CN103360407B - 一种噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用。所述衍生物是具有通式I或通式II或通式III的化合物：上述通式中：Ar为苯基、卤素取代的苯基、C_1-6烷基取代的苯基、联苯基、卤素取代的联苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、卤素取代的噻吩基、C_1-3烷基取代的噻吩基、呋喃基、卤素取代的呋喃基、C_1-3烷基取代的呋喃基中的任意一种；A、D、E分别为碳原子或氮原子，但A、D、E不同时为碳原子；R为R¹——NH——、

Description

一种噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用

技术领域

本发明涉及噻吩并嘧啶类衍生物及其制备方法和应用，具体说，是涉及一种具有表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR抑制活性的噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用，属于药物化学技术领域。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的最严重疾病之一，其治疗主要包括放疗、化疗和手术治疗。近年来随着细胞生物学和肿瘤药理学的发展，肿瘤的化学药物治疗发生了巨大改变。传统的化学治疗药物由于非特异性地阻断细胞***从而在杀死肿瘤细胞的同时也引起正常细胞死亡而逐渐遭到摒弃，同时，以肿瘤细胞中异常激活的信号通路中的关键节点蛋白作为靶点，发现高效、低毒、特异性强的小分子抑制剂已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。在肿瘤中异常表达激活的受体酪氨酸激酶(RTK)由于在肿瘤发生发展、侵袭转移、化疗抗性等各个环节均发挥关键作用已成为抗肿瘤药物研究的热点。

表皮生长因子受体(EGFR，epidermalgrowthfactorreceptor，又称HER1或cerbB1)是人类癌症中表达最广泛的酪氨酸激酶HER家族成员。EGFR结构包括三个区域：胞外区、跨膜区和胞内区；胞外区的氨基终端由622个氨基酸组成，有形成配体结合区的2个富含半胱氨酸段；跨膜区是个单一的α螺旋；胞内区包括激酶区和有许多酪氨酸磷酸化位点的羧基终端尾部。酪氨酸激酶(RTK)是把ATP的γ磷酸盐转运到酪氨酸残基，在与配体结合后，EGFR发生同源或异源二聚体化而使TK区域形成紧密连接。在羧基终端尾部RTK介导酪氨酸磷酸化位点进行磷酸化，创造了酶和联接子蛋白的结合位点(Y992，Y1068，Y1086，Y1148和Y11730)，从而能开始细胞内信号传导反应。这些信号传导形成不同的细胞反应，包括增殖、分化、粘附和血管形成，转移以及抑制凋亡。

研究表明，EGFR在非小细胞肺癌、***癌、乳癌、大肠癌、头颈癌、胃癌、卵巢癌和胰腺癌中都有表达，EGFR活化引发复杂信号传导反应。在不同类型的实体瘤中，EGFR有增殖和过度表达，导致下游信号传导失控而引起各种肿瘤的形成。EGFR中ATP结合位点的突变影响受体的RTK活性，干扰致瘤信号的形成，同时，EGFR还与肿瘤的进展和预后差密切相关。

由于EGFR和VEGFR在致瘤中的独特作用，其单克隆抗体和小分子抑制剂已经成为靶向性抗肿瘤药物研发的热点。目前，已经有数个靶向EGFR或VEGFR的抑制剂上市，近20个候选药物处在临床各个研发阶段。其中，吉非替尼和埃罗替尼代表上市较早的靶向EGFR的小分子抑制剂。吉非替尼(Gefitinib，又称ZD1839或Iressa)作为三线单一治疗药物用于晚期非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer，NSCLC)。埃罗替尼(Erlotinib，又称OSI774或Tarceva)作为标准方案治疗无效的晚期NSCLC的二线或三线治疗药物。

然而，随着这些药物的临床应用，人们发现并非所有高表达EGFR患者都能对这些药物有效，某些初始对吉非替尼(Gefitinib)有治疗反应的肿瘤在治疗几个月后又出现疾病进展。这些结果表明，目前使用的EGFR抑制剂抗肿瘤药物具有天然或继发性耐药现象，因此，发展新型具有低耐药性或能缓解早期抑制剂耐药性的药物已经成为酪氨酸激酶抑制剂的新发展方向。

发明内容

针对现有技术所存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR抑制活性的噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用。

本发明提供的噻吩并嘧啶类衍生物，是具有通式I或通式II或通式III的化合物：

上述通式中：

Ar为苯基、卤素取代的苯基、C_1-6烷基取代的苯基、联苯基、卤素取代的联苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、卤素取代的噻吩基、C_1-3烷基取代的噻吩基、呋喃基、卤素取代的呋喃基、C_1-3烷基取代的呋喃基中的任意一种；

A、D、E分别为碳原子或氮原子，但A、D、E不同时为碳原子；

R为R¹——NH——、 其中：R¹为氢、C₁～C₆烷基、C₃～C₆环烷基、C₁～C₆烷基取代的酰基、C₃～C₆环烷基取代的酰基、C₁～C₆烷基取代的酯基或C₃～C₆环烷基取代的酯基；R²为氢、C₁～C₆烷基、C₃～C₆环烷基、羟基取代的C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷基取代的酰基、C₁～C₆烷羟基取代的酰基、C₃～C₆环烷基取代的酰基、C₁～C₆烷基取代的酯基、C₃～C₆环烷基取代的酯基、磺酰基或C₁～C₆烷基取代的磺酰基；R³、R⁴、R⁵分别为氢、C₁～C₆烷基、C₃～C₆环烷基或羟基取代的C₁～C₆烷基。

作为一种优选方案，所述的噻吩并嘧啶类衍生物，是具有通式I或通式II或通式III的化合物，且通式中：Ar为苯基；A、D、E分别为碳原子或氮原子，但A、D、E不同时为碳原子；R为R¹——NH——、 其中：R¹为氢或C₁～C₆烷基取代的酯基；R²为氢、C₁～C₆烷基、羟基取代的C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷基取代的酰基、C₁～C₆烷羟基取代的酰基、C₃～C₆环烷基取代的酰基或C₁～C₆烷基取代的磺酰基；R³、R⁴、R⁵分别为氢或C₁～C₆烷基。

作为进一步优选方案，所述的噻吩并嘧啶类衍生物，是具有如下化学结构式的化合物：

一种本发明所述的通式I表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，包括如下路线中的步骤③或步骤①和③或步骤②和③或步骤①～③：

所述路线中的Ar、A、D、E及R的定义均如上所述。

一种本发明所述的通式II表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，包括如下路线中的步骤⑤或步骤②和⑤或步骤④和⑤或步骤②、④和⑤：

所述路线中的Ar、A、D、E及R的定义均如上所述。

一种本发明所述的通式III表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，包括如下路线中的步骤⑥或步骤②和⑥：

所述路线中的Ar、A、D、E及R的定义均如上所述。

作为一种优选方案，所述的步骤③、步骤⑤和步骤⑥均是在Pd-催化剂作用下进行的Suzuki偶联反应。

作为进一步优选方案，所述的Pd-催化剂为二氯双(三苯基膦)钯、四(三苯基膦)钯或[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯。

另一种本发明所述的通式II表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，是由通式I表示的噻吩并嘧啶类衍生物进行酰胺还原反应而得。

作为一种优选方案，进行酰胺还原反应的还原剂为LiAlH₄、红铝(Red-Al)或硼烷络合物。

因研究表明本发明所述的噻吩并嘧啶类衍生物具有表皮生长因子受体(EGFR)和/或血管生长因子受体(VEGFR)的抑制活性，因此，本发明所述的噻吩并嘧啶类衍生物或所述衍生物的互变异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、药学上可接受的盐、药学上可接受的溶剂合物中的任意一种或几种的混合物，可应用于制备酪氨酸激酶抑制剂，尤其可应用于制备EGFR和/或VEGFR抑制剂。

同时，所述的抑制剂可应用于制备预防或治疗与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关疾病的药物；具体说，可应用于制备预防或治疗与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关的细胞异常增殖、形态变化、运动功能亢进、血管新生及肿瘤转移疾病的药物。

另外，所述的抑制剂可应用于制备治疗或预防与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关的肿瘤生长和转移的药物。

更进一步说，本专利所述抑制剂的活性成分优选表1中所示化合物或所示化合物的互变异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、药学上可接受的盐、药学上可接受的溶剂合物中的任意一种或几种的混合物：

表1

所述的药学上可接受的盐非限制性地包括：无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐，如甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐等；烷基磺酸盐，如甲基磺酸盐、乙基磺酸盐等；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。

所述的药学上可接受的溶剂合物非限制性地包括所述的化合物与水、乙醇、异丙醇、***、丙酮等的溶剂合物。

与现有技术相比，本发明提供的噻吩并嘧啶类衍生物的结构新颖，具有明显的EGFR抑制活性，而且部分化合物对VEGFR也具有明显抑制活性，可望开发为酪氨酸激酶EGFR或/和VEGFR抑制剂，用于制备预防或治疗与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关的细胞异常增殖、形态变化以及运动功能亢进等相关疾病及与血管新生或肿瘤转移相关疾病的药物，尤其可望用于制备治疗或预防与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关的肿瘤生长和转移的药物，为发展新型具有低耐药性或能缓解早期抑制剂耐药性的酪氨酸激酶抑制剂药物提供了新的发展方向和途径，具有广阔的应用前景和药用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。

下述实施例中所制得的化合物的结构是通过核磁共振(¹HNMR)和质谱(MS)予以确定。

¹HNMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。¹HNMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定的溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6作为单位给出。

MS的测定是用FINNIGANLCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Therm，型号：FinniganLCQadvantageMAX)。

IC₅₀值的测定是用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。

薄层硅胶是使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。

硅胶柱层析是使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。

HPLC测试是使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(SunfireC18150×4.6mm色谱柱)和Waters2695-2996高压液相色谱仪(GiminiC18150×4.6mm色谱柱)。

微波反应是使用CEMDiscover-S908860型微波反应器。

另外，以下实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行。

氩气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

以下实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。

实施例1：化合物I-1的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(2.02g，10mmol)和N-甲基哌嗪(1g，10mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(2.03g，15mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.88g，15mmol)和N，N-二异丙基乙胺(3.88g，30mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(200ml)，二氯甲烷(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮(1.7g，橙红色油状物)，收率：60％；直接用于下一步反应。

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮(400mg，1.41mmol)和联硼酸频那醇酯(393mg，1.55mmol)溶解于二氧六环(10ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(57mg，0.07mmol)、醋酸钾(414mg，4.23mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于甲醇，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(300mg，棕色固体)，收率：64％；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(300mg，1.2mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(220mg，0.63mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(8ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(73mg，0.063mmol)、碳酸钠溶液(1N，2.0ml)，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮(260mg，棕色固体)，收率87.5％。

MSm/z(ESI)：475.6[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.10(s，1H)，8.39(m，3H)，8.04(s，1H)，7.75(d，1H)，7.46(m，2H)，7.30(m，2H)，7.24(m，1H)，5.48(m，1H)，5.03(m，1H)，3.80(m.2H)，3.69(m，4H)，2.47(m，4H)，2.19(s，3H)。

实施例2：化合物I-2的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(303mg，1.5mmol)和N-乙基哌嗪(172mg，1.5mmol)溶解于二氯甲烷(15ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(244mg，1.8mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(346mg，1.8mmol)和N，N-二异丙基乙胺(582mg，4.5mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(100ml)，二氯甲烷(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-(4-乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(400mg，黄色油状物)，收率：89％；直接用于下一步反应。

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-(4-乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(400mg，1.34mmol)和联硼酸频那醇酯(381mg，1.5mmol)溶解于二氧六环中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(33mg，0.04mmol)、醋酸钾(395mg，4.02mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于甲醇，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(313mg，棕色固体)，收率：67％；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(313mg，1.19mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(378mg，1.08mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(124.8mg，0.108mmol)、碳酸钠溶液(1N，3.0ml)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-(4-乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(454mg，棕色固体)，收率86％。

MSm/z(ESI)：489.6[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.10(s，1H)，8.39(m，3H)，8.04(s，1H)，7.76(d，1H)，7.46(m，2H)，7.30(m，2H)，7.24(m，1H)，5.47(m，1H)，5.02(m，1H)，3.81(m.2H)，3.65(m，4H)，2.43(m，4H)，2.35(m，2H)，1.01(t，3H)。

实施例3：化合物I-3的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(2.02g，10mmol)和N-乙基哌嗪(1.30g，10mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(2.03g，15mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.88g，15mmol)和N，N-二异丙基乙胺(3.88g，30mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(200ml)，二氯甲烷(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-(4-羟乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(2.2g，白色固体)，收率：88％。

¹HNMR(400Hz，CDCl₃)：8.64(s，1H)，7.94(m，1H)，7.59(m，1H)，3.83(m，2H)，3.66(m，4H)，2.63(m，6H)。

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-(4-羟乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(628mg，2.0mmol)和联硼酸频那醇酯(1014mg，4mmol)溶解于二氧六环中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(81.6mg，0.1mmol)、醋酸钾(588mg，6mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于甲醇，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(350mg，棕色固体)，收率：62％；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(216.6mg，0.77mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(105mg，0.3mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(35mg，0.03mmol)、碳酸钠溶液(95mg，0.9mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-4-(2-羟基-乙基)-哌嗪-1-基]-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-甲酮(50mg，黄色固体)，收率33％。

MSm/z(ESI)：538.98[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.07(s，1H)，8.47-8.25(m，3H)，8.01(s，1H)，7.72(d，1H)，7.42(d，2H)，7.29(t，2H)，7.19(t，1H)，5.43(d，1H)，5.07(s，1H)，4.58(s，1H)，3.86-3.60(m，4H)，3.52(d，4H)，3.02(m，3H)，2.54(s，6H)。

实施例4：化合物I-4的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(2.02g，10mmol)和1-甲烷磺酰基哌嗪(2.46g，15mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(2.7g，20mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.83g，20mmol)和N，N-二异丙基乙胺(6.46g，50mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(200ml)，二氯甲烷(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-甲酮(3.05g，白色固体)，收率：87.6％。

MSm/z(ESI)：349[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.74(s，1H)，8.22(d，1H)，7.60(d，1H)，3.75(m，2H)，3.54(m，2H)，3.22(m，2H)，3.12(m，2H)，2.91(s，3H)。

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-甲酮(696mg，2mmol)和联硼酸频那醇酯(1016mg，4mmol)溶解于二氧六环中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(163.2mg，0.2mmol)、醋酸钾(588mg，6mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(237mg，棕色固体)；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(237mg，0.75mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(105mg，0.3mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(35mg，0.03mmol)、碳酸钠(95mg，0.9mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]--吡啶-2-基}-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-甲酮(40mg，黄色固体)，收率26％。

MSm/z(ESI)：504.6[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.07(d，1H)，8.44(m，3H)，8.06(s，1H)，7.79(d，1H)，7.44(d，2H)，7.31(d，2H)，7.24(d，1H)，5.46(s，1H)，5.04(s，1H)，3.79(s，1H)，3.62(s，2H)，3.25(s，2H)，3.16(s，2H)，2.93(s，3H)。

实施例5：化合物I-5的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(2.5g，12.4mmol)和吗啉(11g，12.4mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(2.5g，18.6mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.6g，18.6mmol)和N，N-二异丙基乙胺(4.8g，37.2mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(200ml)，二氯甲烷(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-吗啉-4-基-甲酮(2.13g，白色固体)，收率：64％。

MSm/z(ESI)：272[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.74(s，1H)，8.22(m，1H)，7.59(m，1H)，3.55(m，4H)，3.43(m，4H)。

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-吗啉-4-基-甲酮(271mg，1mmol)和联硼酸频那醇酯(330mg，1.3mmol)溶解于二氧六环中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(40.8mg，0.04mmol)、醋酸钾(294mg，3mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(218mg，棕色固体)；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(218mg，0.92mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(200mg，0.57mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(33mg，0.108mmol)、碳酸钠溶液(1N，3.0ml)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-吗啉-4-基-甲酮(80mg，棕色固体)，收率26％。

MSm/z(ESI)：461.89[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.10(s，1H)，8.41(m，3H)，8.04(s，1H)，7.77(d，1H)，7.45(m，2H)，7.32(m，2H)，7.22(m，1H)，5.47(m，1H)，5.04(m，1H)，3.81(m.2H)，3.69(m，4H)，3.59(m，4H)。

实施例6：化合物I-6的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(2.0g，9.9mmol)和2，6-二甲基吗啉(1.14g，9.9mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(2.0g，14.9mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.85g，14.9mmol)和N，N-二异丙基乙胺(3.8g，29.7mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(200ml)，二氯甲烷(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-(2，6-二甲基吗啉-4-基)-甲酮(2.18g，白色固体)，收率：75％。

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.75(s，1H)，8.21(d，1H)，7.59(d，1H)，4.35(d，1H)，3.55(m，4H)，2.78(t，1H)，1.16(d，3H)，0.99(d，3H)。

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-(2，6-二甲基吗啉-4-基)-甲酮(299.2mg，1mmol)和联硼酸频那醇酯(330mg，1.3mmol)溶解于二氧六环中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(40.8mg，0.04mmol)、醋酸钾(294mg，3mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(320mg，棕色固体)；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(320mg，1.2mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(250mg，0.71mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(41mg，0.036mmol)、碳酸钠(225mg，2.13mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-甲酮(85mg，棕色固体)，收率24％。

MSm/z(ESI)：489.98[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.09(s，1H)，8.42(m，3H)，8.02(s，1H)，7.73(d，1H)，7.42(d，2H)，7.30(t，2H)，7.21(d，1H)，5.45(d，1H)，4.98(s，1H)，4.39(d，1H)，3.72(d，3H)，3.55(s，2H)，2.90-2.75(m，1H)，1.20-1.09(m，3H)，1.00(d，3H)。

实施例7：化合物I-7的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲酸(1.0g，4.95mmol)和四氢吡咯(0.35g，4.95mmol)溶解于二氯甲烷(30ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(0.8g，5.94mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.14g，5.94mmol)和N，N-二异丙基乙胺(1.92g，14.85mmol)，室温搅拌24小时，向反应液里加入水(100ml)，二氯甲烷(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-吡啶-2-基)-吡咯烷基-哌嗪-1-基)-甲酮(800mg，白色固体)，收率：61.5％。

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.76(s，1H)，8.22(d，1H)，7.70(d，1H)，3.50-3.63(d，4H)，1.87(s，4H).

第二步：

室温下，将(5-溴-吡啶-2-基)-吡咯烷基-哌嗪-1-基)-甲酮(300mg，118mmol)和联硼酸频那醇酯(388mg，1.53mmol)溶解于二氧六环中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(43mg，0.059mmol)、醋酸钾(347mg，3.54mmol)，氮气置换，加热至120℃反应24小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(340mg，棕色固体)；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(340mg，1.54mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(200mg，0.57mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(40mg，0.034mmol)、碳酸钠(181mg，1.71mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-吡咯烷-1-基-甲酮(56mg，类白色固体)，收率22％。

MSm/z(ESI)：445.96；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.05(s，1H)，8.38(m，3H)，8.05(s，1H)，7.88(d，1H)，7.45(d，2H)，7.32(m，2H)，7.25(m，1H)，5.47(m，1H)，4.99(m，1H)，3.79(m，2H)，3.75(m，2H)，3.54(m，2H)，1.88(m，4H)。

实施例8：化合物II-1的制备

第一步：

室温下，将5-溴-2-吡啶羧酸(1.65g，8.19mmol)溶解于甲醇溶液(30ml)中，然后滴加浓硫酸(2.5ml)，加热，冷凝回流，反应12小时，将反应液缓慢滴加到饱和的碳酸氢钠溶液(200ml)中，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到5-溴-2吡啶羧酸甲酯(白色固体，1.39g)，收率：79％。

第二步：

将5-溴-2-吡啶羧酸甲酯(648mg，3mmol)溶解于甲醇溶液(10ml)中，在冰浴下缓慢加入硼氢化钠(340mg，9mmol)，加完后撤去冰浴，升温至室温，搅拌反应12小时；然后加入1N的HCl调PH值至1，再向里加入饱和的碳酸氢钠溶液调PH值至8，然后用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到5-溴-2-吡啶甲醇(535mg，白色固体)，收率：94.8％。

第三步：

室温下，将5-溴-2-吡啶甲醇(500mg，2.66mmol)溶解于氯化亚砜(5ml)中，室温搅拌，反应12小时，减压浓缩，得到5-溴-2-氯甲基吡啶(635mg，白色固体)，收率：98％。

第四步：

将5-溴-2-氯甲基吡啶(2.43g，10mmol)和N-Boc哌嗪(2.8g，15mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中，然后加入碳酸钾(4.84g，35mmol)，室温搅拌反应12小时，冷却后向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到4-(5-溴-吡啶-2-甲基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3g，类白色固体)，收率：84％。

第五步：

室温下将4-(5-溴-吡啶-2-甲基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3g，8.42mmol)和联硼酸频那醇酯(2.56g，10.1mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(15ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.308g，0.42mmol)和醋酸钾(1g，10.1mmol)，氮气置换，85℃下反应12小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(1.97g，棕色固体)，收率：73％；直接用于下一步反应。

第六步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(1.97g，6.13mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(1.95g，5.57mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(15ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(0.644g，0.56mmol)、碳酸钠(1.77g，16.7mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-甲基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(2.3g，红色固体)，收率76％。

MSm/z(ESI)：547.6。

第七步：

在冰浴下，将乙酸乙酯的盐酸溶液(1.1N，70ml)缓慢加入(S)-4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-甲基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯的二氯甲烷溶液中，加完撤去冰浴，室温搅拌，反应4小时，减压浓缩，然后加入饱和碳酸钠溶液(100ml)，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到产品2-苯基-2-[6-(6-哌嗪-1-甲基-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基]-乙醇(1.69g，棕色固体)，收率：89.9％。

实施例9：化合物II-2的制备

第一步：

室温下将N-甲基哌嗪(301mg，3mmol)和5-溴-2-嘧啶甲酸(507mg，2.5mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(405mg，3mmol)，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(575mg，3mmol)，三乙胺(0.8ml)，室温搅拌，反应12小时，向里加水(100ml)，用二氯甲烷(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-嘧啶-2-基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮(320mg，黄色固体)，收率：45％。

MSm/z(ESI)：285.96；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.11(s，2H)，3.64(m，2H)，3.17(m，2H)，2.51(m，2H)，2.37(m，2H)，2.25(s，3H)。

第二步：

室温下将(5-溴-嘧啶-2-基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮(300mg，1.05mmol)和联硼酸频那醇酯(321mg，1.26mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(38mg，0.053mmol)和醋酸钾(308mg，3.15mmol)，氮气置换，85℃下反应12小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应的嘧啶取代硼酸(200mg，棕色固体)，收率：76％；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(200mg，0.80mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(223mg，0.67mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(39mg，0.034mmol)、碳酸钠(213mg，2.01mmol)，氮气置换，85℃反应4小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-嘧啶-2-基}-甲酮(120mg，白色固体)，收率：37％。

MSm/z(ESI)：475.98；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.10(s，2H)，8.30(m，1H)，7.95(s，1H)，7.63(s，1H)，7.45(m，2H)，7.33(m，2H)，7.24(m，1H)，5.45(m，1H)，5.00(m，1H)，3.79(m，2H)，3.64(m，2H)，3.18(m，2H)，2.51(m，2H)，2.38(m，2H)，2.26(s，3H)。

实施例10：化合物II-3的制备

第一步：

室温下将N-乙基哌嗪(274mg，2.4mmol)和5-溴-2-嘧啶甲酸(406mg，2mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后依次加入1-羟基苯并***(324mg，2.4mmol)，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(460mg，2.4mmol)，三乙胺(0.8ml)，室温搅拌，反应12小时，向里加水(100ml)，用二氯甲烷(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(5-溴-嘧啶-2-基)-(4-乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(287mg，白色固体)，收率：48％。

MSm/z(ESI)：300.06；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.11(s，2H)，3.64(m，2H)，3.18(m，2H)，2.28-2.24(m，6H)，1.00(m，3H)。

第二步：

室温下将(5-溴-嘧啶-2-基)-(4-乙基-哌嗪-1-基)-甲酮(280mg，0.94mmol)和联硼酸频那醇酯(285mg，1.12mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(34mg，0.047mmol)和醋酸钾(276mg，2.82mmol)，氮气置换，85℃下反应12小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应的嘧啶取代硼酸(194mg，棕色固体)，收率：78％；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(194mg，0.73mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(214mg，0.61mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(35mg，0.031mmol)、碳酸钠(194mg，1.83mmol)，氮气置换，85℃反应4小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-(4-乙基-哌嗪-1-基)-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-嘧啶-2-基}-甲酮(87mg，白色固体)，收率：29％。

MSm/z(ESI)：490.23；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.11(s，2H)，8.29(m，1H)，7.94(s，1H)，7.63(s，1H)，7.45(m，2H)，7.33(m，2H)，7.24(m，1H)，5.46(m，1H)，5.01(m，1H)，3.79(m，2H)，3.64(m，2H)，3.18(m，2H)，2.28-2.24(m，6H)，1.01(m，3H)。

实施例11：化合物II-4的制备

第一步：

室温下将2-苯基-2-[6-(6-哌嗪-1-甲基-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基]-乙醇(334mg，0.6mmol)和溴乙醇(113mg，0.9mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(15ml)中，然后加入碳酸钾(497mg，3.6mmol)，室温搅拌过夜，再向里加水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-(6-{6-[4-(2-羟基-乙基)-哌嗪-1-甲基]-吡啶-3-基}-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基)-2-苯基-乙醇(25mg，白色粉末)，收率：8％。

MSm/z(ESI)：490.92；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.03(d，1H)，8.43(s，1H)，8.37(m，1H)，8.28(m，1H)，7.96(s，1H)，7.63(d，1H)，7.49(d，2H)，7.35(m，2H)，7.28(m，1H)，5.49(m，1H)，5.07(m，1H)，3.84(m，2H)，3.75(s，2H)，3.46(m，6H)，2.55(m，6H)。

实施例12：化合物II-5的制备

第一步：

其中5-溴-2-氯甲基吡啶的制备同实施例8中所述。

将5-溴-2-氯甲基吡啶(243mg，2mmol)和N-异丁酰哌嗪(289mg，3mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入碳酸钾(691mg，10mmol)，室温搅拌反应12小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到1-[4-(5-溴-吡啶-2-甲基)-哌嗪-1-基]-2-甲基-丙烷-1-酮(282mg，油状物)，收率：86％。

第二步：

室温下将1-[4-(5-溴-吡啶-2-甲基)-哌嗪-1-基]-2-甲基-丙烷-1-酮(280mg，0.86mmol)和联硼酸频那醇酯(262mg，1.03mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(32mg，0.43mmol)和醋酸钾(102mg，1.03mmol)，氮气置换，85℃下反应12小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(204mg，棕色固体)，收率：82％；直接用于下一步反应。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(204mg，0.7mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(223mg，0.64mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(74mg，0.064mmol)、碳酸钠(203mg，1.92mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-1-(4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-甲基}-哌嗪-1-基)-2-甲基-丙烷-1-酮(192mg，淡黄色固体)，收率：58％。

MSm/z(ESI)：517.6；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.01(s，1H)，8.39(s，1H)，8.29(m，2H)，7.94(s，1H)，7.63(d，1H)，7.45(d，2H)，7.33(m，2H)，7.24(m，1H)，5.46(m，1H)，5.01(m，1H)，3.79(m，2H)，3.72(s，2H)，3.51(m，4H)，2.86(m，1H)，2.41(m，4H)，0.99(d，6H)。

实施例13：化合物II-6的制备

第一步：

室温下，将2-苯基-2-[6-(6-哌嗪-1-甲基-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基]-乙醇(166mg，0.3mmol)和乙醇酸(35mg，0.45mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(8ml)中，然后加入O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(145mg，0.45mmol)和N，N-二异丙基乙胺(388mg，3mmol)，室温搅拌反应30分钟，向里加水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-羟基-1-(4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙氨基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-甲基}-哌嗪-1-基)-乙酮(80mg，灰白色固体)，收率：53％。

MSm/z(ESI)：504.9；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.00(d，1H)，8.39(s，1H)，8.26(m，2H)，7.93(s，1H)，7.62(d，1H)，7.44(d，2H)，7.27(m，2H)，7.21(m，1H)，5.46(m，1H)，4.98(m，1H)，3.80(m，2H)，3.70(s，2H)，3.46(m，4H)，3.33(s，2H)，2.47(m，4H)。

实施例14：化合物II-7的制备

第一步：

室温下，将2-苯基-2-[6-(6-哌嗪-1-甲基-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基]-乙醇(166.8mg，0.3mmol)和2-羟基异丁酸(46.8mg，0.45mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(8ml)中，然后加入O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(144.5mg，0.45mmol)和N，N-二异丙基乙胺(388.5mg，3mmol)，室温搅拌反应30分钟，向里加水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-羟基-1-(4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-yl]-吡啶-2-甲基}-哌嗪-1-yl)-2-甲基-丙烷-1-酮(70mg，灰白色固体)，收率：43.8％。

MSm/z(ESI)：533.0；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.01(d，1H)，8.39(s，1H)，8.27(m，2H)，7.94(s，1H)，7.63(d，1H)，7.45(d，2H)，7.29(m，2H)，7.22(m，1H)，5.45(m，1H)，5.03(m，1H)，3.80(m，4H)，3.71(m，4H)，2.45(m，4H)，1.32(s，6H)。

实施例15：化合物II-8的制备

第一步：

其中5-溴-2-氯甲基吡啶的制备同实施例8中所述。

将5-溴-2-氯甲基吡啶(500mg，2.06mmol)和1-甲烷磺酰基哌嗪(440mg，2.68mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入碳酸钾(996mg，7.21mmol)，室温搅拌反应12小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到1-(5-溴-吡啶-2-甲基)-4-甲磺酰基-哌嗪(520mg，类白色固体)，收率：75.6％。

第二步：

室温下将1-(5-溴-吡啶-2-甲基)-4-甲磺酰基-哌嗪(334mg，1mmol)和联硼酸频那醇酯(330mg，1.3mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(40mg，0.05mmol)和醋酸钾(294mg，3mmol)，氮气置换，85℃下反应12小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(230mg，棕色固体)，收率：76％。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(230mg，0.77mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(170mg，0.48mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(28mg，0.024mmol)、碳酸钠(153mg，1.44mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-2-{6-[6-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-甲基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基}-2-苯基-乙醇(50mg，黄色固体)，收率20％。

MSm/z(ESI)：524.98；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.04(d，1H)，8.40(s，1H)，8.27(m，2H)，7.95(s，1H)，7.56(d，1H)，7.43(d，2H)，7.30(m，2H)，7.22(m，1H)，5.46(m，1H)，5.24(s，2H)，4.96(m，1H)，3.77(m，2H)，3.56(m，4H)，3.16(m，4H)，2.91(s，3H)。

实施例16：化合物II-9的制备

第一步：

其中5-溴-2-氯甲基吡啶的制备同实施例8中所述。

将5-溴-2-氯甲基吡啶(486mg，2mmol)和硫代吗啉1，1-二氧化物(406mg，3mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入碳酸钾(986mg，7mmol)，室温搅拌反应12小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，得到1-(5-溴-吡啶-2-甲基)-(1，1-二氧-硫代吗啉)-哌嗪(499mg，类白色固体)，收率：81.8％。

第二步：

室温下将1-(5-溴-吡啶-2-甲基)-(1，1-二氧-硫代吗啉)-哌嗪(152mg，0.5mmol)和联硼酸频那醇酯(153mg，0.6mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(21mg，0.025mmol)和醋酸钾(59mg，0.6mmol)，氮气置换，85℃下反应12小时，反应液减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，过滤，滤液减压浓缩，得到相应吡啶取代硼酸(118mg，棕色固体)，收率：87％。

第三步：

室温下将相应吡啶取代硼酸(118mg，0.44mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(140mg，0.40mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(47mg，0.04mmol)、碳酸钠(85mg，0.8mmol)，氮气置换，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到(S)-2-{6-[6-(1，1-二氧-硫代吗啉-4-甲基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-氨基}-2-苯基-乙醇(60mg，黄色固体)，收率30％。

MSm/z(ESI)：496.63；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.00(d，1H)，8.39(s，1H)，8.23(m，2H)，7.92(s，1H)，7.66(d，1H)，7.43(d，2H)，7.31(m，2H)，7.23(m，1H)，5.45(m，1H)，4.94(m，1H)，3.86(s，2H)，3.76(m，2H)，3.14(m，4H)，2.99(m，4H)。

实施例17：合物III-1的制备

室温下，将{5-[4-(2-羟基-1-苯基l-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-氨基甲酸叔丁酯溶解于二氯甲烷(2ml)中，然后加入三氟乙酸(257.4mg，2.58mmol)，室温反应2小时，向里加入饱和碳酸钠溶液(100ml)，用二氯甲烷(50ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-[6-(6-氨基-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(30mg，白色固体)，收率：76％。

MSm/z(ESI)：363.92[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.47(m，3H)，7.92(d，1H)，7.64(s，1H)，7.53(d，2H)，7.46(m，3H)，6.81(m，3H)，5.48(m，1H)，5.10(m，1H)，3.86(m，2H)。

实施例18：合物III-2的制备

第一步：

室温下，将2-氨基-5-溴吡啶(5g，29mmol)和二碳酸二叔丁酯(6.9g，32mmol)溶解于四氢呋喃(28ml)中，加热至70℃，冷凝回流，反应24小时，减压浓缩，得到的粗品用***∶石油醚(1∶1)洗涤，减压浓缩得到2-Boc氨基-5-溴吡啶(5g，白色固体)，收率：63％。

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.99(s，1H)，8.36(s，1H)，7.80(d，1H)，7.77(d，1H)，1.47(d，9H)。

第二步：

室温下，将2-Boc氨基-5-溴吡啶(150mg，0.55mmol)和联硼酸频那醇酯(181mg，0.71mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，然后加入醋酸钾(161mg，1.65mmol)、[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(23mg，0.028mmol)，微波100℃反应15分钟，向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-Boc氨基-5-联硼酸频那醇酯吡啶(17mg，白色固体)，收率：20％。

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：9.99(s，1H)，8.47(s，1H)，7.93(m，2H)，1.48(s，9H)，1.28(m，12H)。

第三步：

室温下将2-Boc氨基-5-联硼酸频那醇酯吡啶(96.7mg，0.3mmol)和2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(70mg，0.2mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，然后加入四(三苯基膦)钯(23mg，0.02mmol)、碳酸钠溶液(1N，0.6ml)，85℃反应2小时，冷却后向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到{5-[4-(2-羟基-1-苯基l-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-氨基甲酸叔丁酯(60mg，类白色固体)，收率67％。

MSm/z(ESI)：463.76[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：10.1(s，1H)，8.77(s，1H)，8.39(s，1H)，8.23(m，2H)，7.99(d，1H)，7.83(s，1H)，7.47(d，2H)，7.35(t，2H)，7.26(t，1H)，5.50(m，1H)，4.99(m，1H)，3.76(m，2H)，1.52(s，9H)。

实施例19：合物III-3的制备

第一步：

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(146mg，0.4mmol)和N-Boc哌嗪(223mg，1.2mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基l-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(200mg，浅黄色固体)，收率：94％；直接用作下一步反应。

第二步：

将4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基l-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(200mg，0.38mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，然后加入三氟乙酸(0.6ml，0.008mmol)，室温下搅拌反应直至TLC监测原料反应完全，加入200ml乙酸乙酯，再搅拌下缓慢滴加饱和碳酸氢钠，萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-苯基-2-[6-(6-哌嗪-1-基-吡啶-3-yl)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-乙醇(13mg，黄色固体)，收率：8％。

MSm/z(ESI)：433.15[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.61(d，1H)，8.34(s，1H)，8.09(d，1H)，8.03(dd，1H)，7.68(s，1H)，7.45(d，2H)，7.24(m，3H)，7.01(d，1H)，5.45(m，1H)，4.99(m，1H)，3.80(m，2H)，3.55(m，9H)。

实施例20：合物III-4的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(96mg，0.26mmol)和N-甲基哌嗪(79mg，0.79mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-{6-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺}-2-苯基-乙醇(23mg，黄绿色固体)，收率：20％。

MSm/z(ESI)：447.07[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.60(d，1H)，8.35(s，1H)，8.08(d，1H)，8.01(dd，1H)，7.66(s，1H)，7.46(d，2H)，7.29(m，3H)，6.96(d，1H)，5.44(m，1H)，4.97(m，1H)，3.78(m，2H)，3.62(m，4H)，2.41(m，4H)，2.23(s，3H)。

实施例21：化合物III-5的制备

第一步：

室温下将2-氟吡啶-5-硼酸(282mg，2.0mmol)与2-(6-溴-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺)-2-苯基l-乙醇(800.8mg，2.2mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺中(20ml)，然后依次加入四三苯基膦钯(231mg，0.2mmol)，碳酸钾(828mg，6mmol)，氮气保护，加热至85℃，反应12小时。向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(580mg，类白色固体)，收率：79％。

MSm/z(ESI)：367.13[M+1]。

第二步：

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(146mg，0.4mmol)和N-乙基哌嗪(88mg，0.6mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-{6-[6-(4-乙基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺}-2-苯基-乙醇(100mg，浅黄色固体)，收率：54％。

MSm/z(ESI)：461.64[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.60(s，1H)，8.34(s，1H)，8.09(d，1H)，8.01(d，1H)，7.66(s，1H)，7.40(d，2H)，7.24(m，3H)，6.98(d，1H)，5.44(m，1H)，4.98(m，1H)，3.79(m，2H)，3.64(m，4H)，2.47(m，6H)，1.07(t，3H)。

实施例22：合物III-6的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(96mg，0.26mmol)和N-羟乙基哌嗪(102mg，0.79mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入100ml水，用乙酸乙酯(100ml*2)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-{6-[6-(4--(2-羟基-乙基)-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺}-2-苯基-乙醇(38mg，黄绿色固体)，收率：31％。

MSm/z(ESI)：477.06[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.59(d，1H)，8.35(s，1H)，8.06(d，1H)，7.99(dd，1H)，7.66(s，1H)，7.46(d，2H)，7.29(m，3H)，6.97(d，1H)，5.44(m，1H)，4.97(m，1H)，4.46(m，1H)，3.76(m，2H)，3.58(m，8H)，2.39(m，4H)。

实施例23：合物III-7的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(110mg，0.3mmol)和N-环丙基羰基哌嗪(138mg，0.9mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到环丙基-(4-{5-[4-(2-羟基-1-苯基-乙胺)-噻吩[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-哌嗪-1-基)-甲酮(15mg，淡黄色固体)，收率：10％。

MSm/z(ESI)：501.19[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.63(d，1H)，8.35(s，1H)，8.09(d，1H)，8.02(dd，1H)，7.68(s，1H)，7.45(d，2H)，7.32(m，3H)，7.01(d，1H)，5.45(m，1H)，4.97(m，1H)，3.79(m，2H)，3.69(m，8H)，2.01(m，1H)，0.77(m，4H)。

实施例24：合物III-8的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(100mg，0.27mmol)和1-甲烷磺酰哌嗪(44.8mg，0.27mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(3ml)中，然后加入碳酸钾(138mg，0.410mmol)，室温搅拌20小时，向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-{6-[6-(4-甲磺酰-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺}-2-苯基-乙醇(35mg，黄绿色固体)，收率：25％。

MSm/z(ESI)：510.76[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.60(d，1H)，8.40(s，1H)，8.10(d，1H)，8.07(dd，1H)，7.75(s，1H)，7.48(d，2H)，7.30(m，3H)，7.11(d，1H)，5.48(m，1H)，5.08(m，1H)，3.89(m，6H)，3.21(m，4H)，2.97(s，3H)。

实施例25：合物III-9的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(150mg，0.4mmol)和吗啉(52mg，0.6mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-[6-(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(70mg，黄绿色固体)，收率：40％。

MSm/z(ESI)：434.16[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.63(s，1H)，8.36(s，1H)，8.09(d，1H)，8.01(d，1H)，7.68(s，1H)，7.45(d，2H)，7.34(m，3H)，6.98(d，1H)，5.46(m，1H)，4.98(m，1H)，3.72(m.2H)，3.65(m，4H)，3.57(m，4H)。

实施例26：合物III-10的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(110mg，0.3mmol)和2-甲基-八氢-吡咯[3，4-c]吡咯(113mg，0.9mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-{6-[6-(5-甲基-六氢-吡咯[3，4-c]吡咯-2-基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺}-2-苯基-乙醇(34mg，黄绿色固体)，收率：24％。

MSm/z(ESI)：473.15[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.60(d，1H)，8.35(s，1H)，8.08(d，1H)，8.01(dd，1H)，7.66(s，1H)，7.46(d，2H)，7.29(m，3H)，6.96(d，1H)，5.44(m，1H)，4.97(m，1H)，3.78(m.2H)，3.52(m，8H)，2.91(m，2H)，2.83(s，3H)。

实施例27：合物III-11的制备

室温下将2-[6-(6-氟-吡啶-3-基)-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺]-2-苯基-乙醇(109.8mg，0.3mmol)和硫代吗啉1，1-二氧化物(60.8mg，0.45mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中，室温搅拌20小时，向反应液中加入200ml水，用乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*3)洗涤，得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到2-{6-[6-(1，1-双氧代-硫代吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-噻吩[3，2-d]嘧啶-4-基胺}-2-苯基-乙醇(30mg，黄绿色固体)，收率：21％。

MSm/z(ESI)：482.03[M+1]；

¹HNMR(400Hz，DMSO-d₆)：8.61(d，1H)，8.28(s，1H)，8.25(d，1H)，8.04(dd，1H)，7.68(s，1H)，7.39(d，2H)，7.27(m，2H)，7.16(m，2H)，5.37(m，1H)，5.14(m，1H)，3.78(m，2H)，3.21(m，4H)，2.95(m，4H)。

生物学评价

1.受体酪氨酸激酶EGFR、VEGFR分子水平酶活抑制初步评价

(1)酶反应底物Poly(Glu，Tyr)4∶1用无钾离子的PBS(10mM磷酸钠缓冲液，150mmol/LNaCl，pH＝7.2～7.4)稀释成20μg/ml、125μl/孔包被酶标板，置37℃反应12～16小时，弃去孔中液体，洗板，用200μl/孔的T-PBS(含0.1％Tween-20的无钾离子的PBS)洗板三次，每次5分钟；于37℃烘箱中干燥酶标板1～2小时。

(2)每孔加入用反应缓冲液(50mmol/LHEPESpH7.4，50mmol/LMgCl₂，0.5mmol/LMnCl₂，0.2mmol/LNa₃VO₄，1mmol/LDTT)稀释的ATP溶液50μL，终浓度5μmol/L。每孔中加入1μl的化合物溶液(1％DMSO溶解，终浓度为10μmol/L)，再加入50μl用反应缓冲液稀释的c-Met酪氨酸激酶蛋白；置37℃摇床(100rpm)反应1小时；每次实验设无ATP对照孔两孔及相应DMSO溶剂对照孔(阴性对照孔)；弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。

(3)加入抗体PY99100μl/孔(抗体用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，浓度为0.4μg/ml)，37℃摇床反应0.5小时；弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。

(4)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μl/孔(抗体用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，浓度为0.5μg/ml)，37℃摇床反应0.5小时，弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。

(5)加入2mg/ml的OPD显色液100μl/孔(用含有0.03％H₂O₂的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.4)稀释)，25℃避光反应1～10分钟；(OPD溶解时需用超声，显色液需现配现用)。

(6)加入2mol/LH₂SO₄50μl/孔中止反应，用可调波长式微孔板酶标仪VERSAmax读数，波长为490nm。

(7)样品的抑制率通过下列公式求得：

2、受体酪氨酸激酶EGFR酶活抑制IC₅₀评价实验

将上述筛选得到的明确具有EGFR或VEGFR酶活抑制作用的化合物(化合物在10^-5M对受体酪氨酸激酶EGFR或VEGFR的抑制率＞50％)配成梯度浓度，进行IC₅₀(半数抑制浓度)评价。

通过测验，测量的按照本发明的许多化合物的活性显示在表1中。在这些表中，根据测试，“a”表示小于50纳摩尔浓度(nM)的抑制活性；“b”表示≥50但＜250纳摩尔浓度(nM)的抑制活性；“c”表示≥250但＜500纳摩尔浓度(nM)的抑制活性，“d”表示≥500纳摩尔浓度(nM)的抑制活性；“e”表示没有活性。

3.体外抗肿瘤细胞增殖的IC₅₀测定

通过CCK-8检测试剂盒检测候选化合物对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431的细胞毒性抑制IC₅₀值。

(1).材料和方法

细胞株：A431人皮肤鳞状细胞癌细胞株(中科院上海细胞库)

试剂和耗材：

CellCountingKit-8(Cat#CK04-13，Dojindo)

96孔培养板(Cat#3599，CorningCostar)

胎牛血清(Cat#10099-141，GIBCO)

培养基(Invitrogen)

台式酶标仪SpectraMaxM5MicroplateReader(MolecularDevices)

(2).实验步骤

试剂配制

培养基的配制

细胞系：A431

培养基：DMEM+10％FBS

化合物的制备：用DMSO稀释化合物使终浓度为10mM。

细胞培养

a)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，

b)调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板，每孔接种100μl细胞悬液。

c)细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育24小时。

IC₅₀实验

a)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育24小时。

b)用培养基将待测化合物稀释至500μM后梯度稀释8次。按25μl/孔加入细胞。23个候选化合物作用终浓度从100μM至0μM，5倍梯度稀释，共10个浓度点。

c)细胞置于37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育72小时。

d)吸弃培养基，加入含10％CCK-8的完全培养基置于37℃培养箱中孵育2-4小时。

e)轻轻震荡后在SpectraMaxM5MicroplateReader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

数据处理

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝[(A_c-A_s)/(A_c-A_b)]×100％

A_s：样品的OA(细胞+CCK-8+待测化合物)

A_c：阴性对照的OA(细胞+CCK-8+DMSO)

A_b：阳性对照的OA(培养基+CCK-8+DMSO)

采用软件GraphpadPrism5拟合IC50曲线并计算出IC₅₀值

本实验测试了候选化合物对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431的的抗增值作用。化合物作用终浓度从100μM至0μM，5倍梯度稀释，共10个点。

实验结果如表2所示。

表2

由表2可见：本发明所述的噻吩并嘧啶类衍生物具有较好的酪氨酸激酶EGFR抑制活性，尤其是化合物II-2、II-5、II-6、III-3、III-4、III-5、III-6、III-7、III-10在10纳摩尔级具有比上市药物吉非替尼更好的活性；在细胞水平，化合物II-1、II-2、II-3、II-5、II-6、III-3、III-5、III-6、III-10也显示出明显的抑制A431细胞活性；可望开发为酪氨酸激酶抑制剂，具有广阔的应用前景和药用价值。

Claims (18)

1.一种噻吩并嘧啶类衍生物，其特征在于，是具有通式I：

的化合物，通式中：Ar为苯基；A为氮原子，D、E均为碳原子，R为其中的R²为C₁～C₆烷基、羟基取代的C₁～C₆烷基或C₁～C₆烷基取代的磺酰基，R³、R⁴分别为氢或C₁～C₆烷基；或者，

是具有通式II：

的化合物，通式中：Ar为苯基；A为氮原子，D为碳原子或氮原子，E为碳原子，R为其中的R²为氢、C₁～C₆烷基、羟基取代的C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷基取代的酰基、C₁～C₆烷羟基取代的酰基或C₁～C₆烷基取代的磺酰基；或者，

是具有通式Ⅲ：

的化合物，通式中：Ar为苯基；A为氮原子，D、E均为碳原子，R为R¹-NH-、 其中：R¹为氢或C₁～C₆烷基取代的酯基；R²为氢、C₁～C₆烷基、羟基取代的C₁～C₆烷基、C₃～C₆环烷基取代的酰基或C₁～C₆烷基取代的磺酰基；R³、R⁴均为氢；R⁵为C₁～C₆烷基。

2.根据权利要求1所述的噻吩并嘧啶类衍生物，其特征在于，是具有如下化学结构式的化合物：

3.一种权利要求1所述的通式I表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下路线中的步骤③或步骤①和③或步骤②和③或步骤①～③：

所述路线中的Ar、A、D、E及R的定义均如权利要求1中所述。

4.根据权利要求3所述的通式I表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于：所述的步骤③是在Pd-催化剂作用下进行的Suzuki偶联反应。

5.一种权利要求1所述的通式II表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下路线中的步骤⑤或步骤②和⑤或步骤④和⑤或步骤②、④和⑤：

所述路线中的Ar、A、D、E及R的定义均如权利要求1中所述。

6.根据权利要求5所述的通式II表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于：所述的步骤⑤是在Pd-催化剂作用下进行的Suzuki偶联反应。

7.一种权利要求1所述的通式Ⅲ表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下路线中的步骤⑥或步骤②和⑥：

所述路线中的Ar、A、D、E及R的定义均如权利要求1中所述。

8.根据权利要求7所述的通式Ⅲ表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于：所述的步骤⑥是在Pd-催化剂作用下进行的Suzuki偶联反应。

9.根据权利要求4、6或8所述的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于：所述的Pd-催化剂为二氯双(三苯基膦)钯、四(三苯基膦)钯或[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯。

10.一种权利要求1所述的通式II表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于：由通式I表示的噻吩并嘧啶类衍生物进行酰胺还原反应。

11.根据权利要求10所述的通式II表示的噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于：进行酰胺还原反应的还原剂为LiAlH₄、红铝或硼烷络合物。

12.一种酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于：包含权利要求1所述的噻吩并嘧啶类衍生物或所述衍生物药学上可接受的盐。

13.如权利要求12所述的酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于：所述的抑制剂是指EGFR和/或VEGFR抑制剂。

14.权利要求13所述的EGFR和/或VEGFR抑制剂在制备预防或治疗与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关疾病的药物中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于：所述的药物是与表皮生长因子受体EGFR和/或血管生长因子受体VEGFR相关的细胞异常增殖、形态变化、运动功能亢进、血管新生、肿瘤生长和/或转移的药物。

16.如权利要求13所述的酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于：抑制剂中的活性成分选自以下具体化合物或其药学上可接受的盐：

17.如权利要求12或16所述的酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于：所述的噻吩并嘧啶类衍生物药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐。

18.如权利要求17所述的酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于：所述噻吩并嘧啶类衍生物药学上可接受的盐是指盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐中的任意一种或几种。