CN106399327A

CN106399327A - 毛果杨PtrZFP103基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN106399327A
Application number: CN201611038253.3A
Authority: CN
Inventors: 杨静莉; 王含; 赵世成; 李成浩
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2017-02-15

Abstract

毛果杨PtrZFP103基因及其编码蛋白和应用，它属于生物技术领域。毛果杨PtrZFP103基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。其的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。应用：在提高植物在高盐胁迫下抗逆能力上的应用。毛果杨PtrZFP103基因的编码区全长序列507bp，编码168个氨基酸。本发明发现在高盐胁迫下转基因株系细胞受损程度明显低于WT并且生理指标的结果也验证了PtrZFP103基因的过表达株系抗逆能力明显高于WT。发现PtrZFP103特异性的提高植物在高盐胁迫下的抗性，可培育出抗高盐的转PtrZFP103基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要意义。

Description

毛果杨PtrZFP103基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及毛果杨PtrZFP103基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

森林为社会、生态和经济等提供了利益，但随着气候不断变化树木经历干旱、高盐和高温等胁迫，这些导致它们受到干扰致使死亡。温度、昆虫、病原体和高盐等环境变化被预计为导致森林广泛死亡现象的主要因素。所以培育出抗盐的林木品种对改善森林结构具有重要意义。传统的杂交育种需要优良品种作为主要资源，由于林木生长周期长、遗传机理不明确等致使获得抗逆新品种的时间长而且效率很低，难以满足不同目的定向培育树木新品的要求。随着现代分子生物学技术的发展、基因工程和分子育种等手段的兴起，研究植物抗逆调控机制鉴别出参与抗逆的重要功能性基因，并通过转基因方法改良植物抗逆性已经成为林木新品种培育更为有效的方法和途径。毛果杨作为一个遗传背景清楚的模式植物，为林木遗传改良提供了很好的原材料。

转录因子通过调控相关基因的表达参与植物生长发育、信号传导、逆境胁迫应答等反应。单个基因表达量的增加并不能从根本上改良植物的抗逆能力，而多个基因表达的增强可以提高植物对多种不良环境的抵抗性。转录因子能对胁迫信号做出应答，通过与其启动子中特异且保守的顺式作用元件发生结合，激活或抑制下游基因表达。转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达，因此，研究抗逆相关的转录因子的调控机制对于提高植物抗逆性具有重要意义。

锌指蛋白(zinc finger protein)是一个庞大的转录因子家族，根据锌指的保守基序特点，可将含锌指结构域的转录因子分为C2H2、C4HC3、C3HC4、C2HC5、C3H等亚类，其中以C2H2型最多，为经典锌指模体结构。锌指蛋白转录因子在植物生长发育、形态建成以及非生物和生物胁迫等逆境应答中起着不同的调控作用。研究表明，C2H2型锌指蛋白主要有两方面的功能，一是调控各个时期植物的生长发育，二是调控环境胁迫下基因的表达。已经从拟南芥、矮牵牛、小麦、大麦、大豆等作物中分离到多个C2H2型锌指蛋白基因,广泛地参与植物生长发育和胁迫应答反应。从拟南芥中克隆了一个能编码C2H2型锌指蛋白的STZ基因，将该基因转入烟草明显提高植株对冷及高盐条件的耐受力。将锌指蛋白基因ZFP245和ZFP179转入水稻，提高了植物在干旱胁迫下存活率和耐盐能力。从大豆中克隆得到C2H2型锌指蛋白基因SCOF-1和GsZFP1受低温诱导表达。在矮牵牛中获得的锌指蛋白基因ZPT2-3，转入该基因的烟草对干旱的耐受能力也得到明显提高。因此，选择毛果杨为材料，分离、鉴定C2H2型锌指蛋白转录因子并分析其抗逆功能，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。

发明内容

本发明目的是提供毛果杨PtrZFP103基因及其编码蛋白和应用。

本发明中毛果杨PtrZFP103基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明中毛果杨PtrZFP103基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明中毛果杨PtrZFP103基因的应用是指在提高植物在高盐胁迫下抗逆能力上的应用。

本发明公开了毛果杨中的PtrZFP103转录因子的应用，本发明利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的拟南芥转基因株系有效地提高了植物对高盐胁迫下的耐受性的特征。在高盐胁迫下对PtrZFP103转基因拟南芥株系和WT(野生型拟南芥株系)的细胞的受损情况、生理指标进行了观察，发现在高盐胁迫下转基因株系细胞受损程度明显低于WT并且生理指标的结果也验证了PtrZFP103基因的过表达株系抗逆能力明显高于WT。通过本发明发现PtrZFP103特异性的提高植物在高盐胁迫下的抗性，可培育出抗高盐的转PtrZFP103基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为本发明中毛果杨RNA电泳图；

图2为本发明中毛果杨PtrZFP103基因PCR产物的胶回收电泳图，其中M为DL2000DNA Marker，1为PCR产物；

图3为本发明中实时荧光定量PCR分析在NaCl胁迫下毛果杨根和叶片中PtrZFP103基因的表达量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；

图4为本发明中实时荧光定量PCR分析在Mannitol胁迫下毛果杨根和叶片中PtrZFP103基因的表达量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；

图5为本发明中实时荧光定量PCR分析在ABA胁迫下毛果杨根和叶片中PtrZFP103基因的表达量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；

图6为本发明中实时荧光定量PCR分析在SA胁迫下毛果杨根和叶片中PtrZFP103基因的表达量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；

图7为本发明中实时荧光定量PCR分析在MeJA胁迫下毛果杨根和叶片中PtrZFP103基因的表达量，其中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d；

图8为本发明中PtrZFP103过表达载体转入农杆菌中PCR电泳检测图，M为DL2000DNA Marker，1-3为PtrZFP103基因；

图9为本发明中PtrZFP103基因的亚细胞定位分析；

图10为本发明中PtrZFP103转基因拟南芥在添加卡那霉素的1/2MS培养基中筛选情况；

图11为本发明中具有卡那霉素抗性的T₀代PtrZFP103转基因拟南芥在基因组水平上的PCR检测，M为DL2000DNA Marker，+为阳性对照，-为阴性对照，1～12为转基因植株；

图12为本发明中PtrZFP103转基因拟南芥阳性植株的转录水平上的PCR检测，M为DL2000DNA Marker，+为阳性对照，-为阴性对照，1～12为转基因植株；

图13为本发明中在不同浓度的NaCl胁迫下WT和PtrZFP103转基因拟南芥的萌发率比较图；

图14为本发明中WT和PtrZFP103转基因拟南芥种在1/2MS培养基和含100mM NaCl培养基中生长11天的根部生长情况对比图；

图15为本发明中用300mM NaCl溶液分别浇灌转基因和野生型拟南芥土培苗0h、24h和72h后取其叶片进行的NBT(Nitroblue Tetrazolium,硝基四氮唑蓝)染色图；

图16为本发明中生长4周的野生型和转基因拟南芥土培苗在经300mM NaCl胁迫0h、24h、72h后取其叶片进行DAB(Diaminobenzidine,二氨基苯胺)染色图；

图17为本发明中野生型和转基因拟南芥土培苗生长4周后经300mM NaCl胁迫0h、24h、72h后取其叶片进行Evans Blue(伊文思蓝)染色图；

图18为本发明中在NaCl胁迫下WT和PtrZFP103转基因拟南芥植株MDA含量测定图，其中表示WT，表示Line1，表示Line2，表示Line3；

图19为本发明中在NaCl胁迫下WT和PtrZFP103转基因拟南芥植株SOD活性测定图，其中表示WT，表示Line1，表示Line2，表示Line3；

图20为本发明中在NaCl胁迫下WT和PtrZFP103转基因拟南芥植株POD活性测定图，其中表示WT，表示Line1，表示Line2，表示Line3。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式毛果杨PtrZFP103基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本实施方式中毛果杨PtrZFP103基因的编码区全长序列507bp。

具体实施方式二：本实施方式毛果杨PtrZFP103基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQID No：2所示。

本实施方式毛果杨PtrZFP103基因的编码蛋白由168个氨基酸组成。

具体实施方式三：本实施方式毛果杨PtrZFP103基因的应用是指在提高植物在高盐胁迫下抗逆能力上的应用。

以下实施例中如无特别说明均为常规方法。所使用的材料、试剂、酶、感受态细胞何质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.毛果杨PtZFP103基因的获得以及表达特性分析如下：

1.1 目的基因的克隆

1.1.1 目的基因序列的获得

在目的基因序列两端设计引物如表1。

表1 本发明用于目的基因克隆的引物序列

利用CTAB法提取毛果杨(Populus trichocarpa(Torr.&Gray))雌株无性系Nisqually1总RNA，如图1并且反转录成cDNA。以此cDNA为模板，使用LA Taq酶体系进行目的基因的克隆，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸48s，循环数为35；最后72℃延伸7min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR体系如表2。

表2 本发明用于目的基因克隆PCR反应体系

1.1.2.目的基因连接T载体测序

对目的片段产物进行胶回收如图2，将回收产物连接到T载体，热激法大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，将挑取10个白色菌落进行扩大培养PCR检测，提取阳性质粒后进行测序。经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将该基因片段命名为PtrZFP103，由507bp个碱基组成。其编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。

1.2 毛果杨PtrZFP103基因表达特性分析(qRT-PCR)

1.2.1.引物设计

设计PtrZFP103基因特异性引物103F、103R及Actin内参引物ActinF、ActinR，如表3。

表3 本发明用于基因表达特异性分析的引物序列

1.2.2.实时荧光定量PCR分析

取生长健壮毛果杨组培苗，分别对其进行200mM NaCl、200mM mannitol、200μMABA、100μM SA和200μM MeJA胁迫处理，处理时间为0h、3h、6h、12h、24h；取下各个样品的根和叶，提取RNA并反转录为模板，进行实时荧光定量PCR，反应体系如表4：

表4 本发明用于实时荧光定量PCR反应体系

按两步法反应程序进行扩增：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火及延伸15s，78℃读板1s，循环数为45。将得到的数据输入Excel中，分析数据并使用2^-ΔΔCt法进行数据计算，做图(如图3-200mM NaCl，图4-200mM Mannitol，图5-200μM ABA，图6-100μSA，图7-200Mm MeJA，图中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h，表示7d)。结果表明该基因在NaCl胁迫下根和叶都有上调表达的趋势，推测在盐胁迫下，这个基因可能参与植物的调控作用。

2.转基因手段分析PtrZFP103基因功能

2.1 设计引物

设计构建过表达载体的带有酶切位点的引物及载体检测引物，如表5。

表5 本发明用于构建过表达载体的引物序列

引物用途	引物名称	引物序列(5’-3’)
			过表达载体构建	ZFP103F	GCTCTAGACATGGATTTCCAACCAAACAC
过表达株系检测	ZFP103R	GCGTCGAC T AAGCCTTAAAGACAAATCTA

2.2 实验方法

2.2.1 pBI121-PtrZFP103-GFP过表达载体构建

PtrZFP103基因以ZFP103F和ZFP103R为引物扩增后，产物选取了SalI和XbaI两个酶切位点构建到表达载体pBI121-GFP(购买得到的)上。经PCR后电泳、双酶切及测序检测后，确定载体构建成功。

2.2.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

将克隆pBI121-PtrZFP103-GFP载体转化到EHA105农杆菌细胞中，28℃培养2天。

挑取单克隆农杆菌到5ml 50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃进行小摇，第二天将500μL小摇的菌液加入250mL 50mg/L Kan的LB液体中28℃至菌液OD 600为0.8～1.0，将菌液放入灭菌离心管4000rpm，4℃离心8min，用相同体积的5％(5g蔗糖/100mL水)的蔗糖水对菌液进行重悬，加入SilwetL-77，加入量为每100mL加入20μL，然后作为侵染工程菌液。

选取培养1个月生长健壮、高4-6cm和具有大量的半开的花苞和极少数的果荚的拟南芥，将花苞在菌液中侵染3-5s，取出花苞用吸水纸吸去多余菌液，用保鲜膜包裹放入暗处16h-24h。

等到拟南芥角果发黄，收集T₀代种子，在37℃烘干24h，室温48h，放入4℃冰箱一周后备用。

2.2.3 PtrZFP103基因的亚细胞定位

将pBI121-PtrZFP103-GFP质粒和pBI121-GFP制备成DNA微弹，利用基因枪的方法打入新鲜洋葱的第4～7层鳞茎内表皮即使用基因枪瞬时转化洋葱细胞，利用激光共聚焦显微镜显微镜观察其亚细胞定位。

2.2.4 转基因拟南芥的PCR检测

分别以野生型(WT)和转基因拟南芥为材料，CTAB法提取拟南芥基因组DNA，方法参照实施例一。以pBI121-GFP为阳性对照，以WT的总DNA为阴性对照，对筛选的转化植株进行PCR检测。

2.2.5 转基因拟南芥的多种胁迫

将转PtrZFP103基因的拟南芥T₃代line 1，line 2，line 3和WT(野生型拟南芥株系)的种子在20％的次氯酸钠溶液中消毒20min，最后用灭菌的蒸馏水漂洗5-6次，种入1/2MS培养皿和分别含有75mM、100mM、125mM、150mM NaCl的1/2MS培养基中，将其放置到温度22±2℃、光照强度80-100μmol·m^-2·s^-1、光周期16h/8h(日/夜)的人工培养室中培养12天，观察种子萌发率。

2.3 结果与分析

2.3.1 PtrZFP103过表达载体转入农杆菌

将本实施例实验方法2.2.1中所说PCR检测和双酶切后编号测序，选取结果较好的序号电转农杆菌。涂板28℃培养后挑取单克隆摇菌PCR检测，跑电泳，结果如图8所示。从图中可以看出，在507bp处有条带，说明已将中间表达载体已经导入到农杆菌中。将阳性菌落存菌。

2.3.2 PtrZFP103基因的亚细胞定位

将打完基因枪的洋葱表皮附在载玻片上在激光共聚焦显微镜下观察并拍照如图9，发现PtrZFP103基因定位于细胞核上。

2.3.3 PtrZFP103基因过表达株系的筛选

T₃代转基因株系的获得

在含有50mg/L的卡那霉素的1/2MS培养基中种入T₀种子进行筛选有抗性的植株第一代，在7d左右，没有转入目的基因的植株根系较短，叶片发黄，未能长出四片真叶，甚至死亡。而转化的植株，根系较发达，可以长出真叶，在培养基中正常生长(图10)。继续收获种子为T₁代。继续进行卡那霉素筛选，直到T₃代种子收获。这时转基因植株为纯合株系可以用于后期实验的研究。

2.3.4 PtrZFP103转基因拟南芥的PCR检测

2.3.4.1 PtrZFP103转基因拟南芥基因组水平上的PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，用PtrZFP103的特异性引物(表3)，以pBI121-GFP为阳性对照、WT(野生型拟南芥)为阴性对照进行PCR检测，转基因植株可以扩增出特异性条带长度为507bp，但WT中未出现特异性的条带(图11)，可以初步得出结论，植株的转化成功。

2.3.4.2 PtrZFP103转基因拟南芥RNA水平上的PCR鉴定

进一步对转基因植株分析，将DNA水平上有条带的12个转化植株提取高质量的RNA为模板，反转录成cDNA，再以其为模板进行PCR检测。PCR出的特异条带与质粒PCR出的特异条带在一条线上为507bp(图12)，进一步证明PtrZFP103基因已经进行了转录。

2.3.5 转基因拟南芥的抗逆能力筛选

用同样的转基因拟南芥株系(line 1、line 2和line 3)T₃代种子和非转基因对照拟南芥(WT)株系进行种子萌发率的实验，种子消毒后，用200μL的移液枪在含有各种胁迫的1/2MS培养基中分别点入一定数量的种子，光照培养7d后在CuSO₄、ZnSO₄、CdCl₂、NaCl和甘露醇等条件下，观察各种胁迫下的萌发率，发现结果表明：在NaCl条件下，三个转基因株系T₃代种子萌发率在各个梯度条件下明显高于野生型的种子，说明了这个基因特异性的提高了转基因株系的抗盐的能力(如图13)。

3.盐胁迫下转基因拟南芥的抗逆性分析以及细胞受损情况研究

3.1 植物材料

转基因拟南芥(line 1、line 2和line 3)T₃代种子以及非转基因对照拟南芥(WT)种子，以下实验至少重复三次。

3.2 实验方法

3.2.1 盐胁迫下转基因拟南芥的抗逆性分析

将转PtrZFP103基因的拟南芥T₃代的种子消毒种入1/2MS培养皿和含有NaCl的1/2MS培养基中，观察萌发率。将生长在1/2MS培养基5-8d后的拟南芥放入胁迫条件100mMNaCl下观察幼苗的根长及生长情况。

3.2.2 盐胁迫下转基因拟南芥细胞受损情况研究

将转PtrZFP103基因的拟南芥T₃代和WT的种子消毒种入培养基，培养7-8d待苗长出两叶一芯后种入土中，温室培养3-4周以后，用300mM NaCl胁迫24h、72h后取大小相同的叶片，这些叶片都进行NBT、DAB和Evans Blue染色，观察染色情况。所有的染色是将组培苗放入干净的5ml的离心管中，加入配制好浓度为1mg/ml的染液，过夜，用蒸馏水反复清洗直到没有浮色放入卡诺固定液。其中DAB染色为暗处过夜。

3.2.3 盐胁迫下转基因拟南芥的生理指标测定

3.2.3.1 MDA含量测定

分别取未经胁迫处理和300mM NaCl胁迫处理3天的WT、line1、line2、line3拟南芥植株，每个样取0.04g左右，用液氮速冻后进行研磨，迅速加入1.5mL的10％的三氯乙酸，4℃冰箱放置30min，11000rpm离心10min，吸取1mL的上清液于新的离心管中，然后加入1mL的0.6％TBA混匀，沸水浴15min，立即放入冰上冷却10min，室温下12000rpm离心20min；取上清液2mL在532nm和450nm下进行测OD值，对照管是1mL的0.6％TBA和1mL的水。

根据以下公式即可计算样品提取液中的丙二醛的含量C和单位质量样品中的丙二醛的含量y，计算公式：C(MDA浓度μmol/L)＝6.45×OD523-0.56×OD450；y(μmol/g)＝(c×v)/w。

3.2.3.2 SOD含量测定

现处理拟南芥植株用液氮对整个植株速冻之后对植物材料进行研磨，取0.02g样离心管中，之后加入1.5mL的1/15mol/L磷酸缓冲液，在4℃冰箱中放置30min，11000rpm离心20min，去上清的酶液50μL放入新的2mL离心管中，之后加入1.5mL的SOD反应液和450μL1/15mol/L磷酸缓冲液；30℃，6级光照培养10min，发现变蓝，随后立即测吸收光值(OD560)，用缓冲液置于暗处进行调零，SOD反应液照光做为对照。

A1：0.5mL H₂O+1.5mL SOD反应液光照后测OD值；A2：0.5mL酶液(已经稀释10倍)+1.5mL SOD反应液光照后测OD值(每个样品重复三次)；2mL 1/15mol/L磷酸缓冲液放入暗处用于调零。

计算SOD的活性公式：SOD活性＝(N×ΔA)/(W×T×50％)；其中，ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀释倍数；T代表反应时间(min)；W代表物材料植物材料的净重。

3.2.3.3 POD含量测定

现处理拟南芥植株用液氮对整个植株速冻之后对植物材料进行研磨，取0.02g样加入2mL的离心管中，之后向离心管中加入1.5mL的0.01mol/L磷酸缓冲液，每个样品3个生物学重复，在4℃冰箱中放置0.5h，11000rpm离心20min，取上清的酶液1mL加入2mL离心管中4℃冰箱保存，取酶液0.5mL酶液中加入0.5mL 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.2)，0.5mL愈创木酚溶液，充分混匀，30℃反应10min，在测定之前加入0.5mL 0.8％H2O2，混匀用722S分光光度计在470nm处测各样品的OD值，以dd H₂O替代作为对照值，并以dd H₂O进行调零。需要注意的是在测定的时候要迅速，测每30s读一次OD值，直到数不再变化为止，将这些点连起来，会形成一个曲线，酶液在所测定用时内的变化值一般取曲线初始线性部分的OD变化值。POD活性计算：POD活性＝(N×ΔA)/(W×T)；其中ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀释倍数；T代表反应时间(min)；W代表植物材料粉末的净重。

3.3 实验结果

3.3.1 盐胁迫下转基因PtrZFP103拟南芥的抗逆能力分析

3.3.2.1 盐胁迫下转基因拟南芥幼苗的抗逆分析

选取转PtrZFP103基因的拟南芥T₃代株系用于消毒，种在1/2MS培养基中，5-8d后移至分别含有100mM NaCl和150mM mannitol的培养基平板上，将平板竖直放置8d后，幼苗生长情况如图14所示。结果表明：转基因拟南芥的根系在NaCl胁迫下的长势和鲜重比野生型拟南芥强很多，说明了这个基因转入拟南芥后提高了拟南芥抗盐能力。

3.3.2.2 盐胁迫下转基因拟南芥的萌发情况

2中2.3.5进行了种子萌发率的实验，结果表明：三个转基因株系T₃代种子萌发率在各个梯度条件下明显高于野生型的种子，说明了转基因拟南芥株系在盐胁迫下的耐受力强。

3.3.2.3 盐胁迫下转基因拟南芥细胞受损情况研究

NBT、DAB和Evans Blue染色具有相同的处理条件：生长4周的野生型和转基因拟南芥土培苗在经300mM NaCl胁迫转基因拟南芥(line 1、line 2和line 3)和野生型拟南芥(WT)分别处理24h和72h，取其叶片进行染色。

3.3.2.4 NBT染色法分析逆境下转基因植株细胞内超氧离子水平

NBT还原法，在植物体内NBT被超氧离子O^2-氧化成蓝色甲腙，通过蓝色的深浅可以反映O^2-含量的多少。取样进行染色如图15；结果表明：在正常生长条件下，野生型和转基因株系植株叶片染色情况相似，只有在取材部位分布着少量的蓝色斑块，说明O₂ ^-含量基本一致；在盐胁迫下，随着胁迫时间的增长，无论是野生型还是转基因株系，叶片上的蓝色斑块面积都逐渐增加，颜色也渐渐变深。在不同的胁迫时间下，过表达PtrZFP103基因株系line1、line 2和line 3植株的蓝色斑块面积明显小于野生型，且染色也较浅。这说明在盐胁迫下，与野生型相比，转PtrZFP103基因拟南芥植株体内的O₂ ^-含量明显减少，对氧化伤害的抵抗性明显提高。

3.3.2.5 DAB染色法分析逆境下转基因植株细胞内过氧化氢水平

DAB是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。用于定位过氧化酶活性的具体部位和活性。可以通过染色的深浅，准确的可以反映出H₂O₂含量的多少。取样进行染色如图16；结果表明：在正常生长条件下，野生型和转基因株系植株叶片染色情况相似，分布着很少的棕色斑块，无明显的差异，说明H₂O₂含量基本相同；在盐胁迫条件下，随着胁迫时间的增加，无论是野生型还是转基因株系叶片的斑块颜色和面积均有明显的变化。在不同的胁迫时间下，过表达PtrZFP103基因株系line 1、line 2和line 3植株的棕色斑块面积明显小于野生型，且染色也较浅，说明了转基因PtrZFP103株系叶片内的H₂O₂的含量比野生型株系的植株叶片内的H₂O₂含量少。结果说明在胁迫条件下PtrZFP103转基因拟南芥比WT拟南芥抗逆能力强。

3.3.2.6 Evans Blue染色法分析逆境下转基因植株细胞的受损情况

Evans Blue染色法，原理在于伊文思蓝能够与蛋白结合形成伊文思蓝蛋白复合物，正常细胞膜不能透过伊文思蓝,当细胞受到损伤后,伊文思蓝进入细胞并与蛋白结合,使其染成蓝色。利用这一原理能够通过染色的深浅研究转基因拟南芥细胞的损伤情况。取样进行染色如图17；结果表明；在正常生长条件下转基因株系和转基因植株叶片染色颜色较淡且无明显差异，说明细胞损伤的情况基本相同；在盐胁迫条件下，随着胁迫时间的增加，转基因株系和野生型植株叶片的颜色均变深。而过表达PtrZFP103的转基因株系叶片的颜色明显要比野生型叶片颜色浅。这说明转基因株系叶片在干旱胁迫条件的损伤程度比野生型植株的损伤程度少。结果表明PtrZFP103基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗盐功能。

3.3.3 盐胁迫下转基因拟南芥各项生理指标的研究

将野生型和转PtrZFP103基因拟南芥(Line1、Line2、Line3)的种子消毒后，种于1/2MS培养基平板上，7-9天后将幼苗移至培养土中继续培养4周。然后用300mM NaCl溶液处理野生型和转基因植株，3天后分别取未处理和胁迫处理的拟南芥植株用于以下生理生化指标的测定。

3.3.3.1 MDA(丙二醛)含量的测定

植物在逆境条件下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，可通过检测MDA的含量来检测膜脂过氧化的程度，以间接测定膜***受损程度和植物的抗逆性，结果如图18所示；结果表明：在正常生长条件下，野生型和转基因株系植株的MDA含量基本相同。在盐胁迫下，转基因和野生型拟南芥的MDA含量都增大了，但转基因株系在胁迫情况下，MDA含量要低于野生型。采用单因素方差进行组内比较，发现在盐胁迫下转基因株系Line1、Line2、Line3中的MDA含量与野生型拟南芥中的MDA含量差异极显著。也就是说在干旱胁迫下，转基因株系MDA含量增加的程度没有野生型大，试验结果表明转PtrZFP103基因在拟南芥植株内起着非常重要的抗盐功能。

3.3.3.2 SOD(超氧化物歧化酶)活性的测定

SOD能够通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O^2－)，生成H₂O₂和O₂，抵御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜***的损伤，增强了植物的抗逆功能，如图19；结果表明：在未经胁迫情况下，WT和转基因株系的SOD活性大致相同，而经过盐胁迫的WT和转基因株系清除O₂.^－的能力都有所增加，而转基因株系的SOD活性明显高于野生型。这说明PtrZFP103基因能够正向地调节SOD活性，可以增加植株对活性氧的清除能力。试验结果表明：PtrZFP103基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗盐功能。

3.3.3.3 POD(过氧化物酶)活性的测定

POD是生物体内酶促防御***的重要保护酶，能够清除植物体内氧自由基，提高其抗逆性，如图20；结果如下：WT和转基因株系在正常生长状态下，POD活性基本持平。在盐胁迫下，WT和转基因株系的POD活性都提高了，说明在胁迫下，植物清除H₂O₂的能力增强。采用单因素方差进行组内比较，发现在盐胁迫下转基因株系Line2、Line3中的POD含量与野生型拟南芥中的POD含量差异极显著。这说明在盐胁迫下，转基因株系的POD活性显著高于野生型，也就是说转基因植株的抗盐胁迫能力明显优于野生型植株。试验结果表明PtrZFP103基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗逆功能。

以上实验中所用药品皆为市售产品。从上述实验中可知，利用农杆菌介导法在拟南芥中表达该基因，获得转基因拟南芥发现在盐胁迫下转基因株系的萌发率高。为了更进一步的验证实验结果，通过对不同生长阶段的T₃代纯合植系和WT进行盐条件下的抗逆能力分析。在根长实验中，转基因株系的根长比WT长而且侧根也比较多，转基因拟南芥在NaCl胁迫下的长势和鲜重比野生型拟南芥强很多。说明PtrZFP103基因在盐胁迫下具有很重要的抗逆功能。同时通过NBT、DAB、Evans Blue染色对转基因株系和WT在盐胁迫下细胞的受损情况进行了观察，发现在盐胁迫下WT细胞受损程度明显高于转基因株系，也验证了上面的结论。通过各项生理指标的测定，发现在盐胁迫条件下，PtrZFP103基因的过表达株系的抗逆能力明显高于WT。本实验说明PtrZFP103基因转入拟南芥植株体内提高了植物在盐胁迫下的抗逆能力。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 毛果杨PtrZFP103基因及其编码蛋白和应用

<160> 10

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 毛果杨PtrZFP103基因的核苷酸序列。

<400> 1

atggatttcc aaccaaacac ctctctacat ctaagcctac caagcaatca actaaaccta 60

gaacttgtac tcgagccatc ctcttcttct tcatcatcac ctcatagtcc ggcagaacct 120

cgaattttct catgcaacta ctgccgaaga aagttttata gctcacaagc tcttgggggt 180

caccaaaatg ctcataagct tgagagaacc ttggccaaaa agagccgaga gatgagttca 240

tccgtacggg ctcatggaag atcgaaccca cggtcaggat cgtcttcttg catgagtggg 300

ccaagctttc ctcgacatca tgaaccagcc ctagcaaggt tcgagcacca tggacatgct 360

ggtaggtttg ttggtgacgc gagctatgac aggacagaga tgaattatgg ttccatagaa 420

ggtgtagggg gttcttggtc cctggtatat agaacagaaa atgttcaaga agagttgagc 480

cagctagatt tgtctttaag gctttga 507

<210> 2

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 果杨PtrZFP103基因编码蛋白的氨基酸序列。

<400> 2

atg gat ttc caa cca aac acc tct cta cat cta agc cta cca agc 45

Met Asp Phe Gln Pro Asn Thr Ser Leu His Leu Ser Leu Pro Ser

5 10 15

aat caa cta aac cta gaa ctt gta ctc gag cca tcc tct tct tct 90

Asn Gln Leu Asn Leu Glu Leu Val Leu Glu Pro Ser Ser Ser Ser

20 25 30

tca tca tca cct cat agt ccg gca gaa cct cga att ttc tca tgc 135

Ser Ser Ser Pro His Ser Pro Ala Glu Pro Arg Ile Phe Ser Cys

35 40 45

aac tac tgc cga aga aag ttt tat agc tca caa gct ctt ggg ggt 180

Asn Tyr Cys Arg Arg Lys Phe Tyr Ser Ser Gln Ala Leu Gly Gly

50 55 60

cac caa aat gct cat aag ctt gag aga acc ttg gcc aaa aag agc 225

His Gln Asn Ala His Lys Leu Glu Arg Thr Leu Ala Lys Lys Ser

65 70 75

cga gag atg agt tca tcc gta cgg gct cat gga aga tcg aac cca 270

Arg Glu Met Ser Ser Ser Val Arg Ala His Gly Arg Ser Asn Pro

80 85 90

cgg tca gga tcg tct tct tgc atg agt ggg cca agc ttt cct cga 315

Arg Ser Gly Ser Ser Ser Cys Met Ser Gly Pro Ser Phe Pro Arg

95 100 105

cat cat gaa cca gcc cta gca agg ttc gag cac cat gga cat gct 360

His His Glu Pro Ala Leu Ala Arg Phe Glu His His Gly His Ala

110 115 120

ggt agg ttt gtt ggt gac gcg agc tat gac agg aca gag atg aat 405

Gly Arg Phe Val Gly Asp Ala Ser Tyr Asp Arg Thr Glu Met Asn

125 130 135

tat ggt tcc ata gaa ggt gta ggg ggt tct tgg tcc ctg gta tat 450

Tyr Gly Ser Ile Glu Gly Val Gly Gly Ser Trp Ser Leu Val Tyr

140 145 150

aga aca gaa aat gtt caa gaa gag ttg agc cag cta gat ttg tct 495

Arg Thr Glu Asn Val Gln Glu Glu Leu Ser Gln Leu Asp Leu Ser

155 160 165

tta agg ctt tga 507

168

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PtrZFP103 F的核苷酸序列。

<400> 3

atggatttcc aaccaaacac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PtrZFP103 R的核苷酸序列。

<400> 4

aagccttaaa gacaaatcta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物103F的核苷酸序列。

<400> 5

tgagttcatc cgtacgggct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物103R的核苷酸序列。

<400> 6

caagaacccc ctacaccttc 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ActinF的核苷酸序列。

<400> 7

atggccgatg ccgaggatat tcaac 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ActinR的核苷酸序列。

<400> 8

ggtcaagata cctcttttag attgt 25

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>引物ZFP103 F的核苷酸序列。

<400> 9

gctctagaca tggatttcca accaaacac 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ZFP103 R的核苷酸序列。

<400> 10

gcgtcgacta agccttaaag acaaatcta 29

Claims

1.毛果杨PtrZFP103基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.毛果杨PtrZFP103基因的编码蛋白，其特征在于该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。

3.毛果杨PtrZFP103基因的应用，其特征在于该基因在提高植物在高盐胁迫下抗逆能力上的应用。