CN104854240A - 核苷酸序列及其方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中鉴别和分离山梨醇脱氢酶启动子的方法。另外，本公开内容还涉及在巴斯德毕赤酵母中受山梨醇脱氢酶启动子控制的异源蛋白的表达。

Description

核苷酸序列及其方法
技术领域
本发明描述了来自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的山梨醇脱氢酶启动子的鉴别和分离，以及在所述分离的启动子的影响下，巴斯德毕赤酵母中异源蛋白质的表达，具体地人白蛋白(HA)和刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)的表达。
背景技术
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是广泛使用并且公认的用于生产治疗性重组蛋白的工业宿主。治疗性重组蛋白的生产具有几个问题，如N末端(Prabha等人，2009)或C末端的剪切，所需糖型(glycoform)的引入(Wouter Vervecken等人，2004)。需要提高蛋白产率和质量以满足不断增长的市场需求以及对生物相似性不断增加的调控问题。这可以通过共表达分子侣伴蛋白(Wei Zhang等人，2006)、共表达蛋白酶以获得所需的最终产物来实现。在所有这些情况下，需要额外的启动子来进行遗传操作以改善重组蛋白的品质和数量。
美国专利No.6033898公开了分离自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)山梨醇脱氢酶基因的DNA部分，其用于提高异源多肽的产生。美国专利No.5139936公开了含有外源基因以及在适当位置上的酵母半乳糖苷酶(GAL1)调控区和启动子的克隆载体以提高外源基因的表达。美国专利No.5089398公开了使用来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子区域控制酵母中外源多肽的表达。
尽管对于毕赤酵母表达***有几种组成型或诱导型启动子可用，但是在大部分研究和应用中使用了AOX1。AOX1启动子是强诱导型启动子并且受碳源严格控制，当在存在除甲醇外的大部分其它碳源的情况下生长巴斯德毕赤酵母时，表达被高度抑制。甲醇是AOX1启动子的诱导剂(inducer)，由于其高可燃性和毒性，甲醇是危险物品，另外，依靠甲醇生长的细胞具有很高的氧消耗，其通常需要加入纯氧进行培养，因此提高了工艺成本并且限制了大规模培养能力(Monika Bollok等人，RecentPatents on biotechnology,3(2009)192-201)。
另外，从依靠甲醇生长的巴斯德毕赤酵母释放的宿主细胞蛋白质(HCP)很高，其主要在细胞溶解期间获得，但是当用葡萄糖作为碳源生长时，其程度要低得多。因此，细胞维持更高的存活力和更高纯度的分泌蛋白。
此外，酿酒酵母(S.cerevisiae)中鉴别的山梨醇脱氢酶启动子为750bp。由于较大的碱基对大小，它不易于进行遗传操作，因为它将导致载体大小的增加。本发明旨在克服上述问题。另外，在本领域中需要鉴别更多在巴斯德毕赤酵母中用于异源重组蛋白表达而不需要用于蛋白表达的任何特异性诱导的启动子。
发明内容
因此，本发明涉及SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；分离SEQ ID No.1的方法，所述方法包括以下行为(act)：a)从巴斯德毕赤酵母分离基因组DNA，b)扩增在分离的基因组DNA内包含SEQ ID No.1的区域，和c)对扩增产物进行常规凝胶洗脱程序(conventional gel elution procedure)以分离所述SEQ ID No.1；在包含非特异性诱导剂的培养基(media)中在SEQ ID No.1的调控(调节，regulation)下表达基因的方法，所述方法包括以下行为：a)在SEQ ID No.1下游的表达构建体(expression construct)中克隆所述基因，b)用所述表达构建体转化宿主，和c)在包含非特异性诱导剂的培养基中在所述SEQ ID No.1的调控下表达所述基因以产生异源蛋白；包含如上所述的核苷酸序列的载体；包含如上所述载体的转化的宿主细胞。
附图说明
图1显示了SDPHA/pMBL208的限制性酶切分析。所有消化产生了预期图谱。
图2显示了SDPHA/pMBL208的载体图。
图3显示了在G418抗生素上选择高重组蛋白产生菌(producer)的集落筛选。箭头所示的集落表示较高抗性的克隆。
图4显示了巴斯德毕赤酵母基因组中整合基因的PCR确认。发现所有所选的克隆具有所关注的基因。
图5显示当使用山梨糖醇作为唯一碳源生长时HA的表达分析。
图6显示当使用甲醇作为唯一碳源生长时HA的表达分析。
图7显示当使用葡萄糖作为唯一碳源生长时HA的表达分析。
图8显示没有任何诱导的不含细胞的上清液的表达分析(细胞在扩增培养基中生长)。
图9显示了ETI表达构建体的图片；A)在山梨醇脱氢酶启动子的控制下，在Xhol和E.coRI限制酶切位点中克隆ETI。B)上游无启动子的ETI。
图10显示当使用山梨糖醇作为唯一碳源生长时ETI的表达分析。
图11显示不同碳源下ETI产率的确定。
具体实施方式
本发明涉及SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述核苷酸序列是山梨醇脱氢酶启动子。
在本发明的另一个实施方式中，所述核苷酸序列鉴别并分离自巴斯德毕赤酵母。
本发明涉及SEQ ID No.1的分离方法，所述方法包括以下行为：a)从巴斯德毕赤酵母分离基因组DNA，b)扩增在分离的基因组DNA内包含SEQ ID No.1的区域，和c)对扩增产物进行常规凝胶洗脱程序以分离所述SEQ ID No.1。
在本发明的一个实施方式中，通过SEQ ID No.2所示的正向引物和SEQ ID No.3所示的反向引物进行SEQ ID No.1的扩增。
本发明涉及在包含非特异性诱导剂的培养基中在SEQ ID No.1的调控下表达基因的方法，所述方法包括以下行为：a)在SEQ ID No.1下游的表达构建体中克隆所述基因，b)用所述表达构建体转化宿主，和c)在包含非特异性诱导剂的培养基中在所述SEQ ID No.1的调控下表达所述基因以产生异源蛋白。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主是甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)，优选巴斯德毕赤酵母。
在本发明的另一个实施方式中，所述异源蛋白选自包括以下的组：人白蛋白和刺桐胰蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一个实施方式中，所述表达是通过非特异性诱导剂进行的。
在本发明的另一个实施方式中，所述非特异性诱导剂选自包括以下的组：山梨糖醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、蔗糖、淀粉、甲醇或它们的任意组合。
本发明涉及包含上述核苷酸序列的载体。
本发明涉及包含上述载体的转化的宿主细胞。
本发明涉及对山梨醇脱氢酶启动子的鉴别，其作为在巴斯德毕赤酵母中表达异源重组蛋白的潜在工具，而不需要任何特异性表达诱导。
在本发明的一个实施方式中，210bp启动子位于巴斯德毕赤酵母的染色体1(1号染色体)上。
在本发明的另一个实施方式中，山梨醇脱氢酶启动子是巴斯德毕赤酵母中的最小启动子。
在本发明的一个实施方式中，鉴别山梨醇脱氢酶基因上游可用的启动子区具有位于该区内的CAAT和GC盒(框，box)。
在本发明的另一个实施方式中，该启动子成功用于表达重组蛋白，如人白蛋白(HA)和刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)。在本发明的另一个实施方式中，在山梨醇脱氢酶启动子的控制下表达异源蛋白，如人白蛋白和刺桐胰蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一个实施方式中，山梨醇脱氢酶启动子使异源蛋白能够在任何类型的碳源下表达。
在本发明的另一个实施方式中，山梨醇脱氢酶启动子使得能够使用山梨糖醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、蔗糖、淀粉和甲醇作为碳源表达异源蛋白。
在本发明的另一个实施方式中，通过以下方法鉴别来自巴斯德毕赤酵母的山梨醇脱氢酶基因：a)对山梨醇脱氢酶直系同源基因(gene ortholog)进行NCBI blast，其导致产生了多个命中(hit)；b)在巴斯德毕赤酵母中，鉴别位于染色体1上的山梨醇脱氢酶基因；和c)分析所鉴别的山梨醇脱氢酶基因的上游序列。
在本发明的另一个实施方式中，在本发明的嵌合启动子的影响下，获得所关注的蛋白的目标基因的表达不受所使用的碳源的限制。换言之，通过使用本发明的嵌合启动子，可以通过使用任何碳源，如(但不限于)山梨糖醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、蔗糖来表达所关注的蛋白。然而，本领域技术人员将识别用于特定类型蛋白的更高表达的最有效的诱导剂，并因此将能够使用具有这种高效力或比其它诱导剂具有更高表达可能性的任何诱导剂。
在本发明的另一个实施方式中，根据描述，术语非特异诱导剂和碳源是可以互换使用的。
在本发明的另一个实施方式中，重组表达***选自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞或植物细胞。本领域技术人员可用的细菌和真核细胞得自一些不同的来源，包括商品化来源，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville,Md.)。用于重组蛋白质表达的细胞商业来源还提供了细胞的用法说明。表达体系的选择取决于所表达多肽所需的特征。
在本发明的另一个实施方式中，最优选的宿主细胞是甲基营养型酵母。可以使用本发明改变的甲基营养型酵母菌株包括(但不限于)能够在甲醇上生长的酵母菌株，如毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或球拟酵母属(Torulopsis)酵母。优选的甲基营养型酵母为毕赤氏酵母属(Pichia)的酵母。可以使用本发明方法改变的甲基营养型酵母菌株还包括已通过工程设计表达一种或多种所关注的异源蛋白质的那些甲基营养型酵母菌株。
在本发明的另一个实施方式中，术语“启动子”以本领域的一般含义使用，例如，RNA聚合酶结合位点。术语“载体”包括表达载体、可复制载体、转化载体和穿梭载体(shuttle vector)，包括它们的载体组合。
在本发明的另一个实施方式中，术语“表达载体”表示能够体内或体外表达的构建体(construct)。
在本发明的另一个实施方式中，优选地，将表达载体引入生物的基因组中。术语“引入”优选地包括稳定地引入(并入)到基因组中。
在本发明的另一个实施方式中，“表达多肽”表示编码多肽的DNA序列的表达。“多肽”是通过肽键共价连接的[α]-氨基酸的聚合物。多肽包括低分子量聚合物和高分子聚合物(更通常地称为蛋白质)。另外，多肽可以是磷酸多肽(phosphopolypeptide)、糖多肽(glycopolypeptide)或金属多肽(metallopoly-peptide)。另外，一个或多个聚合物链可以合并形成多肽。如本文所使用的，“异源多肽”是用于表达特定多肽的丝状真菌(filamentous fungus)通常不表达和分泌的多肽。异源多肽包括来源于原核来源(例如，来自芽孢杆菌属的[α]-淀粉酶、来自芽孢杆菌属的碱性蛋白酶和来自假单胞菌属的多种水解酶等)的多肽、来源于真核来源(例如，牛凝乳酶、人组织纤维蛋白溶酶原活化因子、人生长激素、人干扰素、尿激酶、人血清白蛋白、VIII因子等)的多肽和来源于除表达宿主外的真菌来源的多肽(例如，来自黑曲霉(A.niger)的葡糖淀粉酶)，并且异源多肽还包括含有来源于至少两个不同多肽(其相对于真菌表达宿主可以是同源的或异源的)的部分或完整多肽序列的组合的杂合肽。这些杂合多肽的实例包括：1)编码凝乳酶原的DNA序列，其融合至单独的或与不同量的氨基末端成熟的葡糖淀粉酶密码子结合的编码黑曲霉葡糖淀粉酶信号的DNA序列和前序列(pro sequence)，和2)编码真菌葡糖淀粉酶或任何真菌羧基蛋白酶、人组织纤维蛋白溶酶原活化因子或人生长激素的DNA序列，其融合至单独的或与不同量的氨基末端前肽密码子或与功能性信号有关的成熟密码子结合的编码功能性信号序列的DNA序列。
通过以下实施例，将进一步说明本发明。仅出于说明的目的提供了以下实施例，并且这些实施例不意欲限制本发明的范围。
实施例
实施例1：巴斯德毕赤酵母山梨醇脱氢酶启动子(SDP)的分离和克隆
鉴别了山梨醇脱氢酶基因的编码序列，其位于巴斯德毕赤酵母的1号染色体上。检验所鉴别基因的编码序列的5'区的上游区域。将所检验的基因鉴别为包含210bp的山梨醇脱氢酶的启动子区。使用常规基因分离技术分离了巴斯德毕赤酵母的基因组DNA。对所分离的基因进行聚合酶链反应以扩增所检验的210bp区。
用于扩增所检验的基因的引物为-
SORFP＝5'AGA TAT CAA GTT GTA TAT TAT TAA TGG CGG GGC A3'(EcoRV，位于5'端)
SORRP＝5'TCA TAT GTT GGA TAA TAG TGA GTG TAA TGA 3'(NdeI，位于5'端)。
以下色谱图显示了对分离自巴斯德毕赤酵母的山梨醇脱氢酶启动子所获得的测序结果。用括号标出了从区域37至246bp的启动子区。
针对适合的标志物，对扩增子进行琼脂糖凝胶电泳。使用Qiagen离心柱(旋转柱)，将凝胶上扩增的210bp区洗脱。凝胶纯化产物是聚合酶链反应下的A尾(A-tailed)。在16℃，将A尾PCR产物连接到TA载体(pTZ57R)，过夜。通过热冲击法(heat shock method)将连接产物转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α，在LBA100上铺板，并在37℃将板温育过夜。
实施例2：SDPHA/pMBL208的克隆和限制性分析
选择具有人白蛋白基因(HA)和AOXl启动子的质粒pMBL208。通过用EcoRV和NdeI限制酶消化，从rHA/pMBL His质粒上除去AOXl启动子。将相同的限制酶用于从pTZ57R释放山梨醇脱氢酶启动子(SDP)。将释放的SDP连接至除去AOXl的载体(图2)。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α并在LBA100上铺板，将板在37℃温育过夜，并通过集落PCR对转化的集落筛选正确的质粒。分离阳性克隆并接种到Luria肉汤(LB)中，并在37℃生长过夜以分离质粒，使用Qiagen mini prep离心柱从过夜生长培养物中分离质粒。使用下列限制酶-EcoRV和NdeI、EcoRV和EcoRI、EcoRI和NdeI和EcoRV，通过限制性消化确认分离的质粒(图1)。
实施例3：用SDPHA/pMBL208转化巴斯德毕赤酵母
用EcoRV使质粒SDPHA/pMBL208线性化并转化到巴斯德毕赤酵母中。将转化的细胞涂布在无任何氨基酸的酵母氮源(YNB，Yeast nitrogenbase)琼脂平板上进行选择。将平板在30℃温育2天直至出现集落。
实施例4：筛选较高遗传霉素(G418)抗性的集落。
一旦在YNB琼脂板上观察到集落生长，挑取集落并接种到96孔板中的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD，Yeast Extract Peptone Dextrose)中并在30℃温育过夜。将来自96孔板的培养物在含有0.5mg/ml G418的YPD琼脂板上压印(stamp)，并将板在30℃温育2天。2天后，选择对G418显示出较高抗性的集落并在YPD琼脂板上划线，如图3所示。箭头所示的集落表示较高抗性的克隆。
基于对G418的抗性，选择以下克隆：3G11、4F11、5F5、6F10、4B1、4F10、5A1、7A10。从这些所选的克隆中，通过苯酚-氯仿法分离基因组DNA。使用引物SORFP和HSAintRP，通过PCR确认载体SDPHA/pMBL208重组。这获得了约750bp的扩增(图4)。图4显示对于克隆3G11、4F11、5F5、6F10、4B1、4F10、5A1、7A10，对整合到巴斯德毕赤酵母基因组中的基因的PCR确认的凝胶，并且可以看出所有克隆在宿主基因组中具有正确的基因整合。
实施例5：SDPHA/巴斯德毕赤酵母中的表达研究
对4个所选的克隆(5F5、6F10、5A1和7A10)进行摇瓶诱导研究以发现山梨糖醇启动子是否能够产生人白蛋白(HA)。出现细胞团块，并使用3种碳源，如葡萄糖、甲醇和山梨糖醇进行诱导。使用SDS PAGE分析摇瓶诱导样品，其显示于图5、6、7和8中。图5表示当细胞在包含山梨糖醇作为碳源的培养基中生长时，人白蛋白的表达，其中泳道1是蛋白质分子标志物，泳道2是具有山梨醇脱氢酶启动子的巴斯德毕赤酵母，泳道3、4、5和6分别是克隆5F5、6F10、5A1和7A10中的HA。类似地，图6、7是当细胞在分别包含甲醇和葡萄糖的培养基中生长时，巴斯德毕赤酵母中HA蛋白质的表达。图8是克隆5F5、6F10、5A1和7A10的无细胞上清液的表达分析，其中细胞在无任何诱导的扩增培养基中生长。
结果和结论：
a)HA表达水平良好，并且发现对所有三种碳源；山梨糖醇、甲醇和葡萄糖的结果相似。在所有情况下，所获得的SDS PAGE条带强度等价于或大于2μg，认为这种条带强度是良好表达。
b)在细胞团块(cell mass)积累期间观察到表达。
c)还显示随着它的升高，表达水平以剂量依赖性方式增加，根据较高的G418抗性，在所选的克隆中，克隆5F5是最高的，7A10是最低的。
实施例6：刺桐胰蛋白酶抑制剂的表达
为了研究对于更多数目的异源蛋白质表达，山梨醇脱氢酶启动子的稳健性，选择刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)。ETI是～20KDa的小蛋白，并且它对瑞替普酶(Retaplase)的亲合纯化是有用的。用Xhol和EcoRI消化载体SDPHA/pMBL208以从所述载体中除去HA基因。将合成的ETI基因亚克隆(subclone)到pMBL208中来替代HA基因。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α并在LBA100上铺板，将板在37℃温育过夜，并通过集落PCR对转化的集落筛选正确的质粒。分离阳性克隆并接种到Luria肉汤(LB)中，并在37℃生长过夜以分离质粒。使用Qiagen mini prep离心柱从过夜生长培养物中分离质粒。通过使用以下限制酶-EcoRV/NdeI、EcoRV/EcoRI、EcoRI/NdeI和EcoRV的限制性消化确认分离的质粒。将ETI基因克隆到具有和不具有山梨醇脱氢酶启动子的pMBL208中(图9A和9B)。通过这样做，证实了ETI的产生是由于210bp的山梨醇启动子，不是因为任何上游启动子的活性。
实施例7：摇瓶表达研究
用EcoRV使质粒SDPETI/pMBL208线性化并转化到巴斯德毕赤酵母中。将转化的细胞涂布在无任何氨基酸的酵母氮源(YNB)琼脂平板上进行选择。将平板在30℃温育2天直至出现集落。一旦在YNB琼脂板上观察到集落生长，挑取集落并接种到96孔板中的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)中并在30℃温育过夜。将来自96孔板的培养物在含有0.5mg/ml G418的YPD琼脂板上压印(stamp)，并将板在30℃温育2天。2天后，选择对G418显示出较高抗性的集落并在YPD琼脂板上划线。
基于对G418的较高抗性所选择的克隆为克隆1、2、3和4，将这些克隆接种到含有培养基的摇瓶中，在12％SDS PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)上分析摇瓶中ETI的表达。图10和11中显示了不同碳源下所表达的ETI的产率，箭头显示了凝胶上表达的ETI。
结果和结论：
当在任何碳源，如山梨糖醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、蔗糖、乳酸、淀粉和甲醇上生长时，山梨醇脱氢酶启动子能够产生20kDa ETI。没有ETI上游的山梨糖醇启动子时，未发现表达。当使用甘油作为碳源时，发现所表达的蛋白的产率较高。当将乳酸用作碳源时，与其它糖类，如单糖、二糖和多糖相比，其也能够产生ETI。
下表1中显示了用于在山梨醇脱氢酶启动子的影响下产生异源蛋白质的比较表达状态。
整合到巴斯德毕赤酵母基因组中的构建体 诱导剂/碳源 表达状态
亲本巴斯德毕赤酵母宿主 甲醇 否
ETI/pMBL208(ETI CDS，无SDP) 甲醇 否
SDPETI/pMBL208(ETI CDS，SDP调控) 甲醇 是
SDPETI/pMBL208(ETI CDS，SDP调控) 葡萄糖 是
SDPETI/pMBL208(ETI CDS，SDP调控) 山梨糖醇 是
SDPETI/pMBL208(ETI CDS，SDP调控) 甘油 是
SDPHA/pMBL208(人白蛋白，SDP调控) 甲醇 是
SDPHA/pMBL208(人白蛋白，SDP调控) 葡萄糖 是
SDPHA/pMBL208(人白蛋白，SDP调控) 山梨糖醇 是
SDPHA/pMBL208(人白蛋白，SDP调控) 甘油 是

Claims (12)

1.SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1中所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是山梨醇脱氢酶启动子。
3.如权利要求1中所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列鉴别和分离自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。
4.一种分离SEQ ID No.1的方法，其中所述方法包括以下行为：
a)从巴斯德毕赤酵母中分离基因组DNA；
b)在分离的所述基因组DNA内扩增包含SEQ ID No.1的区域；和
c)对扩增产物进行常规凝胶洗脱程序以分离所述SEQ ID No.1。
5.如权利要求4中所述的方法，其中SEQ ID No.1的扩增是通过SEQID No.2所示的正向引物和SEQ ID No.3所示的反向引物进行的。
6.一种在包含非特异性诱导剂的培养基中在SEQ ID No.1的调控下表达基因的方法，其中所述方法包括以下行为：
a)在SEQ ID No.1下游的表达构建体中克隆所述基因；
b)用所述表达构建体转化宿主；和
c)在包含非特异性诱导剂的培养基中在所述SEQ ID No.1的调控下表达所述基因以用于生产异源蛋白。
7.如权利要求6中所述的方法，其中所述宿主是甲基营养型酵母，优选巴斯德毕赤酵母。
8.如权利要求6中所述的方法，其中所述异源蛋白选自包括人白蛋白和刺桐胰蛋白酶抑制剂的组。
9.如权利要求6中所述的方法，其中通过非特异性诱导剂进行所述表达。
10.如权利要求6中所述的方法，其中所述非特异性诱导剂选自包括山梨糖醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、蔗糖、淀粉、甲醇或它们的任意组合的组。
11.包含如权利要求1中所述的核苷酸序列的载体。
12.包含如权利要求11中所述的载体的转化的宿主细胞。
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