CN104120138A

CN104120138A - 一种增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因及其应用

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Publication number: CN104120138A
Application number: CN201410358406.7A
Authority: CN
Inventors: 刘栋; 李卫春; 马利霞; 程建峰
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2014-07-26
Filing date: 2014-07-26
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2034-07-26
Also published as: CN104120138B

Abstract

本发明克隆了一种增强植物耐盐性的拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2，并公开了其应用。该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，也包括与SEQIDNO:1核苷酸序列同源性在90～100%之间的基因。本发明同时还提供了重组载体的构建和转基因的方法以应用上述基因，可培育耐盐性更强的转基因植物新品种，具有广泛的应用价值。

Description

一种增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体说是利用分子生物学技术获得一种能够增强植物耐盐性的基因AtPGK2及其在转基因植物中的应用。

背景技术

土壤盐渍化在全世界都十分严重，盐胁迫是影响全球农作物产量的重要非生物胁迫之一（Parvaiz and Satyawati, 2008）。我国盐渍土面积大、分布广、类型多，约占国土面积的10%，而且每年盐碱化和次生盐碱化都在不断加重，使农业生产的可持续发展受到威胁，严重影响植物的生长发育和经济作物的产量与品质（孙建昌等, 2008）。因此，培育耐盐性增强的转基因农作物新品种是一项十分迫切的任务。

植物基因工程是指在生物体外，利用工具酶对DNA分子进行“剪接”和“拼接”形成重组的DNA分子，将其转化植物细胞并使其表达。目前，利用植物基因工程培育耐盐性增强的转基因植物新品种已取得一定的进展。许多研究表明，将植物的耐盐相关基因导入自身或者其他物种的细胞并产生转基因植株，可以显著增强转基因植物的耐盐能力。如在拟南芥中过量表达玉米的ZmCBL4基因能够提高转基因植株在萌发期和幼苗期对盐胁迫的耐受性（Wang et al., 2007）；Chen 等（2008）利用组成型启动子CaMV 35S驱动拟南芥AtNHX1基因在荞麦中过量表达，转基因荞麦植株中主要营养成分的含量未受高盐胁迫的影响；Liang 等（1997）利用CaMV 35S启动子驱动菠菜的BADH基因在烟草植株中过量表达，转基因烟草的耐盐性显著提高。

植物的3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）作为重要的酶催化3-磷酸甘油酸和1, 3-二磷酸甘油酸之间的互变，在碳固定、糖酵解和糖异生代谢中具有重要功能（Blake and Rice, 1981; Watson et al., 1982）。目前，许多编码PGKs的基因在植物、动物和微生物中被克隆（Watson and Littlechild, 1990）。在植物中，如豌豆（Pacold and Anderson, 1975）、小麦（Longstaff et al., 1989）、大麦（McMorrow and Bradbeer, 1990）、菠菜（Kopke-Secundo et al., 1990）和番茄（Rao et al., 1995）等的PGKs先后被分离和克隆，并且其编码的蛋白多数被纯化用于酶活性研究。序列分析表明，高等植物的PGKs由两个细胞核基因编码，其编码蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性，其中，一个基因编码的氨基酸序列在N-末端有一段大约由70个氨基酸组成的定位于叶绿体的转运肽，相反，另一个基因编码的氨基酸序列在N-末端并无转运肽序列。因此，推测由高等植物细胞核编码的两个PGKs分别定位于叶绿体和细胞质（Longstaff et al., 1989; Kitayama and Togasaki, 1995）。以上所述对高等植物PGKs基因的分离、克隆、序列分析和其编码蛋白的酶活性研究多数集中在上世纪后期。进入本世纪，虽然近期有研究表明在盐胁迫条件下，植物体内PGK蛋白的含量显著增加（Kosova et al., 2011; Wang et al., 2013），但是对于其生理功能特别是参与植物响应盐胁迫的功能尚不清楚。

植物为适应盐胁迫，以最大限度减少盐胁迫对自身的伤害，从对盐胁迫信号的感知、胞间信号传递和胞内信号转导到最终调控胁迫响应基因的表达，使植物产生一系列形态、生理和生化的变化来抵御盐胁迫（Zhu, 2002; Jiang and Deyholos, 2006; Radi et al., 2013）。为了挖掘植物耐盐基因并培育耐盐性增强的转基因植物，本发明克隆了拟南芥编码3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2，将该基因转化模式植物拟南芥，发现转基因拟南芥植株对盐胁迫的耐受性明显增强。

发明内容

本发明目的是分离和克隆植物的耐盐基因，并对其参与盐胁迫响应的功能进行鉴定，提供一种分子生物学模式植物拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2及其在转基因植物中的应用。

本发明提供了一种新的、1437 bp的拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2序列，该基因的核酸序列选自：

（a）如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；

（b）在（a）限定的核酸序列中具有90～100%之间的同源性核苷酸序列。作为具体应用的实例，本发明提供了一种拟南芥编码3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2的克隆方法，具体操作步骤如下：

（1）提取拟南芥植株的总RNA并反转录为cDNA；

（2）以cDNA为模板，用PCR方法扩增AtPGK2基因的CDS序列；

（3）回收PCR扩增产物。

本发明同时提供了拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2在植物耐盐性胁迫的应用，即：利用克隆的AtPGK2 基因的CDS序列，构建“CaMV 35S-AtPGK2”的融合基因，进行植物转化，从而获得在拟南芥中组成型表达AtPGK2目的基因的转基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术、花卉或者农作物耐盐性状改良需要的目的基因。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的构建及其在转基因拟南芥参与盐胁迫的应用。具体操作过程如下：

（1）用Nco I/BstE II双酶切通过PCR扩增的AtPGK2基因的CDS序列片段；

（2）用Nco I/BstE II双酶切pCAMBIA 1301（购自CAMBIA公司）质粒，回收大的载体片段；

（3）混合上述第一步得到的AtPGK2基因的CDS序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的构建。

其中所设计的AtPGK2基因的CDS序列的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了Nco I酶切位点，下游引物引入了BstE II酶切位点：

上游引物：5’-CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3’

下游引物：5’-GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3’。

所述应用中的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的构建在转基因拟南芥中组成型表达表达，操作过程如下：

拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法（Clough and Bent, 1998），获得的种子经过50 mg l^-1 潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，利用50 mg l^-1 的潮霉素进行抗性筛选获得转化AtPGK2基因的纯合转基因拟南芥株系，然后检测转基因拟南芥株系的耐盐性。

本发明的积极效果：

试验结果表明，将克隆的编码3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2转化模式植物拟南芥，可以显著提高转基因植株的耐盐性。本发明的融合基因构建“CaMV 35S-AtPGK2”可作为基因资源在农业生产上使用或选育转基因植物以提高耐盐性，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1 是转化“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的转基因拟南芥株系中目的基因AtPGK2的表达分析，**P﹤0.01。

图2 是转化“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的转基因拟南芥株系幼苗期的耐盐性分析。

图3 是转化“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的转基因拟南芥株系成苗期的耐盐性分析。*P﹤0.05。

具体实施方式

实施例1：拟南芥编码3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2的克隆

（1）利用异硫酸腈胍-酚法提取拟南芥植株的总RNA，药品的使用、配制以及具体操作步骤参考黄培堂等（2002）的方法。

（2）根据已知的拟南芥AtPGK2基因的CDS序列设计特异引物，在上游引物中引入Nco I酶切位点，在下游引物中引入BstE II酶切位点。

上游引物：5’-CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3’（引入Nco I酶切位点）

下游引物：5’-GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3’（引入BstE II酶切位点）

（3）取1 mg RNA作反转录的模板，以P₂₈₅₃为引物利用Promega的反转录酶ImProm-II ^TM进行反转录，P₂₈₅₃引物序列、反转录程序和反转录体系如下。

P₂₈₅₃引物序列：5'-GCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

反转录程序：

72℃ 5分钟；25℃ 5分钟；42℃ 60分钟；80℃ 20分钟；4℃保温。

反转录体系：

试剂	加入量（μl）
		DEPC水	5.0
P₂₈₅₃引物（10 μmol l^-1）	1.0
		5×反应缓冲液（含Mg²⁺）	4.0
MgCl₂（25 mmol l^-1）	2.4
		dNTP（10 mmol l^-1）	4.0
HPRI抑制剂	0.6
		ImProm-II ^TM 反转录酶（5 U μl^-1）	1.0
模板RNA（50 ng μl^-1）	2.0

（4）以反转录的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，获得AtPGK2基因的CDS片段。

PCR 反应程序：

94℃ 3分钟；

94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 2分钟，30个循环；

72℃ 10分钟；

4℃保温。

PCR 反应体系：

试剂	加入量（μl）
		灭菌双蒸水	36.5
10×反应缓冲液（含Mg²⁺）	5.0
		dNTP（10 mmol l^-1）	4.0
上游引物（10 μmol l^-1）	1.0
		下游引物（10 μmol l^-1）	1.0
ExTaq DNA聚合酶（5 U μl^-1）	0.5
		模板DNA（50 ng μl^-1）	2.0

（5）通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

（6）将回收后的PCR产物进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例2：利用pCAMBIA1301载体构建“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因

（1）从大肠杆菌中提取载体pCAMBIA 1301质粒（购自CAMBIA公司），用Nco I/BstE II双酶切后回收大的载体片段。

（2）对实施例1所回收的AtPGK2基因的CDS片段用Nco I/BstE II双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收（同实施例1）酶切后的片段。

（3）将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因构建。

连接体系：

试剂	加入量（μl）
		AtPGK2基因的CDS片段（50 ng μl^-1）	2.0
pCAMBIA1301载体大片段（50 ng μl^-1）	3.0
		Solution I连接酶	5.0

（4）用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法如下：

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α 感受态细胞，用10 μl连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12小时。

（5）以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因，扩增片段的大小是1678 bp。所用引物如下：

上游引物：5'-GCGATAAAGGAAAGGCCATCG-3'

下游引物：5’-GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3’

（6）从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例3：转基因拟南芥植株的制备

（1）用实施例2构建的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的Floral dip的方法（Clough and Bent, 1998），获得的种子经过50 mg l^-1潮霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

（2）转基因植株的实时定量RT-PCR检测：将实施例2中经过PCR鉴定的转基因拟南芥扩繁，经过50 mg l^-1潮霉素抗性筛选获得T₃代纯合的转基因株系，分别获取生长1周的野生型和转基因拟南芥幼苗，按照实施例1的方法提取植物组织的总RNA并反转录为mRNA，用如下引物、反应程序和反应体系进行PCR反应：

AtPGK2基因的检测引物：

上游引物：5’-CGTTGACTCTCGTTTCTCGGTCC-3’

下游引物：5’-TCCAACACTCTTCTTCGCCATCG-3’

TIP41-like基因的检测引物：

上游引物：5’-GTATGAAGATGAACTGGCTGACAAT-3’

下游引物：5’-ATCAACTCTCAGCCAAAATCGCAAG-3’

反应程序：

95℃：2 分钟；1 个循环；95℃：10 秒；60℃：30秒；40 个循环。

反应体系：

成分	加入量（mL）
		灭菌双蒸水	4.0
2 x SYBR Premix	10.0
		cDNA（10 ng/mL）	2.0
上游引物（2 μmol l^-1）	2.0
		下游引物（2 μmol l^-1）	2.0

实时定量PCR结果如图1所示，AtPGK2基因在两个转基因株系的表达量显著升高，与野生型对照比较升高程度增加7～8倍。

实施例4：过表达AtPGK2基因的转基因拟南芥株系的耐盐性检测

（1）幼苗期耐盐性检测：

将实施例3中通过实时定量RT-PCR鉴定的转基因株系在幼苗期进行耐盐性检测。具体方法：将野生型和纯合的过表达AtPGK2基因T₃代的转基因拟南芥种子铺在1/2MS培养基萌发生长4天（生长条件：光照强度：90 μE m^-2 s^-1，光周期：16 h光照/8 h黑暗），然后将幼苗转移至含有150 mM NaCl的1/2MS培养基上生长15天，每隔3天统计幼苗的存活率（存活率=生长点坏死的幼苗数/幼苗的总数）。试验结果如图2所示，过表达AtPGK2基因的转基因拟南芥株系在幼苗期的耐盐性较野生型拟南芥有显著的提高。

（2）成苗期耐盐性检测：

将实施例3中通过实时定量RT-PCR鉴定的转基因株系在成苗期进行耐盐性检测。具体方法：将野生型和纯合的过表达AtPGK2基因T₃代的转基因拟南芥种子在土壤中播种，培养在正常的光照条件下生长28天（生长条件：光照强度：90 μE m^-2 s^-1，光周期：16h光照/8h黑暗），然后每隔3天用300 mM 的NaCl溶液浇灌，15天后统计成苗的存活率（存活率=生长点坏死的成苗数/成苗的总数）。试验结果如图3所示，过表达AtPGK2基因的转基因拟南芥株系在成苗期的耐盐性较野生型拟南芥有显著的提高。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的拟南芥AtPGK2基因与植物的耐盐性呈正相关，在植物中过表达该基因可以显著提高转基因植物在幼苗期和成苗期的耐盐性。因此，本发明的融合基因构建“CaMV 35S-AtPGK2”可作为基因资源在农业生产上使用或选育转基因植物以提高耐盐性，具有广泛的应用价值。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 江西农业大学

<120> 一种增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因及其应用

<130> 2014

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

atggcttcca ccgccgcaac tgcagctctt tcgatcatca aatccaccgg tggcgccgcc 60

gttacacgct cctcccgcgc ctcctttgga cacattccct ccacatctgt ctccgcacgt 120

cgccttggct tctccgccgt cgttgactct cgtttctcgg tccacgtggc gtccaaggtc 180

cactccgtgc gcggaaaggg cgccagggga gtgattacga tggcgaagaa gagtgttgga 240

gatctgaatt ctgtagattt gaaggggaag aaggtgtttg ttagagctga tctcaatgta 300

cctctcgatg acaaccagaa tatcactgac gacactagaa tcagagccgc cattcccacc 360

atcaagtttt tgattgagaa tggtgctaag gtcatcctct ccactcattt gggaaggcca 420

aagggtgtca ctccaaagtt cagcttggct cctcttgttc ccagattatc agagctcctt 480

ggtattgagg tcgtgaaagc tgatgattgt attggtccag aagtggaaac cttggtggct 540

tcccttcctg aaggtggagt tttgcttctt gagaacgtga ggttttacaa ggaggaagag 600

aagaacgaac ctgattttgc taagaagctt gcttctctag ctgaccttta tgtcaacgat 660

gcgttcggga ctgctcacag agcccatgct tcaacagagg gagtcactaa gttcttgaag 720

ccatcagttg ctggtttcct tttgcaaaag gagttggact accttgttgg tgcggtttca 780

aacccaaaga gaccatttgc tgccattgtg ggaggttcca aggtctcatc taagattgga 840

gttatcgaat cgcttcttga gaaatgtgac atccttctgc ttggtggtgg aatgatcttt 900

acattctaca aggcgcaagg tctttccgtt ggctcctccc ttgttgaaga agacaagctt 960

gaattggcta caacactcct tgccaaggct aaggccagag gagtctctct gttgttacca 1020

acagatgttg tgattgctga caagttcgct cctgatgcca acagcaagat tgtgccagca 1080

tcagccattc ctgatgggtg gatgggattg gacatcggtc cagactcggt gaaaacattc 1140

aacgaagctc tggataccac gcagacagtc atttggaatg gaccaatggg agttttcgag 1200

tttgaaaagt ttgcaaaagg aactgaggcg gtagcgaata aactagcaga gctaagcaaa 1260

aagggagtga caacgataat aggaggagga gactcggtgg cagcagtgga gaaagtggga 1320

gtagcaggag tcatgagtca catctccaca ggtggtggtg ccagtttgga gctcttggaa 1380

ggcaaagtgc ttcccggtgt cgtcgctctt gatgaagcaa cgccagtcac tgtttaa 1437

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catgccatgg cttccaccgc cgcaactgca 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggtaacctt aaacagtgac tggcgttgct 30

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgaattctt tttttttttt ttttt 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgataaagg aaaggccatc g 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgttgactct cgtttctcgg tcc 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccaacactc ttcttcgcca tcg 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtatgaagat gaactggctg acaat 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atcaactctc agccaaaatc gcaag 25

Claims

1.一种增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一：

（a）如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；

（b）在（a）限定的核酸序列中具有90～100%之间的同源性核苷酸序列。

2.如权利要求1所述增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因的克隆方法，具体操作步骤如下：

（1）提取拟南芥植株的总RNA并反转录为cDNA；

（2）以cDNA为模板，用PCR方法扩增AtPGK2基因的CDS序列；

（3）回收PCR扩增产物。

3.如权利要求1所述的增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因的应用，它是利用克隆的AtPGK2 基因的CDS序列，构建“CaMV 35S-AtPGK2”的融合基因，进行植物转化，从而获得在拟南芥中组成型表达AtPGK2目的基因的转基因植物，其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术、花卉或者农作物耐盐性状改良需要的目的基因；“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的构建及其在转基因拟南芥参与盐胁迫的应用，具体操作过程如下：

（3）混合上述第一步得到的AtPGK2基因的CDS序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的构建；

上游引物：5’-CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3’

下游引物：5’-GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3’；

所述应用中的“CaMV 35S-AtPGK2”融合基因的构建在转基因拟南芥中组成型表达，操作过程如下：拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法，获得的种子经过50 mg l^-1 潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，利用50 mg l^-1 的潮霉素进行抗性筛选获得转化AtPGK2基因的纯合转基因拟南芥株系，然后检测转基因拟南芥株系的耐盐性；

所述植物为小麦、大麦、水稻、玉米、大豆、花生、棉花、马铃薯、油菜、番茄、黄瓜、苜蓿或拟南芥。