JP4817795B2 - 低温誘導性プロモーター - Google Patents
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Description
(1) 配列番号1の塩基配列からなるDNA
(2) 配列番号1の塩基配列の一部からなるDNA
(3) 配列番号1の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温誘導性プロモーター活性を有するDNA
項2. 以下の(4)、(5)、又は(6)のDNAからなる低温誘導性プロモーター。
(4) 配列番号2の塩基配列からなるDNA
(5) 配列番号2の塩基配列の一部からなるDNA
(6) 配列番号2の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温誘導性プロモーター活性を有するDNA
項3. 項1又は2に記載の低温誘導性プロモーターを含むベクター。
(I)低温誘導性プロモーター
本発明の第1のプロモーターは、アスペルギルス・オリゼのCPaseP遺伝子プロモーターであり、配列番号1の塩基配列からなるDNAである。本発明の第2のプロモーターは、アスペルギルス・オリゼのopdA遺伝子プロモーターであり、配列番号2の塩基配列からなるDNAである。
(II)ベクター
本発明のベクターは、上記の第1の低温誘導性プロモーター又は第2の低温誘導性プロモーターを含むベクターである。
(III)形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の低温誘導性プロモーターを含むベクターであってこのプロモーターにより発現できるように目的遺伝子を連結した組み換えベクターで糸状菌を形質転換したものである。
(IV)タンパク質の製造方法
本発明の目的タンパク質の製造方法は、前述した本発明の糸状菌形質転換体を10〜30℃で培養する第1工程と、培養物から目的タンパク質を回収する第2工程とを含む方法である。
実施例
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
実施例1
麹菌A. oryzae O-1013株(FERM-P16528)のフスマ培養cDNAライブラリーの構築
麹菌A. oryzae O-1013株を、オートクレーブにて加熱殺菌した小麦フスマを用いて25℃にて48時間培養を行った。その培養物から常法であるAGPC法(Chomczynski, P. et al., An al. Biochem. 162, 156-159(1987))にて全RNAを抽出した。得られた全RNAからoligotex-dt30<super>mRNA purification kit(タカラ社)を用いてmRNAを精製した。得られた1μgのmRNAを用いてSMART cDNA library construction kit(クロンテック社)を用いてλTriplEx2ファージcDNAライブラリーを構築した。
実施例2
プロモーターライブラリーの作成
Genome Walker(クロンテック社)を用いて、プロモーター断片取得用のテンプレートDNAライブラリーを構築した。まず、A. oryzae O-1013株(FERM-P16528)のゲノムDNAを5種類の制限酵素(DraI, EcoRV, PvuII, ScaI, StuI)で切断し、PCR増幅用のゲノムテンプレートとした。次に、フスマ培養cDNAライブラリーから得られた塩基配列情報からアンチセンスプライマーを、Genome Walker(クロンテック社)のアダプターからプライマーをそれぞれ設計した。両プライマーを用いて、先に作成したゲノムテンプレートライブラリーに対してPCR反応を行った。反応条件の一例は次の通りである。
<PCR条件>
95℃(1分)、1サイクル
94℃(5秒)、72℃(3分)、7サイクル
94℃(5秒)、67℃(3分)、70℃(3分)、32サイクル
67℃(7分)、1サイクル
5種類のテンプレートそれぞれについてPCR反応後、2-3kbpのDNA断片が増幅されたものについて、電気泳動装置を用いて単離した。これらの断片の塩基配列を決定し、ブラストサーチを用いた相同性検索の結果から推定された開始コドンの上流をプロモーター部分と推定した。
実施例3
プロモーター活性の測定方法
まず目的とするプロモーターの配列を、SalIサイトを付与したプライマーを用いてPCR反応にて増幅させ、次にこの断片を、GUS(uidA)遺伝子を含むプロモーター活性測定用プラスミドのSalIサイトに挿入した。挿入プロモーターの方向がGUS(uidA)遺伝子と正の方向にサブクローニングしたものを選択した。この解析用プラスミドpNGUS(図1)を含む大腸菌(Escherichia coli)IN113株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P-18254として寄託されている。
実施例4
(単離プロモーター遺伝子の低温フスマ培養における発現能の検討)
30のプロモーター候補のうち、20℃のフスマ培養でGUS活性の高いものであった、CPaseP遺伝子プロモーター(Carboxypeptidase類似遺伝子)、opdA遺伝子プロモーター(O-pyrocatechuate decarboxylase類似遺伝子)を挿入したpNGUSを利用して、各種の培養条件下でGUSタンパク質の生産を行い、GUS活性を測定した。
<GUS活性の測定方法>
GUS活性の測定方法は、Jeffersonらの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447-8451 (1986) )に従って行った。
培養条件(a)
培地:フスマ培地
温度:30℃または15℃
培養日数:2日間
結果を以下の表1に示す。
培地:DPY液体培地(2%デキストリン、1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.1%K2HPO4、0.05%MgSO4・7H2O:pH6.0)
温度:30℃または15℃
培養日数:2日間
結果を以下の表2に示す。
培地:フスマ培地
温度:15℃
培養日数:1〜21日
結果を以下の表3に示す。
培地:フスマ培地
温度:5〜30℃
培養日数:4日間
結果を以下の表4に示す。
Claims (6)
- 以下の(1)、又は(3)のDNAからなる低温誘導性プロモーター。
(1) 配列番号1の塩基配列からなるDNA
(3) 配列番号1の塩基配列において、1個又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、又は置換されたDNAであり、かつ低温誘導性プロモーター活性を有するDNA - 以下の(4)、又は(6)のDNAからなる低温誘導性プロモーター。
(4) 配列番号2の塩基配列からなるDNA
(6) 配列番号2の塩基配列において、1個又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、又は置換されたDNAであり、かつ低温誘導性プロモーター活性を有するDNA - 請求項1又は2に記載の低温誘導性プロモーターを含むベクター。
- 低温誘導性プロモーターにより発現できるように目的遺伝子を連結した請求項3に記載のベクターで形質転換した糸状菌。
- 請求項4に記載の糸状菌を10〜30℃で培養する第1工程と、培養物から目的タンパク質を回収する第2工程とを含む目的タンパク質の製造方法。
- 第1工程において、固体培養を行う請求項5に記載の方法。
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JP2005300970A JP4817795B2 (ja) | 2005-10-14 | 2005-10-14 | 低温誘導性プロモーター |
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