CN117925655A

CN117925655A - 陆地棉GhPIP5K2和GhPIP5K22基因及其应用

Info

Publication number: CN117925655A
Application number: CN202410093141.6A
Authority: CN
Inventors: 宿俊吉; 王彩香; 令萍洁; 杨军宁; 郭学峰; 李丹丹; 张雪利
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2024-01-23
Filing date: 2024-01-23
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明公开了陆地棉GhPIP5K2和GhPIP5K22基因及其应用，属于基因工程技术领域。GhPIP5K2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，GhPIP5K22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明还公开了GhPIP5K2和GhPIP5K22基因在提高棉花对非生物胁迫的抗逆性中的应用。本发明在棉花中沉默目的基因，经非生物胁迫处理后，发现目的基因沉默引起植株叶片枯萎、抗氧化酶活性降低、MDA含量增加和逆境胁迫相关基因表达下降。即沉默目的基因减弱棉花对非生物胁迫的抗逆性，证明目的基因正向调控棉花对非生物胁迫的抗逆性。本发明为陆地棉的高抗逆性育种提供重要基因资源。

Description

陆地棉GhPIP5K2和GhPIP5K22基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及陆地棉GhPIP5K2和GhPIP5K22基因及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PtdIns(4,5)P2)是在磷脂酰肌醇磷酸激酶(PIPkinase)作用下，由磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns(4)P)或磷脂酰肌醇-5-磷酸(PtdIns(5)P)进行磷酸化产生的。作为一种信号分子，它在抗盐和抗渗透胁迫、囊泡运输、肌动蛋白组织和对钒酸盐敏感的H⁺-ATP酶调节质膜和离子通道活性等方面也发挥着至关重要的作用。磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸既是与效应蛋白相互作用的脂质信号，也是磷脂酶C信号转导途径中的底物。该信号通路通过调节细胞内多种过程，包括细胞骨架组织、膜运输、保卫细胞运动和花粉管生长。PtdIns(4,5)P2信号功能的相关性在很大程度上取决于其时空分布，而时空分布主要由其在特定膜区域内的代谢活性所决定。PtdIns(4,5)P2的时空结构主要受到参与其合成和分解的酶的调控。在这些过程中，PIPKs家族的磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(PIP5K)对于形成PtdIns(4,5)P2模式起着至关重要的作用。与动物和真菌基因组相比，高等植物基因组中编码PIP5K的基因数量较多，在拟南芥和水稻等模式植物中均发现了PIP5K基因。拟南芥共有11个PIP5K基因，其结构与动物源I型PtdInsP酶高度相似。

近年来，一些研究发现了部分PIP5Ks的生物学功能。例如，在拟南芥中，干旱、盐和ABA(脱落酸)等外界刺激能迅速诱导AtPIP5K1的表达，其调控还与可溶性蛋白激酶相关。AtPIP5K1和AtPIP5K2参与花粉发育，它们对液泡形成和花粉发育具有重要作用，在pip5k1和pip5k2缺失突变体花粉粒中，因失去作用导致液泡缺陷和外壁形成受损。研究发现，AtPIP5K4和AtPIP5K5有助于花粉萌发和花粉管伸长。AtPIP5K4、AtPIP5K5和AtPIP5K6冗余地参与花粉萌发。此外，AtPIP5K3通过在根中的特异性表达调控其根毛的伸长。AtPIP5K9与细胞质酶CINV1相互作用，在糖调控下对根细胞伸长产生抑制作用。AtPIP5K7、AtPIP5K8和AtPIP5K9在渗透胁迫下冗余地参与根的生长。研究发现，单个基因OsPIP5K1在水稻的抽穗过程中起着关键作用。PIP5K基因参与了小麦和辣椒的花粉发育。大豆GmPIP5K基因在拟南芥的过表达植株中增强了干旱胁迫的耐受性。这些结果表明，PIP5K在植物适应非生物环境以及生长发育过程中发挥着至关重要的作用。

棉花(Gossypium spp.)的繁殖容易受到多种不利条件的影响，从而导致低产。与其他作物相比，棉花具有更好的非生物胁迫耐受性，但在极端温度、盐碱和干旱胁迫下，其产量仍受到威胁。PIP5K基因是调节胁迫反应和花粉生成的关键基因，是信号通路中的一个重要组成部分。然而，GhPIP5K在棉花胁迫响应和生长调控中的确切作用仍不明确。

发明内容

本发明的目的是提供陆地棉GhPIP5K2和GhPIP5K22基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。陆地棉GhPIP5K2和GhPIP5K22基因正向调控棉花响应非生物胁迫，在棉花中上调表达可提高其对非生物胁迫的抗逆性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了陆地棉GhPIP5K2基因在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用，陆地棉GhPIP5K2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了包括所述的陆地棉GhPIP5K2基因的重组载体在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

本发明还提供了包括上述的重组载体的工程菌在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

进一步地，通过在陆地棉中上调所述陆地棉GhPIP5K2基因的表达水平，以提高所述陆地棉对非生物胁迫的抗逆性，所述非生物胁迫包括高温、低温、干旱和盐胁迫。

本发明还提供了陆地棉GhPIP5K22基因在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用，陆地棉GhPIP5K22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明还提供了包括所述的陆地棉GhPIP5K22基因的重组载体在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

进一步地，通过在陆地棉中上调所述陆地棉GhPIP5K22基因表达水平，以提高所述陆地棉对非生物胁迫的抗逆性，所述非生物胁迫包括高温和低温胁迫。

本发明还提供一种提高陆地棉对非生物胁迫的抗逆性的方法，其特征在于，包括在陆地棉中上调所述陆地棉GhPIP5K2和/或GhPIP5K22基因的表达水平的步骤。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过对陆地棉进行生物信息学分析，成功鉴定了陆地棉PIP5K家族的28个基因。本发明对高温、低温、干旱和盐四种非生物胁迫处理下GhPIP5Ks的表达模式进行转录组分析，发现GhPIP5K家族成员可以响应非生物胁迫；同时发现GhPIP5K2在高温、低温、干旱和盐胁迫中高表达，GhPIP5K22在高温、低温胁迫中高表达。为了进一步明确GhPIP5K2和GhPIP5K22基因响应非生物胁迫的分子机理，利用VIGS技术将目的基因在棉花植株中沉默，并通过相应非生物胁迫处理后，发现沉默GhPIP5K2基因或沉默GhPIP5K22基因均会引起植株叶片枯萎、抗氧化酶(CAT、POD和SOD)活性的降低和MDA的含量增加。沉默GhPIP5K2降低逆境胁迫相关基因GhHSFB2A、GhDREB2A、GhDREB2C、GhRD20-1、GhRD29A、GhBIN2、GhCBL3、GhNHX1、GhPP2C、GhSnRK2.6和GhCBF1的表达，沉默GhPIP5K22降低逆境胁迫相关基因GhHSFB2B、GhDREB2A、GhDREB2C、GhRD20-1、GhRD29A、GhCBF1和GhCIPK6的表达。说明沉默GhPIP5K2和GhPIP5K22基因减弱棉花对非生物胁迫的抗逆性，进而证明GhPIP5K2和GhPIP5K22基因正向调控棉花响应非生物胁迫，为陆地棉对非生物胁迫的抗逆性育种提供重要基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为载体pEASY-T5 Zero和TRV载体图谱；

图2为对照植株和TRV:GhPIP5K2沉默植株胁迫后表型观察结果；其中，a.阳性对照TRV:GhCLA1中的棉花叶片出现白化现象；b.使用qRT-PCR检测GhPIP5K2的沉默效率，与对照组相比，星号表示显著性水平(*P<0.05，**P<0.01)；c.热胁迫对TRV:00和TRV:GhPIP5K2表型的影响；d.冷胁迫、干旱胁迫和盐胁迫对TRV:00和TRV:GhPIP5K2表型的影响；e.热胁迫后统计对照植株和沉默植株枯萎叶片的数量；f.冷胁迫后统计对照植株和沉默植株新生叶片变黑的数量；g.干旱胁迫后统计对照植株和沉默植株枯萎叶片的数量；h.盐胁迫后统计对照植株和沉默植株枯萎叶片的数量；

图3为对照植株和TRV:GhPIP5K22沉默植株胁迫后表型观察结果；其中，a.阳性对照TRV:GhCLA1中的棉花叶片出现白化现象；b.使用qRT-PCR检测GhPIP5K22的沉默效率，与对照组相比，星号表示显著性水平(*P<0.05，**P<0.01)；c.热胁迫后统计对照植株和沉默植株的变黄叶片数量；d.冷胁迫后统计对照植株和沉默植株的枯萎叶片数量；e.热胁迫和冷胁迫对TRV:00和TRV:GhPIP5K22表型的影响；

图4为非生物胁迫处理前后，TRV:00、TRV:GhPIP5K2和TRV:GhPIP5K22植株的生理生化指标检测结果；其中，a.TRV:GhPIP5K2的SOD活性、POD活性、CAT活性和MDA含量；b.TRV:GhPIP5K22的SOD活性、POD活性、CAT活性和MDA含量；不同字母表示差异(*P<0.05)；

图5为非生物胁迫处理前后，TRV:00、TRV:GhPIP5K2和TRV:GhPIP5K22植株的胁迫相关基因表达水平检测结果；a.TRV:GhPIP5K2的11个胁迫标记基因的表达量；b.TRV:GhPIP5K22的7个胁迫标记基因的表达量；与对照值相比，星号表示差异显著性水平(*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

发明人通过对陆地棉进行生物信息学分析，成功鉴定了陆地棉PIP5K家族的28个基因。本发明对高温、低温、干旱和盐四种非生物胁迫处理下GhPIP5Ks的表达模式进行转录组分析，发现GhPIP5K家族成员可以响应非生物胁迫；同时发现GhPIP5K2在高温、低温、干旱和盐胁迫中高表达，GhPIP5K22在高温、低温胁迫中高表达。

为了进一步明确GhPIP5K2和GhPIP5K22基因响应非生物胁迫的分子机理，利用VIGS技术将目的基因在棉花植株中沉默，将GhPIP5K2和GhPIP5K22目的基因片段进行了克隆，分别构建两种基因的VIGS沉默载体，研究在干旱和盐胁迫下的生物学功能。实验如下：

1.实验材料

1.1棉花品种

本发明以陆地棉品种“新石K25”为研究对象，种子由石河子农业科学研究院提供。

1.2载体与感受态细胞

pEASY-T5 Zero克隆载体(CT501-01，含DH5α大肠杆菌感受态细胞)和GV3101农杆菌感受态细胞分别购买自全式金生物科技有限公司和上海唯地生物技术有限公司，用于基因沉默的VIGS载体***(TRV1、TRV2和TRV-GhCLA1)由中国农学科学院棉花研究所馈赠，载体图谱如图1所示。

2.实验方法

2.1引物设计

利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计GhPIP5K2基因的克隆引物、qRT-PCR引物，以及用于VIGS沉默载体构建引物，引物序列(SEQ ID NO：3-8)如表1所示：

表1GhPIP5K2基因的克隆、qRT-PCR、VIGS沉默载体构建引物序列

利用Primer-BLAST设计GhPIP5K22基因的克隆引物、qRT-PCR引物，以及用于VIGS沉默载体构建引物，引物序列(SEQ ID NO：11-16)如表2所示：

表2GhPIP5K22基因的克隆、qRT-PCR、VIGS沉默载体构建引物序列

2.2棉花种植

a.在各个花盆中装等量的营养土(基质：蛭石＝1:1)，将其放置在含有自来水的大盆中浸水，直到将水吸到花盆表面，用于棉花种子萌发；

b.将新石K25的种子种植在上述花盆中，为使种子出苗一致，种子种植的深度保持在1.5cm，在人工气候培养箱进行培养(16h光照，8h黑暗，温度28℃，湿度70％)；

c.待棉花生长至四叶期时，选幼嫩的叶片进行取样，所取样品先在液氮中速冻，后在-80℃保存备用。

2.3反转录和荧光定量检测分析

2.3.1总RNA的提取

根据RNAprep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(货号DP441，购自中国天根生化科技有限公司)说明书提取棉花叶片中的总RNA。

利用美国Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000分光光度计评估所有样本的RNA质量。样本以-80℃低温保存。

2.3.2反转录

以上述获得的总RNA为模板，根据FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒(货号KR118，购自中国天根生化科技有限公司)说明书进行反转录，生成cDNA。

反应完成后，检测cDNA的浓度及纯度，-20℃保存备用。

2.3.3荧光定量检测

以cDNA为模板，使用Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(货号FP209，购自天根生化科技有限公司)进行荧光定量检测。反应体系如表3所示：

表3荧光定量检测反应体系

针对GhPIP5K22基因的荧光定量检测使用与表3相同的反应体系，将其中引物替换为qRT-PCR的q-GhPIP5K22-F和q-GhPIP5K22-R引物。

反应程序如表4所示：

表4荧光定量检测反应程序

2.4目的基因片段扩增

2.4.1反应体系

以新石K25的cDNA为模板，利用GloriaNova HS2X Master Mix(货号RK20717，购自爱博泰克生物公司)进行GhPIP5K2目的基因片段的扩增，体系如下(表5)：

表5目的基因片段扩增反应体系

GhPIP5K22基因的扩增使用与表5相同的反应体系，将其中引物替换为扩增GhPIP5K22基因的GhPIP5K22-F和GhPIP5K22-R引物。

2.4.2反应程序

根据上述体系加完反应液后，轻摇混匀，短暂离心，按照表6的反应程序进行反应。

表6目的基因片段扩增反应程序

采用PCR方法扩增出GhPIP5K2基因目标片段，GhPIP5K2基因目标片段长417bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

GCCTAGGGAGTGTTGCAGAGGAAGAGGAAGATGAAATCACCAACTATCCACAAGGCCTTGTATTGGTCCCTCGTGGAACAGATGACAATAGTGTTGTTGCAGGTTCTCATATACGAGGTCGACGTTTGCGTGCATCAGCTGTAGGTGATGAAGAAGTAGACCTGCTTCTCCCCGGCACGGCAAGACTCCAAATCCAGCTCGGAGTGAACATGCCAGCAAGAGCCGAACAGATTCCAGGAAAAGAAGAAAACATGTTCCATGAATCATATGACGTTGTGTTATATCTGGGAATCATTGACATTTTACAAGAGTATAACATGACTAAGAAGATTGAACATGCCTATAAATCTCTTCAGTTCGATTCACTATCCATATCTGCCGTCGACCCTACGTTTTACTCGCAACGGTTCTTGCAAT。

GhPIP5K2基因全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(下划线部分为目标片段)：

ATGTCTGGCCTTGTGGTCACTGTTGGTAACGTGGAAGAAGTACTTTCTCGCGCAGAAAGAACTAAATCTCTTGATGCCATCATTGACAAGGACAACGGATGTATACTAACTAATGGTGATGCTAACCATAGTTCCGAAACAGCTGGATTTAGAGTTGGAGAACTCTTGCTGCCGAATGGGGACTCTTATTCCGGGTCATTGCTCGGAAACATGCCAGAGGGTCAAGGGAAATATGTTTGGCAAGGTGGTTGTGTGTATGAAGGAGAATGGAGACGTGGGATGAGGCAAGGGATTGGCAAAATACAATGGCCTTCTGGAACTGTTTATGATGGTGAATTCTCAGGTGGATATATGCATGGTACTGGGACATATATTGGCTCTAATAAATTGACTTATAAGGGGAGATGGAAATTGAGTCTCAAACATGGTTTAGGATACCAAGTTTATCCTAATGGAGATGTGTTTGAAGGCTCCTGGATGCAGGGAACACCGGAAGGTCCTGGAAAATATACTTGGGCCAATGGAAATGTTTATCTAGGGAATATGAAGGGTGGAAAAATGTCAGGCAAAGGAACTCTCACTTGGACAAATGGAGACTCCTTTGAAGGAAGCTGGTTAAATGGAATGATACACGGATTTGGAGTGTATACTTGGAGAGATGGTGGTTGCTATGTAGGAACTTGGACACGGGGTTTAAAGGATGGAAAAGGATCATTTTATCCCCAAGGCAACCGGCTTCCAGCCTCACAAGAAGTTTACCTCAATGCTCTCAGAAAAAGAGGATTGTTACCAGATTTGAGAAAACAGAATCATTCTCATATCCACCATGCTGCTTCTGTGGACATGGGAAGTGTCAAGGTTGGTGGCAACCGGGTATCTGATCGTAATTCTGATAAGCTATCAGAAGGAAACTTATTAAATCTACAACAGTCTCGCAACAGAAATGTTTCCTTGGAAAGACGTTGGAGTCTGGAGGTATCCATTGAGAAAGTGATTGGGCACGATTCGTCATTAGAGTTATCTGATTCTTTTAAGGAAGGGAGAGAAAACGGAAGTGAAACAAATGCTCCAATCTTAGAACGTGAATACATGCAAGGTGTCTTAATTAGTGAGCTTGTGTTGAATAATAGTTTTTCACCACCATCTAGAAGAGCGAAGCGGAGACACAAAAAGTTAGCAAAAGAGGTTAAGAGGCCTGGAGAAGCAATCATTAAAGGTCACAGGAGTTATGATTTAATGCTTAGTTTGCAGCTTGGAATCAGATACACTGTGGGGAAAATTACACCTGTGCAACGACGAGAGGTTAGAGCATCAGACTTTGGCCCCCGAGCAAGCTTTTGGATGAATTTTCCTAAAGTGGGATCACAATTGACACCTACCCATCAGTCTGATGATTTTAAGTGGAAAGATTACTGCCCAATGGTTTTCAGGAATCTAAGGGAGATGTTCAAGATTGATGCTGCCGACTACATGATGTCCATTTGTGGAAATGATGCTCTCAGGGAACTTTCTTCTCCTGGGAAAAGTGGTAGTATCTTCTTTCTGTCTCAAGATGATCGTTTCATGATTAAGACACTCCGGAAATCTGAAGTAAAGGTTCTTCTAAGAATGCTTCCCAACTATCATCATCACGTGAGATCATATGAGAACACACTCATCACAAAGTTCTTTGGGCTTCACAGAATCAAACCATCTAGTGGTCAGAAGTTTCGCTTTGTAGTAATGGGAAATATGTTTTGCACCGAGTTAAGGATTCATAGAAGATATGACTTGAAAGGATCATCACAAGGGCGTTCTGCTGATAATGTTGAAATTGATGAGAACACAACGCTTAAAGATCTGGATCTCAACTACTGCTTTTATTTGGAACCTTCTTGGCGAGATGCTTTATTAAGGCAAATAGAGATTGATAGTAAATTTTTGGAAGCACAATGCATTATGGATTATAGCCTTTTGCTTGGTGTGCATTATCGGGCACCCCAGCATTTGAGGTCTCTCATGTCCTACAACAGAACGGACGGCCTAGGGAGTGTTGCAGAGGAAG AGGAAGATGAAATCACCAACTATCCACAAGGCCTTGTATTGGTCCCTCGTGGAACAGATGACAATAGTGTTGTTGC AGGTTCTCATATACGAGGTCGACGTTTGCGTGCATCAGCTGTAGGTGATGAAGAAGTAGACCTGCTTCTCCCCGGC ACGGCAAGACTCCAAATCCAGCTCGGAGTGAACATGCCAGCAAGAGCCGAACAGATTCCAGGAAAAGAAGAAAACA TGTTCCATGAATCATATGACGTTGTGTTATATCTGGGAATCATTGACATTTTACAAGAGTATAACATGACTAAGAA GATTGAACATGCCTATAAATCTCTTCAGTTCGATTCACTATCCATATCTGCCGTCGACCCTACGTTTTACTCGCAA CGGTTCTTGCAATTCATTCAGAAGGTATTTCCTCTGAATTCCATGAAAACTTGA。

采用PCR方法扩增出GhPIP5K22基因目标片段，GhPIP5K22基因目标片段长431bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(下划线部分为目标片段)：

AGACGGGTGCATGTACGAAGGAGAGTGGCGTCGTGGGAAAGCCAACGGGAAAGGTAAGTTTTCTTGGCCATCTGGAGCCACTTTTGAAGGTGGTTTCAAGTCGGGTCGGATGGAAGGATTCGGGACGTTTATCGGATCCGACGGCGACACGTACCGTGGGTCGTGGAGCTCCGATCTAAAACACGGCTATGGTCACAAGTGTTACGCAAATGGGGATTACTACGAAGGATCATGGAGGAAAAACCTACAAGAGGGGCACGGCCGTTATGTTTGGAGTAACGGTATCGAATACGTCGGTGAATGGAAAAACGGAGTCATCTCTGGCCGTGGAACCCTGATATGGGCAAATGGAAACGGGTACGATGGGCAATGGGAAAACGGTATGCCCAAAGGAGACGGAGTTTTCTCTTGGCCGGACGGAAGTTGCTATA。

GhPIP5K22基因全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示：

ATGGAGGAAGTAGTGCTCAATGAGCCGAGTGACGTCGTTTTAAACGCCAAGAAGAAGAAATCCGACGAGGAGAAGGACCAGTTGGTGGTTGCTGTTACGACACCTACGGATCACCATCACCGGAGCCGATCTCAAGCTGCCACACGGCGCGTGACTCCCACGACTAACGCCGCGTCTTTCTTCACCATGGGTTCGGGTGATACTGTCGAGAAATTCCTCCCTAACGGTGATC

TTTACATCGGTAGCTTCTCAACCAACGCGCCACACGGATCCGGGAAGTACCTTTGGAAA

GACGGGTGCATGTACGAAGGAGAGTGGCGTCGTGGGAAAGCCAACGGGAAAGGTAAG

TTTTCTTGGCCATCTGGAGCCACTTTTGAAGGTGATTTCAAGTCGGGTCGGATGGAAGG

ATTCGGGACGTTTATCGGATCCGACGGCGACACGTACCGTGGGTCGTGGAGCTCCGATC

TAAAACACGGCTATGGTCACAAGTGTTACGCAAATGGGGATTACTACGAAGGATCATGG

AGGAAAAACCTACAAGAGGGGCACGGCCGTTATGTTTGGAGTAACGGTATCGAATACGT

CGGTGAATGGAAAAACGGAGTCATCTCTGGCCGTGGAACCCTGATATGGGCAAATGGAA

ACGGGTACGATGGGCAATGGGAAAACGGTATGCCCAAAGGAGACGGAGTTTTCTCTTG

GCCGGACGGAAGTTGCTATATCGGAGCATGGAACGGAGATAACATGAAGAAAACTCAA

AAGTTGAACGGGACGTTTTATCACGGGAACGACGGGAAGGAGCATTGCCTGAAAGGAG

GAGAGAGTTTGGTGCTTATGCCGAGGAAAAGATCGTCCGTAGATGGAAGGGGAAGCTT

AGGGGAAAGAAACATGAATTTCCCAAGGATTTGCATATGGGAAAGCGATGGTGAAGCC

GGAGATATCACCTGTGATATAATTGATAATGTGGAAGCTTCGATGATTTACAGAGATGGGT

TTAGGCAATTTAGAAAGAATCCTTGTTGTTTTAGCGGGGAAATTAAGAAGCCAGGACAA

ACTATTTCCAAAGGCCATAAGAATTATGAGTTAATGCTTAACTTGCAATTGGGTATCAGGT

ATTCTGTTGGGAAAGATGCCTCAATTTTGCGCGATTTGAAGCCAAGTGATTTTGATCCCA

AGGAGAAGTTCTGGACCAGGTTTCCTGTTGAAGGATCAAAGCTTACACCTCCTCATCAA

TCTGTGGAGTTCCGGTGGAAGGATTATTGTCCGGTGGTTTTTAGACATTTGAGGGACCTA

TTCCAAGTTGATCCTGCTGATTACATGGTAGCTATTTGCGGTAGTGATGCCCTTAGGGAG

CTTTCTTCCCCGGGGAAGAGTGGAAGCTTCTTTTACCTTACTCAGGATGACAGATTTATG

ATAAAGACAGTAAAGAAATCTGAAGTCAAGGTTCTTATAAGGATGCTTCCAAGTTACTAC

CAACATGTTTCTAAATACGAAAATTCCCTAGTGACAAAATTCTTTGGTGTGCACTGTGTC

AAACCTATAGGTGGCCAAAAGACACGGTTCATTGTGATGGGGAATCTGTTTTGCTCTGA

CTATCGAATTCATAGACGGTTTGACCTGAAAGGATCCTCCCATGGCCGCTCAACTGATAA

GCCGGAAGAGGAAATTGATGAAACCACTACCCTTAAAGACCTGGATCTTAATTATGTGTT

TCGCCTCCAGCGGAATTGGTTCCAAGAGCTTATGAAGCAAATTGATCGAGATTGCGAGT

TCTTGGAGGCTGAGAGAATTATGGATTATAGTCTTTTGGTTGGACTACACTTTCGGGATG

ATAATAGAGGTGATAAAATGGGGTTATCACCGTTTCTGTTGCGCACAGGCAAAAAGGATT

CATATCAGAATGAAAAGTTTATGCGTGGCTGTAGATTCCTTGAAGCTGAGCTACAGGACA

TGGATCGGATTTTAGCTGGCCAGAAACCATTGATACGGCTAGGAGCAAACATGCCAGCA

AGAGCAGTGCGAATGTCTAGAAAAAGCGACTTTGATCAGTATACACAGGGTGGAGTCG

GTCTCTTTTCACATAGTGGCGAAGTTTATGAAGTTGTGTTATACTTTGGCATCATTGACAT

CTTACAAGACTACGACATCAGCAAGAAATTGGAGCATGCCTACAAATCACTACAAGCTG

ATCCTTCTTCAATATCAGCTGTTGGTCCAAAACTCTACTCGAAGAGGTTTCGGGATTTTATAGGAAGAATTTTCATTGAAGACGAGTAG。

2.5构建载体和VIGS沉默目的基因

2.5.1构建沉默载体

(1)目的基因片段与克隆载体pEASY-T5 Zero的连接

a.从-80℃冰箱中取出pEASY-T5 Zero载体后，在冰上融化。

b.计算所加目的片段的体积，使载体与目的片段的摩尔比＝1:5，在冰上，向无菌的1.5mL离心管中加入如表7所示成分：

表7连接体系

c.将其轻摇混匀，短暂离心后，25℃连接5分钟。

(2)转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

采用热激法转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。

(3)沉默载体的构建

a.将(2)中测序成功的阳性质粒为模板，通过添加了限制性酶EcoRI和XhoI酶切位点和保护碱基的引物进行沉默片段扩增，并通过双酶切的方法分别将GhPIP5K2和GhPIP5K22的片段***到TRV2(pYL156)沉默载体中，构建TRV:GhPIP5K2和TRV:GhPIP5K22沉默载体，具体酶切体系如下：

表8酶切体系

b.在37℃，酶切3h后，加10×Loading Buffer停止反应，胶回收目的基因片段PCR产物，载体回收酶切大片段。酶切产物回收后，将目的片段与沉默载体连接，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行蓝白斑筛选实验后，进行菌液PCR和双酶切鉴定，完成后将阳性质粒测序(上海生工生物工程有限公司)，并转入农杆菌GV3101感受态中，得到沉默载体。

2.5.2VIGS沉默目的基因

对新石25K幼苗进行VIGS沉默，具体方法如下：

a.按2.2的方法种植陆地棉“新石25K”种子，待其生长至第7天，子叶完全展开时，将其浸水，直至花盆内的营养土将水吸收至表面后，停止浸水，放置备用。

b.向LB液体培养基中加入Kan⁺和Rif备用，其中Kan⁺和Rif的终浓度分别为50μg/mL和25μg/mL。将从-80℃取出的VIGS载体***和目的基因菌液在冰上融化，28℃，200rpm活化12-16h(菌液:LB液体培养基＝1:10)。活化完成后，按同样比例进行扩繁。

c.菌液扩繁完成后，以5000rpm的转速，离心10min，倒掉上清液，保留菌体，并将其利用分光光度计用重悬液使菌体悬浮，OD₆₀₀在0.8-1.0之间即可。

d.重悬完成后，黑暗放置3h，使菌体复苏后，将pYL192(TRV1)分别与含TRV:00(空白对照组)、TRV:GhCLA1(阳性对照组)、TRV:GhPIP5K2(实验组1)、TRV:GhPIP5K22(实验组2)的菌体重悬液1:1混合，并将其充分混匀在黑暗条件下处理3小时。

e.在棉花幼苗生长的第7天，将其按照步骤a的方法浸水。在棉花幼苗生长的第8天对其进行VIGS注射，具体操作为：将子叶背面使用1mL注射器针头划口，将步骤d的混合菌液注射到棉花子叶中，尽可能使菌液充满整个子叶。

f.注射完成后，使用塑料袋将其包裹，25℃黑暗培养24h后，在正常生长条件下培养。

g.待阳性对照棉花幼苗出现白化后，采取实验组及空白对照组的棉花幼叶，进行荧光定量PCR检测其基因表达水平和沉默效率。

2.6非生物胁迫处理

沉默后，待注射过的阳性棉花幼苗出现白化，将TRV:00空载体植株(空白对照组)和TRV:GhPIP5K2植株生长至四周龄的棉花幼苗分别进行高温(42℃)、低温(12℃)、干旱(15％PEG)和盐(200mmol/LNaCl)胁迫处理。进行表型观察。

同时，待注射过的阳性棉花幼苗出现白化，将TRV:GhPIP5K22植株生长至四周龄的棉花幼苗进行高温(42℃)和低温(12℃)胁迫处理。进行表型观察。

2.7抗逆性检测

2.7.1目的基因沉默植株中生理生化指标测定

胁迫处理10天后，按照常规方法分别检测TRV:00空载体植株、TRV:GhPIP5K2植株、TRV:GhPIP5K22植株叶片的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)，三种抗氧化酶的活性和丙二醛(MDA)的含量。

2.7.2目的基因沉默植株中逆境胁迫相关基因荧光定量检测

在胁迫处理前后，采摘基因沉默株系的幼叶，通过根据RNAprep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(货号DP441，购自天根生化科技有限公司)提取RNA，并通过FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒(货号KR118，购自天根生化科技有限公司)进行反转录，最后通过Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(货号FP209，购自天根生化科技有限公司)进行胁迫相关基因的表达水平检测，具体方法参照说明书。

其中TRV:GhPIP5K2沉默植株检测的胁迫相关基因为GhHSFB2A、GhDREB2A、GhDREB2C、GhRD20-1、GhRD29A、GhBIN2、GhCBL3、GhNHX1、GhPP2C、GhSnRK2.6和GhCBF1。

TRV:GhPIP5K22沉默植株检测的胁迫相关基因为GhHSFB2B、GhDREB2A、GhDREB2C、GhRD20-1、GhRD29A、GhCBF1和GhCIPK6。

3.结果与分析

3.1表型观察结果

感染后第9天，棉花叶片表现出白化的表型(图2中a和图3中a)，阳性对照TRV:GhCLA1验证了VIGS技术的有效性，结合qRT-PCR检测沉默效率，VIGS显著地降低了目的基因的表达水平(图2中b和图3中b)。

对于GhPIP5K2在四种非生物胁迫条件(高温、低温、干旱和盐)下的功能，比较沉默的TRV:GhPIP5K2植株和正常植株，TRV:GhPIP5K2植株表现出枯萎、叶片变黄和缺水等特征(图2中c和d)。进一步地，与对照植株相比，沉默的TRV:GhPIP5K2植株在冷胁迫下新生叶片变黑(图2中d)。经统计，四种非生物胁迫处理后，带有发黄或枯萎的叶片的TRV:GhPIP5K2植株数量显著多于正常植株(图2中e、f、g和h)。

对于GhPIP5K22在两种非生物胁迫条件(高温、低温)下的功能，比较沉默的TRV:GhPIP5K22植株和正常植株，TRV:GhPIP5K22植株表现出枯萎、叶片变黄和缺水等特征(图3中e)。经统计，两种非生物胁迫处理后，带有发黄或枯萎的叶片的TRV:GhPIP5K22植株数量显著多于正常植株(图3中c和d)。

这些结果表明，GhPIP5K2和GhPIP5K22在棉花非生物胁迫处理中发挥了积极作用。

3.2生理生化指标检测结果

为了探索非生物胁迫对GhPIP5K2和GhPIP5K22的影响，本发明检测了TRV:GhPIP5K2和TRV:GhPIP5K22沉默棉株中SOD、POD、CAT活性的变化和MDA含量的变化。结果表明，与TRV:00植株相比，沉默植株TRV:GhPIP5K2和TRV:GhPIP5K22的抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)均明显降低；相反地，MDA含量均明显增加(图4)。

上述发现表明，沉默GhPIP5K2和GhPIP5K22会削弱棉花对非生物胁迫的耐受性。

3.3逆境胁迫相关基因荧光定量检测结果

与对照植株相比，在胁迫处理前后TRV:GhPIP5K2和TRV:GhPIP5K22植株的胁迫相关基因的表达均发生了显著变化。

在TRV:GhPIP5K2植株中，GhBIN2、GhCBL3和GhNHX1的表达在对照植株中上调，而在胁迫处理后沉默的植株中则显著下调。在处理前和处理后，沉默植株TRV:GhPIP5K2中GhDREB2A、GhHSFB2C、GhRD20-1、GhPP2C和GhSnRK2.6的表达量均低于对照植株。与处理前的对照相比，沉默植株中GhHSFB2A、GhDR29A和GhCBF1的表达量下调，而与对照植株相比，沉默植株在处理后至少一种胁迫处理下的表达量显著降低(图5中a)。结果表明，GhPIP5K2可能对非生物胁迫有正向调节作用。

在TRV:GhPIP5K22植株中，GhHSFB2B的表达在对照植株上调，而在高温胁迫处理后的沉默植株中则明显下调。同样，其他三个与胁迫相关的基因(GhDREB2A、GhDREB2C和GhRD29A)也呈现出相似的模式。相反，在沉默植株TRV:GhPIP5K22中，处理前后都观察到了GhRD20-1、GhCIPK6和GhCBF1的表达水平低于对照植株(图5中b)。这些发现提示沉默GhPIP5K22可能直接影响GhRD20-1、GhCIPK6和GhCBF1的表达水平。综上所述，我们推测GhPIP5K22在温度胁迫响应过程中可能扮演着积极调控的角色。

综上所述，通过VIGS沉默GhPIP5K2或沉默GhPIP5K22的陆地棉相比于对照组对非生物胁迫更为敏感，说明棉花抗逆性降低，因此证明上述基因正向调控棉花响应非生物胁迫反应。本发明为陆地棉对非生物胁迫的高抗逆性育种提供重要基因资源。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.陆地棉GhPIP5K2基因在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用，其特征在于，所述陆地棉GhPIP5K2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.包括权利要求1中所述的陆地棉GhPIP5K2基因的重组载体在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

3.包括权利要求2中所述的重组载体的工程菌在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过上调陆地棉中所述陆地棉GhPIP5K2基因的表达水平，提高所述陆地棉对非生物胁迫的抗逆性；

所述非生物胁迫包括高温、低温、干旱和盐胁迫。

5.陆地棉GhPIP5K22基因在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用，其特征在于，所述陆地棉GhPIP5K22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

6.包括权利要求6中所述的陆地棉GhPIP5K22基因的重组载体在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

7.包括权利要求7中所述的重组载体的工程菌在调控陆地棉对非生物胁迫的抗逆性中的应用。

8.如权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，通过上调陆地棉中所述陆地棉GhPIP5K22基因的表达水平，提高所述陆地棉对非生物胁迫的抗逆性；

所述非生物胁迫包括高温和低温胁迫。

9.一种提高陆地棉对非生物胁迫的抗逆性的方法，其特征在于，包括在陆地棉中上调所述陆地棉GhPIP5K2和/或GhPIP5K22基因的表达水平的步骤。