CN104844580B - 嘧啶类化合物、其制备方法及医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物领域，具体涉及一种具有式(I)结构特征的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐、它们的制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用。药理实验结果表明，该类化合物对表皮生长因子受体(EGFR)及其突变体具有良好的抑制作用，并且可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，因此可作为EGFR抑制剂用于制备抗肿瘤药物。

Description

嘧啶类化合物、其制备方法及医药用途
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种嘧啶类化合物、其制备方法以及医药用途，特别是在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶是细胞信号转导通路中的重要调控因子，在已知的518种蛋白激酶中，90种属于蛋白酪氨酸激酶。它能催化ATP上γ-磷酸转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，促使激酶由非活化构象转变成活化构象，从而激活下游信号分子，进一步引发细胞的多种生物效应，在细胞生长、增殖、分化等过程中起着重要的作用(Oncogene，2000，19(49)：5548-5557)。在正常细胞中，蛋白酪氨酸激酶的催化活性受到严格的调控，但当其基因发生突变或其它变异时，酪氨酸激酶的功能便会因此失调，从而导致细胞增殖调节发生紊乱，进而诱导肿瘤的发生与发展。因此，近年来蛋白酪氨酸激酶已成为肿瘤分子靶向治疗的热门靶标。
表皮生长因子受体(EGFR)是一类重要的蛋白酪氨酸激酶ErbB家族，该家族包括erbB1(EGFR/HER1)、erbB2(HER2)、erbB3(HER3)、erbB4(HER4)四个成员。当EGFR胞外的受体与配体结合后，引起同源或异源二聚化，然后二聚体发生磷酸化作用，导致胞内酪氨酸激酶区被激活并结合一个ATP分子，促使胞内区的特定酪氨酸残基磷酸化，随后依次识别并结合具有PTB结构域或SH2结构域的接头蛋白(如Cbl、Shc、Grb2、Crk等)，进而激活下游信号分子。EGFR可以通过Ras/MAPK、c-Src和PI3K/Akt等多条信号通路对细胞功能进行调控(EMBOJ，2000，19(13)：3159-3167)。EGFR的功能异常与肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、***癌、胶质母细胞瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关(Clin Cancer Res，2006，12(18)：5268-5272)。因此，近年来靶向EGFR抗肿瘤药物深受人们关注。
第一代小分子EGFR抑制剂主要包括吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)和埃克替尼(icotinib)等。该类可逆的EGFR抑制剂主要是通过竞争性结合于激酶区域的ATP结合口袋，阻止ATP与EGFR结合，从而抑制其磷酸化，阻滞信号转导，进而诱导肿瘤细胞死亡。这些药物在临床治疗非小细胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤中疗效突出。然而，临床研究表明，部分肿瘤患者在接受该类药物治疗一段时间后便发生EGFR二次突变和/或Met基因扩增、HGF过度表达等，从而产生获得性耐药(J BiomedBiotechnol，2011：165214)。其中，发生在EGFR激酶区域的T790M突变被认为是主要的耐药机制，该突变会阻碍抑制剂与激酶活性口袋结合，而增强ATP与活性口袋的结合(N Engl JMed，2005，352(8)：786-792；Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(6)：2070-2075)。为此，人们开展了不可逆EGFR共价抑制剂研发。
不可逆EGFR抑制剂主要是通过亲电基团与EGFR激酶活性位点附近的Cys797巯基发生Michael加成而共价结合，从而占据ATP的结合口袋，阻止激酶激活。目前已有dacomitinib、neratinib、pelitinib、CO-1686和AZD9291等多个不可逆EGFR共价抑制剂进入临床研究，其中afatinib已于2013年7月被美国FDA批准上市，用于治疗转移性非小细胞肺癌。
不可逆抑制剂与靶蛋白发生共价结合虽然通常可以增强药效和延长作用时间，但当其亲电性过强会易于与非靶蛋白的亲核基团发生非特异性共价结合，从而产生脱靶现象。此外，当药物与底物蛋白发生不可逆的共价结合，会导致蛋白质的半抗原化，从而引起自身免疫反应(Chem Res Toxicol，2008，21(1)：84-92；Expert Opin Drug Discov，2012，7(7)：561-581)。
值得一提的是，Taunton小组证实了含有α-氰基-α，β-不饱和羰基的化合物可以与p90核糖体S6蛋白激酶(RSK)发生可逆性共价结合，因此有助于克服或降低不可逆共价药物引发的不良反应(Nat Chem Biol，2012，8(5)：471-476)。
发明内容
本发明公开了一种嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐以及医药用途。药理实验结果表明，该类化合物对表皮生长因子受体(EGFR)及其突变体具有良好的抑制活性，并可抑制多种肿瘤细胞的增殖。因此可作为EGFR激酶抑制剂用于制备抗肿瘤药物。
本发明公开式(I)所示的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐：
其中：
R1代表C1-C8烷基、C3-C6环烷基、C5-C10芳基或C5-C10芳杂环基，所述的烷基、环烷基、芳基或芳杂环基可任选地被下述相同或不相同的取代基单取代至五取代，所述的取代基选自：卤素、氰基、硝基、三氟甲基、C1-C8烷氧基、NR3R4、C(O)NR3R4或C(O)OR5；
R2代表氢、卤素、NR3R4或OR5；
R3和R4可相同或不同，任选自：氢、C1-C8烷基、或R3和R4与跟它们连接的氮原子一起形成5-7元杂环基团，该杂环基团可任选地包含一个或多个选自O、S或N的其它杂原子，并且该杂环基团可任选地由下述相同或不同的取代基单取代至五取代，所述取代基选自：卤素、氰基、硝基、羟基、三氟甲基、氨基、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；
R5代表氢、C1-C8烷基、C3-C6环烷基、C5-C10芳基或C5-C10芳杂环基，所述的烷基、环烷基、芳基或芳杂环基可任选地被下述相同或不相同的取代基单取代至五取代，所述的取代基选自：卤素、氰基、硝基、羟基、三氟甲基、氨基、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基。
进一步地，通式(I)所示的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R1代表特戊基、环丙基、苯基、2-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、吡唑基、吡咯基、咪唑基、呋喃基、吡啶基。
R2代表N，N，N-三甲基乙二胺基、N-甲基哌嗪基、吗啉基。
具体来说，通式(I)所示的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-1)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺(LY-2)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺(LY-3)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(LY-4)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺(LY-5)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡唑-3-基)丙烯酰胺(LY-6)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-4-基)丙烯酰胺(LY-7)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-苯基丙烯酰胺(LY-8)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-环丙基丙烯酰胺(LY-9)；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-特戊基丙烯酰胺(LY-10)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-11)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺(LY-12)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-苯基丙烯酰胺(LY-13)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺(LY-14)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(4-三氟甲基苯基)丙烯酰胺(LY-15)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(LY-16)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺(LY-17)；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-18)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺(LY-19)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺(LY-20)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(LY-21)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺(LY-22)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡唑-3-基)丙烯酰胺(LY-23)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-4-基)丙烯酰胺(LY-24)；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-环丙基丙烯酰胺(LY-25)。
下面药理实验中涉及的化合物代号等同于此处代号所对应的化合物。
本发明的另一目的在于提供通式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于：2-硝基-5-氟苯甲醚经还原制得2-甲氧基-4-氟苯胺1，1经硝化得到2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺2。2，4-二氯嘧啶与N-甲基吲哚在三氯化铝作用下偶联得到1-甲基-3-(2-氯嘧啶-4-基)吲哚3。3与2反应制得1-甲基-3-[[2-(2-甲氧基-4-氟-5-硝基)苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚4，4与胺类化合物缩合制得中间体5，5经还原制得中间体6，6与氰基乙酸缩合得到中间体7，7在哌啶乙酸的催化下与醛类化合物缩合得到LY-1～LY-25；合成路线如下：
其中，R1和R2的定义如权利要求1所述。
本发明的进一步目的在于提供一种药物组合物，由治疗上有效量的权利要求1-5中任一项的化合物或其药学上可接受的载体或者辅料组成。
本发明的再一个目的是提供具有通式(I)的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐以及由它们构成的组合物在抗肿瘤方面的应用，其中所述的肿瘤为非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、***癌、膀胱癌及卵巢癌、头颈部肿瘤或胶质母细胞瘤。
所述的化合物包括通式(I)所示化合物的构象异构体、旋光异构体、外消旋体、非对映异构体或互变异构体，以及任何上述形式的混合体。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1
2-甲氧基-4-氟苯胺(1)的制备
将2-硝基-5-氟苯甲醚(1.00g，5.81mmol)和5％钯碳(0.62g，0.29mmol)加入35mLTHF中，室温下通入氢气搅拌5h，抽滤，旋干溶剂，得浅黄色固体0.80g，收率97％。
2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(2)的制备
冰浴下，将1(1.00g，5.42mmol)分批溶于6.50mL浓硫酸中，分批加入NaNO3(0.46g，5.41mmol)，继续搅拌4小时，2％NaOH溶液调中性，二氯甲烷萃取，旋干溶剂，得橙红色固体0.64g，收率64％。
1-甲基-3-(2-氯嘧啶-4-基)吲哚(3)的制备
将2，4-二氯嘧啶(1.00g，6.71mmol)溶于25mL乙二醇二甲醚中，冰浴冷却，分批加入AlCl3(0.98g，7.42mmol)，控温低于10℃下，加入N-甲基吲哚(0.83mL，6.74mmol)，撤去冰浴，回流反应2h，冷却至室温，倒入200mL冰水中，搅拌30min，抽滤，水洗，乙腈重结晶，干燥得乳白色固体0.88g，收率54％。
1-甲基-3-[2-[(2-甲氧基-4-氟-5-硝基)苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(4)的制备
将3(0.90g，3.71mmol)、2(0.69g，3.72mmol)和一水合对甲苯磺酸(0.84g，4.44mmol)溶于30mL仲戊醇中，回流2.5h，冷却至室温，析出黄色固体，抽滤，乙醇洗涤，干燥得黄色固体1.23g，收率85％。
1-甲基-3-[[2-[2-甲氧基-4-(N，N，N’-三甲基乙二胺基)-5-硝基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(5a)制备
4(0.50mg，1.31mmol)和N，N，N’-三甲基乙二胺(0.16mL，1.30mmol)加入仲丁醇和DIPEA(0.55mL，3.22mmol)，通入N2，回流过夜反应，冷却至室温，抽滤，得红色固体0.48g，收率80％，mp：143～145。ESI-MS：476.4[M+H]+。
1-甲基-3-[[2-[2-甲氧基-4-(N，N，N’-三甲基乙二胺基)-5-氨基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(6a)制备
5a(0.50mg，1.13mmol)和5％钯-碳(0.11g，0.06mmol)加入四氢呋喃，通入氢气，室温反应4h，抽滤，旋干滤液得黄色固体590mg，收率98％。
1-甲基-3-[[2-[2-甲氧基-4-(N，N，N’-三甲基乙二胺基)-5-氰基乙酰胺基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚吲哚(7a)的制备
氰基乙酸(190mg，2.24mmol)、EDC·HCl(859mg，4.48mmol)和6a(0.59g，1.12mmol)加入DMF和DIPEA(1.20mL，6.72mmol)，室温反应4h，加水稀释，超声搅拌，抽滤，水洗干燥得灰白色固体0.45g，收率78％，mp：124～126℃。ESI-MS：513.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.21(s，6H)，2.26(t，2H，J＝6.36Hz)，2.71(s，3H)，2.92(t，2H，J＝6.38Hz)，3.86(s，3H)，3.95(s，3H)，3.96(s，2H)，7.03(s，1H)，7.17(t，1H，J＝7.47Hz)，7.25(d，1H，J＝5.46Hz)，7.27(d，1H，J＝7.86Hz)，7.56(d，1H，J＝7.8Hz)，7.90(s，1H)，8.22(d，1H，J＝7.62Hz)，8.33(d，1H，J＝5.34Hz)，8.67(s，1H)，8.99(s，1H)，10.32(s，1H).
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-1)的制备
7(0.03g，0.06mmol)溶于5mL乙腈，加入吡咯甲醛(5.60mg，0.06mmol)和催化量的哌啶醋酸，室温反应4h，加水，搅拌，抽滤干燥得橘色固体0.02g，收率58％，mp：131～133℃。ESI-MS：590.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.12(s，6H)，2.27(s，2H)，2.72(s，3H)，2.98(s，2H)，3.87(s，3H)，3.95(s，3H)，6.47(s，1H)，7.12(s，2H)，7.23(s，2H)，7.37(s，2H)，7.52(d，1H，J＝7.86Hz)，7.95(s，1H)，8.15(s，1H)，8.26(d，1H，J＝7.50Hz)，8.34(d，1H，J＝4.56Hz)，8.59(s，1H)，9.18(s，1H)，10.0(s，1H)，12.01(s，1H).
实施例2
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺(LY-2)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与咪唑-2-甲醛反应制得黄色粉末状固体，收率73％，mp：137～139℃。ESI-MS：591.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.11(s，6H)，2.28(br，2H)，2.72(s，3H)，2.99(br，2H)，3.88(s，3H)，3.90(s，3H)，7.14(br，2H)，7.24(br，2H)，8.06(br，2H)，8.26(d，1H，J＝6.93Hz)，8.34(m，1H)，8.59(s，1H)，9.19(s，1H)，10.24(br，1H).
实施例3
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺(LY-3)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与呋喃-2-甲醛反应制得黄色粉末状固体，收率81％，mp：174～176℃。ESI-MS：591.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.11(s，6H)，2.45(m，2H)，2.72(s，3H)，2.99(m，2H)，3.88(s，3H)，3.91(s，3H)，6.87(m，1H)，7.14(m，2H)，7.24(m，2H)，7.46(d，1H，J＝3.54Hz)，7.52(d，1H，J＝7.98Hz)，7.99(s，1H)，8.08(s，1H)，8.21(s，1H)，8.26(d，1H，J＝8.10Hz)，8.33(d，1H，J＝5.31Hz)，8.60(s，1H)，9.16(s，1H)，10.26(s，1H).
实施例4
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(LY-4)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与2-甲氧基苯甲醛反应制得黄色粉末状固体，收率73％，mp：197～199℃。ESI-MS：631.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：1.29(s，2H)，2.42(s，2H)，2.98(s，4H)，3.73(s，4H)，3.80(s，3H)，3.87(s，3H)，7.15(br，2H)，7.24(br，2H)，7.49(s，1H)，7.59(s，1H)，7.90(s，1H)，8.01(s，2H)，8.27(s，1H)，8.34(s，1H)，8.60(s，1H)，8.83(s，1H)，9.30(s，1H)，10.01(s，1H).
实施例5
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺(LY-5)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与吡啶甲醛反应制得黄色粉末状固体，收率78％，mp：194～196℃。ESI-MS：602.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.11(s，6H)，2.27(br，2H)，2.74(s，3H)，3.00(br，2H)，3.90(s，3H)，3.92(s，3H)，7.16(br s，2H)，7.21～7.28(m，2H)，7.56(d，1H，J＝8.04Hz)，8.00(s，1H)，8.29(m，1H)，8.38(s，1H)，8.56(s，1H)，8.82(s，1H)，9.23(s，1H)，10.34(s，1H).
实施例6
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡唑-3-基)丙烯酰胺(LY-6)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与吡唑-3-甲醛反应制得黄色粉末状固体，收率73％，mp：223～225℃。ESI-MS：590.3[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.13(s，6H)，2.21(br，2H)，2.74(s，3H)，2.99(br，2H)，3.89(s，3H)，3.93(s，3H)，7.14(br s，2H)，7.16(m，2H)，7.22(d，1H，J＝7.83Hz)，7.25(d，1H，J＝4.65Hz)，7.54(d，1H，J＝7.86Hz)，7.99(d，1H，J＝7.80Hz)，8.22(s，1H)，8.56(d，1H，J＝6.93Hz)，8.35(d，1H，J＝5.19Hz)，8.67(s，1H)，9.19(s，1H)，10.44(s，1H).
实施例7
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-4-基)丙烯酰胺(LY-7)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与咪唑-4-甲醛反应制得黄色粉末状固体，收率65％，mp：210～212℃。ESI-MS：591.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.12(s，6H)，2.26(m，2H)，2.72(s，3H)，2.99(m，2H)，3.87(s，3H)，3.92(s，3H)，7.13～7.16(m，2H)，7.20～7.25(m，1H)，7.52(d，1H，J＝7.68Hz)，7.96(d，1H，J＝5.25Hz)，8.04(s，1H)，8.15(s，1H)，8.25(d，1H，J＝7.77Hz)，8.33(d，1H，J＝5.25Hz)，8.64(s，1H)，9.20(s，1H)，10.14(s，1H).
实施例8
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-苯基丙烯酰胺(LY-8)的制备
参照LY-1的制备方法，由7a与苯甲醛反应制得橙色粉末状固体，收率76％，mp：182～184℃。ESI-MS：601.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.11(s，6H)，2.25～2.27(m，2H)，2.75(s，3H)，2.97～3.01(m，2H)，3.89(s，3H)，3.93(s，3H)，7.15(br s，2H)，7.22(d，1H，J＝8.19Hz)，7.26(d，1H，J＝5.37Hz)，7.99(s，1H)，8.03(d，1H，J＝3.54Hz)，8.05(s，1H)，8.33(s，1H)，8.35(d，1H，J＝5.37Hz)，8.64(s，1H)，9.21(s，1H)，10.42(s，1H).
实施例9
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-环丙基丙烯酰胺(LY-9)制备
参照LY-1的制备方法，由7a与环丙甲醛反应制得浅白色固体，收率84％，mp：192～194℃。ESI-MS：564.3[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.13(s，6H)，2.21(m，2H)，2.70(s，3H)，2.95(m，2H)，3.87(s，3H)，3.90(s，3H)，7.09～7.16(m，3H)，7.23～7.29(m，2H)，7.53(d，1H，J＝7.38Hz)，7.96(s，1H)，8.25(d，1H，J＝7.65Hz)，8.32(d，1H，J＝4.89Hz)，8.59(d，1H，J＝7.38Hz)，9.05(s，1H)，10.02(s，1H).
实施例10
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-特戊基丙烯酰胺(LY-10)的制备
参照LY-1的制备方法，由7与特戊甲醛反应制得灰色固体，收率83％，mp：109～111℃。ESI-MS：581.5[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：1.23(s，3H)，1.30(s，3H)，2.13(s，3H)，2.22～2.27(br s，6H)，2.71(s，4H)，3.87～3.92(m，6H)，3.95(br s，3H)，7.03(d，1H，J＝2.79Hz)，7.08～7.24(m，5H)，7.55(d，1H，J＝0.72Hz)，7.57(s，1H)，7.90(d，1H，J＝0.45Hz)，7.95(s，1H)，8.22～8.27(m，2H)，8.34(d，1H，J＝4.05Hz)，8.62(s，1H)，8.67(s，1H)，9.00(s，1H)，9.13(s，1H)，10.18(s，1H)，10.30(br s，1H).
实施例11
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-11)的制备
1-甲基-3-[2-[[4-(N-甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-硝基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(5b)的制备
参照5a的制备方法，由4与N-甲基哌嗪反应制得红色粉末状固体，收率86％。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.25(s，3H)，3.08(s，4H)，3.87(s，3H)，4.05(s，3H)，6.84(s，1H)，7.13(t，1H，J＝7.50Hz)，7.23(d，1H，J＝5.73Hz)，7.26(d，1H，J＝8.58Hz)，7.52(d，1H，J＝7.92Hz)，8.18(s，1H)，8.32～8.37(m，3H)，8.78(s，1H)。
1-甲基-3-[2-[[4-(N-甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-氨基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(6b)的制备
参照6a的制备方法，由5b与H2-Pd/C反应制得白色粉末状固体，收率97％。
1-甲基-3-[2-[[4-(N-甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-氰基乙酰胺基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(7b)的制备
参照7a的制备方法，由6b与氰基乙酸反应制得白色固体，收率68％，mp：230～232℃。ESI-MS：533.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.56(s，4H)，2.87(s，4H)，3.86(s，3H)，3.93(s，3H)，4.03(s，2H)，6.88(s，1H)，7.18(t，1H，J＝6.3Hz)，7.22(d，1H，J＝5.58Hz)，7.27(d，1H，J＝7.23Hz)，7.54(d，1H，J＝7.89Hz)，7.90(s，1H)，8.26(d，1H，J＝7.38Hz)，8.31(d，1H，J＝5.19Hz)，8.56(s，1H)，8.72(s，1H)，9.25(s，1H).
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-11)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与吡咯-2-甲醛反应制得黄色固体，收率73％，mp：193～195℃。ESI-MS：588.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.61(s，4H)，2.90(s，3H)，3.88(s，4H)，6.48(s，1H)，7.10(br，2H)，7.22(br，2H)，7.39(br，2H)，7.48～7.54(m，1H)，7.96(s，1H)，8.22～8.3(m，3H)，8.58(s，1H)，9.23(s，1H)，9.50(s，1H)，12.05(br，1H).
实施例12
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺(LY-12)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与咪唑-2-甲醛反应制得黄色固体，收率57％，mp：190～192℃。ESI-MS：589.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.62(s，4H)，2.92(s，4H)，3.88(s，3H)，3.90(s，3H)，7.11(s，1H)，7.13(t，1H，J＝7.38Hz)，7.24(m，2H)，7.52(m，3H)，8.00(s，1H)，8.07(s，1H)，8.27(d，1H，J＝7.71Hz)，8.33(d，1H，J＝4.95Hz)，8.58(s，1H)，9.23(s，1H)，9.75(s，1H).
实施例13
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-苯基丙烯酰胺(LY-13)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与苯甲醛反应制得黄色固体，收率66％，mp：240～241℃。ESI-MS：621.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.60(br s，4H)，2.93(br s，4H)，3.89(s，3H)，3.93(s，3H)，7.06(s，1H)，7.16(d，1H，J＝7.59Hz)，7.21～7.26(m，2H)，7.52(d，1H，J＝8.10Hz)，7.63(s，1H)，7.65～7.69(m，2H)，8.00(s，1H)，8.04(s，1H)，8.06(s，1H)，8.27(d，1H，J＝7.89Hz)，8.33(d，1H，J＝5.49Hz)，8.41(s，1H)，8.62(s，1H)，9.25(s，1H)，9.79(s，1H).
实施例14
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺(LY-14)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与苯甲醛反应制得橙色固体，收率68％，mp：220～222℃。ESI-MS：600.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.61(br s，4H)，2.93(br s，4H)，3.88(s，3H)，3.91(s，3H)，7.11～7.14(m，2H)，7.23～7.26(m，2H)，7.52(d，1H，J＝7.35Hz)，7.59(br s，1H)，7.91(d，1H，J＝7.65Hz)，7.99～8.03(m，2H)，8.28(d，1H，J＝9.51Hz)，8.33(d，1H，J＝4.17Hz)，8.40(s，1H)，8.59(s，1H)，8.83(d，1H，J＝7.47Hz)，9.26(s，1H)，9.92(s，1H).
实施例15
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(4-三氟甲基苯基)丙烯酰胺(LY-15)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与4-三氟甲基苯甲醛反应制橙色固体，收率67％，mp：239～240℃。ESI-MS：667.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.22(s，3H)，2.61(brs，4H)，2.93(br s，4H)，3.85(s，3H)，3.90(s，3H)，7.12(s，1H)，7.16(d，1H，J＝7.77Hz)，7.21～7.26(m，2H)，7.52(d，1H，J＝8.34Hz)，7.98(s，1H)，8.00(s，1H)，8.03(s，1H)，8.21(d，1H，J＝8.25Hz)，8.30(d，1H，J＝1.95Hz)，8.33(d，1H，J＝5.31Hz)，8.49(s，1H)，8.59(s，1H)，9.21(s，1H)，9.84(s，1H).
实施例16
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(LY-16)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与2-甲氧基苯甲醛反应制得黄色固体，收率76％，mp：263～265℃。ESI-MS：629.5[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.62(s，4H)，2.92(s，4H)，3.88(s，3H)，3.96(s，3H)，4.02(s，3H)，7.12(s，1H)，7.15(m，1H)，7.18(m，1H)，7.21(s，1H)，7.26(s，1H)，7.28(m，1H)，7.58(d，1H，J＝8.43Hz)，7.63(d，1H，J＝8.40Hz)，7.95(s，1H)，8.18(d，1H，J＝8.22Hz)，8.24(d，1H，J＝8.25Hz)，8.37(d，1H，J＝5.07Hz)，8.71(s，1H)，8.75(s，1H).
实施例17
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺(LY-17)的制备
参照LY-1的制备方法，由7b与呋喃甲醛反应制得黄色固体，收率74％，mp：237～239℃。ESI-MS：589.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.26(s，3H)，2.62(s，4H)，2.92(s，4H)，3.88(s，3H)，3.97(s，3H)，6.88(m，1H)，7.10(s，1H)，7.17(d，1H，J＝5.85Hz)，7.21～7.25(m，2H)，7.48(d，1H，J＝3.54Hz)，7.52(d，1H，J＝8.31Hz)，8.01(s，1H)，8.21(s，1H)，8.27(d，1H，J＝8.25Hz)，8.32(d，1H，J＝5.16Hz)，8.57(s，1H)，9.19(s，1H)，9.70(s，1H).
实施例18
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-18)的制备
1-甲基-3-[2-[[4-(吗啉-1-基)-2-甲氧基-5-硝基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(5c)的制备
参照5a的制备方法，由4与***啉反应制得红色固体，收率89％，mp：236～238℃。ESI-MS：461.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：3.08(br s，4H)，3.75(br s，4H)，3.88(s，3H)，4.00(s，3H)，6.89(s，1H)，7.10～7.15(m，1H)，7.25(d，1H，J＝7.59Hz)，7.25(t，1H，J＝6.63Hz)，7.28(d，1H，J＝7.59Hz)，8.14(s，1H)，8.34～8.41(m，3H)，8.31(d，1H，J＝3.78Hz).
1-甲基-3-[2-[[4-(吗啉-1-基)-2-甲氧基-5-氨基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(6c)的制备
参照6a的制备方法，由5c与H2-Pd/C反应制得白色固体，收率98％，mp：177～179℃。ESI-MS：431.3[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：1.35(s，2H)，2.49(s，1H)，2.84(s，4H)，3.59(s，1H)，3.75(br s，6H)，3.86(s，3H)，4.47(s，2H)，6.71(s，1H)，7.15(s，3H)，7.52(s，2H)，7.79(s，1H)，8.29(s，2H)，8.41(s，1H).
1-甲基-3-[2-[[4-(吗啉-1-基)-2-甲氧基-5-氰基乙酰胺基]苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚(7c)的制备
参照7a的制备方法，由6c与氰基乙酸反应制得白色固体，收率68％，mp：145～147℃。ESI-MS：498.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.88(br s，4H)，3.80(br s，4H)，3.88(s，3H)，3.93(s，3H)，4.04(s，2H)，6.92(s，1H)，7.18(d，1H，J＝6.84Hz)，7.23(d，1H，J＝5.55Hz)，7.28(d，1H，J＝7.53Hz)，7.55(d，1H，J＝7.86Hz)，7.91(s，1H)，7.26(d，1H，J＝7.68Hz)，8.32(d，1H，J＝5.34Hz)，8.58(s，1H)，8.76(s，1H)，9.34(s，1H).
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺(LY-18)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与吡咯-2-甲醛反应制得黄色固体，收率74％，mp：273～275℃。ESI-MS：575.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.91(br s，3H)，3.83(brs，4H)，3.88(s，3H)，3.91(s，3H)，6.48(br s，1H)，7.14～7.17(m，2H)，7.22～7.28(m，2H)，7.53(d，1H，J＝8.07Hz)，8.00(s，1H)，8.22(s，1H)，8.27(d，1H，J＝8.04Hz)，8.34(d，1H，J＝3.96Hz)，8.62(s，1H)，9.25(s，1H)，9.61(s，1H).
实施例19
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺(LY-19)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与咪唑-2-甲醛反应制得黄色固体，收率64％，mp：195～196℃。ESI-MS：598.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.92(br s，3H)，3.84(br s，4H)，3.89(s，3H)，3.92(s，3H)，7.08(br s，1H)，7.14～7.17(m，2H)，7.24～7.26(m，2H)，7.34(s，1H)，7.47(br s，2H)，7.54(d，1H，J＝7.56Hz)，8.01(s，1H)，8.05(s，1H)，8.27(d，1H，J＝8.07Hz)，8.34(d，1H，J＝5.37Hz)，8.63(s，1H)，9.28(s，1H)，9.79(s，1H).
实施例20
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺(LY-20)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与呋喃-2-甲醛反应制得黄色固体，收率87％，mp：269～271℃。ESI-MS：598.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.92(s，4H)，3.88(s，4H)，3.89(s，3H)，3.90(s，3H)，6.70(s，1H)，7.06(m，2H)，7.15(m，2H)，7.47(s，1H)，7.50(s，1H)，8.03(s，1H)，8.14(d，1H，J＝3.18Hz)，8.27(s，1H)，8.30(s，1H)，8.34(s，1H)，8.40(s，1H)，8.43(s，1H)，8.58(s，1H)，9.23(s，1H)，9.76(s，1H).
实施例21
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(LY-21)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与2-甲氧基苯甲醛反应制得黄色固体，收率72％，mp：264～266℃。ESI-MS：638.3[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.92(br s，4H)，3.86(br s，4H)，3.91(s，3H)，3.94(s，3H)，3.97(s，3H)，7.16～7.22(m，2H)，7.23～7.27(m，2H)，7.57～7.66(m，2H)，7.94(s，1H)，8.16(d，1H，J＝9.78Hz)，8.23(d，1H，J＝6.96Hz)，8.34(s，1H)，8.72(d，1H，J＝8.61Hz)，8.77(d，1H，J＝8.22Hz)，9.39(s，1H)，9.91(s，1H).
实施例22
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺(LY-22)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与吡啶-2-甲醛反应制得橙色固体，收率66％，mp：264～266℃。ESI-MS：609.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.10(s，8H)，2.23(s，3H)，2.73(s，5H)，2.99(s，4H)，3.92(s，13H)，6.91(m，8H)，7.57(s，2H)，7.92(m，2H)，8.11(m，2H)，8.23(s，1H)，8.32(s，1H)，8.60(s，1H)，8.73(s，1H)，9.28(s，1H)，10.42(s，1H).
实施例23
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡唑-3-基)丙烯酰胺(LY-23)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与吡唑-3-甲醛反应制得黄色固体，收率67％，mp：259～261℃。ESI-MS：598.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.93(br s，4H)，3.87(br s，4H)，3.89(s，3H)，3.93(s，3H)，7.10～7.29(m，6H)，7.54(d，1H，J＝7.71Hz)，8.01(s，1H)，8.28(d，1H，J＝10.32Hz)，8.34(d，1H，J＝5.55Hz)，8.76(s，1H)，9.26(s，1H)，9.82(brs，1H).
实施例24
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-4-基)丙烯酰胺(LY-24)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与咪唑-4-甲醛反应制得黄色固体，收率57％，mp：289～291℃。ESI-MS：598.4[M+Na]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.91(br s，4H)，3.88(br s，4H)，3.92(s，3H)，4.00(s，3H)，7.13～7.19(m，2H)，7.21～7.26(m，2H)，7.53(d，1H，J＝8.43Hz)，7.93(s，1H)，8.00(s，1H)，8.03(s，1H)，8.21(s，1H)，8.26(d，1H，J＝7.89Hz)，8.34(d，1H，J＝5.40Hz)，8.64(s，1H)，9.29(s，1H)，9.70(s，1H).
实施例25
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-环丙基丙烯酰胺(LY-25)的制备
参照LY-1的制备方法，由7c与环丙甲醛反应制得浅黄色固体，收率86％，mp：257～259℃。ESI-MS：550.4[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：2.90(br s，4H)，3.84(brs，4H)，3.92(s，4H)，7.06(s，1H)，7.11(s，1H)，7.17(s，1H)，7.24(s，1H)，7.27(s，1H)，7.53(d，1H，J＝7.71Hz)，7.98(s，1H)，8.30(s，1H)，8.36(s，1H)，8.59(s，1H)，9.18(s，1H)，9.53(s，1H).
实施例39
本发明化合物的EGFR激酶抑制活性测试
采用Z’-LyteTM激酶测试盒(invitrogenTM，Z’-LyteTM Kinase assay kit-Tyr6peptide)进行测试。先把酶和化合物分别按照一定的配比加于384孔板，混匀，放置30min；然后加入ATP，混匀，放置2h；加5μL Development Regent，混匀，于室温下放置15min，30min，1h后，用酶标仪进行检测；1h后加入5μL的Stop regent，混匀后用酶标仪进行检测。计算相应的磷酸化比例，根据化合物的浓度与对应的激酶抑制率作图，得到剂量反应曲线，据此求得药物的半数抑制浓度(IC50)。结果如表1所示。
抑制率(％)＝[1-(A样品组-A样品空白组)/(A对照组-A空白组)]×100％
表1 本发明化合物的EGFR激酶抑制活性(IC50：nM)
EGFR激酶抑制活性测试结果显示，本发明化合物对EGFR(WT)、EGF(T790M)、EGFR(L861Q)、EGFR(L858R)具有良好的抑制活性，其中，LY-2、LY-5、LY-12和LY-13与阳性药WZ4002和AZD9291活性相当。
实施例40
本发明化合物细胞增殖抑制活性测试
采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT)评价本发明部分化合物对8种人非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌细胞株增殖的抑制活性。MTT法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感测定等。
肿瘤细胞株：A549肺癌细胞(WT EGFR)；HCC827肺癌细胞(EGFR del E746-A750)；A431上皮细胞(过度表达的EGFR)；H1975肺癌细胞(EGFR L858R/T790M)；MCF-7乳腺癌细胞(不表达EGFR和HER-2)；SK-Br-3乳腺癌细胞(HER-2过度表达)；N87胃癌细胞(过度表达的EGFR)；LoVo结肠癌细胞(过度表达的EGFR)。
实验方法：取对数生长期的细胞配成4.5×105/mL细胞悬液，接种至96孔培养板中，每孔180μL，每组设5个平行孔，分别加入不同浓度受试物各20μL。置于恒温CO2培养箱中培养48小时，将四甲基氮唑蓝加入96孔板中，每孔20μL，继续培养4小时。吸去上清液，加入DMSO，每孔150μL，平板摇床上振摇5分钟。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，以上实验各重复3次。计算细胞增殖抑制率(抑制率％＝(阴性对照组OD值-受试组OD值)/阴性对照组OD值×100％)，根据抑制率建立直线回归方程求得半数抑制浓度IC50值。结果见表2。
表2 本发明部分化合物抗肿瘤细胞增殖活性(IC50：μM)
细胞活性测试显示本发明化合物对A549、HCC827、A431、H1975、MCF-7、SK-Br-3、N87和LoVo具有良好的增殖抑制活性。其中，LY-5、LY-6、LY-7、LY-8和LY-9对A549、A431、H1975、MCF-7、SK-Br-3、N87和LoVo增殖抑制活性优于或与阳性药AZD9291相当。

Claims (7)

1.通式(I)所示的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐：
其中：
R1代表C1-C8烷基、C3-C6环烷基、C5-C10芳基或C5-C10芳杂环基，所述的烷基、环烷基、芳基或芳杂环基可任选地被下述相同或不相同的取代基单取代至五取代，所述的取代基选自：三氟甲基或甲氧基；
R2代表N，N，N-三甲基乙二胺基、N-甲基哌嗪基或吗啉基。
2.根据权利要求1所述的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R1代表特戊基、环丙基、苯基、2-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、吡唑基、吡咯基、咪唑基、呋喃基或吡啶基；
R2代表N，N，N-三甲基乙二胺基、N-甲基哌嗪基或吗啉基。
3.根据权利要求1所述的嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自：
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡唑-3-基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-4-基)丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-苯基丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-环丙基丙烯酰胺；
N-[2-[[2-(二甲胺基)乙基](甲基)胺基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-特戊基丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-苯基丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(4-三氟甲基苯基)丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡咯-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(呋喃-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡啶-2-基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(吡唑-3-基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-(咪唑-4-基)丙烯酰胺；
N-[2-(吗啉基)-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]-2-氰基-3-环丙基丙烯酰胺。
4.权利要求1所述的嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于：2-硝基-5-氟苯甲醚经还原制得2-甲氧基-4-氟苯胺1，1经硝化得到2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺2，2，4-二氯嘧啶与N-甲基吲哚在三氯化铝作用下偶联得到1-甲基-3-(2-氯嘧啶-4-基)吲哚3，3与2反应制得1-甲基-3-[[2-(2-甲氧基-4-氟-5-硝基)苯胺基]嘧啶-4-基]吲哚4，4与胺类化合物缩合制得中间体5，5经还原制得中间体6，6与氰基乙酸缩合得到中间体7，7在哌啶乙酸的催化下与醛类化合物缩合得到LY-1～LY-25；合成路线如下：
其中，R1和R2的定义如权利要求1所述。
5.一种药物组合物，由治疗上有效量的权利要求1-3中任一项嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅料组成。
6.权利要求1-3中任一项嘧啶类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐和权利要求5所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6的用途，所述的肿瘤疾病为非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、***癌、膀胱癌及卵巢癌、头颈部肿瘤或胶质母细胞瘤。
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