KR20190092834A - 목적 단백질의 생산을 위한 발현 카세트 및 이를 포함하는 균주 - Google Patents

목적 단백질의 생산을 위한 발현 카세트 및 이를 포함하는 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 생산을 위한 발현 카세트 및 상기 카세트가 도입되어 목적 단백질을 고수율로 생산할 수 있는 균주에 대한 것이다.
본 발명의 발현 카세트 및 이를 포함하는 균주를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 목적 단백질을 대량으로 제조할 수 있다. 따라서, 산업적으로 필요한 효소 등을 대량으로 생산할 수 있으므로, 산업 활용 가능성이 높다.

Description

목적 단백질의 생산을 위한 발현 카세트 및 이를 포함하는 균주{EXPRESSION CASSETTE FOR PRODUCING TARGET PROTEIN AND STRAIN COMPRISING THE SAME}
본 발명은 목적 단백질의 생산을 위한 발현 카세트 및 상기 카세트가 도입되어 목적 단백질을 고수율로 생산할 수 있는 균주에 대한 것이다.
진균은 그 종류가 매우 많으며, 다양한 환경 조건 아래서 생존에 필요한 대사작용에 따라 다양한 효소를 분비할 수 있다. 진균이 분비하는 효소들 중에는 산업적 가치가 높은 효소들이 존재하며, 앞으로 진균을 더 연구할수록 새로운 효소를 발견할 수 있을 것으로 기대된다.
다만, 이러한 효소 또는 이를 생산하는 진균을 찾았다고 하더라도, 이를 산업적으로 활용할 수 있도록 대량생산을 하는 것은 쉽지 않다. 일반적으로 직면하는 문제는 진균이 대량 배양이 잘 안되거나, 배양을 하더라도 효소 단백질의 생산량이 매우 적은 경우 등이 있다. 예를 들어, 표고버섯은 산업적 가치가 높은 라카아제를 생산할 수 있으나, 이 버섯은 배양이 어렵고 여기서 생산되는 효소의 양이 매우 적어 산업적으로 생산하기는 어렵다.
따라서, 이러한 효소 단백질을 대량으로 생산하기 위한 다양한 방법이 시도되고 있으며, 이중 하나가 진균의 유전자를 조작하는 방법이다. 예를 들어, 효소를 생산하는데 방해가 되는 유전자들은 제거하고 유용한 유전자들은 강화시켜서 생산하고자 하는 효소를 많이 생산할 수 있도록 여러 개의 유전자들을 조작한다.
실제로 진균 중 Aspergillus, Trichoderma, Penicillum, Rhizopus 속의 단백질을 효과적으로 많이 분비하는 스트레인들이 개발되어 산업적으로 사용되고 있다
본 발명의 목적은 진균에 적용시 생산하고자 하는 단백질의 수율을 향상시킬 수 있는 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현 카세트가 도입된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 이로부터 분비된 목적 단백질을 회수하는 목적 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 프로모터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 목적 단백질의 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 프로모터, 프로모터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 목적 단백질의 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 발현 카세트가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물로부터 분비된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 발현 카세트 및 이를 포함하는 균주를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 목적 단백질을 대량으로 제조할 수 있다. 따라서, 산업적으로 필요한 효소 등을 대량으로 생산할 수 있으므로, 산업 활용 가능성이 높다.
도 1은 프로모터 및 펙테이트리에이즈 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 도식화한 것이다.
도 2는 프로모터, 분비 신호 펩타이드 및 펙테이트리에이즈 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 도식화한 것이다.
도 3은 프로모터, 분비 신호 펩타이드, 이펙터 단백질 및 펙테이트리에이즈 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 도식화한 것이다.
도 4는 프로모터, 분비 신호 펩타이드, 이펙터 단백질 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트를 도식화한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 프라이머 세트를 표기한 것이다.
도 6은 본 발명 일 실시예에 따른 발현 카세트가 도입된 균주를 배양한 결과를 촬영한 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 카세트가 도입된 균주로부터 발현된 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 카세트가 도입된 균주로부터 발현된 단백질의 총량을 도식화한 것이다.
이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 프로모터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는, 목적 단백질의 발현 카세트를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "프로모터"는 폴리머라제(polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 염기서열을 의미한다. 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역으로, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치한다. 상기 프로모터는 전사에 필요한 기본인자뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서가 더 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 프로모터는 ToxA 프로모터, Trip 프로모터 또는 Ef1a 프로모터로 이루이전 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 ToxA 프로모터 또는 Trip 프로모터일 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "분비 신호 펩타이드"는 새롭게 합성되는 단백질이 분비 경로(secretory pathway)를 통해 지정된 위치로 분비되도록 상기 단백질의 N-말단에 존재하는 30개 이하의 짧은 펩타이드를 의미한다.
구체적으로, 상기 분비 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열의 다양하게 변형된 펩티드인 변이체일 수 있다. 상기 변형은 상기 분비 신호 펩타이드의 분비 활성을 변형시키지 않는 내에서 하나 이상의 단백질을 치환, 변형, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
상기 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산은 상기 분비 신호 펩타이드와 동일하거나 이와 동일한 분비 활성을 나타내는 펩타이드를 코딩하는 염기 서열이라면 제한되지 않는다. 바람직하게는, 서열번호 2의 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "목적 단백질"은 재조합 미생물로부터 분비 발현시키거나, 재조합 미생물을 이용하여 대량으로 생산하고자 하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 산물을 의미한다. 구체적으로, 알터나리아 속(Alternaria) 미생물로부터 분비 발현되거나 이를 이용하여 생산될 수 있는 단백질 또는 산물이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 목적 단백질은 펙테이트리에이즈(Pectate lyase), 라카아제(Laccase), 피타아제(Phytase) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "발현 카세트"는 목적 단백질의 유전자를 포함하고 있어서 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 발현 카세트는 알터나리아　브라시시콜라 (Alternaria brassicicola)에 도입되어 펙테이트리에이즈 (Pectate lyase)를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 카세트는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 이펙터 단백질이 포함됨으로써 목적 단백질의 생산량이 증가되는데, 이는 이펙터 단백질이 융합된 mRNA가 그렇지 않은 mRNA에 비해 안정성이 높거나, 합성된 단백질을 분비 단백질로 인식하게 하여 분해가 억제되는 것으로 보인다.
구체적으로, 상기 이펙터 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열의 다양하게 변형된 펩티드인 변이체일 수 있다. 상기 변형은 상기 이펙터 단백질의 활성을 변형시키지 않는 내에서 하나 이상의 단백질을 치환, 변형, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
상기 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산은 상기 이펙터 단백질과 동일하거나 이와 동일한 활성을 나타내는 펩타이드를 코딩하는 염기 서열이라면 제한되지 않는다. 바람직하게는, 서열번호 4의 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
또한 본 발명의 발현 카세트는 선택 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 선택 마커는 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포의 선택을 허용하며, 종종 비형질전환된 균주에 외인성 특정 형태의 내성을 제공하는 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 일반적으로 중금속, 항생제 또는 살충제에 내성일 수 있다. 구체적으로, 상기 선택 마커는 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 지오마이신 내성 유전자 등이거나 pyrG 유전자와 같이 특정 아미노산과 관련된 유전자 일 수 있다. 상기 pyrG 유전자는 CTP synthetase를 코딩하는 유전자이며, 상기 CTP synthetase는 피리미딘 바이오생합성에 관여하는 효소로서, UTP를 CTP로 전환하는 활성을 가지고 있다. 선택 마커가 별개의 벡터에 있거나 선택 마커가 이종 단백질에 대한 단백질-코딩 서열로서 같은 핵산 단편에 있는 경우에 동시형질전환으로 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 균주에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다는 인위적 DNA 분자로, 구체적으로 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 목적 단백질의 발현 카세트 또는 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 알터나리아 속인 것이 바람직하며, 구체적으로 알터나리아　브라시시콜라(Alternaria brassicicola)일 수 있다. 상기 목적 단백질의 발현 카세트 또는 상기 벡터는 형질전환을 통해 알터나리아 속 균주에 도입될 수 있다. 구체적으로, 전술한 프로모터, 서열번호 2의 분비 신호 펩타이드 염기 서열, 서열번호 4의 이펙터 단백질 염기 서열 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는 발현 카세트가 도입된 알터나리아 브라시시콜라 균주를 배양시 발현되는 목적 단백질의 생산량이 가장 우수하다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 전술한 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물로부터 분비된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법을 제공할 수 있다. 구체적인 생산 방법의 일 예시는 실시예를 통해 설명하기로 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 컨스트럭트를 이용한 형질전환된 균주의 제조
발현 카세트를 주형으로 PCR을 통해 각각의 컨스트럭트를 제조하였다. 이때 사용된 프라이머들은 p1, p4, p5, p6 프라이머들을 공통으로 사용하였으며 P2와 p3 프라이머들은 각 칸스트럭트에 따라 맞도록 제작하였다. 이에 따라 제조된 프로모터 및 펙테이트리에이즈 유전자를 포함하는 제1 컨스트럭트(도 1), 프로모터, 분비 신호 펩타이드 및 펙테이트리에이즈 유전자를 포함하는 제2 컨스트럭트(도 2) 및 프로모터, 분비 신호 펩타이드, 이펙터 단백질 및 펙테이트리에이즈 유전자를 포함하는 제3 컨스트럭트를 알터나리아　브라시시콜라 균주에 형질전환시켜 세 종류의 재조합 균주를 제조하였다.
실험예 1. 재조합 균주별 콜로니 성장 비교
실시예 1.에서 제조된 세 종류의 재조합 균주를 PDA 배지와 추가 탄소원과 펙틴을 포함하는 0.2 x PDA 배지에서 배양한 후 콜로니를 관찰하였다(도 6).
최적의 배지인 PDA 배지에서 배양되는 경우 세가지 다른 균주가 모두 유사한 콜로니의 크기를 나타내는 것을 확인하였다. 주요 탄소원이나 펙틴 등의 영양소가 낮게 포함된 중간 및 아래 패널을 살펴보면, 서로 콜로니의 크기가 상이한 것을 알 수 있다. 이때, 제3 컨스트럭트로 제조된 균주가 가장 활발하게 성장한 것을 알 수 있다.
실험예 2. 재조합 균주로부터 수득된 단백질의 SDS -PAGE 분석
실시예 1.에서 제조된 세 종류의 균주로부터 발현된 단백질의 SDS-PAGE 분석하였다(도 7). 레인 1은 제1 컨스트럭트로 제조된 균주에 관한 것으로, 분비 신호 펩타이드 없이 펙테이트리에이즈 단백질을 발현하였으나 분비된 단백질 총량의 1% 미만으로 분비되었다. 레인 2는 제2 컨스트럭트로 제조된 균주에 관한 것으로, N-말단에 분비 신호 펩타이드를 갖는 펙테이트리에이즈 단백질을 발현하였다. 정제된 단백질은 대부분 목적 단백질에 해당하나, 그 대부분은 분해되었다.
레인 3은 N-말단에 분비 신호 펩타이드 및 이펙터 단백질을 갖는 펙테이트리에이즈 단백질을 발현하였다. 단백질의 크기는 이펙터 도메인이 없는 단백질보다 더 컸으며, 단백질 밴드가 분리되어 있어 배양 배지에서 안정적으로 발현된 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 재조합 균주로부터 수득된 단백질의 총량 분석
실시예 1.에서 제조된 세 종류의 균주를 매 24시간마다 새로운 배지로 교체하면서 3일 동안 성장시켰다. 72시간 배양 후, 1x GYEB 배지를 농축 배양 배지로 대체하고 72시간 동안 배양하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 제3 컨스트럭트가 도입된 균주가 단백질 생산량이 월등히 높은 것을 알 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 프로모터; 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산; 및 목적 단백질의 유전자를 포함하는, 목적 단백질의 발현 카세트(expression cassette).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는, 목적 단백질의 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산을 더 포함하는, 목적 단백질의 발현 카세트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는, 목적 단백질의 발현 카세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 펙테이트리에이즈(Pectate lyase), 라카아제(Laccase), 피타아제(Phytase) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 목적 단백질의 발현 카세트.
  6. 제1항에 있어서,
    선택 마커의 유전자를 더 포함하는, 목적 단백질의 발현 카세트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트가 도입된 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미생물은 알터나리아　브라시시콜라(Alternaria brassicicola)인, 재조합 미생물.
  9. 제8항에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 미생물로부터 분비된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021125913A1 (ko) * 2019-12-20 2021-06-24 (주)셀트리온 목적 단백질의 고발현을 위한 인트론을 포함하는 발현 카세트 및 이의 이용

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