的特性，使得华通氏胶的利用率实现最大化，与华通氏胶组织块一次性贴壁培养相比，P0代间充质干细胞的获取数量可至少增加2倍，后续通过控制间充质干细胞的培养密度、培养基中血清替代物浓度和培养时间，细胞传代培养至P3代时，所获得细胞数量可完全满足细胞储存和临床移植的需要。

Description

一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法

技术领域

本发明涉及细胞培养与细胞分离技术领域，具体地说，涉及一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类特殊的干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，在分类上属于多能干细胞。在体内或体外特定的诱导条件下，MSC可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，因其具有多向分化潜能的特性，在临床中可广泛用于多种疾病治疗比如肝纤维化、神经损伤、脑瘫、心肌梗死等诸多疑难病症。MSC不表达主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如CD80、CD40、CD46、CD40L，是一类免疫缺陷细胞，所以在免疫疾病方面有非常大的治疗优势，可用于移植物抗宿主病(GVHD)，类风湿、红斑狼疮、多发性硬化病等免疫缺陷病，单纯hUCMSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34⁺细胞向髓系分化，所以在血液疾病方面MSC具有很好的治疗前景，MSC是目前干细胞研究的热点之一。

目前，间充质干细胞的提取研究已较为广泛，最初人们从骨髓中提取MSC，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，这使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。后来经过大量深入的研究发现，MSC广泛分布于胎儿和成人的骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs)由于脐带采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤，脐带间充质干细胞生长环境单一、体外提取方便，使得提取的间充质干细胞纯度高、数量大，且不存在伦理问题，成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，具有更广阔的临床应用潜能。

目前，国内外从脐带中分离间充质干细胞的方法主要是对脐带华通氏胶(Wharton′s Jelly)进行酶消化和组织块贴壁两种：酶消化法耗时长，操作过程中所用消化酶对细胞损伤较大，使得分离得到的间充质干细胞活力低、状态差、扩增慢且成本高，故而限制了其临床应用；组织块贴壁法是目前应用比较广泛的一种方法，虽然原代和传代细胞在细胞的获取时间方面相比酶消化法要更长，但因其具有操作简便、细胞损伤小、细胞产量高、成本低廉等优点，因而更合适临床大规模制备与应用。在实际操作过程中，将脐带置于培养皿中，剔除一根脐动脉血管和两根脐静脉血管后，获得脐带华通氏胶。而后，采用组织块贴壁法提取制备间充质干细胞，需要将脐带华通氏胶剪碎成1～3mm³的小组织块，将组织块贴附于培养瓶或培养皿底部，添加培养基后培养几日，间充质干细胞便可从组织块中游离出并在培养容器底部贴壁生长，待间充质干细胞于培养容器底部生长汇合度达85％以上时，用眼科镊将华通氏胶组织块扣除并废弃，所获得细胞即为原代间充质干细胞，可使用消化酶进行消化并传代为第一代，随后，细胞逐代进行消化并扩大培养，最后将获得的间充质干细胞进行冻存。

目前，国内外已有许多机构在开展间充质干细胞储存，及用于诸如肝纤维化、心梗、软骨修复等方面的临床试验研究，对所使用的人脐带来源间充质干细胞的数量要求较高。按照临床静脉输入P3代间充质干细胞1×10⁸/疗程，且至少满足50疗程的间充质干细胞治疗剂量进行计算，P3代间充质干细胞总量应不少于5×10⁹。但现在大多机构处理一根约20cm长脐带组织，获得原代间充质干细胞的数量介于5×10⁶～1×10⁷，其P3代间充质干细胞数量为(1.00～3.00)×10⁹，细胞得率明显不足，主要原因在于获得的原代间充质干细胞数量太低。如何最大程度获取可供临床试验研究、甚至以后直接临床应用所需的间充质干细胞数量，这是亟待解决的一个问题。

脐带间充质干细胞制备包括细胞原代培养与传代培养，传代培养可通过调整接种细胞密度、血清浓度和培养时间等方式优化改进以往的方法，如“一种脐带间充质干细胞的分离方法”(公开号CN105524877A)、“一种简化的脐带间充质干细胞的规模化制备方法”(公开号CN101914496B)、“一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法”(公开号CN107236702A)将间充质干细胞传代培养至3～5代便可获得较多可供应用的细胞。而原代间充质干细胞获取的数量，即种子细胞的多少直接决定了通过传代培养获取的高代次细胞数量，研究表明，每厘米脐带中理论上含有约1.00×10⁶个间充质干细胞，但间充质干细胞在实际制备过程中，现有技术(如公开号为CN105420183A、CN105586309A、CN102154200B、CN102660497B的专利申请)中公开的方法均在组织块周围出现较多长梭形间充质干细胞时将组织块扣除并废弃，而仅将已游离出并贴附于培养容器底部的细胞进行扩增并传代，但所废弃的组织块中仍存在较多未游离出的间充质干细胞。因此，如何最大化获取华通氏胶中的间充质干细胞成为亟待解决的一个问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的方法，具体为：将脐带华通氏胶剪碎至1～3mm³大小组织块，将组织块转移至细胞培养皿中平铺贴壁；在间充质干细胞从华通氏胶组织块中游离出的过程中，分阶段收集华通氏胶组织块，将所收集的华通氏胶组织块进行二次贴壁培养；在二次贴壁培养过程中，再次分阶段收集华通氏胶组织块，进行再次贴壁培养，以此类推，直至无法收集到可用于贴壁培养的华通氏胶组织块；将各次贴壁培养中游离出的原代间充质干细胞收集，即得脐带来源间充质干细胞原代细胞(P0代间充质干细胞)。

其中，所收集的华通氏胶组织块包括漂浮和贴壁的华通氏胶组织块，收集时，需要将颜色发黑、活性较低的组织块剔除掉，留下的即为可用于贴壁培养的华通氏胶组织块。

当在某次贴壁培养中分阶段收集华通氏胶组织块时，第一次收集只收集漂浮的华通氏胶组织块，第二次收集时对漂浮和贴壁的华通氏胶组织块均进行收集。

本发明使得华通氏胶组织块中的原代间充质干细胞通过多次贴壁培养而游离出来，提高了华通氏胶的利用程度，进而提高了所获取的原代间充质干细胞的数量。

作为优选，首次分阶段收集华通氏胶组织块的时间为贴壁培养的6～11天和12～15天，之后，以再次贴壁培养为基础的收集，其收集时间均较上一次收集时间有所缩短。

例如，将首次贴壁培养记为T1，分别在T1的6～11天和12～15天，优选10天和13天时先后收集漂浮的华通氏胶组织块、和漂浮与贴壁的华通氏胶组织块，再次贴壁，分别记为T2和T3；T2和T3分别在5～10天和11～13天，优选8天和12天时收集华通氏胶组织块，再次贴壁，分别记为T4～T7；T4～T7分别在4～8天和9～12天时收集华通氏胶组织块，再次贴壁，即每多贴壁一次，收集华通氏胶组织块的时间则提前1～2天。

进一步地，收集华通氏胶组织块进行再贴壁的次数可为1～7次，优选为3次。

所述华通氏胶组织块进行贴壁培养时，需将组织块贴附于培养皿底部静置2～4小时。

本发明用于组织块培养以及原代间充质干细胞培养的培养基为1640、DMEM、MEM或无血清培养基中的任一种，优选使用DMEM培养基。

作为优选，在所述培养基中加入5％～20％，优选为10％的血清。

所述血清为胎牛血清、马血清或人血清替代物中的任意一种，优选使用人血清替代物。

在实际应用中，当需要对原代间充质干细胞(P0代间充质干细胞)进行传代培养时，将原代间充质干细胞按照细胞密度(0.50～1.50)×10⁴/cm²逐代进行传代培养，每代培养细胞汇合度至约90％时，胰酶消化并传代，直至传代培养至P3代。所得高代次间充质干细胞数量可以完全满足储存和临床移植的需要。

需要说明的是，本发明旨在提供一种多次收集华通氏胶组织块再贴壁以提高原代间充质干细胞产量的方法，其中贴壁培养的培养条件等，如无特殊说明，均可采用本领域常规的技术手段进行。

进一步地，所述脐带华通氏胶组织块的制备方法也可采用本领域常规的制备方法，本发明仅给出一种可选示例，包括如下步骤：

(1)产室内按照无菌操作要求，采集足月剖腹产健康新生儿脐带约20cm，将脐带投入样本保存液中保存，立即送至细胞实验室，且在12小时内尽快进行处理；

(2)用PBS缓冲液冲洗脐带样本后，以75％酒精浸泡消毒20～30秒，用手术剪将脐带样本剪成2cm～3cm左右大小，挤出动脉和静脉中的残血，并分别剔除掉动脉和静脉血管，即得脐带华通氏胶，用PBS缓冲液漂洗3次，即得。

本发明所用脐带组织必须经病毒筛查(包括艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、***、人嗜T细胞病毒等)和遗传疾病筛查(单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿瘤等)，且均为阴性者。组织必须为足月剖腹产新生儿脐带，无菌采集且须在12小时内尽快处理。脐带组织处理时，将脐带组织剪成2cm～3cm大小，便于操作提取华通氏胶。

基于上述技术方案，本发明进一步提供一个完整的操作流程，旨在说明最全面的一种情况，具体步骤如下：

(1)产妇及其配偶进行常见病毒筛查和遗传疾病筛查，签署知情同意书；

(2)产室内按照无菌操作要求，采集足月剖腹产健康新生儿脐带约20cm，将脐带投入样本保存液中保存，立即送至细胞实验室，且在12小时内尽快进行处理；

(3)用PBS缓冲液冲洗脐带样本后，以75％酒精浸泡消毒20～30秒，用手术剪将脐带样本剪成2cm～3cm左右大小，挤出动脉和静脉中的残血，并分别剔除掉动脉和静脉血管，即得脐带华通氏胶，用PBS缓冲液漂洗3次；

(4)用眼科剪将华通氏胶剪碎至1～3mm³大小组织块，将组织块转移至细胞培养皿中平铺贴壁，即首次贴壁，记为T1，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL完全培养基(含10％血清)，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(5)T1培养6～11天，每隔2天向培养皿中补加5～10mL含10％血清的完全培养基，继续培养。收集培养皿中漂浮的华通氏胶组织块，将收集获得的组织块平铺于新的培养皿中，进行二次贴壁，记为T2，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(6)T1培养12～15天，收集培养皿中漂浮和贴壁的华通氏胶组织块，将收集获得的组织块平铺于新的培养皿中，进行三次贴壁，记为T3，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(7)T1在培养12～15天剔除所有华通氏胶组织块后，待培养皿底部间充质干细胞生长汇合度至80％～90％时，向培养皿中添加3～5mL胰酶消化细胞，用PBS缓冲液清洗离心，血球计数板法计算获得原代间充质干细胞总数P0-1；

(8)T2和T3培养5～10天，每隔两天向培养皿中补加5～10mL含10％血清的完全培养基，继续培养；

(9)T2和T3培养11～13天，剔除掉培养皿中的所有华通氏胶组织块，继续培养，待培养皿底部间充质干细胞汇合度至80％～90％时，向培养皿中添加3～5mL胰酶消化细胞，用PBS缓冲液清洗离心，血球计数板法计算获得间充质干细胞总数P0-2和P0-3；

(10)理论上，T2和T3在培养4～9天时，可分别收集培养皿中漂浮的华通氏胶组织块，将收集获得的组织块平铺于新的培养皿中，进行四次贴壁、五次贴壁，记为T4、T5，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(11)T4和T5经4～9天培养，每隔两天向培养皿中补加5～10mL含10％血清的完全培养基，待培养皿底部间充质干细胞汇合度至80％～90％时，向培养皿中添加3～5mL胰酶消化细胞，用PBS缓冲液清洗离心，血球计数板法计算获得原代间充质干细胞总数P0-4和P0-5；

(12)理论上，T2和T3培养11～13天，可分别收集培养皿中漂浮和贴壁的华通氏胶组织块，将收集获得的组织块平铺于新的培养皿中，进行六次贴壁、七次贴壁，记为T6、T7，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(13)T6和T7经4～9天培养，每隔两天向培养皿中补加5～10mL含10％血清的完全培养基，待培养皿底部间充质干细胞汇合度至80％～90％时，向培养皿中添加3～5mL胰酶消化细胞，用PBS缓冲液清洗离心，血球计数板法计算获得原代间充质干细胞总数P0-6和P0-7；

(14)考虑到每次华通氏胶组织块在培养皿底部贴壁并开始培养后，总会有一部分华通氏胶组织块因贴壁不牢而自行漂浮，可收集该部分组织块并重新置于培养皿中进行贴壁培养。而贴壁牢固的华通氏胶组织块在培养一段时间后，部分间充质干细胞已游离出并在组织块旁致密生长，这就会影响组织块内其他间充质干细胞游离出，因此，也需要将组织块扣除，重新贴壁培养；

(15)考虑到华通氏胶组织块的活性在体外会随着培养时间的延长而降低，组织块贴壁次数可控制在3～7次；

(16)考虑到随着华通氏胶组织块从首次贴壁培养至多次重新收集再贴壁培养的过程中，组织块内的胶原蛋白、透明质酸等物质不断分解，间充质干细胞不断从组织块内游离出且随着组织块培养时间的延长而更容易从组织块内游离出，因此，每一次重新收集华通氏胶组织块贴壁培养后获得的P0代间充质干细胞数量应介于上一次组织块贴壁培养后获得P0代间充质干细胞的1/3倍～1倍；

(17)T1～T7获得的P0代按照细胞密度(0.50～1.50)×10⁴/cm²逐代进行传代培养，每代培养细胞汇合度至约90％时，胰酶消化并传代，直至传代培养至P3代。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果至少在于：

本发明通过精细设计每一次收集华通氏胶组织块及再次贴壁的时间，使得华通氏胶组织块中的间充质干细胞充分游离出，最大化利用了华通氏胶。

本发明未使用比传统常用的酶消化法和一次性贴壁培养法更多的耗材和试剂，因而其生产制备成本低，但P0代间充质干细胞产量更高。

本发明提供的方法操作简单，对技术人员的操作要求并不高，因此，该方法学习简单，掌握快，容易推广。

总的来说，本发明提出了一种提高脐带华通氏胶组织的利用度，提高P0代间充质干细胞得率的方法，可满足细胞库储备以及临床对移植细胞数量的要求。

所述方法可在传统华通氏胶组织块一次性贴壁培养分离间充质干细胞的基础上，在培养后期不同时间精细地收集华通氏胶组织块并重复贴壁，可在不同的时间连续收集P0代间充质干细胞，该方法通过间充质干细胞不断从华通氏胶组织中游离出生长的特性，使得华通氏胶的利用率实现最大化，与华通氏胶组织块一次性贴壁培养相比，P0代间充质干细胞的获取数量可至少增加2倍，后续通过控制间充质干细胞的培养密度，细胞传代培养至P3代时，所获得细胞数量可完全满足细胞储存和临床移植的需要。

附图说明

图1为本发明P0代间充质干细胞的显微镜视野图(20×)；A、组织块培养第7天；B、组织块培养第9天；C、组织块培养第11天；D、组织块培养第15天。

图2为本发明P0代间充质干细胞的生长曲线。

图3为本发明P0代间充质干细胞的表面抗原表达情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、脐带来源间充质干细胞分离与扩增

1、产妇及其配偶进行常见病毒筛查(包括艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、***、人嗜T细胞病毒等)和遗传疾病筛查(单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿瘤等)，签署知情同意书。

2、产室内按照无菌操作要求，采集足月剖腹产健康新生儿脐带约20cm，将脐带投入样本保存液中保存，立即送至细胞实验室，且在12小时内尽快进行处理。

3、将脐带浸泡于无菌PBS缓冲液中，采集脐带血管中的血样进行细菌、真菌、支原体检测，结果应为阴性。

4、用PBS缓冲液冲洗脐带样本后，以75％酒精浸泡消毒20～30秒，用手术剪将脐带样本剪成2cm～3cm左右大小，挤出动脉和静脉中的残血，并分别剔除掉动脉和静脉血管，即得脐带华通氏胶，用PBS缓冲液漂洗3次。

5、将华通氏胶剪碎至1～3mm³大小组织块，将组织块转移至细胞培养皿中平铺贴壁，即首次贴壁，记为T1。每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

本实施例所采用的完全培养基为DMEM培养基(下同)，所采用的血清为人血清替代物。

6、T1培养6～11天，每隔2天向培养皿中补加5～10mL含10％血清的完全培养基，继续培养。收集培养皿中漂浮的华通氏胶组织块，将收集获得的组织块平铺于新的培养皿中，进行二次贴壁，记为T2，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

T1培养12～15天，收集培养皿中漂浮和贴壁的华通氏胶组织块，将收集获得的组织块平铺于新的培养皿中，进行三次贴壁，记为T3，每块培养皿中加入50～80块组织块，培养皿于37℃、5％CO₂细胞培养箱中静置2～4小时后，向培养皿中缓慢加入15～20mL含10％血清的完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

7、T1在培养12～15天剔除所有华通氏胶组织块后，待培养皿底部间充质干细胞生长汇合度至80％～90％时，向培养皿中添加3～5mL胰酶消化细胞，用PBS缓冲液清洗离心，血球计数板法计算获得原代间充质干细胞总数P0-1；

8、T2和T3培养5～10天，每隔两天向培养皿中补加5～10mL含10％血清的完全培养基，继续培养；

9、T2和T3培养11～13天，剔除掉培养皿中的所有华通氏胶组织块，继续培养，待培养皿底部间充质干细胞汇合度至80％～90％时，向培养皿中添加3～5mL胰酶消化细胞，用PBS缓冲液清洗离心，血球计数板法计算获得间充质干细胞总数P0-2和P0-3；

10、T1～T3获得的P0代按照细胞密度(0.50～1.50)×10⁴/cm²逐代进行传代培养，每代培养细胞汇合度至约90％时，胰酶消化并传代，直至传代培养至P3代。

二、P0代间充质干细胞生物学特征

1、华通氏胶不同贴壁时间间充质干细胞分离情况

20cm华通氏胶在首次贴壁分离培养间充质干细胞后，后续在不同时间分别收集漂浮和贴壁的华通氏胶组织块再次贴壁，分离组织块中残留的间充质干细胞，可持续且充分分离华通氏胶组织块中的间充质干细胞。首次贴壁可获得P0代间充质干细胞的数量为(1.67±0.04)×10⁶/每厘米脐带组织，逐代进行传代培养，培养至P3代时，细胞总数可达(5.07～9.73)×10⁸。

通过多次收集漂浮和贴壁的华通氏胶组织块再次贴壁分离培养后，组织块中的间充质干细胞游离出的时间比首次贴壁缩短，最终可获得P0代间充质干细胞的数量为(3.29±1.63)×10⁶/每厘米脐带组织，通过调整细胞密度为(0.50～1.50)×10⁴/cm²，逐代进行传代培养，培养至P3代，细胞总数可达(27.40～56.80)×10⁸。

通过技术改进，P0代间充质干细胞可提高一倍得率。同时，由于间充质干细胞移植通常使用P3代～P5代细胞，技术改进前，P3代间充质干细胞数量并不满足临床移植的要求；技术改进后，P3代间充质干细胞数量至少提高4倍得率，细胞数量足以满足临床移植的需要。

2、间充质干细胞生长特征

T1在贴壁6～11天时，可逐渐在组织块旁明显观察到梭形贴壁细胞，10天左右可形成大片螺旋状细胞克隆。T2和T3贴壁后5～10天时，便可逐渐在组织块旁明显观察到梭形贴壁细胞，9天左右可形成大片螺旋状细胞克隆。这些P0代间充质干细胞形态相对均一，比较容易被胰酶消化，传代后细胞贴壁较快，1小时内即可观察到细胞贴壁并伸展开，扩增速度较快(图1)。

3、P0代间充质干细胞生长曲线及倍增时间

取T1、T2、T3贴壁获得的对数期P0代间充质干细胞，以含10％血清的完全培养基调整细胞密度为1.00×10⁴/mL，向24孔培养板中每孔中加入1mL细胞悬液，培养板于37℃、5％CO₂培养箱中培养。每天胰酶消化并收集3孔细胞，所获得细的间充质干细胞以台盼蓝染液染色计算细胞活率和细胞总数，取平均值，连续观察7天。以培养时间为横坐标，细胞总数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间，即Td＝T×lg2/Lg(Nt/No)，Td：倍增时间(h)，Nt为t时间的细胞数，N0为初始细胞数，T为培养时间。

通过每天计数细胞的结果绘制细胞生长曲线，计算倍增时间。见图2，从生长曲线可看出，P0代细胞在培养3～4天时进入指数生长期，6～7天逐渐进入平台期。

4、流式细胞术检测P0代间充质干细胞表面表型

分别取T1、T2和T3的P0代间充质干细胞，用PBS缓冲液清洗一次，1200rpm离心10分钟，弃掉上清，加入1.8mL PBS缓冲液重悬细胞，吹打混匀细胞，并把细胞加入12支流式细胞上样管中，每支管150μL，向每支上样管中分别加入10μL FITC标记的IgG、CD45、HLA-DR抗体，10μL PE标记的IgG、CD73、CD90、CD105抗体，10μL ECD标记的IgG、CD14、CD19、CD34抗体，并设置一管空白对照。抗体与细胞混匀后，在4℃下避光反应30min，1200rpm离心10min，PBS缓冲液清洗一次，于1200rpm离心10min，弃上清加入150μL PBS缓冲液混匀细胞，再加入200μL 1％多聚甲醛固定，上流式细胞仪检测。

间充质干细胞的表面表型在一定程度上代表干细胞的均一性。国际细胞治疗协会(ISCT)对间充质干细胞表型的要求为，均一性较好的间充质干细胞，其表面分子CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达均应低于2.00％，CD73、CD90、CD105的表达水平应高于95.00％。我们检测了华通氏胶组织块不同贴壁时间获得的P0代间充质干细胞的表面分子CD14、CD19、CD34、CD45、CD49、CD73、CD90、CD105、HLA-DR的表达水平。

结果为，不同时间获得的P0代间充质干细胞CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达几乎均低于0.50％，而CD49、CD73、CD90、CD105的表达水平几乎均超过98.00％(图3)，这说明，通过技术的改良优化，华通氏胶组织块不同时间贴壁分离培养出的间充质干细胞原始特性保持一致、分化极少，并未因华通氏胶组织块反复收集、再贴壁、延长组织块培养时间而受到影响。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的方法，其特征在于，将脐带华通氏胶剪碎至1～3mm³大小组织块，将组织块转移至细胞培养皿中平铺贴壁；在间充质干细胞从华通氏胶组织块中游离出的过程中，分阶段收集华通氏胶组织块，将所收集的华通氏胶组织块进行二次贴壁培养；在二次贴壁培养过程中，再次分阶段收集华通氏胶组织块，进行再次贴壁培养，以此类推，直至无法收集到可用于贴壁培养的华通氏胶组织块；收集各次贴壁培养中游离出的原代间充质干细胞，即得脐带来源间充质干细胞原代细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，收集华通氏胶组织块时，需要将颜色发黑、活性较低的组织块剔除掉，留下可用于再贴壁培养的华通氏胶组织块。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，首次分阶段收集华通氏胶组织块的时间为贴壁培养的6～11天和12～15天，之后每多贴壁一次，收集华通氏胶组织块的时间较上一次收集时间提前1～2天。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将首次贴壁培养记为T1，分别在T1的6～11天和12～15天，优选10天和13天时收集华通氏胶组织块，再次贴壁，分别记为T2和T3；T2和T3分别在5～10天和11～13天，优选8天和12天时收集华通氏胶组织块，再次贴壁，分别记为T4～T7；T4～T7分别在4～8天和9～12天时收集华通氏胶组织块，再次贴壁，以此类推。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，收集华通氏胶组织块进行再贴壁的次数可为1～7次，优选为3次。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述华通氏胶组织块进行贴壁培养时，将组织块贴附于培养皿底部静置2～4小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，华通氏胶组织块贴壁培养所用的培养基为1640、DMEM、MEM或无血清培养基中的任一种，优选使用DMEM培养基。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述培养基中加入5％～20％，优选为10％的血清。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述血清为胎牛血清、马血清或人血清替代物中的任意一种，优选为人血清替代物。

10.权利要求1～9任一项所述方法得到的原代间充质干细胞在制备高代次间充质干细胞中的应用，其特征在于，将原代间充质干细胞逐代按照细胞密度(0.50～1.50)×10⁴/cm²进行传代培养，每代培养细胞汇合度至约90％时，胰酶消化并传代，即得高代次间充质干细胞。