CN104829700A

CN104829700A - 一种玉米CCCH型锌指蛋白及其编码基因ZmC3H54与应用

Info

Publication number: CN104829700A
Application number: CN201510236703.9A
Authority: CN
Inventors: 朱苏文; 徐倩倩; 赵阳; 彭元成; 彭晓剑
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开了一种玉米CCCH型锌指蛋白及其编码基因ZmC3H54与应用，本发明的一种玉米CCCH型锌指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明所述的玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因ZmC3H54，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明含有所述编码基因ZmC3H54的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。本发明ZmC3H54基因参与了胁迫应答，可以提高植物的抗非生物逆境胁迫能力。转基因植物对ABA都有较高的敏感性，转基因水稻对干旱的耐受性提高，本发明从玉米中分离克隆该家族基因并鉴定它在提高目的植物抗逆性方面所发挥的功能。

Description

一种玉米CCCH型锌指蛋白及其编码基因ZmC3H54与应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种玉米CCCH型锌指蛋白及其编码基因ZmC3H54与应用。

背景技术

玉米是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物。玉米是三大粮食作物中最适合作为工业原料的品种，在国民经济中占有重要的地位。但干旱、高盐等非生物胁迫严重影响玉米的产量，因此发掘和创建抗逆性强，高产，优质玉米新种质和选育新品种已成为实现玉米生产持续发展的关键所在。随着分子生物学以及植物基因工程育种技术的快速发展，通过基因工程育种技术提高玉米在逆境条件下的生产力，培育抗性较强的新品种，成为目前抗逆遗传改良的一个研究热点领域。

这种CCCH锌指蛋白广泛的存在于真核生物中，是一类重要的调控因子,在动植物的生长发育和对外界逆境的反应过程中起到了不能忽视的作用,它们大多数都跟RNA的代谢有关，通常可以在转录水平或者是转录后水平对基因的表达进行调控。植物中CCCH家族的基因众多，近年来通过生物信息学的办法,在拟南芥和水稻两种模式植物中分别鉴定出68和67个CCCH家族的基因,表达谱的分析还发现其中有一个亚家族中的大多数成员与拟南芥的逆境胁迫相关,为在植物中广泛研究这类蛋白走出了第一步(Wang et al.,2008a)。

一些CCCH锌指蛋白通过超量或抑制表达转基因和基因表达分析等方法证明在植物的发育、对环境压力的应答反应等方面发挥作用。CCCH型锌指蛋白是锌指蛋白家族中的一类，典型的CCCH锌指蛋白至少含有一个或者更多的由3个Cys和1个His顺序排列组成的锌指模体,这种结构可以被归纳为:C-X_5-14-C-X_4-5-C-X₃-H。X代表任意氨基酸残基,(Blackshear,2002；Wang et al.,2008a)。

如OsDOS被发现与水稻叶片的衰老相关(Kong et al.,2006)；AtSZFl和AtSZF2被发现在拟南芥对盐胁迫的反应中起作用(Sun et al.,2007)；GhZFPl被发现参与烟草对盐和病原物的胁迫反应(Guo et al.,2009)。AtTZFl是一个糖敏感的蛋白,参与赤霉素/脱落酸介导的植物发育过程和面对环境压力的反应(Pomeranz et al.,2010)。这些CCCH型锌指蛋白相关抗逆基因的功能报道目前多在拟南芥，水稻，棉花中，玉米中很少。非生物胁迫的研究已经很多了，低温、高盐、干旱等非生物胁迫一般会引起一些基因的变化或一些转录因子的结合。

目前，缺乏一种抗非生物逆境胁迫能力强的玉米CCCH型锌指蛋白ZmC3H54及其编码基因ZmC3H54。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗非生物逆境胁迫能力强的玉米CCCH型锌指蛋白及其编码基因ZmC3H54与应用。

为了实现以上目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一种玉米CCCH型锌指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因ZmC3H54，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

本发明含有所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系。

本发明所述的玉米CCCH型锌指蛋白或者所述的玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因ZmC3H54在培育抗非生物逆境胁迫的转基因植物中的应用。

进一步地，所述的应用，所述转基因植物为水稻或拟南芥。

本发明的一种所述的抗非生物逆境胁迫的转基因植物的制备方法，包括如下步骤：

(1)获得玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因ZmC3H54的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用PCR获得玉米ZmC3H54基因片段；

用荧光定量PCR的方法分析玉米基因ZmC3H54在逆境胁迫时的表达谱，将ZmC3H54基因片段构建到质粒载体中；

(3)将步骤(2)得到的带有ZmC3H54的质粒转化农杆菌；

将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；

(4)目标植物转基因阳性苗的筛选与鉴定；转基因纯合植株的抗非生物逆境胁迫分析。

进一步地，在步骤(1)中，将含ZmC3H54基因的克隆载体质粒经BamHI+XbaI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收1119bp的SEQ ID NO.2的DNA片段，将此片段与相应酶切pCAMBIA1301a载体相连，获得的载体命名为p1301a-ZmC3H54重组载体；

用从玉米cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，该扩增ZmC3H54基因的引物为分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；

在步骤(3)中，所述的目标植物是水稻或拟南芥。

在步骤(4)中，抗非生物逆境胁迫分析包括耐旱分析和植物种子萌发对植物激素ABA的敏感性分析。

本发明的一种用于体外检测ZmC3H54基因在诱导后植物中表达量以及在植物中各组织中表达量差异的方法，包括如下步骤：

(1)取植物相应诱导后各时间段的叶片处理样及植物几种不同的组织样；

(2)用Trizol法提取各个样的RNA；

(3)用DnaseI消化DNA,然后反转录形成cDNA,以其为模板；

(4)用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR的检测引物序列，所述引物为分为上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步地，在步骤(1)中，所述植物为玉米；

胁迫处理取样：植物材料为玉米B73自交系，待玉米幼苗长至三叶期时，以正常灌水的植株作对照，分别进行10％PEG溶液，100uM的ABA溶液和200mmol/L NaCl溶液胁迫处理，处理不同时间段后取样，时间分别为0h,1h,3h,6h,12h,24h；用剪刀分别剪取试验组和对照组玉米幼苗相同部位叶片，每个处理阶段取样三份；采样完毕后，样品用液氮冷冻保存于-80℃；

组织取样：为了分析玉米ZmC3H54基因在各个组织中的表达水平差异，选取玉米的8个代表性的组织，所述代表性的组织分别为根，茎，幼叶，花丝，雄穗，未授粉前果穗，苞叶，胚和胚乳，取样后用液氮冷冻保存于-80℃；

在步骤(4)中，总RNA纯度和含量的检测：取1μL总RNA样品加到微量分光光度计探头上，检测总RNA纯度和含量；

取正常的玉米作对照，玉米内参基因Actin引物，所述引物为分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

进一步地，在步骤(4)中，取正常的拟南芥作对照，拟南芥内参基因Actin引物，所述引物为分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示。

有益效果：本发明ZmC3H54基因参与了胁迫应答，可以提高植物的抗非生物逆境胁迫能力。转基因水稻与转基因拟南芥对ABA都有较高的敏感性，转基因水稻对干旱的耐受性提高，本发明从玉米中分离克隆该家族基因并鉴定它在提高目的植物抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆新型作物品种具有十分重要的意义。

本发明相对于现有技术，具有如下优点：

(1)本发明从玉米中分离、克隆得到ZmC3H54基因，诱导表达分析发现ZmC3H54的表达受到外源ABA、PEG和高盐的诱导，通过农杆菌介导的转化法分别将其导入水稻和拟南芥，并获得相应的转基因植株。转基因植株对ABA的敏感性提高且在耐旱方面的能力增强。

(2)本发明以生物信息学分析为基础，根据其进化关系和胁迫诱导表达模式，筛选了一个受干旱与ABA强烈诱导表达的一个CCCH型锌指蛋白的编码基因，通过转基因技术调节其在植物体内的表达水平，可以改良植物的抗逆性。本发明中可以用半定量PCR的方法分析转基因拟南芥中ZmC3H54基因的表达量情况。具体是根据转录因子ZmC3H54基因序列设计引物，利用PCR技术从玉米自交系B73总cDNA中扩增得到ZmC3H54基因。诱导表达分析发现ZmC3H54的表达受到外源ABA、PEG和高盐的诱导。

(3)本发明为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，有利于抗逆新品种的研究，对提高农作物产量具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的ZmC3H54与其他物种CCCH家族锌指蛋白保守区的氨基酸序列同源性比对图；

图2为本发明的ZmC3H54与拟南芥以及其他植物中已报道功能的CCCH锌指蛋白家族氨基酸序列比对后的进化树；

图3为本发明的ZmC3H54基因在ABA、干旱、高盐逆境处理时的诱导表达模式分析以及ZmC3H54基因的组织表达模式图；A：10％PEG溶液处理；B：100uM的ABA溶液处理；C：200mmol/LNaCl溶液处理；

图4为本发明的转ZmC3H54基因水稻对干旱的耐受性的提高对比图；A:干旱处理15天；B:干旱处理30天；C：恢复浇水20天；D：恢复生长20天后野生型与转基因植株的存活率；

图5为本发明的转ZmC3H54基因水稻对ABA的敏感性的提高对比图；A-C:野生型和转基因幼苗在不同浓度ABA的MS培养液中的生长表型、幼苗高度和根的长度；

图6为本发明的ZmC3H54在野生型(WT)拟南芥和T1代转基因植株中的表达分析图；A:荧光定量分析；B:半定量分析；

图7为本发明的转ZmC3H54基因拟南芥对ABA敏感性的提高对比图；A：MS培养基上表型；B：MS+0.2ABA培养基上的表型；C MS+0.4ABA培养基上的表型；D：三个板上的萌发率；

图8为本发明所涉及的改造前pCAMBIA1301载体与改造后pCAMBIA1301a载体的对比图。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工生物有限公司合成；测序由Invitrogen公司进行；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自Takara公司；反转录试剂盒购于Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均以及基因组提取试剂盒购于全式金生物技术有限公司，方法均参照说明书进行。

本发明的一种玉米CCCH型锌指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

所述序列表SEQ ID NO.1自氨基端第44-95位氨基酸残基序列是两个比较典型的CCCH型锌指CX₈CX₅CX₃H和CX₅CX₄CX₃H的保守结构。

所述的玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一个新的玉米锌指蛋白编码基因的核苷酸序列，它编码一个受干旱和ABA诱导表达的ZmC3H54基因，GRMZM2G117007，主要表现是其相应的转基因种子萌发对ABA有较高的敏感性，植株有一定的抗旱性。玉米C3H54基因，GRMZM2G117007全长1466bp，cDNA编码区序列长1119bp，如SEQ ID NO.2所示，本基因编码372个氨基酸，且含有两个比较典型的CCCH型锌指结构CX₈CX₅CX₃H和CX₅CX₄CX₃H，如SEQ ID NO.1所示。

本发明含有所述编码基因ZmC3H54的重组载体、重组菌、转基因细胞系。

所述的应用，所述转基因植物为水稻或拟南芥。

实施例1

玉米ZmC3H54基因的获得

待玉米幼苗长至三叶期后，提取总RNA，并反转录为cDNA。检索MAIZEGENOME和NCBI数据库，获得ZmC3H54的推测编码序列，用Primer Premier 5.0软件设计特异引物，引物由生工生物公司合成。引物序列如下：

ZmC3H54-F 5′-CGGGATCCATGTACAACTTCAAAGTGAAGC-3′SEQ ID NO.5

BamHI

ZmC3H54-R 5′-GCTCTAGATCAGGCCACCATCTGCTC-3′SEQ ID NO.6

XbaI

以上述获得玉米总cDNA为模板，通过PCR得到一个包含有完整开放阅读框的编码区，长度为1119bp，回收，连接到pEASY-T1载体上，进行测序。所得序列为玉米ZmC3H54基因。

植物表达载体pCAMBIA1301的改造

将植物表达载体pCAMBIA1301改造成pCAMBIA1301a载体，图8为本发明所涉及的改造前pCAMBIA1301载体与改造后pCAMBIA1301a载体的图谱。

如图8所示，具体步骤如下：

(1)用限制性内切酶EcoRI和SacI双酶切再T4连接酶连接，在pCAMBIA1301载体的多克隆位点处加上一个35S片段，方向与GUS方向一致，构建成pCAMBIA1301-35S载体；

(2)接着通过PstI和HindIII双酶切，再用T4连接酶连接，紧接着35S片段后面加上一小段polyA，构建成pCAMBIA1301-35S-polyA载体(后面简称pCAMBIA1301a载体)。

玉米ZmC3H54表达载体的构建

将获得的ZmC3H54+pEASY-T1载体与pCAMBIA1301a载体同时用BamHI和XbaI双酶切，酶切体系如表1所示：

表1

按照上面的双酶切体系加样，酶切3小时后分别回收目的片段与pCAMBIA1301a载体大片段。然后将酶切回收后的ZmC3H54目的基因片段和pCAMBIA1301a载体大片段进行连接，连接反应体系如表2所示，

表2

16℃连接3-5小时后,经过一系列转化与验证后获得p1301a-ZmC3H54重组载体，为ZmC3H54的表达载体。

玉米ZmC3H54表达载体的农杆菌的转化

将上面构建并验证好的pCAMBIA1301-35S-ZmC3H54-polyA载体用冻融法导入农杆菌EH105中，具体步骤如下：

(1)从-80℃超低温冰箱中取出农杆菌感受态细胞，冰上解冻，加入3-5μL的过量表达载体质粒，轻弹混匀，冰上放置5分钟；

(2)立即液氮中速冻1分钟，迅速放在水浴锅中37℃热激5分钟；

(3)加入300-500μL的无抗生素的YEP液体培养基，放在28℃摇床中，220rpm培条件下培养5小时；

(4)在10000rpm条件下离心30秒，弃上清，加100μL重悬菌体，涂布于含50mg/L利福霉素(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kan)的YEP固体平板上，封口后28℃下倒置培养培养2-3天。

(5)取单菌落摇菌，保菌，提取质粒，然后进行菌落PCR或酶切验证。

(6)将验证正确的菌液放入-80℃保存待用。

实施例2

玉米ZmC3H54基因在PEG,ABA,NaCl条件下的表达模式分析以及组织模式分析

如图3所示，为本发明的ZmC3H54基因在ABA、干旱、高盐逆境处理时的诱导表达模式分析以及ZmC3H54基因的组织表达模式；A：10％PEG溶液处理；B：100uM的ABA溶液处理；C：200mmol/L NaCl溶液处理；

1.胁迫处理取样：植物材料为玉米B73自交系，待玉米幼苗长至三叶期时，以正常灌水的植株作对照，分别进行10％PEG溶液，100uM的ABA溶液和200mmol/L NaCl溶液胁迫处理，处理不同时间段后取样，时间分别为0h,1h,3h,6h,12h,24h；用剪刀分别剪取试验组和对照组玉米幼苗相同部位叶片，每个处理阶段取样三份。采样完毕后，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃的冰箱；

组织取样：为了分析玉米ZmC3H54基因在各个组织中的表达水平差异，选取玉米的8个代表性的组织，所述代表性的组织分别为根，茎，幼叶，花丝，雄穗，未授粉前果穗，苞叶，胚和胚乳，取样后立即用液氮冷冻保存于-80℃的冰箱；

2.用Trizol法提取各个样的RNA；

RNA提取：根据改良Trizol法提取总RNA，具体步骤如下：

(1)从-80℃冰箱取出材料，放入研磨内，戴上手套，加液氮研磨，然后将100mg左右的粉末转移到1.5mL离心管，液氮预冷中；

(2)加入1mL Trizol试剂，用力上下颠倒混匀为15s，室温条件下放置10min；4℃，13,000rpm离心20min；

(3)吸取上清于一新的离心管中，加入250μL的5M NaCl以及250μL氯仿；4℃，10,000rpm离心20min；

(4)吸取上清液到新离心管中，加入200μL异丙醇，室温放置10min；4℃，13,000rpm离心15min；

(5)小心弃去上清，加入500μL的75％乙醇，使用DEPC水配制乙醇；4℃，7,500rpm离心5min，倒掉乙醇；

(6)重复步骤步骤(5)，4℃，7,500rpm离心5min，倒掉乙醇，倒放在纸上，室温下放干，干燥时间为5-10min；

(7)轻甩一下，将管壁液体甩至管底，-70℃保存并取2μL检测结果。

3.用DnaseI消化DNA,然后反转录形成cDNA,以其为模板；

4.总RNA纯度和含量的检测：取1μL总RNA样品加到微量分光光度计探头上，检测总RNA纯度和含量。A₂₆₀/A₂₈₀介于1.8-2.0之间说明提取的总RNA质量较高。

用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR的检测引物序列，所述引物为分为上游引物和下游引物；

5.去除基因组DNA处理

(1)先根据上一步检测的每个样的RNA浓度情况，计算出统一终浓度时，每个样要加的RNA量，在微量离心管中，反应体系如表3所示，依次加入下列试剂：

表3

(2)点动混匀后，42℃温浴2分钟或室温放置30分钟后待用。

6.反转录：按照宝生物公司反转录试剂盒提供的步骤操作，反转录体系如下：

(1)在微量的离心管中，反转录反应体系如表4所示，依次加入下列试剂：

表4

(2)点动混匀后，37℃保温15分钟；

(3)85℃处理5分钟后，4℃孵育数分钟后；

(4)室温离心5秒，以便收集所有溶液到管底，用RNase Free dH₂O稀释10倍数后置于-20℃冰箱保存待用。

7.荧光定量PCR反应

(1)引物设计

引物使用Primer Express 3.0(ABI)软件进行设计，由上海生物工程公司合成。

目的基因ZmC3H54检测引物的核苷酸序列为：

qPCR-ZmC3H54-F 5′-GGACGCGCCTCTGCAAG-3′SEQ ID NO.3

qPCR-ZmC3H54-R 5′-ATCTGCATGCCGACGGACA-3′SEQ ID NO.4

玉米内参基因Actin引物的核苷酸序列为：

qPCR-ZmActin-F 5′-GGGATTGCCGATCGTATGAG-3′SEQ ID NO.7

qPCR-ZmActin-R 5′-GAGCCACCGATCCAGACACT-3′SEQ ID NO.8

(2)荧光定量PCR反应体系如表5所示，

表5

(3)PCR反应程序

PCR反应程序如下：95℃10min；95℃15sec，60℃1min，共40个循环，反应程序设置好后，填加溶解曲线，反应开始。反应结束后，拷贝出数据，采用2^–ΔΔCT法对所获得的数据进行处理。每个基因实验重复3次，每次做3个平行样。

实施例3

玉米ZmC3H54基因的序列同源与同源性分析

如图1所示，为本发明的ZmC3H54与其他物种CCCH家族锌指蛋白保守区的氨基酸序列同源性比对图；根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与CCCH锌指蛋白家族同源关系最近。将该转录因子与已知的其它CCCH型锌指蛋白家族成员的蛋白序列进行比对，分析其锌指结构类型为CCCH型，依据该DNA结合域的结构特征，该ZmC3H54蛋白的结构为CX₈CX₅CX₃H。

如图2所示，为本发明的ZmC3H54与拟南芥以及其他植物中已报道功能的CCCH锌指蛋白家族氨基酸序列比对后的进化树；为了进一步分析ZmC3H54和其它已经报道功能的CCCH型锌指蛋白的***进化关系，将不同植物的CCCH型锌指蛋白与ZmC3H54进行***进化关系的分析。通过同源序列比较和聚类分析发现：ZmC3H54与其中一小部分锌指蛋白在***进化关系上很近，且它们

在整个***进化树中构成独特的一枝，即成为一个独特的亚家族，这个亚家族中的成员结构比较保守，且其中已经报道的大多数成员与逆境胁迫相关，与ZmC3H54在一个分支上的AtC3H47(AtSZF1)、AtC3H29(AtSZF1)以及CaKR1已经被报道参与植物的非生物胁迫。

实施例4

转基因水稻的获得

将实施例1中构建好的植物表达载体p1301a-ZmC3H54,通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将其导入水稻品种中花中，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到25棵幼苗植株。为了筛选出阳性转基因苗，将幼苗叶片剪成0.5-1cm长度，浸泡于Gus染色液中，于37℃培养箱中染色12小时，用75％的乙醇脱色去除叶绿素，然后进行观察，最终获得16株水稻转基因苗。

实施例5

转基因拟南芥的获得

(1)花序浸润法转化拟南芥

摇菌：取100μl实施例1中过表达载体的农杆菌菌液，加到100ml LB或YEP液体培养基中，添加相应的抗性，28℃过夜培养。

1.Buffer配置：

用NaOH调pH值至5.8,添加表面活性剂：每升Buffer加300微升

2.制备转化液：

离心28℃过夜摇的菌液收集菌体，用50ml离心管，4000r/min离心10min，加25mlBuffer，吹打沉淀使其重悬。

3.转化

选取花期拟南芥六盆，约25棵，将上一步制备好的转化液用吸管滴到拟南芥未开的花和顶端分生组织上，注意尽量让菌液挂在花上，提高转化效率。为了保证转化效率，菌液滴加两遍。转化过后，用保鲜膜将所有植株包裹起来，避免菌液过快蒸干，影响转化效率。保鲜膜24小时后可以摘除。一般转化需要1-2次，第二次转化选在第一次转化后四到五天。

(2)拟南芥阳性苗的筛选

1.种子初筛，将收到的种子种植于含有筛选剂，如卡那霉素/潮霉素等的培养基上，筛选出抗性幼苗35株。

2.取部分叶片对筛选的幼苗进行Gus染色，最终获得20株转基因拟南芥植株。

实施例6

ZmC3H54转基因水稻植株耐旱性鉴定

将实施例1中的植物表达载体转入农杆菌EHA105中，然后侵染水稻愈伤，后经过共培养，抗生素筛选，获得ZmC3H54基因过表达转基因植株。

取ZmC3H54基因水稻株系L4、L6作为实验组及对照株系(中花水稻株系)的水稻种子置于培养皿中，用去离子水浸泡使其吸胀萌发，待苗长到10cm左右时，实验组中取GUS能染上色的且长势一致的幼苗与对照组一起转移至营养土：蛭石＝1：l的方盆中，分区等量种植，每个株系设置三个重复。在日光温室中培养四周后进行干旱处理。将培养四周后的转基因水稻和对照组水稻苗，浇入饱和水，以此时为处理0天，干早胁迫30天后，恢复培养20天，观察表型并统计其存活率。如图4所示，本发明的转ZmC3H54基因水稻提高了植物对干旱的耐受性。

实施例7

ZmC3H54转基因水稻植株对ABA的敏感性分析

如图5所示，为本发明的转ZmC3H54基因水稻提高了植物对ABA的敏感性；A-C:野生型和转基因幼苗在不同浓度ABA的MS培养液中的生长表型、幼苗高度和根的长度；

将T2代转ZmC3H54基因L4、L6、L8水稻株系种子播种于含有不同浓度ABA 0μM，1μM,3μM,5μM的1/2MS培养基上，以非转基因的中花水稻为对照，在28℃条件下，16h光照/8h黑暗使其萌发生长，培养2周后对幼苗的生长表型进行观察和比较，包括幼苗的高度和根长，实验重复3次。

从图中可明显看出，含有ABA的培养液中，野生型和转基因水稻幼苗的生长均受到抑制，而转基因幼苗的抑制程度显著大于野生型，主要表现在转基因组幼苗茎高与根长均短于对照组，随着ABA浓度的提高5μM时，转基因幼苗生长抑制更为明显，转基因组幼苗几乎不长根。这些结果说明过量表达ZmC3H54能够显著提高转基因植株对ABA的敏感性。

实施例8

ZmC3H54转基因拟南芥植株对ABA的敏感性分析

如图7所示，为本发明的转ZmC3H54基因拟南芥对ABA敏感性的提高比对图；A：MS培养基上表型；B：MS+0.2ABA培养基上的表型；C MS+0.4ABA培养基上的表型；D：三个板上的萌发率；

取转ZmC3H54基因的拟南芥L20、L29、L35株系T2代种子以及转pCAMBIA1301a空载体的转基因植株T2代种子，用12％的漂白水消毒处理15min，后用灭菌水清洗5-6遍，消毒完后，置于4℃温度下，春化3天。春花后分区将其分别点入含有不同浓度ABA，0μM，0.2μM，0.4μM的MS培养基上,封口后平放入拟南芥培养温室中，在22℃条件下，16h光照/8h黑暗使其萌发生长，期间观察其萌发数与表型变化。实验重复3次。由图可知：与对照组相比，ZmC3H54转基因拟南芥株系提高了对ABA的敏感性。

由实施例7与实施例8可以进一步推测ZmC3H54基因可能参与了ABA介导的信号途径，并且在种子的萌发及幼苗发育过程中起到一定的作用。

实施例9

转基因拟南芥中ZmC3H54基因的表达量情况

取转基因拟南芥相应诱导后各时间段的叶片处理样及植物几种不同的组织样；在步骤(1)中，取实施例5中获得的转基因拟南芥株系中我们随机挑选了4个转化株，分别为L20、L29、L35、L9；

(2)用Trizol法提取各个样的RNA；

(3)用DnaseI消化DNA,提取拟南芥RNA后反转录成cDNA,以其为模板；

(4)总RNA纯度和含量的检测：取1μL总RNA样品加到微量分光光度计探头上，检测总RNA纯度和含量；

分别利用荧光定量与半定量PCR的方法对目的基因ZmC3H54的表达进行分析，同时对野生型水稻进行检测作为阴性对照。

荧光定量PCR的检测引物序列，所述引物分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

以拟南芥Actin基因作为内源参照，通过调整退火温度、循环次数、模板量等参数，建立适宜的半定量PCR反应体系。

拟南芥内参基因Actin引物的核苷酸序列为

qPCR-AtActin-F 5′-TCGTTGCCCCTCCAGAGA-3′SEQ ID NO.9

qPCR-AtActin-R 5′-TACTCTGCCTTTGCGATCCA-3′SEQ ID NO.10

如图6所示，图6为本发明的ZmC3H54在野生型(WT)拟南芥和T1代转基因植株中的表达分析；A:荧光定量分析；B:半定量分析；ZmC3H54可以在转基因株系中正常表达，不同的株系中表达量有较大差异，其中以选取的L29与L35株系表达量相对来说较高，其他转基因株系的表达量相对较低，可能与目的基因片段的***位点及拷贝数有关。而在野生型水稻中未有检测到目的基因的表达。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims

1.一种玉米CCCH型锌指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因ZmC3H54，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2中所述编码基因ZmC3H54的重组载体、重组菌、转基因细胞系。

4.权利要求1所述的玉米CCCH型锌指蛋白或者权利要求2所述的玉米CCCH型锌指蛋白的编码基因ZmC3H54在培育抗非生物逆境胁迫的转基因植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述转基因植物为水稻或拟南芥。

6.一种权利要求4所述的抗非生物逆境胁迫的转基因植物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)用PCR获得玉米ZmC3H54基因片段；

(3)将步骤(2)得到的带有ZmC3H54的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；

7.根据权利要求6所述的抗非生物逆境胁迫的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，将含ZmC3H54基因的克隆载体质粒经BamHI与XbaI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收1119bp的SEQ ID NO.2的DNA片段，将此片段与相应酶切pCAMBIA1301a载体相连，获得的载体命名为p1301a-ZmC3H54重组载体；

用从玉米cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，该扩增ZmC3H54基因的引物为分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；

在步骤(3)中，所述的目标植物是水稻或拟南芥。

8.一种用于体外检测ZmC3H54基因在诱导后植物中表达量以及在植物中各组织中表达量差异的方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)用Trizol法提取各个样的RNA；

(3)用DnaseI消化DNA,然后反转录形成cDNA,以其为模板；

所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

9.根据权利要求8所述的用于体外检测ZmC3H54基因在诱导后植物中表达量以及在植物中各组织中表达量差异的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述植物为玉米；

取正常的玉米作对照，玉米内参基因Actin引物，所述引物为分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

10.根据权利要求8所述的用于体外检测ZmC3H54基因在诱导后植物中表达量以及在植物中各组织中表达量差异的方法，其特征在于：

在步骤(4)中，取正常的拟南芥作对照，拟南芥内参基因Actin引物，所述引物为分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示。