CN104725495A - 棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及棉花WRKY转录因子及其应用技术领域，具体是一种棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用。棉花GhWRKY51转录因子，是如（a）或（b）所示的蛋白：（a）SEQ ID NO.2所示的蛋白质；（b）将SEQ ID NO.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和***而衍生得到的仍具有GhWRKY51转录因子功能或活性的蛋白变体。本发明GhWRKY51在施用JA、ABA、GA 中表达表现为显著上调，施用SA是表达变化不大，利用干旱和NaCl处理时发现GhWRKY51基因表达均显著上调。过量表达的转基因烟草能够产生高的抗逆性。

Description

棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及棉花WRKY转录因子及其应用技术领域，具体是一种棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用。
背景技术
棉花是重要的经济作物，其纤维是世界上纺织工业的重要原料。同时棉花还是油料、饲料和其他工业原料的重要来源之一。然而棉花的产量和品质经常受到虫害、病害和各种逆境的影响。为了保证粮食安全，棉花的种植面积和种植地都要发生变化。尤其在不利于种植粮食作物的盐碱地和干旱地种植棉花成为棉花研究的一个方向。为了解决这个问题必须加强棉花抗逆育种研究。通过挖掘一系列抗逆相关基因，利用基因工程技术创制抗逆棉花新材料，可加速培育适应性强和产量高的棉花新品种进程。对于抗逆棉花品种培育的研究最大的难点是抗逆资源的培育，然而常规育种的方法很难有效地获得这些抗逆资源。随着人口不断的增长、环境污染、不合理的灌溉，过量施用化肥等因素，土壤盐碱化愈发严重，农业生产与可利用耕地间的矛盾日益加剧。因此,提高棉花的抗逆性特别是棉花的耐盐能力对于扩大棉花的种植范围、开发盐碱土地具有十分重要的意义。
转录因子(transcription factor)是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用并对转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白,转录因子调控复杂的蛋白间的互作网络。现有的转录因子主要包括:MYB、WRKY、bZIP、AP2/EREBP，它们广泛参与植物抗旱、耐盐等非生物逆境的调控。WRKY转录因子是近年来发现的一类在植物中广泛存在的重要转录因子超家族。WRKY蛋白通过特异性识别下游目的基因启动子区的W-box，从而参与植物的生长发育及抗逆反应过程。大量研究表明WRKY转录因子在响应植物的生物胁迫反应过程中发挥重要作用。近年来有关WRKY转录因子参与植物生物胁迫的研究逐渐被报道，但关于棉花WRKY参与非生物胁迫的研究不多。
除了在植物抗逆性的信号转导方面起着十分重要作用外，WRKY转录因子家族还参与调控植物生长发育和物质代谢等生理过程，包括种子形成、种子休眠和萌发、果实的成熟、根毛发育、叶片的衰老、胚胎形成等。WRKY转录因子的部分成员也参与了植物衰老过程并且发挥了重要的作用。
发明内容
本发明旨在提供一种棉花GhWRKY51转录因子，是如(a)或(b)所示的蛋白：
(a)SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和***而衍生得到的仍具有GhWRKY51转录因子功能或活性的蛋白变体。
本发明的目的之二是提供一种棉花GhWRKY51转录因子编码基因，是如SEQ ID NO.1所示的碱基序列；或在SEQ ID NO.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和***的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhWRKY51转录因子的功能或活性。
SEQ ID NO.1所示的碱基序列或者在严格条件下与其杂交且编码得到的仍具有GhWRKY51转录因子功能或活性的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述SEQ ID NO.1所示的碱基序列是通过抗盐SSH文库中获得EST序列后，使用RACE技术从棉花叶片中克隆的。
本发明的目的之三是提供棉花GhWRKY51转录因子编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。
SEQ ID NO.1是一种从棉花叶片中克隆出的棉花转录因子编码基因，命名为GhWRKY51，开放阅读框546bp，编码由181个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ IDNO.2所示。该转录因子启动特定基因的转录表达，引起植物生理生化的改变，从而保护植物的生长发育，增加植物对逆境胁迫抗性。
为了使上述(a)所示的蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)所示的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)所示蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示碱基序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
含有上述编码基因的重组载体(克隆载体或植物表达载体)或重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
进一步，本发明在pPZP111的多克隆位点***棉花GhWRKY51转录因子编码基因得到的重组载体。
本发明的另一目的是提供一种培育耐逆境胁迫的转基因植物的方法，具体为将上述重组载体导入到植物中，培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。
上述植物为双子叶植物和单子叶植物，优选烟草、棉花和玉米。上述逆境胁迫包括高盐或干旱。
本发明根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物，利用3′，5′-RACE技术，从棉花叶片中克隆该基因，命名为GhWRKY51。利用qPCR分析发现该基因在棉花里为组成型表达，在花里的表达量较高，在蕾里表达量较低。GhWRKY51在施用JA、ABA、GA中表达表现为显著上调，施用SA是表达变化不大，利用干旱和NaCl处理时发现GhWRKY51基因表达均显著上调。过量表达的转基因烟草能够产生高的抗逆性。因此利用本发明的抗逆蛋白及基因来培育抗逆植物，在植物环境适应性和种植范围的扩大等应用中将会有广阔的前景。
附图说明
图1为棉花GhWRKY51与其他植物WRKY基因***发育树分析对比图。
图2为GhWRKY51在棉花不同组织器官的特异性表达对比图。
图3为棉花GhWRKY51基因在SA处理下的表达分析示意图。
图4为棉花GhWRKY51基因在JA处理下的表达分析示意图。
图5为棉花GhWRKY51基因在ABA处理下的表达分析示意图。
图6为棉花GhWRKY51基因在GA3处理下的表达分析示意图。
图7为棉花GhWRKY51基因在干旱处理下的表达分析示意图。
图8为棉花GhWRKY51基因在盐处理下的表达分析示意图。
图9为重组克隆载体pBWRKY51的构建过程示意图。
图10为转基因烟草植株的PCR检测结果。
图11为转基因烟草植株的RT-PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(Sambrook J等人，1989)所述进行；有关试剂盒使用参照所购试剂盒的应用说明；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自NEB公司。
棉花材料为抗逆棉花品种晋棉19，由山西省农业科学院棉花研究所品种资源室提供。烟草品种为SR1，由中国科学院微生物所吴家和研究员提供，大肠杆菌DH5α、5’-Full RACE Kit、3’-Full RACE Kit以及SYBR Premix Ex Taq均购自TaKaRa公司，pGEM-T Easy Vector System购自Promega公司，Revert Aid H MinusFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司，Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，TRIzol试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
实施例1棉花GhWRKY51转录因子cDNA序列的克隆和表达分析
1.总RNA的提取和棉花GhWRKY51基因EST目的片段的扩增
将棉花品种晋棉19种子用无菌水浸泡，置于25℃的光照培养箱中处理48h，光周期为12h光照12h黑暗，等种子露白后种于蛭石和营养土(1:1)混合的培养土中放置于温室中出苗，温度27℃，自然光照。在棉花生育期中分别摘取棉花幼苗的根、茎、叶和棉花盛花期的蕾、花和铃样品，使用TRIzol试剂盒提取棉花RNA。
参照棉花盐胁迫EST序列，设计特异性引物进行RT-PCR扩增，观察棉花叶片中是否有GhWRKY51基因的表达。PCR扩增结果表明该基因在叶片中有一定的表达水平，说明能够直接从叶片中克隆该基因。为了进一步确证所扩增的产物为该基因的相关片段，从琼脂糖凝胶上回收PCR产物连接到T载体上进行测序,结果表明得到的序列与所参照的的EST序列一致，将该序列在NCBI上进行Blast比对，与拟南芥的同源性很高，确认此序列为棉花GhWRKY51的基因序列。
2.棉花GhWRKY51基因克隆
(1)cDNA第一链的合成
用于表达分析的cDNA第一链合成使用Revert Aid H Minus First StrandcDNA Synthesis Kit进行。
基因克隆的cDNA第一链的合成分别参照TaKaRa 5’-Full RACE Kit、3’-FullRACE Kit User Manual进行。
(2)引物的设计与合成
根据棉花EST数据库中GhWRKY51基因的一段序列分别设计2条5’-RACE反义引物：GhWRKY51-R1、GhWRKY51-R2和2条3’-RACE正义引物GhWRKY51-F1、GhWRKY51-F2。引物设计结果如下：
GhWRKY51-F1：5’-GTTGGGACTGGGACATCGTATTGC-3’
GhWRKY51-F2：5’-CCCCAATCCAAGGAATTACTAT-3’
GhWRKY51-R1：5’-TGGGCTCTCATGATTATGAACACCT-3’
GhWRKY51-R2：5’-TCCTCTTCTTCACATTGCATCCTCC-3’
本实验所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
(3)RACE法克隆基因
按照TaKaRa 5’-Full RACE Kit、3’-Full RACE Kit User Manual进行目的片段5’和3’末端的扩增。
将5’-RACE和3’-RACE产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外灯下将目的片段切胶回收，连接到pGEM-T4载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑，菌落PCR检测后，将阳性克隆测序。测序由上海生工生物工程有限公司完成。
利用5’-RACE和3’-RACE技术，从棉花叶片总RNA中分别获得GhWRKY51基因cDNA的5’和3’端的序列。RACE技术扩增获得目的条带后切胶回收、产物连接到T载体上，挑选阳性克隆测序,结果显示5’-RACE产物长度为450bp，3’-RACE产物长度为250bp。将这两个片段进行拼接获得GhWRKY51基因全长为700bp，包含的开放阅读框546bp，编码181个氨基酸，分子量为44.8KDa，等电点pI＝5.21(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)。
3.GhWRKY51基因序列***进化树构建
在NCBI中选取不同植物的WRKY51的氨基酸序列，在数据库中选取不同类型的WRKY蛋白，利用MEGA4程序来构建有关WRKY蛋白的进化树。选取了不同植物且包括不同类的WRKY蛋白与棉花GhWRKY51进行***进化树的构建，由图1我们可以看出，GhWRKY51和其它植物的WRKY51蛋白具有较高的亲缘关系，属于I类WRKY，与可可(Theobroma cacao)WRKY51具有高度的亲缘关系。这个进化树也表明了WRKY在植物中不断进化和变异情况，说明WRKY在植物中执行着重要的生理和生化功能。
4.棉花GhWRKY51基因在不同组织及不同处理条件下的表达分析
(1)样品的采集和处理设置
盐处理试验：棉花品种晋棉19种子在温室中种植，选取长势一致的子叶期幼苗用来做不同处理。盐胁迫用300mmol/LNaCl浇灌棉花苗。用清水处理的棉苗作为对照，每个处理3次重复。在处理后0、2、4、8和12h时间点取植株叶片放到液氮中速冻然后保存在-80℃冰箱中待用。
干旱处理：上述类似的棉花苗，干旱胁迫停止浇水连续干旱胁迫12天，直至叶片出现萎蔫。正常浇水的植株作为对照。在处理后0、2、4、6、8、10和12天时间点取植株叶片放到液氮中速冻然后保存在-80℃益冰箱中待用。
激素处理：上述类似的棉花苗在温室中进行不同激素的处理，处理的方法按照报道进行。喷洒激素JA、SA、ABA、GA的浓度分别为100mmol/L、2mmol/L、50mmol/L、1μmol/L。处理后不同时间点取植株叶片放到液氮中速冻然后保存在-80℃冰箱中待用。
(2)Quantitative Real-time RT-PCR方法
利用Quantitative Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法，检测GhWRKY51在棉花根、茎、叶、花蕾、花、铃中的表达情况及其激素诱导和逆境诱导后的不同时段的表达情况GhWRKY51扩增的一对引物为GhWRKY51-F：5’-GTTGGGACTGGGACATCGTA-3’；GhWRKY51-R：5’-CTGTTTTTGACCGACTTTTTCC-3’。以棉花ubiquitin基因(登录号：AY189972)作为内标基因，扩增一对引物为Ubi-F：5’-AAGACCTACACCAAGCCCAAG-3’；Ubi-R：5’-ACACTCCGCATTAGGACACTC-3’。ubiquitin与目的基因同机分管扩增。
qRT-PCR所用的反应体系为25μl，其中模板是定量稀释后的0.5μl cDNA。扩增条件为：95℃，1min；95℃，5s；59℃，30s；72℃，30s；78℃，82℃，85℃各读板一次，设置40个循环，绘制溶解曲线。以ubiquitin基因为内参，生物学实验重复3次。运用比较Ct法求得GhWRKY51基因在根、茎、叶、花蕾、花、铃中的相对表达量，其中计算公式Y＝10△Ct/3×100％(△Ct是内标基因Ct和目的基因Ct的差值，即△Ct＝CtGhubi–CtGhWRKY51)；运用OpticonMonitor 2软件计算样品的Ct值，并采用2-△△Ct计算方法求得不同处理下样品的相对表达量。
(3)组织特异表达分析
棉花的根、茎、叶、蕾、花和幼铃等器官的总RNA被抽取，反转录成cDNA，利用该cDNA作为模板进行定量qRT-PCR分析，结果表明GhWRKY51基因在这些组织器官中均有表达(如图2所示)，说明这个基因是一个组成型表达基因，同时发现其在花里的表达量较高，其次分别为叶、茎、铃、根，在蕾中的表达量最低，暗示该基因的功能可能存在组织特异性。
(4)不同激素处理下GhWRKY51表达分析
利用SA、JA、ABA和GA3对棉花进行处理，提取相应处理的RNA并反转录成cDNA进行qPCR分析，结果表明GhWRKY51在SA、JA、ABA和GA3处理下均在一段时间内表现为上调表达(如图3、图4、图5以及图6所示)。在JA、ABA和GA3处理后GhWRKY51表达均表现为先剧烈上升然后开始回落，但SA处理后GhWRKY51基因表达的上调幅度不如其它三个激素信号分子。说明了该基因能够对这些激素都存在着应答，但是应答的模式不是完全一致。
(5)干旱和盐处理下GhWRKY51的表达分析
盆栽棉花被停止浇水12天后出现了萎蔫现象，我们采摘早晨萎蔫恢复的叶片和正常浇水的植株叶片进行qPCR分析，结果表明GhWRKY51基因被显著地诱导，其表达量是对照的3.3倍(如图7所示)。同样，用300mM NaCl处理棉花，在不同时间里取样进行qPCR分析，结果表明盐处理的棉花叶片中GhWRKY51基因表达显著提高，尤其在处理后8小时，转录水平最高，是对照水处理的3.5倍(如图8所示)。从上面结果可以看出GhWRKY51基因对干旱和盐逆境具有显著地响应，表明该基因可能在这些逆境适应上具有重要的功能。
实施例2、转GhWRKY51基因烟草植株的获得及功能分析
1、含有融合基因GhWRKY51的重组表达载体pPZP-GhWRKY51的构建
(1)二元表达载体pPZP111的结构：
二元表达载体为中国科学院微生物研究所吴家和研究员提供，含有由带双增强子的CaMV35S启动子(DE35S)、TMV-RNAcDNA的Ω片段、来自pBR322的BamH I-Sal I片段及Nos转录终止序列组成的外源基因表达框架。
(2)含有GhWRKY51基因的重组表达载体的构建
把上述GhWRKY51基因克隆到T载体上，在设计克隆基因引物时在5’端加上了BamH I酶切位点，在3’端加上了Sal I酶切位点，扩增该基因的CDS序列，然后连接到T载体上，该载体命名为pBWRKY51，用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切重组克隆载体pBWRKY51和二元表达载体pPZP111，用T4DNA连接酶将切下的GhWRKY51的CDS序列插到pPZP111的BamH I和Sal I位点之间构建成重组植物表达载体pPZP-WRKY51，其构建过程如图9所示(RB：右边界；NPT II：硫酸新霉素基因；DE-35SP：双增强子的CaMV35S启动子；Nos：终止子；LB：左边界)。
将重组表达载体pPZP-WRKY51转化大肠杆菌DH5α后，挑选阳性克隆，进行BamH I和Sal I酶切以及测序鉴定，结果表明pPZP-WRKY51在BamH I和SalI位点间的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID NO.1中自1位核苷酸至546位核苷酸，即基因GhWRKY51的CDS序列。
(3)重组表达载体转化根癌土壤杆菌
对已经构建正确的重组植物表达载体pPZP-WRKY51用电击法转化到根癌土壤杆菌LBA4404中，经卡那霉素筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和测序验证，结果表明重组植物表达载体pPZP-WRKY51已经转入根土壤杆菌。
2、转入GhWRKY51基因的烟草植株的获得及分子检测
(1)转入GhWRKY51基因的烟草植株的获得
按照(Horch RB.A simple and general method for transferring genes intoplants.Science,1985,227:1229～1231)所述的叶盘法，将无菌培养的烟草SR1(Nicotiana tabacum cv.SR1)叶片与含有pPZP-WRKY51载体的根癌土壤杆菌共培养，以将以上构建的重组植物表达载体pPZP-WRKY51中的T-DNA(包括nptII基因和抗逆基因GhWRKY51)转入到烟草染色体组中，获得了抗卡那霉素nptII基因和GhWRKY51基因的烟草植株。
(2)转入GhWRKY51基因烟草植株的PCR扩增检测验证
以转入GhWRKY51基因的烟草植株为材料，按(Paterson AH,Curt LB,Wendel JF.A rapid method for extrac-tion of cotton(Gossypium spp.)genomic DNAsuitable for RFLP and PCR analysis.Plant Mol Bil Rep,1993,11:112-117)所述方法提取其DNA。设计扩增GhWRKY51基因部分片段的PCR特异引物，其序列为：
P1：5′-5’-GTTGGGACTGGGACATCGTATTGC-3’
P2：5′-TGGGCTCTCATGATTATGAACACCT-3′，
由上海生工生物工程有限公司合成，这一对引物的扩增产物应为524bp左右的片段。
PCR扩增条件是：95℃预变性3min；94℃变性50sec，58℃退火50sec，72℃延伸50sec，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。同时以没有转入任何基因的野生型植株和克隆载体pBWRKY51作为正负对照。
用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，部分抗卡那霉素的再生植株的PCR结果如图10所示(泳道M为1kb DNA Marker；CK+为扩增克隆载体pBWRKY51的结果；CK-为非转基因烟草SR1的结果；1-14为转入GhWRKY51基因烟草的结果)。这些PCR结果表明基因已整合到所检测的烟草植株的染色体组中。
(3)转基因烟草中GhWRKY51转录表达分析
按照上面所述方法提取转基因烟草和对照烟草叶片中总RNA，并进行逆转录获得第一链cDNA。然后利用上面所述的方法进行PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果，部分PCR结果如图11所示(1为扩增克隆载体pPZP-WRKY51的结果；CK-为非转基因烟草SR1的结果；2-5为转入GhWRKY51基因烟草品系YS1、YS2、YS3、YS4的结果)。这些PCR结果表明GhWRKY51基因可能已整合到所检测的烟草植株的染色体组中。
4、转基因烟草的抗盐实验
(1)转基因烟草植株与对照植株幼苗在盐处理条件下的比较
选择T1转基因烟草5个不同转化株系YS1、YS2、、YS3、YS4、和YS5对照非转基因植株种子，经消毒处理后播种于含有100g·L-1Kan的1/2MS培养基上进行阳性筛选，生长一周后将阳性转基因幼苗转移到含200mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基上继续生长12d，观察转基因烟草与野生型烟草的生长情况。以未转化烟草WT为对照，每个株系处理100粒种子，挑取60株阳性幼苗，进行盐胁迫下幼苗成活率检测。每个处理设置3个重复。统计烟草发芽率、植株的根长、植株的干重和鲜重。
表2转基因烟草植株与对照植株幼苗在盐(200mmol·L-1)处理条件下的比较分析
从表2中可以看到，在200mmol·L-1盐处理条件下，转GhWRKY51基因的烟草植株与对照相比，转GhWRKY51基因的烟草植株与对照相比，根长增加了3.0倍，发芽率增加了20％、达到90％以上，植株干重和鲜重增加了2倍以上。这些结果说明在盐处理条件下特异表达GhWRKY51基因具有显著促进烟草发芽和生长的作用，超量表达GhWRKY51基因具有增强烟草耐盐的功能。
(2)转基因烟草对盐处理的抗性
将转入GhWRKY51的烟草植株、未转入任何基因的野生型烟草植株种子灭菌后，用无菌水浸泡，种植在平板上，置于25℃的光照培养箱中，光周期为12h光照/12h黑暗，等苗长到1cm高度时移栽于蛭石和营养土(1:1)混合的培养土中，盆栽苗放置于温室中，温度25℃，自然光照。苗生长3周左右，进行盐处理实验。刚开始用100mM的NaCl处理7天，再用150mM的NaCl处理7天，最后再用200mmol/LNaCl处理2周，然后用自来水洗盐。
结果如表3所示：步骤一获得的转GhWRKY51基因的烟草植株除了YS7外，其余6个(YSI至YS6)株系均表现出高的抗盐性能，在不断增加的盐浓度情况下，直到28天绝大部分植株仍然能够恢复正常生长，而非转基因烟草植株(CKI)和空载体对照(CK2)在盐处理28天后即全部死亡，由此证明，获得的转GhWRKY51基因的烟草植株(除YS7外)具有较高的抗盐能力，具有较高的抗盐能力，这对抗盐育种的研究具有很高的应用价值。
表3转基因烟草的抗盐对比结果
5、转入的融合基因GhWRKY51在转基因植株中的遗传稳定性检测
为了解目的基因的遗传稳定性，对三个植株的自交一代植株的PCR基因扩增和卡那霉素抗性进行检测。
取转基因烟草植株自交一代的种子(T1)，按照无菌苗的操作方法，将灭菌后的种子转移到含有200mg/ml卡那霉素的MS平板培养基上，置光照培养箱内培养，待幼苗长出一对真叶后不抗卡那霉素的植株很快变为白色，而抗卡那霉素的小苗仍保持绿色，计各个株系的绿苗数和白苗数，统计卡那霉素抗性的分离比。同时对子代植株(T1)进行PCR扩增目的基因，方法如上所述，统计抗性在子一代的分离情况。实验设3次重复。
实验结果如表4所示。结果表明：由表达载体带到植物染色体组中的nptII基因(卡那霉素抗性基因)在转基因植物子代按单基因分离规律进行遗传的，从子代中选到转基因纯合系，而且与nptII紧密连锁的GhWRKY51基因的目的片段扩增也显示出3:1的分离特点，初步表明合成的融合基因GhWRKY51在转基因植株后代也可以稳定遗传。
表4转GhWRKY51基因烟草植株后代目的基因和抗卡那霉素的分离情况
注：表中KanR、KanS分别表示抗卡那霉素和卡那霉素敏感反应。
<110>山西省农业科学院棉花研究所
<120>棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用
<160>2
<210>1
<211>546
<212>DNA
<213>棉花
<221>CDS
<222>（1）…（546）
<400>1
ATGAGCTTCT  GTCCTACTGA  CCACTCAAAC  CCTAACCCTA  ATTCTATCTT  50
CTTCCCTGAA  AATCCCGATC  CGATGGCCGA  CTTCGAGCTC  TCTGATTACC  100
TTATGCTTGA  TGCCGGTGTC  TTCGAGGATG  ATACATCGGA  GAAGGGCATG  150
GGTGTCGCGA  ATGAAAGTGC  AACACCAAAA  CATAGTAACA  TAAGATGCAA  200
AAGTGGAGAG  AAGAAAAGCA  AGTTGGGACT  GGGACATCGT  ATTGCATTTA  250
GAATGAAATC  AGAGATAGAA  GCCATGGATG  ATGGATATAA  ATGGAGGAAA  300
TATGGGAAAA  AGTCGGTCAA  AAACAGCCCC  AATCCAAGGA  ATTACTATAA  350
ATGTGTAAGT  GGAGGATGCA  ATGTGAAGAA  GAGGATAGAA  AGGGACAGAG  400
ATGATAAAAG  TTATGTGATA  ACTACCTATG  AAGGTGTTCA  TAATCATGAG  450
AGCCCATACA  CGTCTTACTG  TAATCAAATG  CCTCTTATGG  CTCCTAATGC  500
TTGCATTTCC  CAACCTTCTC  CTTTCTCCTC  TTCTTTTTCT  ACATGA      546
<210>2
<211>181
<212>PRT
<213>棉花
<222>（1）…（181）
<400>2
MET Ser Phe Cys Pro Thr Asp His Ser Asn Pro Asn Pro Asn Ser Ile Phe Phe Pro Glu 20
Asn Pro Asp Pro MET Ala Asp Phe Glu Leu Ser Asp Tyr Leu MET Leu Asp Ala Gly Val 40
Phe Glu Asp Asp Thr Ser Glu Lys Gly MET Gly Val Ala Asn Glu Ser Ala Thr Pro Lys 60
His Ser Asn Ile Arg Cys Lys Ser Gly Glu Lys Lys Ser Lys Leu Gly Leu Gly His Arg 80
Ile Ala Phe Arg MET Lys Ser Glu Ile Glu Ala MET Asp Asp Gly Tyr Lys Trp Arg Lys 100
Tyr Gly Lys Lys Ser Val Lys Asn Ser Pro Asn Pro Arg Asn Tyr Tyr Lys Cys Val Ser 120
Gly Gly Cys Asn Val Lys Lys Arg Ile Glu Arg Asp Arg Asp Asp Lys Ser Tyr Val Ile 140
Thr Thr Tyr Glu Gly Val His Asn His Glu Ser Pro Tyr Thr Ser Tyr Cys Asn Gln MET 160
Pro Leu MET Ala Pro Asn Ala Cys Ile Ser Gln Pro Ser Pro Phe Ser Ser Ser Phe Ser 180
Thr*                                                                                                   181

Claims (9)

1.棉花GhWRKY51转录因子，其特征在于，是如（a）或（b）所示的蛋白：
（a）SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
（b）将SEQ ID NO.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和***而衍生得到的仍具有GhWRKY51转录因子功能或活性的蛋白变体。
2.棉花GhWRKY51转录因子编码基因，其特征在于，是如SEQ ID NO.1所示的碱基序列；或在SEQ ID NO.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和***的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhWRKY51转录因子的功能或活性。
3.权利要求2所述编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在pPZP111的多克隆位点***权利要求2所述的编码基因得到的重组载体。
6.一种培育耐逆境胁迫的转基因植物的方法，其特征在于，将权利要求5得到的重组载体导入到植物中，培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。
7.根据权利要求6所述的培育耐逆境胁迫的转基因植物的方法，其特征在于，所述的植物为双子叶植物和单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的培育耐逆境胁迫的转基因植物的方法，其特征在于，所述的植物为烟草、棉花和玉米。
9.根据权利要求6所述的培育耐逆境胁迫的转基因植物的方法，其特征在于，所述逆境胁迫包括高盐或干旱。
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