CN112011469B

CN112011469B - 一种产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112011469B
Application number: CN202010866728.8A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 黄雪年; 耿策; 唐慎; 靳志刚; 曹海峰; 郭强; 李继彬
Original assignee: Shandong Lukang Shelile Pharmaceutical Co ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Shandong Lukang Shelile Pharmaceutical Co ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN112011469A

Abstract

一种产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高生物法合成反式乌头酸的产量，本发明提供了一种产反式乌头酸的重组土曲霉菌株，是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌株，在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶Adi1而获得的。所述乌头酸异构酶Adi1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明在敲除CadA的基础上过表达Adi1推动了顺乌头酸转化为反式乌头酸，从而获得更高的反式乌头酸产量，可用于反式乌头酸的生产。

Description

一种产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用。

背景技术

反式乌头酸(trans-Aconitic acid,CAS:4023-65-8)是一种不饱和三羧酸。因其含有不饱和双键和丰富的羟基，因此可以作为制备聚合材料的单体化合物，也可以作为其他化合物的合成前体，如三甲基反式乌头酸等。另外，反式乌头酸作为三羧酸循环关键中间体顺乌头酸(cis-Aconitic acid,CAS:585-84-2)的立体异构体，对三羧酸循环中的关键酶乌头酸酶具有一定的抑制作用，可以干扰三羧酸循环，从而影响生命活动，展现出一定的生物活性。多项研究表明反式乌头酸在线虫防治等方面具有较好的效果，因此在生物农药开发方面具有很好的潜力。

目前，反式乌头酸主要是通过化学合成的方法生产，其生产工艺复杂，副产物多，成本高，而且没有形成规模化生产，这将不利于反式乌头酸的下游应用和产品的开发。为了开发更加绿色、高效的反式乌头酸生产工艺，研究人员通过在土曲霉中阻断催化顺乌头酸脱羧生成衣康酸的顺乌头酸脱羧酶基因(cadA)，获得了一株能生产乌头酸的土曲霉工程菌株At-ΔcadA(图1中A)。根据生物合成途径及发酵结果分析，推测敲除cadA积累的直接产物是顺乌头酸，然而顺乌头酸作为三羧酸循环的中间体会很快被转化成异柠檬酸并进一步代谢。

发明内容

为了解决反式乌头酸现有合成工艺存在的问题及提高反式乌头酸的产量，本发明提供了一种高产反式乌头酸的重组土曲霉菌株，所述重组土曲霉以土曲霉（Aspergillus terreus）为出发菌株，是在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶Adi1而获得的。

在本发明的一个实施例中，所述出发菌株为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

本发明中所述CadA是指土曲霉中的顺乌头酸脱羧酶，本发明中不对该基因的序列做强制性的限定；在优选的实施方式中，所述cadA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；在其他的实施方式中，所述cadA还包括与所示序列具有高度同源性的氨基酸序列，优选的，所述高度同源性包括与目的序列的同源性至少99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%或60%的序列（即同源性60%以上）。

在本发明的一个实施例中，所述乌头酸异构酶Adi1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一个实施例中，编码所述乌头酸异构酶Adi1的基因核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

本发明还提供了上述的重组土曲霉的构建方法，是以所述土曲霉为出发菌株，敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因并将所述乌头酸异构酶Adi1的表达元件导入所述出发菌株中，构建重组土曲霉菌株。

在本发明的一个实施例中，所述乌头酸异构酶Adi1的表达元件使用的启动子为PcadA启动子或PgpdAt启动子。

本发明还提供了上述重组土曲霉在生产反式乌头酸中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述应用是指将所述重组土曲霉经发酵培养后生产反式乌头酸，所述发酵条件为37 ℃，220 rpm发酵72 h-168 h。

在本发明的一个实施例中，所述发酵所用的培养基配方为：100 g L^-1葡萄糖，2 gL^-1 NH₄NO₃，0.2 g L^-1（NH₄）₂HPO₄，20 mg L^-1 FeSO₄，0.4 g L^-1 MgSO₄，40 mg L^-1 ZnSO₄，40mg L^-1 CuSO₄，余量为水。

进一步地限定，所述DNA修复相关蛋白ku80 Genbank登录号为EAU32303.1，所述顺乌头酸脱羧酶cadA Genbank登录号为MK026070.1。

本发明的一个实施方式中，对cadA进行的阻断为将cadA基因进行完全敲除，所述工程菌株的基因组中不再保留cadA基因的任何片段。

在一个实施例中，以敲除了cadA的土曲霉At-∆cadA为出发菌株，用PgpdAt启动子定点表达adi1，获得整合了adi1表达元件的纯种转化子，记为At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1；在另一个实施例中，进行了敲除cadA过表达adi1基因打靶元件的构建及异源表达adi1土曲霉工程菌株的构建，获得整合了adi1表达元件的纯种转化子，记为At-∆cadA::adi1。

本发明提供的利用所述基因工程菌株生产反式乌头酸的方法，包括将所述菌株接种至培养基中进行发酵的步骤。发酵液经处理后通过高效液相色谱分析方法比较两个纯种转化子株及对照组的反式乌头酸产量、反式乌头酸与顺式乌头酸产量比例及经不同时间反式乌头酸与顺乌头酸的比例变化。

有益效果

如图1中B所示，在玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）中有一种乌头酸异构酶Adi1，可以催化顺乌头酸异构化生成反式乌头酸（Geiser E. et al., Ustilago maydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans-aconitate,Microbial Biotechnology, 2016, 9(1): 116–126）。本发明以不表达顺乌头酸脱羧酶的土曲霉（Aspergillus terreus）为出发菌株，通过在不同基因组位点、使用不同启动子在土曲霉中异源表达adi1基因的方式，获得了更高效的产反式乌头酸土曲霉工程菌株（图1中A），规避了反式乌头酸化学合成的缺陷，开发出了更加高效的通过微生物发酵生产反式乌头酸的绿色工艺。

经实验证明，本发明的基因工程菌株At-∆cadA::adi1 和At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1相对于对照菌株At-∆cadA来说，具有更高的反式乌头酸的产量和更低的顺乌头酸产量，并且菌株At-∆cadA::adi1的反式乌头酸产量高于菌株At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1。此外，本发明的基因工程菌株在发酵中期72h可以实现顺式乌头酸到反式乌头酸的转化，而对照菌株At-∆cadA实现顺式乌头酸到反式乌头酸相同比例的转化需要在168 h。因此adi1基因在PcadA启动子或PgpdAt启动子的驱动下引入均在一定程度上缩短了反式乌头酸的发酵时间。

附图说明

图1.A为高产反式乌头酸土曲霉工程菌株构建示意图，B为乌头酸异构酶Adi1的作用示意图；

图2.表达乌头酸异构酶Adi1土曲霉重组菌株的构建策略示意图，A为以PgpdAt作为adi1异源表达启动子整合在ku80位点；B为敲除cadA的同时利用PcadA启动子驱动adi1的异源表达；

图3.构建的At-ΔcadA-ku80::PgpdAt-adi1工程菌株的基因组PCR验证结果，A为用引物U-ku80-F/adi-R(TtrpC)进行PCR验证的结果，WT为出发菌株At-ΔcadA；B为用引物adi-F/D-ku80-R验证的结果，WT为出发菌株At-Δku80-ΔpyrG；

图4.构建的At-ΔcadA::adi1工程菌株的基因组PCR验证结果；

图5.菌株发酵产有机酸的HPLC分析图，CA71-1:(At-ΔcadA::adi1菌株的7号转化子3个平行实验中的第1瓶)；GA11-2：(At-ΔcadA-ku80::PgpdAt-adi1菌株的1号转化子3个平行实验中的第2瓶)；Δcad-1：(At-ΔcadA菌株3个平行实验中的第1瓶)；

图6.为工程菌株摇瓶发酵产反式乌头酸情况分析结果，A为顺式及反式乌头酸在72h的产量，左侧是反式乌头酸，右侧是顺乌头酸，B为不同转化子发酵中反式乌头酸与顺乌头酸的比例在72h(左)、112h(中)和168h(右)的变化。At-ΔcadA-ku80::PgpdAt-adi1工程菌的三个转化子：GA11、GA31和GA51，At-ΔcadA::adi1工程菌的三个转化子：CA21、CA71和CA101，出发菌株At-ΔcadA工程菌株的一个转化子：Δcad；A图中Error bar代表的三个平行实验的SEM，B图中柱高为三个平行实验中乌头酸与顺乌头酸比例的平均值。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册（New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989）所记载，或按照厂商的建议条件。

按以下培养基配方配制培养基备用：

再生筛选培养基平板PDA-SH：3.9 g L^-1马铃薯右旋糖琼脂培养基（Difco^TMPotatoDextrose Agar, BD, LOT:1165825），和1.2 M山梨醇，灭菌后冷却至约55 °C时加入潮霉素B（Solarbio，Catalog No.：M419099）至终浓度为100 μg/mL，制备平板。

PDAS：3.9 g L^-1马铃薯右旋糖琼脂培养基（Difco^TMPotato Dextrose Agar, BD,LOT:1165825）和1.2 M山梨醇，灭菌后制备平板。

PDBS：2.4 g L^-1马铃薯右旋糖培养基（Difco^TMPotato Dextrose Broth, BD,LOT:9239568）、1.2 M山梨醇和0.5%琼脂糖，灭菌后制成顶层琼脂。

土曲霉产孢培养基：10 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1 NaNO₃，0.2 g L^-1 KH₂PO₄，5 g L^-1MgSO₄，0.02 g L^-1 FeSO₄，0.5 g L^-1 NaCl，0.04 g L^-1 ZnSO₄，0.04 g L^-1 CuSO₄，0.5%麸皮，1.5%琼脂粉，115 ℃灭菌25 min，制备平板。

有机酸发酵培养基IPM：100 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1 NH₄NO₃，0.2 g L^-1（NH₄）₂HPO₄，20mg L^-1 FeSO₄，0.4 g L^-1 MgSO₄，40 mg L^-1 ZnSO₄，40 mg L^-1 CuSO₄，用硫酸调整pH至3.5，115 ℃灭菌30 min。

土曲霉产孢斜面培养基：10 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1NaNO₃，0.2 g L^-1, KH₂PO₄，20mg L^-1FeSO₄，5 g L^-1 MgSO₄，0.5 g L^-1NaCl，40mg L^-1ZnSO₄，40 mg L^-1CuSO₄，0.5% 麸皮，1.5%琼脂，115 ℃灭菌15min，然后分装至试管，再115 ℃灭菌25 min，制备斜面。

本发明所用的土曲霉（Aspergillus terreus），从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得，保藏号为CICC 40205。

土曲霉工程菌株At-∆cadA（记载在：吕雪峰等，一种乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用，CN 201910649851.1 ，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。）

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini KitI试剂盒（D6943-02），DNA片段回收采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒（D6492-02），凝胶回收采用OMEGA公司GelExtraction Kit试剂盒（D2500-01）。

质粒pSGF957（由Seoul National university得到，质粒记载在 Kim,J.G.,Choi,Y.D., Chang,Y.J., Kim,S.U., Genetic transformation of Monascus purpureusDSM1379, Biotechnology Letters, 2003, 25, 1509-1514）。

质粒pXH-106（记载在：吕雪峰等，一种乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用，CN 201910649851.1 ，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得）。

质粒pXH2-1（记载在：Huang X et al. Cloning, characterization andapplication of a native glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter forAspergillus terreus. J Ind Microbiol Biotechnol 2014, 41:585–592. 公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得）

本发明中使用的DNA Marker从北京全式金生物购买，产品名称为：1Kb DNALadder，产品目录号为：BM201-01。

在实施例1和实施例2中所述重组土曲霉以土曲霉（Aspergillus terreus）为出发菌株，是在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶Adi1而获得的。出发菌株为目前已知常用的土曲霉，如土曲霉CICC40205、土曲霉NRRL1960、土曲霉DSM23081、土曲霉TN484 、土曲霉TN484-M1或其他能够生产衣康酸的基因工程菌或者野生菌株等均可，本实施例中使用的出发菌株为土曲霉CICC40205。

实施例1、用PgpdAt启动子定点表达adi1

1）表达adi1基因打靶元件的构建

ku80位点：该位点为DNA修复相关蛋白，Genbank登录号EAU32303.1

SEQ ID NO.2是玉蜀黍黑粉菌的乌头酸异构酶Adi1的氨基酸序列，按照土曲霉密码子偏好性优化并合成Adi1的编码核苷酸片段如SEQ ID NO.3。

根据基因序列信息设计并合成如下引物：

U-ku80-F: 5’- cgcgggtttctagaagtcacatcagc -3’；

U-ku80-R(PgpdAt): 5’- gtacctggatcctcccagagtgtaaggtggatctggagcagagg -3’；

PgpdAt-F743: 5’- ttacactctgggaggatccaggta -3’；

PgpdAt-R(adi1) : 5’- gtgtcgatggggtgcagcattgtgatgattgatgagttg -3’；

adi1-F : 5’- atgctgcaccccatcgacac -3’；

adi1-R(TtrpC) : 5’- cagtaacgttaagtggatccttaggacaggctacggtcgctag -3’；

TtrpC-F : 5’- ggatccacttaacgttactg -3’；

hph-R(-TtrpC) : 5’- cggtcggcatctactctattcc -3’；

D-ku80-F(hph-TtrpC) : 5’- ggaatagagtagatgccgaccgtagcccggagttaggtagatag -3’；

D-ku80-R : 5’- catcaccgaccctacgctgt -3’；

C-ku80-F : 5’- ggtggtttctctctatcatgg -3’；

C-ku80-R : 5’- gcgaaggcgaaaagtagtctc -3’；

以土曲霉At-∆cadA基因组DNA为模板，采用pfu DNA聚合酶（全式金, 产品目录号: AS231-01）进行PCR扩增，用引物U-ku80-F/U-ku80-R(PgpdAt)可以扩增获得大小约为1.0 kb的ku80基因的上游同源臂U-ku80，用引物D-ku80-F(hph-TtrpC)/D-ku80-R可以扩增获得大小为1.0 kb的ku80基因下游同源臂D-ku80。

以质粒pXH2-1为模板，用引物PgpdAt-F743/PgpdAt-R(adi1)进行PCR扩增得到土曲霉组成型启动子PgpdAt，即PgpdAt片段。

同样以质粒pXH2-1为模板，用引物TtrpC-F/hph-R(-TtrpC)进行终止子TtrpC和潮霉素抗性基因hph的PCR扩增，得到TtrpC-hph片段。

Adi1片段的获得则是以合成adi1基因所在质粒为模板，用引物adi1-F/adi1-R(TtrpC)PCR扩增得到。

将所有PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-ku80片段、PgpdAt片段、Adi1片段、TtrpC-hph片段和D-ku80片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C-ku80-F/C-ku80-R作为引物扩增获得大小约为7.0 kb的基因打靶元件ku80::PgpdAt-adi1-hph片段，可用于ku80位点用PgpdAt启动子定点表达Adi1的工作。

2）ku80位点异源表达adi1土曲霉工程菌株的构建

土曲霉At-∆cadA是通过敲除cadA基因得到的产乌头酸工程菌株。将工程菌株At-∆cadA的孢子接种至50 mL IPM液体培养基中，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200 rpm、32℃培养12-18 h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6 M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50 mL三角瓶中，根据菌丝重量加入适量酶解液（每1 g菌丝加入10 mL酶解液），在30 ℃、60 rpm处理1-3 h。将上述酶解后的混合液用300目尼龙布或擦镜纸过滤，收集滤液。在4 ℃、4000 rpm离心收集原生质体，用预冷1.0 M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC（STC组成：1.0 M山梨醇，50 mM Tris-HCl（pH 8.0），50 mM CaCl₂）洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。向150 μL该原生质体悬液中加入10 μL打靶元件ku80::PgpdAt-adi1-hph的DNA片段（约2 μg）。再加入50 μL冰浴的PSTC（PSTC组成：40％ PEG4000，1.2 M山梨醇，50 mM Tris-HCl（pH8.0），50 mM CaCl₂），轻轻混匀，冰浴30 min。加入1 mL常温的PSTC，混匀后室温放置20 min。然后与30 mL的PDBS顶层琼脂混合后倾注于10块PDA-SH平板上进行再生筛选培养，在30 ℃黑暗条件下培养5-7天。

从转化筛选平板上挑取生长状况良好的转化子转接至PDAH（添加了100 mg/L潮霉素B的PDA平板）平板上，在30 ℃培养5天进行传代纯化。将稳定传代转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200 rpm培养48 h，收集菌丝提取基因组DNA，用引物U-ku80-F/adi-R(TtrpC)和adi-F/D-ku80-R这两对引物进行PCR验证，同时用At-∆cadA菌株的基因组作为对照。阳性转化子能扩增出大小分别约为3.0 kb和5.5 kb的条带，对照不能扩增出条带。选取5个阳性转化子进行单孢分离纯化，每个转化子验证3个单孢，并再次用引物U-ku80-F/adi-R(TtrpC)和adi-F/D-ku80-R进行基因组PCR验证，如图3所示，获得ku80位点整合了adi1表达元件的纯种转化子，即用于高产反式乌头酸的基因工程菌株，记为At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1。

实施例2、在cadA位点用PcadA启动子定点表达Adi1

1）敲除cadA过表达adi1基因打靶元件的构建

根据土曲霉基因组信息和SEQ ID NO.3基因序列信息设计并合成如下引物：

U-cadA-F: 5’- gcgataaatgttgaacgaggc-3’；

U-cadA-R(adi1) : 5’- gtgtcgatggggtgcagcattggtcaatttaataggacaattttc-3’；

adi1-F: 5’- atgctgcaccccatcgacac-3’；

adi1-R(TtrpC) : 5’- cagtaacgttaagtggatccttaggacaggctacggtcgctag-3’；

TtrpC-F: 5’- ggatccacttaacgttactg-3’；

TtrpC-R: 5’- aagaaggttacctctaaacaag-3’；

pyrG/loxp-F(TtrpC) : 5’- cttgtttagaggtaaccttctttaagggagatggtgattgaactag-3’；

pyrGAn-R(PgpdAtF743) : 5’- gcatcaaatcgtcgtaccgca-3’；

D-cadA-F(pyrGAn) : 5’- tgcggtacgacgatttgatgctaaatgggaagcgatatggaaac-3’；

D-cadA-R: 5’- cattgcagggaagtatatgcttc-3’；

C-cadA-F: 5’- tgtggttcctaccaaggtggc-3’；

C-cadA-R: 5’-cgactatagctggattgatcac-3’；

以土曲霉At-∆ku80（土曲霉At-∆ku80是针对土曲霉CICC40205进行ku80基因敲除的工程菌株）（吕雪峰等，一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5）基因组DNA为模板，采用pfu DNA聚合酶（Fermentas, 产品目录号:EP0501）进行PCR扩增，用引物U-cadA-F/U-cadA-R(adi1)可以扩增获得大小约为1.2 kb的cadA基因的上游同源臂U-cadA，用引物D-cadA-F(pyrGAn)/D-cadA-R可以扩增获得大小为1.3 kb的cadA基因下游同源臂D-cadA。

以质粒pXH2-1为模板，用引物TtrpC-F/TtrpC-R进行终止子TtrpC的PCR扩增，得到TtrpC片段。

以质粒pXH-106为模板，用引物pyrG/loxp-F(TtrpC)/pyrGAn-R(PgpdAtF743)进行PCR扩增黑曲霉pyrG _An基因表达元件作为筛选标记，即pyrG_An片段。

Adi1片段的获得是以合成adi1基因所在质粒为模板，用引物adi1-F/adi1-R(TtrpC)。

将所有PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-cadA片段、adi1片段、TtrpC片段、pyrG_An片段和D-cadA片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C-cadA-F/C-cadA-R作为引物扩增获得大小约为5.7 kb的∆cadA::adi1基因打靶元件，可用于在cadA位点用PcadA启动子定点表达Adi1工作。

2）cadA位点异源表达adi1土曲霉工程菌株的构建

At-∆ku80-∆pyrG是在At-∆ku80菌株基础上敲除了pyrG基因之后得到的尿嘧啶营养缺陷型工程菌株（吕雪峰等，一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5）。将工程菌株At-∆ku80-∆pyrG的孢子接种至50 mL IPM-FU（添加了1 g L^-15-氟乳清酸和10 mM尿嘧啶核苷的IPM）液体培养基中，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200 rpm、32 ℃培养12-18 h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6 M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50 mL三角瓶中，根据菌丝重量加入适量酶解液（每1 g菌丝加入10 mL酶解液），在30 ℃、60 rpm处理1-3 h。将上述酶解后的混合液用300目尼龙布或擦镜纸过滤，收集滤液。在4℃、4000 rpm离心收集原生质体，用预冷1.0M 山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC（STC组成：1.0 M 山梨醇，50 mM Tris-HCl（pH8.0），50 mM CaCl₂）洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。向150 μL该原生质体悬液中加入10 μL打靶元件∆cadA::adi1的DNA片段（约2 μg）。再加入50 μL冰浴的PSTC（PSTC 组成：40％PEG4000，1.2M山梨醇，50 mM Tris-HCl（pH8.0），50 mM CaCl₂），轻轻混匀，冰浴30 min。加入1 mL常温的PSTC，混匀后室温放置20 min。然后与30 mL的PDBS顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS平板上进行再生筛选培养，在30 ℃黑暗条件下培养5-7天。

从转化筛选平板上挑取生长状况良好的转化子转接至PDA平板上，在30 ℃培养5天进行传代纯化。将稳定传代转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30 ℃、200 rpm培养48 h，收集菌丝提取基因组DNA，用引物U-cadA-F/D-cadA-R进行PCR验证，同时用At-∆ku80-∆pyrG菌株的基因组作为对照。阳性转化子能扩增出大小约为6.0 kb的条带，对照能扩增大小约为4.5 kb的条带。选取5个阳性转化子进行单孢分离纯化，每个转化子验证3个单孢，并再次用引物U-cadA-F/D-cadA-R进行基因组PCR验证，如图4所示，获得cadA位点整合了adi1表达元件的纯种转化子，即用于高产反式乌头酸的基因工程菌株，记为At-∆cadA::adi1。

实施例3、异源表达adi1土曲霉工程菌株的发酵产乌头酸的摇瓶分析

分别选取3个At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1（实施例1）和At-∆cadA::adi1（实施例2）的阳性转化子株，同时以At-∆cadA作为对照菌株，分别接种至土曲霉产孢斜面培养基，32 ℃培养7天获得成熟的孢子。再分别将一支斜面上的孢子接种至一瓶IPM中（500 mL三角瓶中装有55 mL培养基），接种量约为终浓度2x10⁵个孢子/mL，每个转化子设置3个摇瓶作为平行，37 ℃，220 rpm发酵70-170 h。

取上清液经0.45 μm滤器过滤后进行适当稀释，用高效液相色谱分析方法（HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC）检测有机酸含量。色谱柱:Bio-rad AminexHPX-87H, 300 mm x 7.8 mm；流动相：5 mM硫酸；流速：0.5 mL/min；柱温：55 ℃；检查温度：35 ℃；紫外检测器（210 nm）。结果如图5和图6所示，菌株At-∆cadA、At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1和At-∆cadA::adi1的顺/反式乌头酸的HPLC色谱图和发酵产量统计比较分析显示在摇瓶发酵中期72 h：At-∆cadA::adi1转化子CA71（15.34g/L）的反式乌头酸产量和峰图远高于At-∆cadA-ku80::PgpdAt-adi1的转化子GA11（9.46g/L）和出发菌株At-∆cadA转化子∆cad（5.52g/L），而顺式乌头酸的产量CA71（1.48g/L） GA11（2.53g/L）和峰图却低于出发菌株At-∆cadA转化子∆cad（4.12g/L），其中, At-∆cadA::adi1的转化子CA71反式乌头酸产量最优，比较反式乌头酸/顺式乌头酸产量比例可以明显的发现在72 h发酵中期At-∆cadA::adi1转化子CA101（9:1）、CA71（10:1）及CA21（10:1）At-∆pgpdAt::adi1转化子GA11（7:2）、GA31（4:1）及GA51（2:1）都远大于出发菌株At-∆cadA转化子∆cad（4:3），并且如图6中A所示，比较转化子在发酵72 h，112 h及168 h三个时间点的反式乌头酸/顺式乌头酸产量比例可以明显的发现，转化子CA71在发酵72 h时的反式乌头酸/顺式乌头酸产量比例最高。综合以上反式乌头酸产量和反式乌头酸/顺式乌头酸产量比例结果证明引入异构酶Adi1可以实现在发酵中期72 h顺式乌头酸到反式乌头酸的转化，其中PcadA启动子引导的Adi1异构酶最优，在比例提高的同时实现了产量提高，PgpdAt启动子引导的Adi1异构酶次之，通过我们选择最优的启动子PcadA启动子引入Adi1异构酶可以提高反式乌头酸的产量及缩短发酵时间。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

本发明涉及的基因及氨基酸序列：

SEQ ID NO.1顺乌头酸脱羧酶CadA

MTKQSADSNAKSGVTSEICHWASNLATDDIPSDVLERAKYLILDGIACAWVGARVPWSEKYVQATMSFEPPGACRVIGYGQKLGPVAAAMTNSAFIQATELDDYHSEAPLHSASIVLPAVFAASEVLAEQGKTISGIDVILAAIVGFESGPRIGKAIYGSDLLNNGWHCGAVYGAPAGALATGKLLGLTPDSMEDALGIACTQACGLMSAQYGGMVKRVQHGFAARNGLLGGLLAHGGYEAMKGVLERSYGGFLKMFTKGNGREPPYKEEEVVAGLGSFWHTFTIRIKLYACCGLVHGPVEAIENLQGRYPELLNRANLSNIRHVHVQLSTASNSHCGWIPEERPISSIAGQMSVAYILAVQLVDQQCLLSQFSEFDDNLERPEVWDLARKVTSSQSEEFDQDGNCLSAGRVRIEFNDGSSITESVEKPLGVKEPMPNERILHKYRTLAGSVTDESRVKEIEDLVLGLDRLTDISPLLELLNCPVKSPLV

SEQ ID NO.2

序列特征：

长度：443aa

分子类型：氨基酸序列

最初来源：玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）

特异性名称：乌头酸异构酶Adi1

MLHPIDTTIYRAGTSRGLYFLASDLPAEPSERDAALISIMGSGHPLQIDGMGGGNSLTSKVAIVSASTQRSEFDVDYLFCQVGITERFVDTAPNCGNLMSGVAAFAIERGLVQPHPSDTTCLVRIFNLNSRQASELVIPVYNGRVHYDDIDDMHMQRPSARVGLRFLDTVGSCTGKLLPTGNASDWIDGLKVSIIDSAVPVVFIRQHDVGITGSEAPATLNANTALLDRLERVRLEAGRRMGLGDVSGSVVPKLSLIGPGTETTTFTARYFTPKACHNAHAVTGAICTAGAAYIDGSVVCEILSSRASACSASQRRISIEHPSGVLEVGLVPPENAAQSLVDVAVVERSIALIAHARVYYTTPDRRRSYDSPLTSPSTPADTHNLFDAAYRPVIQPSDTDVEAPHMLALENKEQCVSRCDTALHHIVASYGASDAHASDRSLS

SEQ ID NO.3

序列特征：

长度：1332bp

分子类型：DNA序列

最初来源：玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）

特异性名称：乌头酸异构酶adi1基因

ATGCTGCACCCCATCGACACCACCATCTACCGCGCCGGCACCAGCCGCGGTCTGTACTTCCTGGCCTCCGACCTGCCCGCCGAGCCTTCTGAGCGCGACGCTGCTCTGATCTCCATCATGGGCTCCGGCCACCCCCTGCAAATCGACGGCATGGGCGGCGGCAACTCCCTGACCTCCAAGGTCGCCATCGTCTCCGCCTCCACCCAGCGCAGCGAGTTCGACGTCGACTACCTGTTCTGCCAGGTCGGCATCACCGAGCGCTTCGTCGACACCGCCCCCAACTGCGGCAACCTGATGTCCGGCGTCGCCGCCTTCGCCATCGAGCGTGGTCTGGTCCAGCCCCACCCCTCCGACACCACCTGCCTGGTCCGCATCTTCAACCTGAACTCCCGCCAGGCCTCCGAGCTGGTCATCCCCGTCTACAACGGCCGCGTCCACTACGACGACATCGACGACATGCACATGCAGCGCCCCAGCGCCCGCGTCGGTTTGCGTTTCCTGGACACCGTCGGCAGCTGCACCGGCAAGCTGCTGCCCACCGGCAACGCCAGCGACTGGATCGACGGCCTGAAGGTCAGCATCATCGACTCCGCCGTCCCCGTCGTCTTCATCCGCCAGCACGACGTCGGCATCACGGGCAGCGAGGCCCCTGCTACCCTGAACGCCAACACCGCCCTGCTGGACCGCCTGGAGCGCGTTCGTCTGGAGGCCGGTCGCCGTATGGGCCTGGGTGACGTCTCCGGCAGCGTCGTCCCCAAGCTGAGCCTGATCGGCCCCGGCACCGAGACCACCACCTTCACCGCCCGCTACTTCACCCCCAAGGCCTGCCACAACGCCCACGCCGTCACCGGTGCCATCTGCACCGCCGGTGCCGCTTACATCGACGGCAGCGTCGTGTGCGAGATCCTGTCCAGCCGCGCCTCCGCCTGCTCCGCTTCTCAGCGTCGCATCAGCATCGAGCACCCCAGCGGCGTCCTGGAGGTCGGTCTGGTCCCCCCTGAGAACGCCGCCCAGTCCCTGGTCGACGTCGCCGTTGTCGAGCGCAGCATCGCCCTGATCGCCCACGCCCGTGTCTACTACACCACCCCCGACCGCCGCCGCTCCTACGATAGCCCTCTGACCTCCCCCTCCACCCCCGCTGACACCCACAACCTGTTCGACGCCGCCTACCGCCCCGTCATCCAGCCTAGCGACACCGACGTCGAGGCCCCCCACATGCTGGCCCTGGAGAACAAGGAGCAGTGCGTCTCCCGCTGCGACACCGCCCTGCACCACATCGTCGCCTCCTACGGCGCCAGCGACGCCCATGCTAGCGACCGTAGCCTGTCCTAA

SEQ ID NO.4编码顺乌头酸脱羧酶CadA的基因

ATGACCAAACAATCTGCGGACAGCAACGCAAAGTCAGGAGTTACGTCCGAAATATGTCATTGGGCATCCAACCTGGCCACTGACGACATCCCTTCGGACGTATTAGAAAGAGCAAAATACCTTATTCTCGACGGTATTGCATGTGCCTGGGTTGGTGCAAGAGTGCCTTGGTCAGAGAAGTATGTTCAGGCAACGATGAGCTTTGAGCCGCCGGGGGCCTGCAGGGTGATTGGATATGGACAGGTAAATTTTATTCACTCTAGACGGTCCACAAAGTATACTGACGATCCTTCGTATAGAAACTGGGGCCTGTTGCAGCAGCCATGACCAATTCCGCTTTCATACAGGCTACGGAGCTTGACGACTACCACAGCGAAGCCCCCCTACACTCTGCAAGCATTGTCCTTCCTGCGGTCTTTGCAGCAAGTGAGGTCTTAGCCGAGCAGGGCAAAACAATTTCCGGTATAGATGTTATTCTAGCCGCCATTGTGGGGTTTGAATCTGGCCCACGGATCGGCAAAGCAATCTACGGATCGGACCTCTTGAACAACGGCTGGCATTGTGGAGCTGTGTATGGCGCTCCAGCCGGTGCGCTGGCCACAGGAAAGCTCCTCGGTCTAACTCCAGACTCCATGGAAGATGCTCTCGGAATTGCGTGCACGCAAGCCTGTGGTTTAATGTCGGCGCAATACGGAGGCATGGTAAAGCGTGTGCAACACGGATTCGCAGCGCGTAATGGTCTTCTTGGGGGACTGTTGGCCCATGGTGGGTACGAGGCAATGAAAGGTGTCCTGGAGAGATCTTACGGCGGTTTCCTCAAGATGTTCACCAAGGGCAACGGCAGAGAGCCTCCCTACAAAGAGGAGGAAGTGGTGGCTGGTCTCGGTTCATTCTGGCATACCTTTACTATTCGCATCAAGCTCTATGCCTGCTGCGGACTTGTCCATGGTCCAGTCGAGGCTATCGAAAACCTTCAGGGGAGATACCCCGAGCTCTTGAATAGAGCCAACCTCAGCAACATTCGCCATGTTCATGTACAGCTTTCAACGGCCTCGAACAGTCACTGTGGATGGATACCAGAGGAGAGACCCATCAGTTCAATCGCAGGGCAGATGAGTGTCGCATACATTCTCGCCGTCCAGCTGGTCGACCAGCAATGTCTTTTGTCCCAGTTTTCTGAGTTTGATGACAACCTGGAGAGGCCAGAAGTTTGGGATCTGGCCAGGAAGGTTACTTCATCTCAAAGCGAAGAGTTTGATCAAGACGGCAACTGTCTCAGTGCGGGTCGCGTGAGGATTGAGTTCAACGATGGTTCTTCTATTACGGAAAGTGTCGAGAAGCCTCTTGGTGTCAAAGAGCCCATGCCAAACGAACGGATTCTCCACAAATACCGAACCCTTGCTGGTAGCGTGACGGACGAATCCCGGGTGAAAGAGATTGAGGATCTTGTCCTCGGCCTGGACAGGCTCACCGACATTAGCCCATTGCTGGAGCTGCTGAATTGCCCCGTGAAATCGCCACTGGTATAA

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

山东鲁抗舍里乐药业有限公司

<120> 一种高产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> 顺乌头酸脱羧酶CadA

<400> 1

Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser

20 25 30

Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys

35 40 45

Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala

50 55 60

Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile

85 90 95

Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser

100 105 110

Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala

115 120 125

Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile

130 135 140

Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser

145 150 155 160

Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro

165 170 175

Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser

180 185 190

Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met

195 200 205

Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala

210 215 220

Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala His Gly Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met

245 250 255

Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val

260 265 270

Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys

275 280 285

Leu Tyr Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu

290 295 300

Asn Leu Gln Gly Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser

305 310 315 320

Asn Ile Arg His Val His Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His

325 330 335

Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln

340 345 350

Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys

355 360 365

Leu Leu Ser Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu

370 375 380

Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Ser Ser Gln Ser Glu Glu Phe

385 390 395 400

Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe

405 410 415

Asn Asp Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ser Val Glu Lys Pro Leu Gly Val

420 425 430

Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu

435 440 445

Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu

450 455 460

Val Leu Gly Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Ser Pro Leu Leu Glu Leu

465 470 475 480

Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val

485 490

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 乌头酸异构酶Adi1

<400> 2

Met Leu His Pro Ile Asp Thr Thr Ile Tyr Arg Ala Gly Thr Ser Arg

1 5 10 15

Gly Leu Tyr Phe Leu Ala Ser Asp Leu Pro Ala Glu Pro Ser Glu Arg

20 25 30

Asp Ala Ala Leu Ile Ser Ile Met Gly Ser Gly His Pro Leu Gln Ile

35 40 45

Asp Gly Met Gly Gly Gly Asn Ser Leu Thr Ser Lys Val Ala Ile Val

50 55 60

Ser Ala Ser Thr Gln Arg Ser Glu Phe Asp Val Asp Tyr Leu Phe Cys

65 70 75 80

Gln Val Gly Ile Thr Glu Arg Phe Val Asp Thr Ala Pro Asn Cys Gly

85 90 95

Asn Leu Met Ser Gly Val Ala Ala Phe Ala Ile Glu Arg Gly Leu Val

100 105 110

Gln Pro His Pro Ser Asp Thr Thr Cys Leu Val Arg Ile Phe Asn Leu

115 120 125

Asn Ser Arg Gln Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Val Tyr Asn Gly Arg

130 135 140

Val His Tyr Asp Asp Ile Asp Asp Met His Met Gln Arg Pro Ser Ala

145 150 155 160

Arg Val Gly Leu Arg Phe Leu Asp Thr Val Gly Ser Cys Thr Gly Lys

165 170 175

Leu Leu Pro Thr Gly Asn Ala Ser Asp Trp Ile Asp Gly Leu Lys Val

180 185 190

Ser Ile Ile Asp Ser Ala Val Pro Val Val Phe Ile Arg Gln His Asp

195 200 205

Val Gly Ile Thr Gly Ser Glu Ala Pro Ala Thr Leu Asn Ala Asn Thr

210 215 220

Ala Leu Leu Asp Arg Leu Glu Arg Val Arg Leu Glu Ala Gly Arg Arg

225 230 235 240

Met Gly Leu Gly Asp Val Ser Gly Ser Val Val Pro Lys Leu Ser Leu

245 250 255

Ile Gly Pro Gly Thr Glu Thr Thr Thr Phe Thr Ala Arg Tyr Phe Thr

260 265 270

Pro Lys Ala Cys His Asn Ala His Ala Val Thr Gly Ala Ile Cys Thr

275 280 285

Ala Gly Ala Ala Tyr Ile Asp Gly Ser Val Val Cys Glu Ile Leu Ser

290 295 300

Ser Arg Ala Ser Ala Cys Ser Ala Ser Gln Arg Arg Ile Ser Ile Glu

305 310 315 320

His Pro Ser Gly Val Leu Glu Val Gly Leu Val Pro Pro Glu Asn Ala

325 330 335

Ala Gln Ser Leu Val Asp Val Ala Val Val Glu Arg Ser Ile Ala Leu

340 345 350

Ile Ala His Ala Arg Val Tyr Tyr Thr Thr Pro Asp Arg Arg Arg Ser

355 360 365

Tyr Asp Ser Pro Leu Thr Ser Pro Ser Thr Pro Ala Asp Thr His Asn

370 375 380

Leu Phe Asp Ala Ala Tyr Arg Pro Val Ile Gln Pro Ser Asp Thr Asp

385 390 395 400

Val Glu Ala Pro His Met Leu Ala Leu Glu Asn Lys Glu Gln Cys Val

405 410 415

Ser Arg Cys Asp Thr Ala Leu His His Ile Val Ala Ser Tyr Gly Ala

420 425 430

Ser Asp Ala His Ala Ser Asp Arg Ser Leu Ser

435 440

<210> 3

<211> 1332

<212> DNA

<213> 乌头酸异构酶adi1基因

<400> 3

atgctgcacc ccatcgacac caccatctac cgcgccggca ccagccgcgg tctgtacttc 60

ctggcctccg acctgcccgc cgagccttct gagcgcgacg ctgctctgat ctccatcatg 120

ggctccggcc accccctgca aatcgacggc atgggcggcg gcaactccct gacctccaag 180

gtcgccatcg tctccgcctc cacccagcgc agcgagttcg acgtcgacta cctgttctgc 240

caggtcggca tcaccgagcg cttcgtcgac accgccccca actgcggcaa cctgatgtcc 300

ggcgtcgccg ccttcgccat cgagcgtggt ctggtccagc cccacccctc cgacaccacc 360

tgcctggtcc gcatcttcaa cctgaactcc cgccaggcct ccgagctggt catccccgtc 420

tacaacggcc gcgtccacta cgacgacatc gacgacatgc acatgcagcg ccccagcgcc 480

cgcgtcggtt tgcgtttcct ggacaccgtc ggcagctgca ccggcaagct gctgcccacc 540

ggcaacgcca gcgactggat cgacggcctg aaggtcagca tcatcgactc cgccgtcccc 600

gtcgtcttca tccgccagca cgacgtcggc atcacgggca gcgaggcccc tgctaccctg 660

aacgccaaca ccgccctgct ggaccgcctg gagcgcgttc gtctggaggc cggtcgccgt 720

atgggcctgg gtgacgtctc cggcagcgtc gtccccaagc tgagcctgat cggccccggc 780

accgagacca ccaccttcac cgcccgctac ttcaccccca aggcctgcca caacgcccac 840

gccgtcaccg gtgccatctg caccgccggt gccgcttaca tcgacggcag cgtcgtgtgc 900

gagatcctgt ccagccgcgc ctccgcctgc tccgcttctc agcgtcgcat cagcatcgag 960

caccccagcg gcgtcctgga ggtcggtctg gtcccccctg agaacgccgc ccagtccctg 1020

gtcgacgtcg ccgttgtcga gcgcagcatc gccctgatcg cccacgcccg tgtctactac 1080

accacccccg accgccgccg ctcctacgat agccctctga cctccccctc cacccccgct 1140

gacacccaca acctgttcga cgccgcctac cgccccgtca tccagcctag cgacaccgac 1200

gtcgaggccc cccacatgct ggccctggag aacaaggagc agtgcgtctc ccgctgcgac 1260

accgccctgc accacatcgt cgcctcctac ggcgccagcg acgcccatgc tagcgaccgt 1320

agcctgtcct aa 1332

<210> 4

<211> 1529

<212> DNA

<213> 编码顺乌头酸脱羧酶CadA的基因

<400> 4

atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60

tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120

cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180

tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240

caggtaaatt ttattcactc tagacggtcc acaaagtata ctgacgatcc ttcgtataga 300

aactggggcc tgttgcagca gccatgacca attccgcttt catacaggct acggagcttg 360

acgactacca cagcgaagcc cccctacact ctgcaagcat tgtccttcct gcggtctttg 420

cagcaagtga ggtcttagcc gagcagggca aaacaatttc cggtatagat gttattctag 480

ccgccattgt ggggtttgaa tctggcccac ggatcggcaa agcaatctac ggatcggacc 540

tcttgaacaa cggctggcat tgtggagctg tgtatggcgc tccagccggt gcgctggcca 600

caggaaagct cctcggtcta actccagact ccatggaaga tgctctcgga attgcgtgca 660

cgcaagcctg tggtttaatg tcggcgcaat acggaggcat ggtaaagcgt gtgcaacacg 720

gattcgcagc gcgtaatggt cttcttgggg gactgttggc ccatggtggg tacgaggcaa 780

tgaaaggtgt cctggagaga tcttacggcg gtttcctcaa gatgttcacc aagggcaacg 840

gcagagagcc tccctacaaa gaggaggaag tggtggctgg tctcggttca ttctggcata 900

cctttactat tcgcatcaag ctctatgcct gctgcggact tgtccatggt ccagtcgagg 960

ctatcgaaaa ccttcagggg agataccccg agctcttgaa tagagccaac ctcagcaaca 1020

ttcgccatgt tcatgtacag ctttcaacgg cctcgaacag tcactgtgga tggataccag 1080

aggagagacc catcagttca atcgcagggc agatgagtgt cgcatacatt ctcgccgtcc 1140

agctggtcga ccagcaatgt cttttgtccc agttttctga gtttgatgac aacctggaga 1200

ggccagaagt ttgggatctg gccaggaagg ttacttcatc tcaaagcgaa gagtttgatc 1260

aagacggcaa ctgtctcagt gcgggtcgcg tgaggattga gttcaacgat ggttcttcta 1320

ttacggaaag tgtcgagaag cctcttggtg tcaaagagcc catgccaaac gaacggattc 1380

tccacaaata ccgaaccctt gctggtagcg tgacggacga atcccgggtg aaagagattg 1440

aggatcttgt cctcggcctg gacaggctca ccgacattag cccattgctg gagctgctga 1500

attgccccgt gaaatcgcca ctggtataa 1529

Claims

1.一种产反式乌头酸的重组土曲霉菌株，其特征在于，所述重组土曲霉是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌株，是在出发菌株中敲除顺乌头酸脱羧酶CadA基因，并过表达乌头酸异构酶Adi1而获得的；所述乌头酸异构酶Adi1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述乌头酸异构酶Adi1的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述乌头酸异构酶Adi1的表达元件使用的启动子为PcadA启动子或PgpdAt启动子。

2.根据权利要求1所述的重组土曲霉菌株，其特征在于，构建所述出发菌株为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

3.根据权利要求1所述的重组土曲霉菌株，其特征在于，所述顺乌头酸脱羧酶CadA，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.权利要求1-3任意一项所述的重组土曲霉菌株的构建方法，其特征在于，是以土曲霉为出发菌株，敲除顺乌头酸脱羧酶cadA基因并将所述乌头酸异构酶Adi1的表达元件导入所述出发菌株中，构建重组土曲霉菌株。

5.权利要求1-3任意一项所述的重组土曲霉菌株在生产反式乌头酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是指将所述重组土曲霉菌株经发酵培养后生产反式乌头酸，所述发酵条件为：37℃，220rpm发酵时间为72-168h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵所用的培养基配方为：100 g L^-1葡萄糖，2 g L^-1 NH₄NO₃，0.2 g L^-1 (NH₄)₂HPO₄，20 mg L^-1 FeSO₄，0.4 g L^-1 MgSO₄，40 mgL^-1 ZnSO₄，40 mg L^-1 CuSO₄，余量为水。