CN102010473A

CN102010473A - 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用

Info

Publication number: CN102010473A
Application number: CN2010105382254A
Authority: CN
Inventors: 曹鹏; 夏志南; 高健; 蔡雪婷; 卢悟广
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2011-04-13

Abstract

本发明涉及一种长效稳定的胃泌酸调节素，它由人免疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。该融合蛋白的制备方法如下：分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白Fc片段基因，并将它们连接，然后构建含连接片段的重组表达载体；用重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。本发明的融合蛋白能用于制备治疗代谢疾病如糖尿病和肥胖症的药物。

Description

重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明涉及构建一种长效稳定的胃泌酸调节素，及其用于治疗代谢疾病如糖尿病和肥胖症的用途。

背景技术

人体食欲和能量代谢调控主要由下丘脑、脑干孤束核、胰岛素、脂联素、瘦素等胰岛、脂肪代谢信号分子、胃促生长激素、高血糖素样肽、胃泌素调节激素等胃肠激素和迷走神经等来共同调节。下丘脑、延脑孤束核分泌的激素和神经递质及脂肪代谢信号分子都需要通过神经***和血液循环***来发挥作用，针对这些调节通路的减肥药物需要通过中枢神经来起作用，影响面大，副作用严重。只有胃肠激素多直接作用于胃肠道，调节食欲和能量代谢。因此，针对胃肠激素的减肥药物靶点局限，副作用小。

胃泌酸调节素(Oxyntomodulin，OXM)是肠上皮L-细胞分泌的一种短肽激素。在人肠道末端有大量的OXM分布，在啮齿类动物胃肠道中，从十二指肠到回肠，OXM的浓度逐渐增高，盲肠之后逐渐减少。肠上皮分泌胃泌酸调节素受营养和能量代谢调节，进食后5-10分钟后OXM水平开始升高，30分钟后达到高峰。在体内有一定的昼夜规律，清晨分泌水平低，晚上分泌水平高。OXM由37个氨基酸组成。

对于OXM的认识来源于一些胃肠及腹部疾病患者血清中OXM的变化。人们发现在一些胃肠道疾病如热带吸收不良，空肠回肠改道术等病态情况下，OXM水平显著变化，其减轻体重的作用引起人们的注意。前期研究结果也显示，OXM是有效的减肥药物，长期中枢性和周围性地给与OXM可减少大鼠的体重增加。静脉给与高于生理水平的OXM可减少受试者食物摄取。Dhilfows等在为期四周的研究中发现，自行给与OXM的超重或肥胖受试者，其摄入量显著少于生理盐水对照组，并且体重减轻也显著快于对照组，这种效应在四周的研究过程中持续维持。OXM可减缓胃内营养物质的排空。具有减少食物吸收，抑制食欲及动员脂肪、减少能量摄入，增加能量消耗，使能量代谢处于负平衡状态，从而减轻体重的功能。

啮齿动物脑室注射或皮下注射胃泌酸调节素可降低食物吸收和体重，减少脂肪。英国研究人员在《糖尿病》杂志上报告，皮下注射OXM可有效地减轻体重和减少脂肪组织。研究人员对26名过重或肥胖的志愿者进行了一项双盲研究。受试者被随机指定在每餐前30分钟皮下注射OXM或盐水，同时要求他们在研究期间保持正常饮食和常规水平的体育锻炼。治疗组体重减轻了2.3kg，对照组0.5kg。治疗组显示瘦素水平降低，脂联素增加，与脂肪组织减少一致。受试者的热量摄取也显著减少。开始研究进餐时减少了 170kcal，最后进餐时 250kcal。在嗜食性的感知上没有变化。OXM主要通过三条途径调节食欲和能量摄取。一是直接作用于胃肠道胰高血糖素样肽-l(GLP-l)受体，作用于迷走神经，调节食欲，抑制糖和脂肪的吸收。二是下调胃生长素的分泌，抑制食欲。研究显示，皮下注射OXM可使啮齿动物血液中的胃生长素下降20%，而人类可下降到44%。三是通过甲状腺途径刺激甲状腺素的合成分泌，增加能量消耗，动员脂肪分解。现在多认为OXM通过GLP-1受体起作用。在GLP-1受体敲除的小鼠实验中发现，OXM的厌食效应消失。

OXM具有很短的半衰期，可被细胞表面的二肽基肽酶IV（DP-IV）迅速失活，然而，DP-IV抑制剂在临床中的体重效果居中，表明可能需要超生理水平的OXM来实现人体的减肥。因此，胃泌酸调节素显示了作为代谢疾病如糖尿病和肥胖症的治疗手段的潜力，但是，因为OXM的体内稳定性差，所以需要开发可被安全有效的给药用于治疗代谢疾病如糖尿病和肥胖症的长效OXM。

抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体效应功能，包括决定抗体半衰期和在体内的分布固定补体和结合细胞表面Fc受体的能力。Fc结构域的性质使其称为有用的治疗剂。许多研究已将Fc 结构域融合于其他非抗体蛋白质，例如受体蛋白，例如伊纳西普，也可将Fc结构域融合体用做研究试剂，Fc标签其有利于蛋白的检测与纯化。人IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体, 它在人体内的半衰期约为20 天, 其稳定性是由于IgG 的Fc片段可与新生Fc受体(FcRn)结合, 避免IgG进入溶酶体中被降解。因此, IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白, 以提高活性蛋白的体内半衰期, 达到长效的目的。IgG可通过Fc片段上的补体结合位点激活补体, 起到细胞杀伤作用。根据铰链区的长短及 Fc片段氨基酸序列的不同, 人IgG分为4个亚型, 其中IgG Fcγ2具有较低的诱导细胞毒性作用, 而IgG Fcγ1最强。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc (Hinge-CH2- CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连, 以避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造成的影响。另外, 如果活性蛋白以同源二聚体的形式发挥其生物活性, Fcγ片段及铰链区的半光氨酸构成的分子间二硫键可增强和稳定融合蛋白二聚体的形成。例如人白细胞功能抗原3 (LFA-3), 肿瘤坏死因子受体II(TNFRII), 白细胞介素12(IL-12)等, 这些融合蛋白在保留细胞因子生物功能的同时在动物实验中明显延长细胞因子的半衰期。此外, IgG的融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段, 但是由于其高效性、半衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明通过构建OXM与人IgG Fc融合蛋白，增强了OXM多肽的体内稳定性和延长了半衰期，并提供了该融合蛋白用于治疗代谢疾病如糖尿病和肥胖症的方法。

本发明的一个方面提供了一种重组胃泌酸调节素融合蛋白OXM-Fc，它由人免疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。

其中，OXM与Fc之间的链接肽选择至关重要， OXM通过连接肽来连接Fc与OXM以形成融合蛋白，OXM连接肽-Fc或Fc-连接肽-OXM。连接肽可以是(G₄S)_3-10，连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基酸。连接肽长度可短至Fc对OXM形成的位阻保持最小，例如（G₄S）_1-2。连接肽有利于OXM与其受体结合。

所说的融合蛋白OXM-Fc可以是包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽，或其片段同源物、类似物或衍生物。在一优选的实施方案中，OXM-Fc由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成。

本发明的另一个方面提供了一种编码重组OXM-Fc融合蛋白的多核苷酸分子，它是选自下列核苷酸序列的一种：

1）SEQ ID NO:6的核苷酸序列；

2）与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；

3）在严谨杂交条件下能与SEQ ID NO:6或其互补的多核苷酸分子杂交的核苷酸序列；

4）编码与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

本发明所说的融合蛋白OXM-Fc可通过以下方法制备：

（1）分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白G的 Fc片段基因，

（2）连接人胃泌酸调节素和Fc基因；

（3）构建含上述（2）连接片段的重组表达载体；

（4）用上述（3）中得到的重组表达载体转化宿主细胞，

（5）培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。

上述方法中提供了含有编码本发明的多核苷酸的重组表达载体，由该重组表达载体转化的宿主细胞，以及由该宿主细胞所衍生的新的细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供一种包含本发明多核苷酸分子的重组真核表达载体pOXM-Fc，以及含有该重组表达载体的宿主细胞pOXM-Fc/CHO。

上述步骤（5）具体是在适于该融合蛋白的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收和纯化该重组融合蛋白的步骤。在一个优选的实施方案中，宿主细胞经细胞培养，离心后，上清液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。在一个优选的实施方案中，亲和层析是ProteinA sepharose FF亲和层析柱，分子筛是Superdex 200 PREP grad柱。

本发明进一步提供含有本发明OXM-Fc融合蛋白作为活性成分和药学上可接受载体的药物组合物，以及该药物组合物在治疗内分泌相关疾病的药物中的用途，包括糖尿病和肥胖症等。

本文中提到的OXM-Fc融合蛋白为同源性多肽，本文中的同源性多肽是指，多肽本来具有OXM-Fc融合蛋白的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守的取代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代时本领域已知的。造成这样的取代原则包含由Dayholf，MD等所述的取代规则。更具体的说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照描述的重组技术完成。可用于表达本发明的OXM-Fc融合蛋白序列的表达载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA和粘粒DNA表达载体，可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达质粒包括PUC8,PUC9,PBR322和PBR329,pET系列载体，PQE50等等，可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达***，基于鞠细胞病毒启动子-增强子的表达***，和基于杆状病毒表达***。

可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的宿主细胞包括单不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如BL21菌株。真核细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括CHO，和HEK293，NIH-3T3细胞等。

含有本发明的重组融合蛋白质的药物组合物可用于内分泌相关疾病的治疗，尤其是在减肥和糖尿病领域。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药，经皮给药，静脉给药，肌肉内给药，局部给药，经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的重组蛋白药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。

适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾剂，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液。

含有本发明重组蛋白的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药，在使用前科加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配置，液体配方一般是缓冲液，等渗溶液和水溶液。

剂型中还包含由其他常规组分，如防腐剂，稳定剂，表面活性剂，缓冲液，调节渗透压的盐，乳化剂，增甜剂，着色剂，调味剂等。本发明药物组合物种使用的稳定剂优选柠檬酸钠，甘氨酸，甘露醇，神经节糖苷等。含有本发明药物组合物的注射水针或冻干粉针更优选的配方包括，Roxm-Fc，NaCl 4mg，硫酸盐3.02mg，甘氨酸10mg或甘露醇15mg，注射用水0.5ml。

本发明药物组物种多肽的用量可以再一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些一直的因素如根据疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，给药途径等因素很容易的加以确定。

本发明的优点：

1)在分子数相同时与天然OXM相比，具有类似的生物学活性；

2)在药物的药代实验中显示出显著延长的半衰期和稳定性；

3)选择IgG的Fc片段作为融合片段，避免副作用的产生；

4)表达量高，稳定性好，易于放大生产，成本低。

本发明的工程细胞株连续传代100代后，仍能稳定分泌表达OXM-Fc融合蛋白，通过悬浮培养方式进行培养，用ELISA方法检测上清中的表达量，统计50余次的数据，表达量均在400-1000mg/L。在纯化方面，由于融合蛋白在细胞培养上清中含量高，而纯化工艺中的亲和层析步骤具有很高的纯化效率，每毫升凝胶可以结合50mg的蛋白，易于放大生产。

附图说明

图1：显示重组质粒pOXM-Fc的构建过程。

图2：显示重组质粒pOXM-Fc的酶切鉴定结果（1% agrose电泳），其中泳道M为分子量标准，1,分别代表号克隆。

图3：显示纯化后蛋白的电泳图谱（12%SDS-PAGE），其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道S为纯化后的样品。

图4：OXM-Fc蛋白以腹腔一次给药方式注射雄性C57小鼠后的药代动力学结果。

图5：OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠体重的影响，^*＝p＜0.001，和对照组比较。

图6：OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠食物摄入量(FI)的影响，^*＝p＜0.05，和对照组比较。

图7：OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠糖耐量的影响

图8：OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠口服葡萄糖后胰岛素释放的影响，^*＝p＜0.05，和对照组比较。

具体实施方式

实施例1：OXM目的基因及人IgG1 Fc片段基因的获得

根据OXM基因序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，基因序列为SEQ ID NO：2，送交基因合成公司合成。根据人IgG1 Fc基因序列，以正常人淋巴细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增IgG1 Fc 片段，反应条件如下：RT-PCR反应混合物在50℃变性30分钟后，按下列条件进行反应：逆转录反应：94℃变性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸1分钟，反应10个循环。PCR反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟，反应25个循环。然后68℃再延伸12分钟。反应完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。如图1所示，我们得到了预计大小的DNA片段（约 600bp）。经测序，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，基因序列为SEQ ID NO：4。

实施例2：重组质粒的构建

载体的构建如图1所示，通过over-lap PCR技术将OXM和Fc的基因序列拼合；利用引物延伸PCR技术，通过三次PCR将鼠Igκ信号肽连接在OXM-Fc序列的氨基端；再将目的基因与pcDNA3.0质粒分别用Hind III和EcoR V内切酶进行酶切；将酶切产物用T4连接酶连接，将构建好的质粒命名为pcDNA3.0/OXM-Fc。具体是：

1.1 根据OXM和人IgG1 Fc (hinge+ CH2+ CH3) cDNA序列设计如下引物：

POXM1:5’CATGGCGAGGGCACCTTCACCTC 3’

POXM2: 5’ CAGGTGTGGGTCTTGTCAGAGGACTTGGGC3’

PFc1: 5’GTCCTCTGACAAGACCCACACCTG 3’

PFc2: 5’ CGCGGATCCTCACTTGCCGGGGCTCAGGGACAG3’

其中POXM2和PFc1斜体部分为互补区域，PFc2含由EcoRV酶切位点。利用重叠延伸拼接技术合成OXM-Fc。

1.2 根据鼠IgG κ链和OXM-Fc序列设计如下引物：

P1：CCCAAGCTTGCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGG

P2：ATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGAGT

P3：CTACCGCCACCGGAGTGCATTCTGACAAGACCCACACCTGTC

利用引物延伸技术合成信号肽之后，通过重叠拼接技术将信号肽OXM-Fc结合并将得到的序列酶切后转入pcDNA3.0真核表达载体，酶切鉴定结果为图2，表达质粒命名为pcDNA3.0/OXM-Fc。

实施例3：CHO稳定表达株（CHO-OXM细胞）筛选及鉴定

1)取10ug大量制备的实施例2中的pOXM-Fc质粒，利用脂质体Lipofectin2000转染CHO细胞。两天后按1：5的比例传代，加入0.4 mg/ml的G418筛选，10天可见克隆形成。随机消化50个边缘明显分开、细胞状态良好的单克隆接种于24孔板培养（第一轮筛选）。

2)取三天后的培养上请用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选出表达阳性的15个克隆分别接种于24孔板（第二轮筛选）及6孔板（用于保种），培养4天后，取上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的4个克隆：A5-3、B2-3、B2-5、C1-4一步用有限稀释法进行筛选。

3)分别接种96孔板（5细胞/孔/200ul）(第三轮筛选)，待细胞长满后（大约13天后），去培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，B2-3、B2-5、C1-4均为均一的克隆，分别挑取表达较高的6个克隆接种24孔板，各平行届2孔。待细胞长满后，其中一孔用于保种，另一孔接种6孔板。待6孔板内的细胞长满后，抽取基因组DNA和总RNA，用PCR鉴定整合入基因组的***片段的存在情况，用RT-PCR鉴定***片段的转录（即表达）情况。结果显示B2-3、B2-5、C1-4均为正确的克隆。

4)分别取B4-3（C3）、A6-4（B4）、C1-5（D8）接种96孔板（1细胞/孔/200ul）(第四轮筛选)，待细胞长满后（大约15天后），取培养上请用ELISA检测融合蛋白的表达情况，三个克隆均为均一的克隆，将其中表达最高的分别扩增、保种，进行下一步表达和纯化。pOXM-Fc转化CHO细胞后，将稳定表达的细胞命名为CHO-OXM细胞。

实施例4 制备OXM-Fc融合蛋白

大规模培养CHO-OXM细胞，经离心后上清液用1M的NaOH调节pH至7.3，用以10mM PB(pH7.3)平衡的rProteinA-Sepharose F.F.(Parmacia)亲和层析柱进行吸附，再用同样的缓冲液洗涤亲和柱至280nm的OD值小于0.01。用0.05～0.1M的柠檬酸缓冲液将融合蛋白洗下，收集洗脱峰并立即用200 mM Na₂HPO₄调节PH至7.0。样品浓缩后，上分子筛Superdex 200 prep grade 柱预先用20 mM PBS(含150mM NaCL, pH7.2)缓冲液平衡，将浓缩后的样品上样纯化。纯化后的蛋白电泳图谱见图3，纯度可达到 98%以上。

实施例5：制备以OXM-Fc 为活性组分的注射剂/冻干剂

配方： OXM-Fc 100mg

NaCL 8g

Na₂HPO4·12H2O 5.16g

NaH₂PO4·2H2O 0.874g

甘氨酸 15g

甘露醇 30g

注射用水 1000ml

pH值 7.2

无菌过滤后分装成0.5ml/支的注射水针剂或冻干，制成冻干粉针。

实施例6：OXM-Fc在雄性C57小鼠体内腹腔注射（IP）一次给药的药代动力学

实验方法

1)实验动物：清洁级10周龄健康雄性C57小鼠66只，体重(21.69士1.39)，由上海中科院SLAC实验动物中心提供。实验前小鼠适应性喂养l 周，自由饮水，进食普通饲料，无不良反应、进食、饮水和活动正常者纳入实验。动物饲养实验室符合国标清洁级，空间50M²，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温23℃，相对湿度50%-60%。

2)动物分组及实验设计：实验前称小鼠体重，按体重随机分成2组，每组33只，每个时点3只。各组小鼠处理如下：OXM组：0.16mg/kg；OXM- Fc组：5mg/kg。每只小鼠注射一个IP注射剂量的OXM或OXM- Fc。在给药0.08，0.5，1，6，24，48，72，96，168，240和336hr后眼眶静脉取血。血样4℃凝固，3500 x g低温离心10min分离血清，各时点每只小鼠血样于-20℃保持待测。

3)药代动力学测定：采用ELISA试剂盒测定各个给药方法、各个时间点小鼠血清中OXM-Fc浓度，得到血药浓度-时间曲线及主要药代动力学参数。以OXM单克隆抗体10 μg/ml包被ELISA板。以Bradford法测定OAP标准蛋白液的浓度。将OAP标准品以抗体稀释液倍比稀释至1000、500、250、125、62.5、30ng/ml，100 μl/孔。用此测得的值制定标准曲线，取一特定时间点采到的血清样品以抗体稀释液作1:10，1:100，1:1000，1:5000稀释，加入100 μl/孔，37℃水浴箱孵育1 h。以洗液洗5遍，每遍3 min，每洗一遍之后以毛巾包裹拍干。之后加入1:5000抗体稀释液稀释的HRP标记的抗小鼠IgG（Cell Signaling），37℃水浴箱孵育1 h。按前述方案洗板5遍。之后加入100 μl/孔底物液，37℃水浴箱孵育20～30 min，加入反应终止液20 μl/孔。于多功能酶标仪测定OD492nm。

4)统计学处理：所有数据用均数士标准差(x土S)表示，用统计软件SPSS11.5处理。根据所测OXM，OXM-Fc血药浓度-时间数据，取各时点3只小鼠血药浓度的均数，用DAS软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。P<0.05视为统计学差异显著，P<0.001为统计学差异非常显著。

图4和表1是OXM-Fc蛋白以腹腔一次给药方式注射雄性C57小鼠后的药代动力学结果，

表明OXM-Fc融合蛋白比OXM具有更长的半衰期和更低的清除率，OXM的半衰期为1hr，清除率为60hr，而OXM-Fc融合蛋白的半衰期可以达到90hr以上，清除率却只有1hr左右。

实施例7：融合蛋白在肥胖小鼠体内的功效包括测定OXM-Fc蛋白对小鼠体重，食物摄入量，空腹血糖，口服葡萄糖耐量和血清胰岛素的急性效应

实验方法

1)实验动物：清洁级18-19周龄雄性年长肥胖小鼠81只，体重(45.9士1.85)，由上海中科院SLAC实验动物中心提供。小鼠自由饮水，60%高脂饮食。动物饲养实验室符合国标清洁级，空间50M²，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温23℃，相对湿度50%-60%。

2)动物分组及实验设计：实验前称小鼠体重，按体重随机分成9组，每组9只。各组小鼠处理如下：空白对照组（生理盐水组，1次/天），OXM组（60ug/kg，1次/天），PBS VH组（PBS/CMF是OXM-Fc蛋白的溶剂，2次/周），OXM-Fc组（3mg/kg，2次/周）。小鼠禁食过夜，第二天早上给药，每只小鼠注射一个腹腔注射剂量的各组药物。给药30min后恢复食物，每周测两次体重。15天后进行OGTT，禁食5hr后再测。

3)小鼠体重和食物摄入量测定：测量给药1，2，5，8，12和14天后小鼠的体重。测定第一天，第一周和第二周的食物摄入量，采用前ld早晨8:00的食物剩余量减去后ld/7d同时间的剩余量，得到每笼小鼠的日或周食物摄入量，精确到小数点后一位。

4)空腹血糖测定：自小鼠尾静脉或眶静脉取血，使用微量血糖仪检测。

5)糖耐量测定：通过口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）评估。15天后，禁食5小时，2g/kg葡萄糖口服灌胃后0，15，30，60分钟，分别自清醒小鼠尾静脉取血液标本检测血糖（微量血糖仪）。

6)胰岛素释放试验：OGTT中的血液样本，用来测定血清胰岛素。清醒小鼠尾静脉收集血液样本后，置于EDTA加激胎释放酶抑制剂——抑肤酶的试管中测定胰岛素。4℃，3000rpm离心12分钟，取血清储存于-80℃，待分析。用小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素，按照说明书操作。

7)统计学处理：所有数据用均数士标准差(x土S)表示，用统计软件SPSS11.5处理，多组数据用ANOVA分析，两组间数据采用T检验，若方差不齐，采用非参统计检验。P<0.05视为统计学差异显著，P<0.001为统计学差异非常显著。

实验结果：

1)图5显示的是OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠体重的影响。OXM组（60ug/kg，1次/天）使小鼠体重减少了约3%， OXM-Fc组（3mg/kg，2次/周）则使小鼠体重减少了约23%。

2)图6显示的是OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠食物摄入量（FI）的影响。OXM处理后，小鼠摄食量明显下降，注射第一天，OXM组只减少了31%的食物摄入量，而OXM-Fc组相对于PBS对照组减少了80%左右。第二周，食物摄入量开始增加，并接近对照组。

3)图7显示的是OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠糖耐量的影响。OGTT分析显示OXM-Fc蛋白可显著提高肥胖小鼠的糖耐量，但是OXM-Fc蛋白没有OXM效果明显。

图8显示的是OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠口服葡萄糖后胰岛素释放的影响。OGTT试验后，取血清测胰岛素释放量，数据显示OXM-Fc蛋白不仅可以增强小鼠的糖耐量，还能降低胰岛素释放量。

Claims

1.一种重组人胃泌酸调节素融合蛋白，其特征在于，它由人免疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。

2.如权利1所述的重组人胃泌酸调节素融合蛋白，其特征在于所述人胃泌酸调节素通过一个连接肽与Fc片段连接构成融合蛋白，所述连接肽为(G₄S)_3-10。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于是SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。

4.一种编码权利要求1融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是选自下列核苷酸序列的一种：

1）SEQ ID NO:6的核苷酸序列；

2）与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；

5.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白Fc片段基因，

（2）连接人胃泌酸调节素和Fc基因；

（3）构建含上述（2）连接片段的重组表达载体；

（4）用上述（3）中得到的重组表达载体转化宿主细胞，

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：宿主细胞经细胞培养，离心后，上清液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：亲和层析中使用的是Protein A sepharose FF亲和层析柱；分子筛中使用的是superdex 200 Prep grade柱。

8.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物由作为活性成分的权利要求1的融合蛋白以及药学上可接受的载体组成。

9.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗肥胖症、糖尿病药物中的应用。