CN104918632B

CN104918632B - 治疗糖尿病或糖胖病的包括胃泌酸调节素类似物的组合物

Info

Publication number: CN104918632B
Application number: CN201380069535.8A
Authority: CN
Inventors: 金镇善; 金大振; 李相贤; 郑圣烨; 权世昌
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2017-10-31
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: EA201590759A1; CL2015001207A1; HUE049240T2; EP3679944A1; JP7341263B2; MY173828A; JP6363613B2; KR101993393B1; EP3679944B1; JP2015536943A; AU2019275590A1; PL2916860T3; ES2802099T3; AU2013342324B2; KR20140058104A; JP2018162298A; BR112015010203A8; NZ708105A; HRP20200925T1; JP2020079301A

Abstract

本发明涉及预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的组合物，其包括胃泌酸调节素类似物作为活性成分。本发明还涉及治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的方法，包括给予对象药学上有效量的胃泌酸调节素类似物。胃泌酸调节素类似物与天然胃泌酸调节素相比具有激活GLP‑1受体和胰高血糖素受体的高性能。胃泌酸调节素类似物诱导β‑细胞扩张和增加胰岛素分泌，从而降低由于高热量和高脂肪饮食而增加的血糖水平。胃泌酸调节素类似物引起体重和饮食摄入减少，从而提高胰岛素敏感性和使由于胰岛素抗性不被控制的血糖水保持在正常水平。因此，胃泌酸调节素类似物可有效用于预防或治疗糖尿病和相关疾病。

Description

治疗糖尿病或糖胖病的包括胃泌酸调节素类似物的组合物

技术领域

本发明涉及预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的组合物，该组合物包括胃泌酸调节素类似物作为活性成分。此外，本发明涉及预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的方法，该方法包括给予对象药学上有效量的胃泌酸调节素类似物。

背景技术

近年来，在韩国，来自食物的脂肪摄入由于经济增长和饮食习惯西方化已渐增，并且由于缺乏运动而引起的代谢疾病如高脂血、肥胖、糖尿病、高血压、动脉硬化和脂肪肝病已经增加。

糖尿病是一种胰岛素分泌不足或不发挥正常功能的代谢疾病(DeFronzo，1988)。糖尿病的特征在于血糖水平增加，导致各种状况和症状。在糖尿病的情况下，葡萄糖随尿液排出。近年来，由于肥胖(尤其是腹部肥胖)的增加，糖尿病的发病率呈爆发性增长。

估测2000年世界上的糖尿病患者的数量为1亿7千万，并且预期在2030年达到3亿7千万。然而，最近的报告显示世界上的糖尿病数量已在2008年达到约3亿5千万(Danaei等，2011)，因此这远远大于预期。据报告，约80％或更多的2型糖尿病患者肥胖，而仅小于10％的肥胖患者患有糖尿病(Harris等，1987)。糖尿病和肥胖之间的这种关系是因为，由于脂肪因子和游离脂肪酸不规律分泌，脂肪酸在β-细胞或胰岛素敏感性组织如肾脏、肝脏或心脏中积累，产生脂毒性。

如果慢性高血糖状况没有得到适当治疗，其会导致身体的各种病理状况。一般，其增加视网膜病、肾功能障碍、神经病、血管障碍导致的中风、肾脏或心脏疾病、糖尿病、足溃疡和心血管疾病的风险。这些并发症会降低生活质量，并最终减少糖尿病患者的预期寿命。因此，为预防糖尿病并发症，有效控制血糖水平非常重要。

当前用于控制血糖水平的方法包括生活方式改变(饮食治疗或运动治疗)和药物治疗。然而，饮食治疗或运动治疗难以严格控制和执行，并且其治疗效果也并不足。因此，大多数糖尿病患者依靠生活方式改变联合药物控制血糖水平，该药物如胰岛素、胰岛素分泌刺激剂、胰岛素敏感性增强剂和血糖水平降低剂。

通过重组方法生产的胰岛素对于血糖水平不被控制的1型糖尿病患者和2型糖尿病患者是重要的药物，并且其有利于控制血糖水平。然而，其具有缺点，包括对皮下注射针的恐惧感、给药困难、低血糖风险和体重增加。

美格列奈类(Meglitinides)，作为胰岛素分泌刺激剂，是效果极快的药物，在饭前服用，包括NovoNorm(瑞格列奈(瑞格列奈))、Fastic(那格列奈(nateglinide))、Glufast(米格列奈(mitiglinide))等。胰岛素敏感性增强剂的特征在于其在被单独服用时极少或不引起低血糖，其实例包括甲福明——双胍类药物、噻唑烷二酮药物如Avandia(罗格列酮(rosiglitazone))、Actos(吡格列酮(pioglitazone))等。

最近研发的药物包括基于胰高血糖素样肽-1(刺激胰岛素分泌的激素)研发的GLP-1激动剂，并且GLP-1激动剂的实例包括艾塞那肽(exenatide)和利拉鲁肽(liraglutide)。另外，DPP-4抑制剂也是最近研发的新药物，其抑制DPP-4(二肽基肽酶-4)(快速灭活GLP-1的酶)的活性，并且其典型实例包括Januvia(西他列汀(sitagliptin))。

然而，据报道这些药物具有副作用，包括肝毒性、胃肠道障碍、心血管疾病和致癌作用，并且治疗糖尿病的年费用高昂，因此阻碍糖尿病的治疗。事实上，与糖尿病前期和糖尿病相关的费用2007年在USA达到约2000000亿韩元(Dall等，2010)，并且与肥胖相关的费用2008年在USA也达到1500000亿韩元(Finkelstein等，2009)。

因此，急需研发可用于通过减少体重和有效降低血糖水平治疗糖尿病和糖胖病并且同时具有较少副作用的药物。

作为这种药物的一种选择，胃泌酸调节素近来已受到关注。胃泌酸调节素由前胰高血糖素(前体)产生，并且是可结合于胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素受体以执行双重功能的肽。基于这种特征，已基于各种目的对胃泌酸调节素进行研究，包括治疗肥胖，糖尿病、高脂血和脂肪肝病。

然而，胃泌酸调节素具有下列问题：其应被高剂量给予，因为其具有很短的体内半衰期，并且其活性不足以用于治疗肥胖、糖尿病、高脂血和脂肪肝病。

公开内容

技术问题

发明人已经研发了与天然胃泌酸调节素相比活性增加的胃泌酸调节素类似物，并且已经发现，在高脂肪饮食诱导型(HF DIO)小鼠模型和通过瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病小鼠(db/db)模型中，胃泌酸调节素类似物降低血糖水平，提高葡萄糖耐受性，和增加糖基化血红蛋白(HbA1c)的比例，表明胃泌酸调节素类似物可有效用于治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症，从而完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供预防或治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症的组合物，其包括胃泌酸调节素类似物作为活性成分。

本发明的另一目的是提供预防或治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症的方法，包括给予对象药学上有效量的胃泌酸调节素类似物。

本发明的再一目的是提供本发明的胃泌酸调节素类似物在制备预防或治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症的药物中的应用。

有利效果

本发明的胃泌酸调节素类似物与天然胃泌酸调节素相比具有激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的高活性。进一步，本发明的胃泌酸调节素类似物诱导β-细胞扩张，并增加胰岛素分泌，从而使由于高热量和高脂肪饮食而增加的血糖水平降低。另外，胃泌酸调节素类似物导致体重和饮食摄入减少，以提高胰岛素敏感性和允许由于胰岛素抗性而不被控制的血糖水平保持在正常水平。因此，胃泌酸调节素类似物可有效用于预防或治疗糖尿病和相关疾病。

附图简述

图1是显示通过在患有长期(26周)高脂肪饮食诱导的肥胖的小鼠内给予长效胃泌酸调节素类似物而导致的体重变化的图形图。体重变化以相对于第0天测量的体重的百分数表示。

图2是显示通过在患有长期(26周)高脂肪饮食诱导的肥胖的小鼠内给予长效胃泌酸调节素类似物而导致的血糖水平变化的AUC(曲线下方面积)的图形图。

图3是显示通过在患有瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的小鼠模型内4周给予长效胃泌酸调节素类似物而导致的4周体重变化的图形图。

图4是显示通过在患有瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的小鼠模型内4周给予长效胃泌酸调节素类似物而导致的血糖水平变化的AUC(曲线下方面积)的图形图。

实施本发明的最佳方式

一方面，本发明提供预防或治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症的组合物，其包括胃泌酸调节素类似物作为活性成分。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素”指由前胰高血糖素(胰高血糖素的前体)生成的肽。在本发明中，胃泌酸调节素意为包括天然胃泌酸调节素和其前体、类似物、片段和变体。优选地，胃泌酸调节素具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素变体”是具有不同于天然胃泌酸调节素的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基并且具有激活GLP-1和胰高血糖素受体的功能的肽。胃泌酸调节素变体可通过下列中的任一种制备：天然胃泌酸调节素的一些氨基酸的置换、添加、缺失、修饰或其组合。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素类似物”指通过天然胃泌酸调节素的一些氨基酸的添加、缺失或置换而制备并且与天然胃泌酸调节素相比可高度激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的肽、肽衍生物或肽模拟物。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素片段”指在天然胃泌酸调节素的氨基或羧基端添加或缺失一个或多个氨基酸的片段，其中添加的氨基酸也可以是非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)。这种胃泌酸调节素片段具有调控体内血糖水平的功能。

制备胃泌酸调节素变体、类似物和片段的方法可单独或组合应用。例如，本发明包括具有不同于天然肽的一个或多个氨基酸、在N-端具有脱氨基的氨基酸残基并且具有激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的功能的肽。

本文述及的氨基酸按IUPAC-IUB命名规则缩写如下：

丙氨酸A；精氨酸R；

天冬酰胺N；天冬氨酸D；

半胱氨酸C；谷氨酸E；

谷氨酰胺Q；甘氨酸G；

组氨酸H；异亮氨酸I；

亮氨酸L；赖氨酸K；

甲硫氨酸M；苯丙氨酸F

脯氨酸P；丝氨酸S；

苏氨酸T；色氨酸W；

酪氨酸Y；缬氨酸V。

在本发明中，胃泌酸调节素类似物包括任何通过SEQ ID NO：1的氨基酸序列中氨基酸的置换、添加、缺失或翻译后修饰(例如，甲基化、酰基化、泛素化、或分子内共价结合)制备并且可激活胰高血糖素和GLP-1受体的肽。在置换或添加氨基酸时，不仅可使用人蛋白质中常见的20种氨基酸，而且也可使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和Genzyme Pharmaceuticals。包括这些氨基酸和非典型肽序列的肽可被合成和购自供应商，例如，American Peptide Company或Bachem(USA)或Anygen(韩国)。

在本发明的具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素类似物是包括下式1的氨基酸序列的新型肽：

式1

R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2

其中

R1是组氨酸、去氨基-组氨酰基、二甲基-组氨酰基(N-二甲基-组氨酰基)、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、β-羧基咪唑并丙酰基或酪氨酸；

X1是Aib(氨基异丁酸)、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或d-丝氨酸；

X2是谷氨酸或谷氨酰胺；

X3是亮氨酸或酪氨酸；

X4是丝氨酸或丙氨酸；

X5是赖氨酸或精氨酸；

X6是谷氨酰胺或酪氨酸；

X7是亮氨酸或甲硫氨酸；

X8是天冬氨酸或谷氨酸；

X9是谷氨酸、丝氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或丝氨酸或缺失；

X11是丙氨酸、精氨酸或缬氨酸或缺失；

X12是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸或缬氨酸或缺失；

X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X14是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；

X15是苯丙氨酸或缺失；

X16是异亮氨酸或缬氨酸或缺失；

X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X18是色氨酸或缺失；

X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸或缬氨酸或缺失；

X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或精氨酸或缺失；

X21是天冬酰胺或缺失；

X22是丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸或缺失；

X23是半胱氨酸或赖氨酸或缺失；

X24是具有2至10个由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成的氨基酸的肽，或被剔除；和

R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)、GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)或缺失(除了式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同的情况)。

为增加野生型胃泌酸调节素对于胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性，可用4-咪唑并乙酰基(通过使SEQ ID NO：1的氨基酸序列的1位的组氨酸的α碳缺失获得)、去氨基-组氨酰基(通过缺失N端氨基获得)、二甲基-组氨酰基(N-二甲基-组氨酰基)(通过用两个甲基修饰N端氨基获得)、β-羟基咪唑并丙酰基(用羟基置换N端氨基获得)、或β-羧基咪唑并丙酰基(用羧基置换N端氨基获得)置换本发明的胃泌酸调节素类似物。另外，可用增强疏水键和离子键或其组合的氨基酸置换GLP-1受体结合区。进一步，部分胃泌酸调节素序列可用GLP-1或艾塞那肽-4的氨基酸序列置换，以增加GLP-1受体的活性。

此外，部分胃泌酸调节素序列可用增强α螺旋的序列置换。优选地，式1的氨基酸序列的第10、14、16、20、24和28位氨基酸可用包括下列的已知稳定α螺旋的氨基酸或氨基酸衍生物置换：Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO₂)、Phe(4-NH₂)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)和Ala(苯并噻吩基)，并且待***的α螺旋稳定化氨基酸或氨基酸衍生物的类型和数量不限。优选地，氨基酸序列的第10和14、12和16、16和20、20和24、以及24和28位氨基酸也可用谷氨酸或赖氨酸置换以形成环，并且待***的环数量不限。最优选地，胃泌酸调节素类似物可具有选自下式2至6的氨基酸序列。

在具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素类似物是新型的肽，其包括通过用艾塞那肽或GLP-1的氨基酸序列置换胃泌酸调节素的氨基酸序列获得的下式2的氨基酸序列：

式2

R1-A-R3

在另一具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素类似物是新型的肽，其包括通过经由适当的氨基酸连接体连接胃泌酸调节素的部分氨基酸序列的和艾塞那肽或GLP-1的部分氨基酸序列制备的下式3的氨基酸序列：

式3

R1-B-C-R4

在再一具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素类似物是新型的肽，其包括其中胃泌酸调节素的部分氨基酸序列被增强与GLP-1受体的疏水结合的氨基酸置换的下式4的氨基酸序列。例如，其是其中第26位的Leu被增加疏水性的氨基酸Ile或Val置换的肽。

式4

R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3

在再一具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素类似物是新型的肽，其包括其中天然胃泌酸调节素的部分氨基酸序列被缺失、添加、或被其他氨基酸置换以增加天然胃泌酸调节素激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的性能的下式5的氨基酸序列：

式5

R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5

在式2至5中，R1如在式1中所述；

A选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO：42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQ ID NO：43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ ID NO：46)、和SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO：47)；

B选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO：42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQ ID NO：43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQID NO：45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ ID NO：46)、SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO：47)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(SEQ ID NO：48)、和SQGTFTSDYSRYLD(SEQID NO：49)；

C是具有2至10个由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成的氨基酸的肽；

D1是丝氨酸、谷氨酸或精氨酸；

D2是精氨酸、谷氨酸或丝氨酸；

D3是精氨酸、丙氨酸或缬氨酸；

D4是精氨酸、缬氨酸或丝氨酸；

D5是谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸；

D6是异亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸；

D7是甲硫氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；

D8是苏氨酸、甘氨酸或丙氨酸；

E1是丝氨酸、Aib、Sar、d-丙氨酸或d-丝氨酸；

E2是丝氨酸或谷氨酸；

E3是精氨酸或赖氨酸；

E4是谷氨酰胺或赖氨酸；

E5是天冬氨酸或谷氨酸；

E6是谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸；

E7是半胱氨酸或赖氨酸或缺失；

R3是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)或GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)；

R4是HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)；和

R5是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)或GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)或缺失(除了式2至5的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同的情况)。

优选地，本发明的胃泌酸调节素类似物可以是下式6的新型肽：

式6

其中R1是组氨酸、去氨基-组氨酰基、4-咪唑并乙酰基或酪氨酸；

X1是Aib(氨基异丁酸)、甘氨酸、丝氨酸或d-丝氨酸；

X2是谷氨酸或谷氨酰胺；

X3是亮氨酸或酪氨酸；

X4是丝氨酸或丙氨酸；

X5是赖氨酸或精氨酸；

X6是谷氨酰胺或酪氨酸；

X7是亮氨酸或甲硫氨酸；

X8是天冬氨酸或谷氨酸；

X9是谷氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸或缺失；

X11是丙氨酸或精氨酸或缺失；

X12是丙氨酸或缬氨酸或缺失；

X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X14是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；

X15是苯丙氨酸或缺失；

X16是异亮氨酸或缬氨酸或缺失；

X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X18是色氨酸或缺失；

X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸或缺失；

X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸或精氨酸或缺失；

X21是天冬酰胺或缺失；

X22是苏氨酸或缺失；

X23是半胱氨酸、赖氨酸或缺失；

X24是具有2至10个由甘氨酸组成的氨基酸的肽或缺失；和

R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)、GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)或缺失(除了式6的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同的情况)。

更优选地，本发明的胃泌酸调节素类似物可选自SEQ ID NO：2至34的肽。还更优选地，本发明的胃泌酸调节素类似物可以是实施例2-1的表1中描述的胃泌酸调节素类似物。

在本发明的实施例中，分别制备具有SEQ ID NO：2至34的氨基酸序列的胃泌酸调节素类似物，并且发现胃泌酸调节素类似物与天然胃泌酸调节素相比显示良好的激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的性能(实施例2)。换句话说，由上述结果可见，本发明的胃泌酸调节素类似物，与常规胃泌酸调节素相比，通过激活GLP-1受体和胰高血糖素受体，对预防或治疗糖尿病、糖胖病和/或糖尿病并发症呈现良好的效果。

本发明的胃泌酸调节素类似物以包括多种聚合物的缀合物形式存在，从而提高该类似物的治疗效果和体内半衰期。

本发明的缀合物比天然胃泌酸调节素更具长效效果，并且该长效缀合物包括通过修饰、置换、添加或缺失天然胃泌酸调节素的氨基酸而制备的胃泌酸调节素、缀合于可生物降解的聚合物如聚乙二醇(PEG)的胃泌酸调节素、缀合于白蛋白、抗体、弹性蛋白、纤连蛋白或多糖如几丁质或缀合于长效蛋白质如免疫球蛋白片段的胃泌酸调节素、缀合于具有结合于体内白蛋白的性能的脂肪酸的胃泌酸调节素、或封装在可生物降解的纳米颗粒中的胃泌酸调节素，并且用于本发明的长效缀合物类型不限。

优选地，缀合物是这样的缀合物：其中胃泌酸调节素类似物，其具有选自SEQ IDNO：2至34的氨基酸序列的氨基酸序列，通过非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区。

免疫球蛋白Fc区是体内代谢的可生物降解的多肽，因此用作药物载体是安全的。免疫球蛋白Fc区与整个免疫球蛋白分子相比具有低分子量，因此在缀合物制备、纯化和产率方面占优。另外，由于抗体之间氨基酸序列不同，显示高非同质性的Fab部分被去除，因此可大幅增加物质同质性，并且也可降低诱发血液抗原性的可能性。

如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”指包含免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，不包含免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。其可进一步包括处于重链恒定区的铰链区。而且，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是扩大的Fc区，包括除重链和轻链可变区外的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的部分或全部，只要其具有基本上等于或优于天然蛋白质的效果。进一步，免疫球蛋白Fc区可以是其中缺失相应于CH2和/或CH3的相对较长的氨基酸序列的部分的区域。具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可包括1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合；或6)重链恒定区和轻链恒定区各结构域的二聚体。

本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突变体)。如本文所用，术语“氨基酸序列衍生物”指由于天然氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的缺失、***、非保守型或保守型置换或其组合而不同于天然氨基酸序列的序列。例如，在IgG Fc的情况下，第214至238、297至299、318至322、或327至331位的氨基酸残基——已知在结合中非常重要——可用作适当的修饰位点。

另外，其他多种衍生物也可以，包括其中能够形成二硫键的区域缺失或天然Fc的N端的一些氨基酸残基缺失、或天然Fc的N端添加了甲硫氨酸残基的衍生物。进一步，为去除效应功能，缺失可在补体结合位点如C1q结合位点和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点进行。制备免疫球蛋白Fc区的这种序列衍生物的技术被公开于国际专利公开号WO97/34631、WO 96/32478等。

蛋白质和肽中不总体上改变蛋白质或肽活性的氨基酸交换在本领域已知(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最普遍存在的交换是双向Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。另外，如需，Fc区可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化及类似方式被修饰。

上述Fc衍生物显示与本发明的Fc区相同的生物学活性，或对于热、pH等具有增加的结构稳定性。

另外，这种Fc区可得自从人和其他动物(包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)分离的天然形式，或可以是得自转化的动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。在此，Fc区可通过如下从天然免疫球蛋白获得：从活的人体或动物体分离全免疫球蛋白，和用蛋白酶处理分离的免疫球蛋白。当用木瓜蛋白酶处理全免疫球蛋白时，其被切割成Fab和Fc区，而当用胃蛋白酶处理全免疫球蛋白时，其被切割成pF'c和F(ab)₂片段。Fc或pF'c可利用尺寸排阻色谱法或类似方法分离。优选地，人源Fc区是得自微生物的重组免疫球蛋白Fc区。

另外，免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链或与天然形式相比糖链增加或减少的形式，或可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可通过常规方法如化学法、酶法和利用微生物的基因工程法实现。通过从Fc去除糖链而获得的Fc区显示与C1q部分的结合亲和力显著下降和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性减少或丧失，因此不会引起不必要的体内免疫应答。在这方面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可在本发明中更适于作为药物载体的目的。

如本文所用，术语“去糖基化”指从Fc区用酶去除糖部分，并且术语“非糖基化”指在原核生物(优选大肠杆菌(E.coli))中生成的非糖基化Fc区。

同时，免疫球蛋白Fc区可衍生自人或其他动物，包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠。优选地，其衍生自人。

另外，免疫球蛋白Fc区可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或杂合。优选地，其衍生自人血液中最丰富的蛋白质IgG或IgM，最优选衍生自IgG，IgG已知增强配体结合蛋白的半衰期。

如本文所用，术语“组合”意为将编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽连接至不同来源的单链多肽，以形成二聚体或多聚体。具体地、二聚体或多聚体可由选自IgGFc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、和IgE Fc片段的两个或更多个片段形成。

如本文所用，术语“杂合”意为不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc片段的相应序列存在于单链免疫球蛋白Fc区中。在本发明中，可以有多种形式的杂合。换句话说，可以是由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的1至4个结构域组成的杂合，并且其可包括铰链。

同时，IgG还可被细分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且在本发明中，这些子类的组合或杂合也可以。优选地，IgG是IgG2和IgG4子类，并且最优选地，其是基本上不具有效应功能如补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG4的Fc区。

换句话说，在本发明中用作药物载体的最优选免疫球蛋白Fc区是衍生自人IgG4的Fc区。人源Fc区比非人源Fc区更优选，非人源Fc区可在人体内充当抗原，导致不期望的免疫应答，如针对该抗原的新抗体产生。

如本文所用，术语非肽基聚合物指包括通过任意共价键(代替肽键)相互连接的两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物。在本发明中，非肽基聚合物可与非肽基连接体互换地使用。

可用于本发明的非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯***、可生物降解的聚合物如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、及其组合。优选地，非肽基聚合物是聚乙二醇。另外，本领域已知的其衍生物和可容易通过本领域已知的方法制备的衍生物也落入本发明的范围内。

用于通过常规框内融合方法获得的融合蛋白的肽连接体具有缺点：其容易被体内蛋白酶切割，因此无法如预期获得足够的通过载体增加活性药物血清半衰期的效果。然而，在本发明中，具有蛋白酶耐受性的聚合物可用于保持肽的血清半衰期，类似于载体。因此，任何非肽基聚合物可无限制地在本发明中使用，只要其是具有上述功能的聚合物，即，具有体内蛋白酶耐受性的聚合物。非肽基聚合物的分子量范围为1至100kDa，优选为1至20kDa。本发明的连接至免疫球蛋白Fc区的非肽基聚合物可以是一种聚合物、或不同聚合物的组合。

用于本发明的非肽基聚合物可具有能够结合于免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物的反应基团。非肽基聚合物的两端的反应基团优选选自反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。

琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基丙酸基、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸基。具体地，当非肽基聚合物其两端具有反应性醛基时，可最小化非特异性反应，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可分别有效结合于非肽基聚合物两端。通过醛键的还原烷基化生成的最终产物远比通过酰胺键连接更稳定。醛反应基团在低pH下选择性地结合于N端，并且可在高pH如pH 9.0下与赖氨酸残基形成共价键。

作为非肽基聚合物的连接体其两端的反应基团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有马来酰亚胺基，而在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。当两端具有反应性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，可通过已知的化学反应将羟基激活成多种反应基团，或者也可利用具有市售的修饰后的反应基团的聚乙二醇来制备本发明的长效缀合物。

本发明的缀合物可以是其中非肽基聚合物各端分别连接至免疫球蛋白Fc区和胃泌酸调节素类似物的氨基或巯基的缀合物。

同时，在本发明中，非肽基聚合物的两端包括免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物可结合的反应基团。反应基团的实例包括但不限于，醛基、丙醛基或丁醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺衍生物(琥珀酰亚胺基丙酸基、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基丙酸基羧甲基或琥珀酰亚胺基碳酸基)及类似基团。

作为非肽基聚合物的连接体的两端的反应基团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有马来酰亚胺基，而在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。例如，当非肽基聚合物在一端具有反应性醛基而在另一端具有反应性马来酰亚胺基时，可最小化非特异性反应，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可有效结合于非肽基聚合物两端。在本发明的实施例中，利用包括丙醛基一者或马来酰亚胺基和醛基两者的非肽基聚合物PEG，通过将胃泌酸调节素或其类似物经由共价键连接至免疫球蛋白Fc区，来合成缀合物。

本发明的药物组合物可用于预防或治疗糖尿病、糖胖病和/或糖尿病并发症。

如本文所用，术语“预防”指抑制或延迟目标疾病发展的一切行为。具体地，术语“预防”意为给予本发明的胃泌酸调节素类似物，以将血糖水平控制到正常水平，从而抑制或延迟糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的发展。

如本文所用，术语“治疗”指指代缓解、改善或减轻已患疾病的症状的一切行为。具体地，术语“治疗”意为给予本发明的胃泌酸调节素类似物，以使血糖水平稳定保持在正常水平，从而缓解、改善或减轻糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症状况。

如本文所用，术语“糖尿病”是一种代谢疾病，其中胰岛素分泌不足或不发挥正常功能。糖尿病的特征在于血糖水平增加，引起各种状况和症状。在糖尿病的情况下，葡萄糖随尿液排出。

如本文所用，术语“糖胖病”指伴随肥胖状况的糖尿病，尤其是2型糖尿病、或通常出现于2型糖尿病患者的肥胖状况。约80-90％的2型糖尿病患者有肥胖状况，并且特征在于胰岛素抗性。适当的运动、饮食治疗和药物治疗可预防糖胖病和缓解糖胖病的状况。在本发明中，糖胖病可意为由肥胖导致的糖胖病。

如本文所用，术语糖尿病并发症指由于长期保持高血糖状况而在身体中出现的各种病理状况。糖尿病并发症的实例包括但不限于，视网膜病、肾功能障碍、神经病、血管障碍导致的中风、肾脏或心脏疾病、糖尿病足溃疡和心血管疾病。如果长期保持高血糖状况，则其会导致身体的各种病理状况。一般，其增加视网膜病、肾功能障碍、神经病、血管障碍导致的中风、肾脏或心脏疾病、糖尿病足溃疡、和心血管疾病的风险。因此，为预防糖尿病并发症，有效控制血糖水平非常重要。

因此，本发明的药物组合物可用于预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症。

在本发明的实施例中，通过将本发明的胃泌酸调节素类似物经由聚乙二醇共价连接至免疫球蛋白Fc区来制备本发明的长效胃泌酸调节素类似物缀合物，并且将制备的缀合物给予患有高脂肪饮食引起的肥胖的小鼠模型和患有由瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的小鼠模型。结果显示，与诱导肥胖动物模型相比，给予了本发明的长效胃泌酸调节素类似物缀合物的组的体重和饲料摄入显著减少(图1)，并且血糖水平显著下降(图2)。另外，本发明的长效胃泌酸调节素类似物缀合物显示等于或高于(市售长效GLP-1类似物)的血糖降低效果(图2)。

在本发明的实施例中，通过将本发明的胃泌酸调节素类似物共价连接至免疫球蛋白Fc区来制备长效胃泌酸调节素类似物缀合物，并且将制备的缀合物给予患有由瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的小鼠模型。结果显示，与对照组相比，在给予了长效胃泌酸调节素类似物缀合物的组中，体重的增加被显著抑制(图3)，并且血糖水平显著下降(图4)，而且与(市售长效GLP-1类似物)相比缀合物还显示较好的血糖降低效果(图4)。

换句话说，根据本发明的胃泌酸调节素类似物起作用引起体内β-细胞扩张，以增加胰岛素分泌，从而提高控制血糖水平的性能。另外，根据本发明的胃泌酸调节素类似物引起体重减少，从而提高胰岛素敏感性和防止心血管疾病(包括动脉硬化、高脂血和高血压)发展，其可发展至胰岛素抗性。因此，本发明的胃泌酸调节素类似物可有效用作治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症的剂。另外，本发明的缀合物与天然胃泌酸调节素相比具有激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的高性能，并且由于与Fc区结合，其显示体内血液半衰期增加，因此其活性可在体内长期保持。

本发明的组合物可以是药物组合物。

本发明的药物组合物可进一步包括显示抗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的预防或治疗效果的剂。为与已知作为抗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的治疗剂的剂组合给予本发明的胃泌酸调节素类似物，本发明的组合物可进一步包括这种已知的剂。

因此，本发明的组合物可单独或组合其他药物来给予，以预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症。

如本文所用，术语“给予”意为通过任何适当的方法将给定物质引入患者体内。本发明的类似物可通过任何一般途径给予，只要其可到达目标组织。具体地，本发明的类似物可被腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内给予，但不限于此。然而，由于肽在口服给予时被消化，口服组合物优选被配制使得活性成分被涂覆或受保护，以免在胃中降解。优选地，可以可注射形式给予本发明的组合物。另外，本发明的药物组合物可利用任何能够递送活性成分至目标细胞的***来给予。

包括本发明的胃泌酸调节素类似物的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。关于口服给予，药学上可接受的载体包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和调味剂。关于可注射制剂，药学上可接受的载体包括缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。关于局部给予，药学上可接受的载体包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可利用上述药学上可接受的载体以多种剂型配制。例如，关于口服给予，药物组合物可配制成片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂或类似物。关于可注射制剂，药物组合物可以单位剂量安瓿瓶或多剂量容器来提供。另外，药物组合物也可配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊和持续释放制剂。

同时，适于配制的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，本发明的药物组合物可进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、防腐剂及类似物。

本发明药物组合物的剂量根据活性成分种类以及多种因素如待治疗疾病、给药途径、患者年龄、性别和体重、和疾病严重程度来确定。本发明的药物组合物具有长的体内半衰期和良好的生物利用度，因此药物组合物的给予数量和频率可显著减少。

另一方面，本发明提供预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的方法，方法包括给予对象药学上有效量的胃泌酸调节素类似物。

在此，胃泌酸调节素类似物，糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症如上限定。

如本文所用，术语“对象”指疑患糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的对象。具体地，该术语意为患有上述疾病或具有上述疾病的发展风险的哺乳动物，包括人、大鼠和家养动物。另外，对象可以是任何可通过本发明的胃泌酸调节素类似物治疗的对象。

本发明的治疗方法可包括给予药学上有效量的包括缀合物的药物组合物。组合物的总日剂量可由医师通过适当的医疗判断来确定，并且组合物可被给予一次或数次。然而，鉴于本发明的目的，对于任何具体患者而言，组合物的具体治疗有效剂量可根据医学领域公知的各种因素而改变，该因素包括待实现的响应的种类和程度、具体组合物——根据是否有其他试剂一起使用、患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给药时间和途径、组合物分泌速率、治疗持续时间、与本发明的组合物组合或同时使用的其他药物和医学领域已知的其他因素。

再一方面，本发明提供本发明的胃泌酸调节素类似物在制备预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的药物中的应用。

再一方面，本发明提供制备胃泌酸调节素类似物缀合物的方法。

本发明的制备方法可以包括步骤：(1)将两端具有反应性醛基、马来酰亚胺基或琥珀酰亚胺基的非肽基聚合物共价连接至胃泌酸调节素类似物肽的氨基或巯基；(2)从步骤(1)的反应混合物分离包括胃泌酸调节素类似物肽的缀合物，其中非肽基聚合物共价连接至其氨基末端之外的位置；和(3)将免疫球蛋白Fc区共价连接至分离的缀合物的连接的非肽基聚合物的另一端，从而生成包括分别连接至非肽基聚合物两端的免疫球蛋白Fc区和胃泌酸调节素类似物肽的肽缀合物。

更具体地，制备方法可包括步骤：(1)将各端具有反应性醛基和反应性马来酰亚胺基的非肽基聚合物共价连接至胃泌酸调节素类似物的半胱氨酸残基；(2)从步骤(1)的反应混合物分离包括胃泌酸调节素类似物的缀合物，其中非肽基聚合物共价连接至半胱氨酸残基；和(3)将免疫球蛋白Fc区共价连接至分离的缀合物的连接的非肽基聚合物的另一端，从而生成包括分别连接至非肽基聚合物两端的免疫球蛋白Fc区和胃泌酸调节素类似物的肽缀合物。

发明实施方式

在下文中将参考实施例对本发明进行进一步详细描述。然而要理解，这些实施例仅以示例为目的，并非意图限制本发明的范围。

实施例1：生成用于体外激活的细胞系

实施例1-1：生成对GLP-1显示cAMP响应的细胞系

利用相应于人GLP-1受体基因的cDNA(OriGene Technologies，Inc.USA)的oORF(开放阅读框)的部分作为模板，分别使用包括HindIII切割位点和EcoRI切割位点的反向和正向引物进行PCR，从而获得PCR产物。

正向引物：5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'(SEQ ID NO：50)

反向引物：5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'SEQ ID NO：51)

将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr中，从而构建重组载体x0GC/GLP-1R。

将重组载体x0GC/GLP-1R引入CHO DG44细胞系，利用lipofectamine(Invitrogene，USA)在DMEM/F12(10％FBS)培养基中培养，获得转化体。将转化体在包含1mg/mL G418和10nM甲氨蝶呤的选择培养基中培育，并从中选择单克隆细胞系。然后，最终从单克隆细胞系中选择对GLP-1显示良好浓度依赖性cAMP响应的细胞系。

实施例1-2：生成对胰高血糖素显示cAMP响应的细胞系

利用相应于人胰高血糖素受体基因的cDNA(OriGene Technologies，Inc.USA)的ORF(开放阅读框)的部分作为模板，分别使用包括EcoRI切割位点和XhoI切割位点的反向和正向引物进行PCR，从而获得PCR产物。

正向引物：5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(SEQ ID NO：52)

反向引物：5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'(SEQ ID NO：53)

将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr中，从而构建重组载体x0GC/GCGR。

将重组载体x0GC/GCGR引入CHO DG44细胞系，利用lipofectamine(Invitrogene，USA)在DMEM/F12(10％FBS)培养基中培养，获得转化体。将转化体在包含1mg/mL G418和10nM甲氨蝶呤的选择培养基中培育，并从中选择单克隆细胞系。然后，最终从单克隆细胞系中选择对胰高血糖素显示良好浓度依赖性cAMP响应的细胞系。

实施例2：胃泌酸调节素类似物的体外活性

实施例2-1：合成胃泌酸调节素类似物

为测量胃泌酸调节素类似物的体外活性，合成胃泌酸调节素类似物，该胃泌酸调节素类似物具有下表1显示的氨基酸序列。

表1

胃泌酸调节素和胃泌酸调节素类似物

在上表1中，在每个SEQ ID NOS:19、20、22、25、26、和27中粗体字母表示的氨基酸在一起形成环，X表示的氨基酸意为作为非天然氨基酸的α-甲基-谷氨酸。另外，CA表示4-咪唑并乙酰基，DA表示脱氨基-组氨酰基，并且(d)S表示d-丝氨酸。

实施例2-2：测量胃泌酸调节素类似物的体外活性

为测量上述实施例2-1制备的肽的效果，利用实施例1-1和1-2制备的转化体测量细胞中的肽的体外活性。

各转化体被转化以在CHO(中国仓鼠卵巢)中表达人GLP-1受体和胰高血糖素受体基因中的每一个，并且适于测量GLP-1和胰高血糖素的活性。因此，利用各转化体测量各胃泌酸调节素类似物的活性。

具体地，将各转化体继代培养一周两次或三次，并且将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度分配到96孔板的各孔中并培养24小时。

将培养的细胞用KRB缓冲剂洗涤，悬浮于40ml的1mM含IBMX的KRB缓冲剂，然后使其在室温下留置5分钟。将各胃泌酸调节素(SEQ ID NO：1)和胃泌酸调节素类似物(SEQ IDNO：2-6、8、10-13、17、18、23-25、27、28和32-34)从1000nM至0.02nM以五倍系列稀释，并将40各稀释液加入细胞，然后在37℃的CO₂培育箱中培育1小时。然后，加入20ml细胞溶解缓冲剂以溶解细胞，并利用cAMP分析试剂盒(Molecular Device，USA)测量各细胞溶解产物的cAMP浓度。根据测量结果，计算EC₅₀值，并相互比较(表2)。

表2

胃泌酸调节素类似物之间GLP-1受体和胰高血糖素受体的体外活性的比较

在上表2中可见，胃泌酸调节素类似物，与SEQ ID NO：1的胃泌酸调节素相比，显示良好的体外GLP-1和胰高血糖素受体活性。

已知胃泌酸调节素具有通过激活GLP-1受体和胰高血糖素受体治疗肥胖、高脂血、脂肪肝病或动脉硬化的效果。根据本发明的胃泌酸调节素类似物与天然胃泌酸调节素相比具有体外激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的高性能，表明这些胃泌酸调节素类似物与天然胃泌酸调节素相比高度有效治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症。

实施例3：制备包括胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23)和免疫球蛋白Fc缀合物 (免疫球蛋白Fc缀合型胃泌酸调节素类似物23)

为在胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列第24位的半胱氨酸残基处PEG化MAL-10K-ALD PEG(NOF.，日本)，使胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23)和MAL-10K-ALD PEG在3㎎/的蛋白质浓度下在室温下以1：3的摩尔比彼此反应3小时。反应在包含1M胍的50mM Tris缓冲剂(pH 8.0)中进行。反应完成后，将反应溶液在下列条件下施加于SOURCE S，从而纯化在半胱氨酸处单PEG化的胃泌酸调节素类似物：柱：SOURCE S，流速：2.0/min，梯度：A 0->100％50min B(A：20mM柠檬酸钠(pH 3.0)+45％乙醇，B：A+1M KCl)。

然后，使纯化的单PEG化的胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23)和免疫球蛋白Fc在20㎎/的蛋白质浓度下在4℃下以1：5的摩尔比彼此反应16小时。反应在包含20mM SCB作为还原剂的100mM磷酸钾缓冲剂(pH 6.0)中进行。反应完成后，将反应溶液施加于SOURCE纯化柱(柱：SOURCE 15Q，流速：2.0/min，梯度：A 0->4％1min，B->20％80min B(A：20mMTris-HCl，pH 7.5，B：A+1M NaCl))和Source ISO柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0/min，梯度：B 0->100％100min A，(A：20mM Tris-HCl，pH 7.5，B：A+1.1M AS))，从而纯化包括胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23)和免疫球蛋白Fc的缀合物。

实施例4：制备包括胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物(免疫球蛋白Fc缀合型胃泌酸调节素类似物25)

为在胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列第30位的半胱氨酸残基处PEG化MAL-10K-ALD PEG，使胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25)和MAL-10K-ALD PEG在3㎎/的蛋白质浓度下在室温下以1：3的摩尔比彼此反应3小时。反应在包含1M胍的50mMTris缓冲剂(pH 8.0)中进行。反应完成后，将反应溶液在下列条件下施加于SOURCE S，从而纯化在半胱氨酸处单PEG化的胃泌酸调节素类似物：柱：SOURCE S，流速：2.0/min，梯度：A0->100％50min B(A：20mM柠檬酸钠(pH 3.0)+45％乙醇，B：A+1M KCl)。

然后，使纯化的单PEG化的胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc在20㎎/的蛋白质浓度下在4℃下以1：5的摩尔比彼此反应16小时。反应在包含20mM SCB作为还原剂的100mM磷酸钾缓冲剂(pH 6.0)中进行。反应完成后，将反应溶液施加于SOURCE15Q柱(柱：SOURCE 15Q，流速：2.0/min，梯度：A 0->4％1min B->20％80min B(A：20mMTris-HCl(pH 7.5)，B：A+1M NaCl))和Source ISO柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0/min，流速：B 0->100％100min A(A：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，B：A+1.1M AS))，从而纯化包括胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物。

实施例5：制备包括胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：27)和免疫球蛋白Fc的缀合物(免疫球蛋白Fc缀合型胃泌酸调节素类似物27)

为在胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：27)的氨基酸序列第30位的在半胱氨酸残基处PEG化MAL-10K-ALD PEG，使胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：27)和MAL-10K-ALD PEG在3㎎/的蛋白质浓度下在室温下以1：3的摩尔比彼此反应3小时。反应在包含1M胍的50mMTris缓冲剂(pH 8.0)中进行。反应完成后，将反应溶液在下列条件下施加于SOURCE S，从而获得在半胱氨酸处单PEG化的胃泌酸调节素类似物：柱：SOURCE S，流速：2.0/min，梯度：A0->100％50min B(A：20mM柠檬酸钠(pH 3.0)+45％乙醇，B：A+1M KCl)。

然后，使纯化的单PEG化的胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：27)和免疫球蛋白Fc在20㎎/的蛋白质浓度下在4℃下以1：5的摩尔比彼此反应16小时。反应在包含20mM SCB作为还原剂的100mM磷酸钾缓冲剂(pH 6.0)中进行。反应完成后，将反应溶液施加于SOURCE15Q柱(柱：SOURCE 15Q，流速：2.0/min，梯度：A 0->4％1min B->20％80min B(A：20mMTris-HCl(pH 7.5)，B：A+1M NaCl))和Source ISO柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0/min，梯度：B 0->100％100min A(A：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，B：A+1.1M AS))，从而纯化包括胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：27)和免疫球蛋白Fc的缀合物。

实施例6：长效胃泌酸调节素类似物对高脂肪饮食诱导型肥胖(HF DIO)小鼠的体重和血糖水平下降的效果

实施例6-1：实验方法

6周龄小鼠(C57BL/6，120-130g)购自OrientBIO(韩国)。购买的C57BL/6小鼠是广泛用于肥胖和糖尿病研究的动物，因为其肥胖可相对容易通过高脂肪饮食诱导。HF DIO小鼠是频繁用于糖尿病研究的啮齿类，并且由于在无遗传操纵的情况下将高脂肪饮食移植到器官中而天然地显示类似于人的肥胖和糖尿病状况，这与患有通过瘦蛋白受体的突变诱导的糖尿病的db/db小鼠不同。因此，在本发明中，利用这些动物检验本发明的组合物对糖胖病中的体重和血糖水平下降的效果。

使动物获得通过UV照射灭菌的高脂肪饮食(60％Kcal来自脂肪饮食，D12492；Research Diets Inc.)。而且，利用水瓶使动物获得过滤后的和UV灭菌的自来水。将动物在12-hr光照/12-hr黑暗循环(光照：am 6至pm 6)下圈养在满足GLP标准的养殖室中，并且全部实验程序按照动物实验标准指导进行。药物给予在26周肥胖诱导后开始，并且将动物分成五组(n＝6)，如下表3所示。

表3

具体地，将第1组(HF DIO诱导组，对照组)用高脂肪饲料饲养，并皮下给予5ml/kg(注射体积)Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，Sigma)一周一次或多次。关于血糖耐受性测试，将第1组在测试前24小时皮下给予Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，Sigma)，并禁食16小时。从尾部采集血液，以测量禁食葡萄糖水平，并且测量腹内给予1g/kg葡萄糖后15min、30min、60min、90min和120min的血糖水平。

将第2组(HF DIO诱导且100nmol/kg给药组)用高脂肪饮食饲养以诱导肥胖和高血糖，然后一日一次皮下给予5ml/kg(注射体积)市售(GSK)。关于血糖耐受性测试，使第2组在测试前禁食16小时，并在测试前4小时皮下给予100nmol/kg从尾部采集血液，以测量禁食葡萄糖水平，并且测量腹内给予1g/kg葡萄糖后15min、30min、60min、90min和120min的血糖水平。

第3组(HF DIO诱导且1nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物给药组)用高脂肪饲料饲养以诱导肥胖和高血糖，然后一周一次皮下给予1nmol/kg(注射体积5ml/kg)实施例4制备的SEQ ID NO：25-Fc缀合物。关于血糖耐受性测试，使第3组在测试前禁食24小时，并在测试前24小时皮下给予1nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物，并禁食16小时。从尾部采集血液，以测量禁食葡萄糖水平，并且测量腹内给予1g/kg葡萄糖后15min、30min、60min、90min和120min的血糖水平。

将第4组(HF DIO诱导且3nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物给药组)用高脂肪饲料饲养以诱导肥胖和高血糖，然后一周一次皮下给予3nmol/kg(注射体积5ml/kg)实施例4制备的SEQ ID NO：25-Fc缀合物。关于血糖耐受性测试，使第3组在测试前禁食24小时，并在测试前24小时皮下给予3nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物，并禁食16小时。从尾部采集血液，以测量禁食葡萄糖水平，并且测量腹内给予1g/kg葡萄糖后15min、30min、60min、90min和120min的血糖水平。

将第5组(HF DIO诱导且5nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物给药组)用高脂肪饲料饲养以诱导肥胖和高血糖，然后一周一次皮下给予5nmol/kg(注射体积5ml/kg)实施例4制备的SEQ ID NO：25-Fc缀合物。关于血糖耐受性测试，使第3组在测试前禁食24小时，并在测试前24小时皮下给予5nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物，并禁食16小时。从尾部采集血液，以测量禁食葡萄糖水平，并且测量腹内给予1g/kg葡萄糖后15min、30min、60min、90min和120min的血糖水平。

关于所有组(n＝6)，将盐水或每种药物给予2周，然后分析其对体重和血糖水平下降的效果。

实施例6-2：长效胃泌酸调节素类似物对作为稳定肥胖模型的高脂肪饮食诱导型肥胖(HF DIO)小鼠的体重和血糖水平下降的效果

为检验本发明的长期胃泌酸调节素类似物对作为稳定肥胖模型的高脂肪饮食诱导型(26周)肥胖(HF DIO)小鼠的血糖水平下降的效果，将实施例6-1中分类的DIO小鼠一周一次皮下给予长效胃泌酸调节素类似物，给予2周。每天测量体重和饲料摄入，并在第0、3、7、10和14天从DIO小鼠的尾部采集血液，利用HITACHI 7020分析血糖水平变化。体重和血糖水平变化显示在图1和2中。

图1显示体重变化，图2显示血糖AUC(曲线下方面积)。统计学处理所得结果，并计算平均值和平均值的标准偏差。

在小组(n＝6)之间的显著性验证中，利用单向ANOVA的Dunnett测试统计学处理数据，并且认为p<0.05的值是统计学显著的。

具体地，体重变化的测量结果表明，患有26周高脂肪饮食引起的肥胖的小鼠的体重不减少，而对患有肥胖的小鼠给予长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25-Fc缀合物)时，其体重以剂量依赖性方式减少(图1)。

血糖水平的测量结果表明，在对小鼠给予长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25-Fc缀合物)时，患有肥胖的小鼠的血糖水平以剂量依赖性方式减少。具体地，在对患有肥胖的小鼠给予5nmol/kg长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25-Fc缀合物)时，其与高脂肪饮食诱导的DIO小鼠相比血糖水平显著减少，并且5nmol/kg长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25-Fc缀合物)的血糖降低效果等于或优于是治疗糖尿病的市售药物(图2)。

根据实施例6-2的结果，发现包括通过PEG共价连接至免疫球蛋白Fc区的胃泌酸调节素类似物的本发明的长效胃泌酸调节素类似物缀合物使高脂肪饮食诱导肥胖(HF DIO)小鼠的体重和血糖水平下降，表明其可有效用于治疗糖尿病、糖胖病或相关疾病。

实施例7：长效胃泌酸调节素类似物对患有瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的db/db 小鼠的体重和血糖水平下降的效果

实施例7-1：实验方法

7周龄雄性BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠(25±3g，Harlan U.S.A)购自DooYeol Biotech(韩国)。BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠(在下文中被称为db/db小鼠)连同ob/ob小鼠是最常用于糖尿病研究的啮齿类，并且这些小鼠通过瘦蛋白受体突变天然地显示类似于人的糖尿病状况。因此，在本发明中，利用这些动物在糖尿病治疗剂的研发中检验本发明的剂的血糖降低效果。

使购买的动物驯化和适应实验环境1周，然后根据其葡萄糖水平随机分组。

使动物获得通过UV照射灭菌的固体饲料(Picolab啮齿类饮食5053)。而且，利用水瓶使动物获得过滤后的和UV灭菌的自来水。将动物在12-hr光照/12-hr黑暗循环(光照：6a.m.至6p.m.)下圈养在满足GLP标准的养殖室中，并且所有实验程序按照动物实验标准指导进行。将动物分成四组(n＝7)，并给予下表4所示的药物。

表4

具体地，对第1组(介质)，对照组，皮下给予5ml/kg Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，Sigma)一周一次。

对第2组(给予60nmol/kg)，药物给予组，一日一次皮下给予60nmol/kg(糖尿病剂量；注射体积5ml/kg)市售(GSK)。

对第3组(给予100nmol/kg)，药物给予组，一日一次皮下给予100nmol/kg(肥胖剂量；注射体积5ml/kg)市售(GSK)。

对第4组(15nmol/kg SEQ ID NO：23-Fc缀合物)，药物给予组，一周一次皮下给予15nmol/kg(注射体积5ml/kg)实施例4制备的SEQ ID NO：23-Fc缀合物。

对第5组(6nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc缀合物)，药物给予组，一周一次皮下给予6nmol/kg(注射体积5ml/kg)实施例4制备的SEQ ID NO：25-Fc缀合物。

关于所有小组(n＝7)，将盐水或每种药物给予4周，然后分析其对体重和血糖水平下降的效果。

实施例7-2：分析长效胃泌酸调节素类似物对患有瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的db/db小鼠的体重和血糖水平下降的效果

为检验本发明的长效胃泌酸调节素类似物对患有瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的db/db小鼠的血糖水平下降的效果，对实施例7-1中分类的db/db小鼠一周一次皮下给予长效胃泌酸调节素类似物，给予4周。一周两次测量小鼠体重变化，并从db/db小鼠尾部采集血液(在第1和4周一天一次，和在第2和3周一周两次)，利用HITACHI 7020分析血糖水平的变化。

图3显示体重变化，图4显示血糖AUC(曲线下方面积)。统计学处理所得结果，并计算平均值和平均值的标准偏差。在小组(n＝6)之间的显著性验证中，利用单向ANOVA的Dunnett测试统计学处理数据，并认为p<0.05的值是统计学显著的。

具体地，体重变化的测量结果表明，db/db小鼠对照组的体重从给予开始的那天起持续增加，而对小鼠给予长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23-Fc缀合物或SEQ ID NO：25-Fc缀合物)时，体重相对于给予开始那天测量的体重不发生大幅变化，表明缀合物显示抑制体重增加的显著效果(图3)。

血糖水平的测量结果表明，在对小鼠给予长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：23-Fc缀合物或SEQ ID NO：25-Fc缀合物)时，血糖水平与对照组相比显著减少。具体地，6nmol/kg长效胃泌酸调节素类似物(SEQ ID NO：25-Fc缀合物)的给予与相比显示血糖降低效果，是治疗糖尿病的市售药物(图4)。

根据实施例7的结果，发现包括通过PEG共价连接至免疫球蛋白Fc区的胃泌酸调节素类似物的本发明的长效胃泌酸调节素类似物，与介质和用作治疗糖尿病的药物的相比，使患有瘦蛋白受体突变诱导的糖尿病的db/db小鼠的血糖水平(糖尿病指数)显著下降，表明本发明的长效胃泌酸调节素类似物可非常有效地用于治疗糖尿病。另外，本发明的长效胃泌酸调节素类似物显示抑制体重增加的显著效果，表明其可减少糖尿病心血管并发症。

根据实施例6和7的结果，发现本发明的长期胃泌酸调节素类似物缀合物显示等于或优于已知具有血糖降低效果的的良好血糖降低效果以及良好体重降低效果，表明本发明的长期胃泌酸调节素类似物缀合物基于其血糖水平降低效果可有效用作治疗糖尿病、糖胖病和糖尿病并发症的剂。

本领域技术人员将理解，本发明可以其他具体形式实施，而没有脱离其精神或基本特征。所述实施方式将被认为在各个方面都只是作为示例，而非限制。因此，本发明范围由所附权利要求指定，而非前文描述。术语权利要求的等同形式的含义和范围的所有变化都被包括在本发明的范围内。

Claims

1.胃泌酸调节素类似物用于制备预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的药物的应用，所述胃泌酸调节素类似物由选自下列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：4、5、23-28和32-34的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的应用，其中所述胃泌酸调节素类似物由选自SEQ ID NO：24-26和28的氨基酸序列的氨基酸序列组成。

3.权利要求1所述的应用，其中所述胃泌酸调节素类似物是与选自下列的一种形成的缀合物形式：免疫球蛋白片段、抗体、弹性蛋白、白蛋白和纤连蛋白。

4.权利要求3所述的应用，其中所述缀合物是如下缀合物：其中所述胃泌酸调节素类似物由选自SEQ ID NO：4、5、23-28和32-34的氨基酸序列的氨基酸序列组成，所述胃泌酸调节素类似物通过非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区。

5.权利要求4所述的应用，其中所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、聚乙烯***、PLA(聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物及其组合。

6.权利要求5所述的应用，其中所述多糖选自葡聚糖、几丁质和透明质酸。

7.权利要求4所述的应用，其中所述非肽基聚合物的各端分别连接至所述免疫球蛋白Fc区和所述胃泌酸调节素的氨基或巯基。

8.权利要求1所述的应用，进一步包括显示针对糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的预防或治疗效果的药剂。

9.权利要求1所述的应用，其中所述糖尿病是胰岛素依赖性1型糖尿病或胰岛素独立性2型糖尿病。

10.权利要求1所述的应用，其中所述糖胖病源自肥胖。

11.用于预防或治疗糖尿病、糖胖病或糖尿病并发症的组合物，所述组合物包括胃泌酸调节素类似物作为活性成分，

其中所述胃泌酸调节素类似物由选自下列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：24-26和28的氨基酸序列。