CN108368515A - 耐旱玉米 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备耐旱的遗传改变的植物的方法，以及可通过所述方法获得的植物及其用途。

Description

耐旱玉米
发明领域
本发明涉及耐旱的植物以及相关方法和用途。
引言
玉米(Zea mays)生产通常被缺水损害，其在全球范围内因气候变暖的趋势和异常降雨形式而加重[1-2]。在过去二十年期间，尽管已经对玉米产量的整体增加取得了进展，植物对干旱胁迫的敏感度增加[1]。提出了提高玉米克服胁迫瓶颈的能力而不是初级生产力将会是生产较高产量的玉米的主要驱动力[3]。因此，增强的耐旱性已经成为在当前玉米遗传改善努力中的优先性状。然而，已经证实构成耐旱性的遗传组分的鉴别是具有挑战性的。迄今为止，尽管有其作图(mapping)信息的报告，尚未克隆导致玉米耐旱性的数量性状基因座(QTL)[4-7]。
在双亲分离群体、通常为重组自交系(RIL)内使用分子标记物的基于某些性状的遗传连锁的常规QTL作图已经成功用于鉴别构成针对颖结构[8]、分支结构[9]、开花时间[10]、光周期敏感度[11]、对丝黑穗病(head smut)的抗性[12]等的QTL的基因。然而，生成就性状而言表型差异明显的双亲的RIL通常花费较长的时间。此外，作图分辨率主要取决于在这些RIL之间的遗传重组。为了实现针对基因克隆的准确作图，通常首先需要大量的RIL或多个连续的自交或回交步骤，从而将含有候选基因的区域缩小。因此，已经进行了大量的QTL作图研究，但是仅克隆了它们中的有限数量[13]。这种方法的另一个限制是，在作图过程期间通常能够评价仅两个亲本等位基因中的一种或多种功能性变异。
近来，已经使用基于遗传连锁不平衡(LD)并且利用天然变异和重组体的全基因组关联研究(GWAS)作为用于仔细研究植物中复杂性状基因座的新型策略[14-17]。因为可以在一组大量的基因型中采用历史的和革命性的重组事件，LD作图可以达到高分辨率并且研究单个基因座的多个等位基因[14]。随着高通量DNA变异发现技术的发展统计学分析的改进，GWAS已经在多个植物物种中的遗传研究中获得了认可。尤其是，归因于玉米基因组中的快速LD衰减，GWAS促进了多种复杂性状的遗传解剖，包括粒β-胡罗卜素[18]和油含量[19]、和玉米中的开花时间[20]。尽管已经尝试了玉米耐旱性的关联研究[21-24]，所提出的候选基因或其导致的变异仍然待确认和分辨。
在玉米基因组中，基因组含量的～85％由转座元件(TE)构成，并且在TE的广阔区域中嵌入通用序列[25]。为了维持基因组的稳定性，归因于DNA和染色质修饰，转座元件(TE)通常是沉默的和非活性的[26]。然而，已经显示TE在植物进化和环境适应中起重要作用。例如，在teosinte branched1(tb1)的上游～60-kb***的Hopscotch元件增加了玉米的顶端优势[9]并且发现位于ZmCCT的上游～2-kb的CACTA样转座元件有助于玉米光周期敏感度[20]。微型反向重复转座元件(MITE)是一类非自主DNA转座子，其通常短于600bp并且在植物基因组中广泛分布[27]。证实了在ZmRAP 2.7的上游～70-kb的MITE***与玉米开花时间相关[10]。TE可以通过位于其自身序列中的顺式作用元件或者通过改变相邻基因的DNA或染色质甲基化状态来影响附近的基因表达[26、28、29]。在水稻(Oryza sativa)中，最近已经发现MITE能够依赖Dicer样3a(OsDCL3a)活性产生24-nt siRNA，并且通过RNA介导的DNA甲基化(RdDM)干扰附近的基因表达[30]。在植物中，RdDM通路由以下主要步骤组成：(i)RNA聚合酶IV从重复异染色质区域中转录单链RNA，(ii)其物理结合的RNA依赖性RNA聚合酶2(RDR2)合成双链RNA(dsRNA)，(iii)dsRNA被Dicer样3(DCL3)裂解为24-nt的siRNA，并且(iv)ARGONAUTE 4(AGO4)随后将siRNA加载至其互补DNA区域。最后，所形成的复合体募集DNA甲基转移酶(DRM2)以催化在CG、CHG和CHH成分(H＝A、G或C)中胞嘧啶上的甲基化，尤其是在CHH序列环境中，其为RdDM31-33的标志。主要由组蛋白甲基转移酶SUVH4(也被称为KYP)催化的染色质组蛋白3赖氨酸9二甲基化(H3K9me2)的富集与在相邻区域中的DNA甲基化偶联[30、34]。
发明人已经通过GWAS显示，在NAC基因(ZmNAC111)的启动子区域中的82-bp(MITE)***与玉米耐旱性相关。MITE***与在玉米中较低的ZmNac111表达相关，并且当在拟南芥中异源表达时，其通过RdDM通路抑制ZmNac111表达。转基因研究证实，ZmNac111的增强的表达在转基因拟南芥和玉米幼苗二者中通过提高植物水分利用效率(WUE)和在胁迫下增强胁迫应答基因的表达而赋予耐旱性。在热带/亚热带和温带基因型的类蜀黍(teosinte)之间的ZmNac111基因座上的MITE***频率和核苷酸多样性的比较表明，MITE***似乎在玉米由类蜀黍驯化之后发生并且在温带种质中分布。这种MITE***的鉴别因此提供了对玉米耐旱性的遗传天然变异的认识。
发明概述
发明人已经确认并且表征了在玉米中的ZmNac111启动子基因，并且已经意外地发现在其中微型反向重复转座元件(MITE)***至启动子中的植株中，其明显影响耐旱性。发明人也已经生成了过度表达ZmNac111遗传改变的、尤其是转基因的玉米和拟南芥(Arabidopsis)，其显示出与不过度表达ZmNac111的对照植物相比对干旱胁迫增强的耐受性。这些植物也未显示出任何生长不利后果。ZmNac111的鉴别及其在赋予耐旱性方面的作用具有明显价值，因为这种可以生成在农业中重要的耐旱植物。
由此本发明的目标是提供显示出耐旱性的遗传改变的植物以及相关方法和用途。在一个实施方案中，本发明的目标是提供显示出耐旱性的转基因植物以及相关方法和用途。
在第一方面中，本发明涉及遗传改变的植物或其部分，所述遗传改变的植物或其部分表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物或其部分，所述转基因植物或其部分表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。本发明还涉及产品，所述产品来源于如以上所限定的植物或来源于其部分。
在另一个方面中，本发明涉及载体，所述载体包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体。
在另一个方面中，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的载体。
在另一个方面中，本发明涉及如在SEQ ID NO.1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体或如上所述的载体在赋予耐旱性中的用途。
在另一个方面中，本发明涉及如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体或如上所述的载体在干旱胁迫条件下增加植物的产量/生长中的用途。
在另一个方面中，本发明涉及用于增加植物的耐旱性的方法，所述方法包括在所述植物中引入并且表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。
在另一个方面中，本发明涉及用于在干旱或缺水条件下增加植物的产量的方法，所述方法包括在所述植物中引入并且表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。
在另外的方面中，本发明涉及用于制备耐旱的突变体植物的方法，所述方法包括使用靶向的基因组修饰将突变引入至内源性ZmNAC111或内源性ZmNAC111启动子或其功能同源物或变体的核酸序列中。
在最终的方面中，本发明涉及遗传改变的植物，其中所述植物在内源性NAC111基因或NAC111启动子基因中携带突变。
在以下非限制性的附图中进一步描述了本发明。
附图简述
图1示出了与玉米耐旱性相关的ZmNac111启动子中的82-bp MITE***。(a)在ZmNac111中的遗传变异与在玉米中的耐旱性的关联分析以及DNA多态性的成对LD的形式。提供了ZmNAC111的2.3-kb基因组区域的示意图，其包括5’-、3’-UTR、三个外显子和两个内含子。将起始密码子(ATG)的位置标记为“+1”。编码NAC结构域的区域以红色指出。启动子中的最明显的InDel(InDel-572)和在编码区中的两个非同义变异通过实线与它们在基因图中的位置连接。在编码的蛋白中，SNP1532产生Pro到Gln的改变，并且SNP1535将Gln改变为Arg。(b)在ZmNac111启动子中***的82-bp MITE的DNA序列和结构。靶位点重复(TSD)和环由红色框指出。蓝色箭头指出了两个末端反向重复序列。在底部示出了MITE的预测的发夹结构。与MITE比对的在谷物小RNA数据库(Cereal Small RNA Database)中找到的24-ntsiRNA序列以红色突出显示。MITE存在于在许多对干旱敏感的基因型如B73和Mo17中的ZmNac111基因的启动子中，而其不存在于耐旱基因型如CIMBL55、92、70和CML118中。
图2示出了ZmNAC111的表达水平。与植物存活率相关的在水分充足、中度和严重干旱条件下的ZmNac111的相对表达水平，以及MITE(InDel-572)***的存在或不存在。(a)植物存活率与ZmNAC111的相对表达水平的相关性。通过相对叶片水含量(RLWC)从98％(水分充足)到70％(中度干旱)以及到58％(严重干旱)的降低来估算干旱胁迫。红色和绿色的点分别表示在ZmNac111启动子中具有或不具有MITE***(MITE+和MITE-)的基因型。使用t检验确定显著性。(b)在MITE-和MITE+基因型中与RLWC相关的ZmNac111表达的比较。应用单向方差分析(ANOVA)以确定ZmNac111表达的统计学差异。
图3示出了ZmNAC111的耐旱和对干旱敏感的等位基因的DNA和H3K9me2甲基化状态。(a)通过用McrBC(甲基化敏感的核酸内切酶)处理并且之后在ZmNAC111的基因组序列的八个区域(R1-R8)中进行qPCR(McrBC-qPCR)分析来确定DNA甲基化状态。基因组DNA从在水分充足(WW)和中度干旱(干燥，RLWC 1/4 70％)条件下生长的B73和CIMBL55基因型中提取。(b)通过BSP1区域的亚硫酸氢盐测序显示在CG、CHG和CHH位点(分别为灰色、绿色和蓝色线)中的胞嘧啶残基的甲基化。分析(a)的DNA样品。MITE区域由双向箭头指出。(c)使用抗H3K9me2ChIP-qPCR测定在ZmNAC111-B73和ZmNAC111-CIMBL55的基因组区域的八个不同区域(R1-R8)检测染色质状态。平行测试玉米Ubi2和Actin1的H3K9me2状态作为阴性对照。使用抗H3作为在ChIP-qPCR测定中的内部参考。(d)在ZmNAC111的基因组区域中的R1-R8的位置。示出了50-和30-UTR区域(浅灰色框)、外显子(灰色框)和82-bp MITE***(红色框)。黑色线指出了McrBC-qPCR、ChIP-qPCR和亚硫酸氢盐测序(BSP1)分析的位置。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图4示出了在异源表达时ZmNac111表达被MITE***抑制取决于RNA介导的DNA甲基化和组蛋白甲基化。(a)用于转化拟南芥的质粒构建体(35S:gZmNAC111-B73和35S:gZmNAC111-CIMBL55)的图。指出了MITE***(红色框)、McrBC-qPCR、ChIP-qPCR的区域(R1-R8)和亚硫酸氢盐测序(BSP1)分析。(b)左图：在35S:gZmNAC111-B73和35S:gZmNAC111-CIMBL55的独立转基因品系中的ZmNac111表达的比较。右图：在转基因拟南芥品系中的ZmNac111基因表达的统计学差异。(c)通过McrBC-qPCR测定确定的35S:gZmNAC111-B73和35S:gZmNAC111-CIMBL55的基因组序列的八个区域(R1-R8)中的DNA甲基化状态。(d)利用BSP1区域的亚硫酸氢盐测序测定的在CG、CHG和CHH位点中的胞嘧啶残基的甲基化状态。(e)使用抗H3K9me2ChIP-qPCR测定的在八个区域(R1-R8)检测的染色质状态。平行评价18S和Actin8拟南芥基因的H3K9me2状态并且将其用作阴性对照。使用抗H3作为用于ChIP-qPCR的内部参考。(f)在野生型和RdDM突变体中的35S:gZmNAC111-B73的转录本水平以及在野生型中的35S:gZmNAC111-CIMBL55转录本水平的qRT-PCR分析。(g)在指定遗传背景下使用R1区域的McrBC-qPCR测定确定的DNA甲基化状态。(h)在R1(左栏)和R2(右栏)区域使用抗H3K9me2ChIP-qPCR测定来检测的染色质状态。在(f)和(g)中的“x dcl2-1；dcl4-2”；“xsuvh4-3”；“x rdr2-2”；“x ago4-5”；和“x drm1-2；drm2-2”指出了在杂交之后的35S:gZmNAC111-B73-2(左栏)和-23(右栏)转基因植物的纯合遗传背景。绿色栏指出，ZmNac111表达(f)、DNA甲基化(g)和H3K9me2(h)与在野生型背景下的35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因植物中的水平相当，而红色栏指出，它们与在35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因植物中的那些明显不同。(i)在不同的RdDM缺陷型突变体背景下利用35S:gZmNAC111-B73转基因植物的BSP1区域的亚硫酸氢盐测序测定的胞嘧啶残基的甲基化。MITE区域由双向箭头指出。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图5示出了ZmUbi:ZmNAC111转基因玉米的耐旱性。(a)T1代转基因和同胞转化阴性(WT)植物的生长表型。示出了四个代表性的独立转基因阳性品系(ZmNAC111-OE1、OE3、OE4和OE7)和WT。(b)在WT以及三个独立ZmUbi:ZmNAC111转基因玉米品系中的ZmNac111的转录本水平。(c)与WT相比的ZmUbi:ZmNAC111转基因玉米的T2幼苗的耐旱性。在水分充足条件下以及在干旱处理然后重新浇水7天的时间段之后拍摄照片。比较WT和转基因ZmUbi:ZmNAC111-OE1、OE3和OE7植物的存活率。(d)在干旱处理并且恢复之后的存活率的统计学分析。根据四个独立的实验计算存活的平均百分比和标准误差。(e-h)在干旱胁迫过程期间ZmUbi:ZmNAC111转基因和WT植物的光合作用性能的比较。(e)光合速率；(f)气孔导度；(g)蒸腾速率；和(h)水分利用效率。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图6示出了转录组分析和MITE***的频率。ZmUbi:ZmNAC111转基因玉米的转录组分析，以及MITE***频率的比较和在类蜀黍(teosinte)、TST和温带玉米自交系中的ZmNac111的核苷酸多样性。(a)使用P<0.001的显著性临界值(significance cutoff)和>2的倍数变化(FC)的相对于WT植物的在ZmUbi:ZmNAC111-OE1和OE3植物中的上调或下调基因的维恩(Venn)图。(b)相对于WT植物的在转基因品系中的差异表达的基因的层次聚类(hierarchical clustering)。所指出的尺度是归一化的基因表达水平的log2值。(c)基于上调或下调基因在转基因品系中富集的生物途径的基因本体(ontology)。使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。(d)涉及在正常和干旱条件下在转基因植物中的植物干旱应答和耐受的基因的增加的表达的qRT-PCR验证。误差条是s.d.。(e)在类蜀黍、TST和温带(包括非硬茎的(NSS)、硬茎的(SS)和混合的)51个玉米自交系中的ZmNac111启动子中的MITE***的频率。(f)在类蜀黍以及玉米的MITE(玉米)和MITE(玉米)自交系之间的ZmNac111基因座的核苷酸多样性。在72个MITE和190个MITE-玉米自交系和42个类蜀黍项目之间比较跨ZmNac111基因座的核苷酸多样性。“P”表示ZmNac111启动子区域。使用100-bp滑动窗口和25-bp步幅计算类蜀黍(itT，灰色)、玉米(红色)和(Maize)(it_，绿色)的玉米自交系的核苷酸多样性(it)。示出了不同区域的Tajima D值。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图7示出了全基因组关联研究分析，其显示位于GRMZM2G127379中的SNP与在玉米中的植物耐旱性明显相关。GRMZM2G127379，ZmNAC111以红色指出。显示了染色体10的0.5Mb区域。预测的基因的物理位置基于MaizeGDB release 5b.60。在标准混合线性模型(MLM，MAF≥0.05)下，使用Tassel 3.1.0计算每种标记物与耐旱性的关联。
图8示出了在玉米、水稻、高粱和拟南芥中的胁迫相关的NAC蛋白的进化树。基于来自四个物种的55个全长的含NAC结构域的蛋白的序列比对来构建邻接(Neighbor-joining)进化树。基因编码和名称对于玉米来说以红色表示；对于水稻来说以蓝色表示；对于高粱来说以黑色表示；对于拟南芥来说以绿色表示。条表示所检查的序列的相对散度(relativedivergence)并且紧邻分支显示来自1,000个重复的自助值(bootstrap value)。
图9示出了六个玉米自交系的表型。(a)经历严重干旱胁迫的B73、Mo17、CML118、CIMBL70、CIMBL92和CIMBL55植物的存活率。(b)在水分充足、中度、和严重干旱条件下在B73、Mo17、CML118、CIMBL70、CIMBL92和CIMBL55中的ZmNac111的表达水平。评估干旱严重程度的水平作为RLWC从98％(水分充足)到70％(中度干旱)、到58％(严重干旱)的降低。误差条是s.d.。
图10示出了ZmNac111的耐旱等位基因与在三个玉米的F2:3群体中的耐旱性共分离。(a)经历严重干旱胁迫的CIMBL55、CIMBL91、CIMBL9、GEMS54和BY4944植物的存活率。(b)在水分充足、中度、和严重干旱条件下在CIMBL55、CIMBL91、CIMBL9、GEMS54和BY4944中的ZmNac111的表达水平。评估干旱严重程度的水平作为RLWC从98％(水分充足)到70％(中度干旱)、到58％(严重干旱)的降低。(c)基于在三个分离群体中的82-bp MITE***的F2个体基因分型的代表性照片。P1和P2表示相应群体的双亲。来自CIMBL9、GEMS54和BY4944的DNA条带的大小是206-bp；并且来自CIMBL55、CIMBL91的条带长度为124-bp。(d)针对MITE***分离的F2个体植物的数量：纯合MITE-/-(耐受等位基因)、纯合MITE+/+(敏感等位基因)和杂合MITE-/+。(e)在三个F2:3分离群体中ZmNac111耐受等位基因对耐旱性的影响。将携带ZmNac111的纯合耐受或敏感等位基因的F3品系的存活率与在三个群体中进行比较。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图11示出了由具有两个非同义变异的基因型编码的不同的ZmNac111蛋白的反式激活活性。(a)不同的玉米自交系的名称和它们在编码区中的两个明显非同义位点的基因型。(b)由CIMBL19、123、22、91、55、B73、Mo17、D863F、BY4944、和Shen5003自交系克隆的、用携带ZmNac111基因的载体(pGBKT7)转化的酵母菌株AH109。将转化的酵母细胞的培养物稀释并且放置在-色氨酸(-T)、合成缺陷型(synthetic dropout,SD)培养基(SD/-T)、-色氨酸-组氨酸(SD/-T-H)培养基、或-色氨酸-组氨酸-腺嘌呤(SD/-T-H-A)培养基的琼脂培养板上。对在相应培养基上的3日龄的培养物拍摄照片。
图12示出了与在ZmNAC111-B73等位基因中的82-bp MITE***比对的siRNA。(a)ZmNAC111-B73等位基因的结构图。外显子是在黑色框中并且MITE***是在红色框中。(b)ZmNAC111-B73等位基因的siRNA概况。轨迹指示从谷物小RNA数据库中得到的比对的、独特siRNA的位置。作图的小RNA的长度由不同颜色表示。
图13示出了35S:gZmNAC111-B73和35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因拟南芥的耐旱性。(a)35S:gZmNAC111-B73和35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因拟南芥的耐旱性。在干旱处理然后进行六天时间段的重新浇水之前和之后拍摄照片。示出了载体转化的拟南芥(VC)以及35S:gZmNAC111-B73-2、-23和35S:gZmNAC111-CIMBL55-5、-12转基因植物。(b)在四个独立品系中的ZmNac111转录本水平的qRT-PCR分析。(c)在干旱胁迫处理之后的存活率的统计学分析。基于从三个独立实验得到的数据计算平均存活率和标准误差。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图14示出了在RdDM突变体中的35S:gZmNAC111-CIMBL55的DNA甲基化和组蛋白H3K9me2。(a)在野生型中的35S:gZmNAC111-B73和在野生型和RdDM突变体背景中的35S:gZmNAC111-CIMBL55转录本水平的qRT-PCR分析。(b)R1区域的DNA甲基化状态通过在指定遗传背景下的McrBC-qPCR测定来确定。在(a)和(b)中的“×suvh4-3”；“×rdr2-2”；和“×ago4-5”指出了在杂交之后的35S:gZmNAC111-CIMBL5-5(左栏)和-12(右栏)转基因植物的纯合遗传背景。(c)在R1(左栏)和R2(右栏)区域通过抗H3K9me2 ChIP-qPCR测定来检测的染色质状态。在每个指定的遗传背景下使用两个独立的F3纯合品系进行ChIP测定。绿色栏指出，ZmNac111表达(a)、DNA甲基化(b)和H3K9me2(c)与在野生型背景下的35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因植物中的水平相当，而红色栏指出，它们与在35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因植物中的那些明显不同。(d)在不同的RdDM突变体背景下利用35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因植物的BSP1区域的亚硫酸氢盐测序测定的胞嘧啶残基的甲基化。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图15示出了35S:ZmNAC111转基因拟南芥的表型。(a)过度表达ZmNAC111的转基因拟南芥植物的耐旱性。在干旱处理然后进行六天时间段的重新浇水之前和之后拍摄照片。示出了载体转化的拟南芥(VC)和ZmNAC111-OE6、OE7和OE8转基因植物。(b)在三个独立品系中的ZmNac111转录本水平的qRT-PCR分析。(c)在干旱胁迫处理之后的存活率的统计学分析。基于从三个独立实验得到的数据计算平均存活率和标准误差。(d)外源性ABA对种子萌发的影响。将VC和ZmNAC111-OE6、OE7和OE8转基因植物的种子放置在补充有0.5μM和1μMABA的半强度MS平板上并且根据根的外观对萌发进行评分。在将种子放置在MS平板上7天之后得到植物图像。(e)在VC和ZmNAC111-OE6、OE7和OE8转基因植物中的ABA诱导的气孔闭合。使用表皮剥落测量响应于在0.1、1.0、和10μM的ABA的气孔开度(stomatal aperture)的尺寸。(f)(d)的统计学分析基于从三个独立实验(在每个实验中使用100个种子)得到的数据。(g)(e)的统计学分析基于从三个重复得到的数据并且所给出的值表示平均值±s.d.(n＝45)。误差条是s.d.并且使用t检验确定显著性差异，*P<0.05；**P<0.01。
图16示出了在水分充足条件下ZmUbi:ZmNAC111转基因玉米的转录组分析。(a)在与WT植物相关的两种ZmUbi:ZmNAC111-OE1和ZmUbi:ZmNAC111-OE3转基因玉米(OE1和OE3)中的ZmNac111上调和下调基因的维恩图(P<0.001、FC>2.0)。(b)在OE1和OE3植物中的ZmNac111上调和下调基因的层次聚类。尺度表示归一化的基因表达水平的log2值。(c)在ZmNac111转基因植物中基于上调和下调基因的富集的GOBP(P<0.01，通过DAVID计算P值，表明富集的显著性)。
图17示出了在水分充足条件下在T2代中的ZmUbi:ZmNAC111转基因玉米和同胞转化阴性(WT)植物之间的表型比较。N，植物数量；PH，植物高度；EH，耳高度；NN，节数量；LN，叶数量；LEA，在耳以上的叶数量；TL，穗长；LW，顶部耳的叶宽；LL，顶部耳的叶长。数据显示为平均值±s.d.。
图18示出了在本文中使用的引物。引物的名称基于基因名称和实验目的。括号内的数字表示引物在相应基因内的位置。认为起始密码子(ATG)的位置是+1。
图19示出了ZmNAC11同源物的比对。
图20是在正常生长条件下的ZmNAC111转基因拟南芥的RNA-seq分析。
图21是在正常干旱处理下的ZmNAC111转基因拟南芥的RNA-seq分析。
详细描述
现在将进一步描述本发明。在以下途径中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确地相反指出，如此定义的每个方面均可以与任何其他一个方面或多个方面组合。具体地，指出作为优选的或有利的任何特点均可以与指出作为优选的或有利的任何其他一个特征或多个特征组合。除非另外指出，本发明的实施将会采用本领域技术内的植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术。这样的技术在文献中充分解释。
如在本文中所使用的，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，自然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链的或双链的。这样的核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列、和不编码mRNA或蛋白产物的非编码调控序列。这些术语还包括基因。术语“基因”或“基因序列”广义地用于指与生物功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括在基因组序列中的内含子和外显子，或可以仅包括在cDNA中的编码序列，和/或可以包括与调控序列组合的cDNA。因此，根据本发明的多个方面，可以使用基因组DNA、cDNA或编码DNA。在一个实施方案中，核酸是cDNA或编码DNA。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。
如在本文中所使用的，术语“遗传改变”包括，但不限于转基因植物和突变体植物。
对于本发明的目的来说，针对例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含所述核酸序列的载体，或者用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，“转基因”、“转基因”或”重组”意指通过重组方法产生的所有那些结构，其中
(a)编码可用于本发明的方法的蛋白质的核酸序列，或
(b)与根据本发明的核酸序列可操作地连接的一个或多个遗传控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不存在于其天然遗传环境中，或者已经通过重组方法修饰，对于该修饰来说可以采取例如一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒位或***的形式。天然遗传环境应理解为意指在原始植物中的天然基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境位于核酸序列的至少一侧，并且具有至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp的长度。当天然存在的表达盒——例如如以上所限定的核酸序列的天然启动子与编码可用于本发明的方法的多肽的相应核酸序列的天然存在的组合——被非天然的、合成(“人工”)方法如，例如诱变处理时，该表达盒成为转基因表达盒。例如，在US 5,565,350或WO 00/15815中描述了适合的方法，二者通过引用结合。
本发明的方法包括将多肽或多核苷酸引入至植物中。“引入”意在表示以序列获得向植物细胞内部的进入的方式向植物提供多核苷酸或多肽。本发明的方法不依赖于用于将序列引入至植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽获得向植物的至少一个细胞内部的进入即可。用于将多核苷酸或多肽引入至植物中的方法是在本领域中已知的，包括但不限于育种方法、稳定转化方法、瞬时转化方法、和病毒介导的方法。对于多核苷酸在植物基因组的特定位置处的靶向***来说，方法是在本领域中已知的。
因此如上理解用于本发明的目的的转基因植物意指，在本发明的方法中使用的核酸不位于它们在所述植物的基因组中的天然基因座，对于所述核酸来说可能同源或异源地表达。然而，如提到的，转基因还意指，在根据本发明的不同实施方案的核酸位于它们在植物的基因组中的天然位置时，已经将序列针对天然序列进行修饰，和/或已经将天然序列的调控序列进行修饰。转基因优选为理解为意指在基因组中的非天然基因座的根据本发明的核酸的表达，即进行核酸的同源或、优选异源表达。根据本发明，将转基因稳定地整合至植物中，并且植物优选为对转基因纯合的。因此，来源于所述植物的任何后代或可收获的材料对转基因也优选是纯合的。
本发明的多个方面包括重组DNA技术，并且在优选的实施方案中排除仅基于通过常规育种方法产生植物的实施方案。
对于本发明的目的来说，“突变体”植物是与自然存在的野生型(WT)植物相比已经遗传改变的植物。在一个实施方案中，突变体植物是与天然存在的野生型(WT)植物相比已经使用诱变方法如在本文中所述的诱变方法改变的植物。在一个实施方案中，诱变方法是靶向的基因组修饰或基因组编辑。在一个实施方案中，与野生型序列相比已经使用诱变方法改变了在小麦中的内源性ZmNac111启动子序列。这些突变可能会导致ZmNac111启动子或其功能同源物或变体的激活或者增强其活性。这样的植物具有改变的表型并且与野生型植物相比显示出对干旱的耐受性或增加的耐受性。因此，通过在小麦植物基因组中存在突变的内源性ZmNac111启动子基因而赋予耐受性。在优选的实施方案中，内源性ZmNac111启动子序列使用靶向的基因组修饰而被特异性地靶向，而不是由小麦中表达的转基因的存在赋予。在备选的实施方案中，提供突变体植物，所述突变体植物表达如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体。同样地，这样的植物具有改变的表型并且与野生型植物相比显示出对干旱的耐受性或增加的耐受性。此外，同样地，在一个实施方案中，这样的植物的表型不是由一个或多个转基因的存在赋予。
发明人已经确认，***至NAC基因(ZmNAC111)的启动子中的微型反向重复转座元件(MITE)明显地影响耐旱性并且此外在转基因玉米中的ZmNac111的过度表达增强耐旱性。
如在本文中所使用的对照植物是未根据本发明的方法修饰的植物。因此，对照植物尚未被基因修饰或改变以表达如在本文中所描述的核酸。在一个实施方案中，对照植物是野生型植物。在另一个实施方案中，对照植物是不携带根据在本文中所述的方法的转基因但是表达不同转基因的植物。在另一个实施方案中，对照植物是尚未经历靶向的基因组修饰或编辑的植物。对照植物通常属于与待评估的植物相同的植物物种，优选相同的生态型。
因此，在第一方面中，本发明涉及遗传改变的植物，所述遗传改变的植物表达包含ZmNac111核酸序列或其变体或同源物的核酸构建体。在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物，所述转基因植物表达包含ZmNac111核酸序列或其变体或同源物的核酸构建体。因此，遗传改变的、或在一个实施方案中转基因的植物在其基因组内包括包含ZmNac111核酸序列的核酸构建体。在其中植物是转基因植物的一个实施方案中，优选地，对于转基因的存在来说，所述植物是纯合的。
在一个实施方案中，ZmNac111核酸序列包含SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体，或者由其组成。SEQ ID NO:1表示基因组DNA。SEQ ID NO:1的残基157至364、534至872和968至1850是编码区(SEQ ID NO:2)。SEQ ID NO:1是自交玉米品系B73的ZmNac111的核苷酸序列。登录号是GRMZM2G127379。在另外的实施方案中，ZmNac111核酸序列包含SEQ IDNO:3或其功能同源物或变体，或者由其组成。SEQ ID NO:3是ZmNAC111的cDNA序列。
由SEQ ID NO:1、2、3或其功能同源物或变体编码的多肽包含SEQ ID NO:4或其功能同源物或变体，或者由其组成。因此，本发明的遗传改变的、或在一个实施方案中转基因的植物表达ZmNac111核酸序列并且产生包含SEQ ID NO:4或其功能同源物或变体或者由其组成的蛋白质。
根据本发明的多个方面，如在本文中所使用的术语“核酸序列的功能同源物或变体”，例如参照SEQ ID NO:1、2、3或4或其同源物，是指当在非遗传改变的或转基因植物中表达时保留完整非变体ZmNac111基因或ZmNac111蛋白序列的生物功能、例如赋予耐旱性的变体基因序列或基因序列的部分。功能变体还包括编码具有不影响所得蛋白的功能的序列改变(例如在非保守残基中)的多肽的目标基因的变体。还包括与如在本文中示出的野生型序列基本相同(即仅具有一些序列变化，例如在非保守残基中)并且具有生物活性的变体。
因此，如本领域技术人员将会理解的，应理解的是，包括方法和用途在内的本发明的多个方面不仅包括如在本文中所描述的ZmNac111核酸或ZmNac111蛋白序列，例如包含SEQ ID NO:1、2、3或由其组成的核酸序列、包含SEQ ID NO:4或由其组成的多肽，而且还包括不影响所得蛋白的生物活性和功能的ZmNac111基因或ZmNac111蛋白的功能同源物或变体。导致在给定位点产生不同氨基酸但是不影响被编码的多肽的功能特性的核酸序列的改变是在本领域内公知的。例如，用于作为疏水氨基酸的氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一种较不疏水的残基如甘氨酸、或更疏水的残基如缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸的密码子置换。类似地，导致一个带负电的残基置换另一个，如天冬氨酸置换谷氨酸，或一个带正电的残基置换另一个，如赖氨酸置换精氨酸的变化也可以是被预期的，以制备功能上等同的产品。所提出的修饰中的每一种完全在本领域中的常规技能内，确定被编码的产物的生物活性的保留也是如此。
通常，ZmNac111的变体与由SEQ ID NO:1、2、3或4表示的序列具有至少75％70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的整体序列同一性。
ZmNac111蛋白的生物活性变体可以与该蛋白的差异可以为少至1-15个氨基酸残基，少至1-10如6-10、少至5、少至4、3、2、或甚至1个氨基酸残基。在某些实施方案中，可以以多种方式改变ZmNac111蛋白，包括氨基酸置换、缺失、截短、和***。用于这样的操作的方法通常是在本领域中已知的。例如，可以通过在DNA中的突变来制备ZmNac111蛋白的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸改变的方法是在本领域内公知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods inEnzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编，(1983)Techniques inMolecular Biology(分子生物学中的技术)(MacMillan Publishing Company,纽约)以及在其中引用的参考文献。在本文中包括的蛋白质序列的缺失、***、和置换并非预期用于产生蛋白质特征的根本变化。然而，当在做出这样的修饰之前难以预测置换、缺失、或***的确切影响时，本领域技术人员将会理解的是，将会通过常规筛选测定来对影响进行评价。
如在本文中所使用的术语同源物也表示来自其他植物物种的NAC111直系同源物。ZmNac111多肽的同源物与由SEQ ID NO:4表示的氨基酸具有(按照递增的优选顺序)至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％的整体序列同一性。优选地，整体序列同一性大于70％或大于73％。优选地，整体序列同一性是至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，最优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％。在另一个实施方案中，NAC111核酸序列的同源物与由SEQ ID NO:1、2或3表示的核酸具有(按照递增的优选顺序)至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％的整体序列同一性。优选地，整体序列同一性大于70％或大于73％。优选地，整体序列同一性是至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，最优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％。整体序列同一性使用在本领域中已知的全局比对(globalalignment)算法确定，如在程序GAP(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的NeedlemanWunsch算法。同源物的变体也在本发明的范围内。
例如，在本文中提供的序列同一性/相似性值可以是指使用GAP版本10使用以下参数得到的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性使用50的GAP Weight和3的长度Weight以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性使用8的GAP Weight和2的长度Weight以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等同的程序。
如在本文中所使用的，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中“序列同一性”或“同一性”是指当通过指定的比较窗比对最大对应性时两个序列中相同的残基。当参照蛋白质使用序列同一性的百分比时，应意识到，不相同的残基位置通常因其中用氨基酸残基置换具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因此不改变分子的功能特性的保守性氨基酸置换而不同。当序列的保守性置换不同时，可以向上调节百分比序列同一性以针对置换的保守性质校正。因这样的保守性置换而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。
在本文中所述的植物、方法和用途的一个实施方案中，功能同源物是NAC10，例如OsNac10(参见SEQ ID NO:5和6)。
在本文中所述的植物、方法和用途的一个实施方案中，功能同源物如在SEQ ID No5或6、7或8、9或10、11或12、13或14、15或16或其变体中所示。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体(SEQ ID NO:4)编码的ZmNAC111氨基酸序列的特征在于存在保守基序。在功能性ZmNac111变体蛋白中，氨基酸序列的变化优选位于这些结构域以外。
在一个实施方案中，ZmNac111同源物包含NAC DNA结合结构域。NAC DNA结合结构域通常是大约160个氨基酸并且分为分类为A、B、C、D和E的五个亚结构域，并且在一个实施方案中具有以下共有序列：
亚结构域A：LPPGFRFHPTDEELICHYL(SEQ ID NO:17)
亚结构域B：IIAEVDLYKCEPWDLPEKCKI(SEQ ID NO:18)
亚结构域C：WYFFCPRDRKYPNGTRTNRATGSGYWKATGKDKEI(SEQ ID NO:19)
亚结构域D：VGMRKTLVFYMGRAPRGTKTNWVMHEFRL(SEQ ID NO:20)
亚结构域E：DEWVVCKVHHK(SEQ ID NO:21)
或其变体。变体是如在本文中定义的。
在一个实施方案中，NAC111同源物包含具有以下序列的NAC DNA结合结构域：
LPAGFRFHPTDEELMVHYLMRQAASMPCPVPIIAEVNIYQCNPWDLPAKALFGDKEWFFFSPRDRKYPNGARPNRAAGSGYWKATGTDKAILSSSTPTSHGGANIVVGVKKALVFYGGRPPKGTKTDWIMHEYRLSGAADDDCKGSTRRRVSSSSSSSMRLDDWVLCRIHKK(SEQ ID NO:22)
或其变体。在一个实施方案中，结构域与该结构域具有至少80％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％的序列同一性。
在另外的实施方案中，ZmNac111同源物包含如以上所限定的NAC DNA结合结构域(SEQ ID NO:22)和/或是功能同源物，意味着同源物保留ZmNac111基因或ZmNac111蛋白序列的生物功能，例如当在遗传改变的、或在一个实施方案中转基因的植物中表达时赋予耐旱性，和/或与由SEQ ID NO:4表示的氨基酸或与由SEQ ID NO:1、2或3表示的核酸具有(按照递增的优选顺序)至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％的整体序列同一性。
可以通过保守结构域的序列比较和鉴别来鉴别适合的同源物。在本领域中存在可以用于鉴别这样的序列的预测物。可以如在本文中所描述的鉴别同源物的功能并且技术人员因此将能够当在植物中表达时确认功能。因此，本领域技术人员将会意识到，通过将待突变的多肽序列与如在SEQ ID NO:4中给出的ZmNac111多肽序列进行比对，可以在来自其他植物的ZmNac111中做出以上参照SEQ ID NO:4列出的相似的氨基酸置换。
因此，本发明的和在本文中所述的核苷酸序列可以用于从其他生物、尤其是其他植物、例如作物植物中分离相应的序列。以这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法基于它们与在本文中所述的序列的序列同源性鉴别这样的序列。可以基于它们与全部序列或与其片段的序列同一性来分离序列。在杂交技术中，使用已知核苷酸序列的全部或一部分作为与存在于来自所选择的植物的一群克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即，基因组或cDNA文库)中的其他相应核苷酸序列选择性杂交的探针。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团或任何其他可检测标记物进行标记。用于制备用于杂交和用于构造cDNA和基因组文库的探针的方法通常是在本领域中已知的并且公开于Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:A Library Manual(分子克隆：图书馆手册)(第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),Plainview,纽约)。
这样的序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是探针将会与其靶序列杂交至与其他序列相比可检测的更高程度(例如，高于背景至少2倍)的预期条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中将会不同。通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，可以鉴别与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测较低的相似性程度(异源探测)。通常，探针长度少于约1000个核苷酸，优选长度少于500个核苷酸。
通常，严格条件将会是这样的，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)来说为至少约30℃并且对于长探针(例如，大于50个核苷酸)来说为至少约60℃。杂交的持续时间通常少于约24小时，通常约4至12小时。严格条件还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来获得。
ZmNac111肽的优选的同源物是来自作物植物例如谷物作物的ZmNac111同源物。在一个实施方案中，优选的同源物包括玉米、水稻、小麦、高粱、甘蔗、油菜(canola)、大豆、棉花、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、菜豆、蚕豆或其他豆科植物、莴苣、向日葵、苜蓿、甜菜、花椰菜或其他芸苔属蔬菜或杨树。优选的同源物和它们肽序列还在SEQ ID NO 5至16中示出。
此外，包括方法和用途的本发明的多个方面不仅包括如在本文中示出的ZmNac111核酸序列，而且还包括其片段。“片段”预期是核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及因此由其编码的蛋白的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性并且因此赋予耐旱性的蛋白片段。
在根据本发明的多个方面的一个实施方案中，核酸构建体包含调控序列或元件。根据本发明的多个方面，术语“调控元件”在本文中与“控制序列”和“启动子”可互换地使用，并且全部术语广义上是指能够实现与其连接的序列的表达的调控核酸序列。术语“调控元件”还包括可以在ZmNac111核酸序列的3’包含的终止子序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合，从而指导可操作地连接的核酸的转录。前述术语包括来源于经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或不具有CCAAT框序列的准确转录起始所需的TATA框)，以及通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在这种情况中，其可以包括-35框序列和/或-10框转录调控序列。
术语“调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中的表达的调控元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如来源于攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以来源于植物细胞，例如，来源于利用将在本发明的过程中表达并且在本文中所述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他“植物”调控信号，如“植物”终止子。位于可用于本发明的方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸的置换、***和/或缺失进行修饰，而不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外可以通过修饰启动子的序列来增加其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物的启动子。为了在植物中表达，如上所述，核酸分子必须可操作地连接至或包含适合的启动子，所述启动子在正确时间点并且以所需的空间表达模式表达基因。为了鉴别功能上等同的启动子，例如通过将启动子与报告基因可操作地连接并且测定该报告基因在植物的多种组织中的表达水平和模式，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。适合的公知的报告基因对技术人员来说是已知的并且包括例如β-葡糖醛酸苷酶或β-半乳糖苷酶。
在一个实施方案中，ZmNac111核酸可操作地连接至调控序列或元件。如在本文中所使用的术语“可操作地连接”是指启动子序列和目标基因之间的功能性连接，以使得启动子序列能够启动目标基因的转录。
在一个优选的实施方案中，可以使用驱动过度表达的启动子表达核酸序列。根据本发明的过度表达意指在比内源性对应物通过其内源性启动子驱动的表达高的水平下表达转基因。例如，可以使用强启动子如组成型启动子进行过度表达。“组成型启动子”是指在生长和发展的大多数但不必是所有阶段期间以及在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S或19S)、水稻肌动蛋白启动子、玉米泛素启动子、rubisco小亚基、玉米或苜蓿H3组蛋白、OCS、SAD1或2、GOS2或任何提供增强的表达的启动子。备选地，增强或增加的表达可以通过使用转录或翻译增强子或活化剂实现并且可以将增强子结合至基因中以进一步增加表达。此外，可以使用可诱导的表达***，其中通过由环境胁迫条件、尤其是干旱诱导的启动子驱动表达。启动子也可以是组织特异性的。在本领域中描述了以上列出的启动子的类型。其他适合的启动子和可诱导的***对技术人员来说也是已知的。
在一个实施方案中，启动子是组成型启动子或强启动子。在一个实施方案中，启动子是Zmubi1。在一个实施方案中，如在本文中定义的，启动子具有SEQ ID NO:23的序列或变体。
在另一个实施方案中，调控序列是CaMV35S启动子。
在一个实施方案中，启动子是从耐旱玉米自交系分离的ZmNac111启动子。这样的启动子在以下位置处不含有多态性：与对干旱敏感的品系相比相对于SEQ ID NO:2(在ATG位点中的A被指定为+1；这种是在SEQ ID NO:2中的第一个残基)的InDel-572。尤其是，这种启动子可以用于在干旱胁迫开始时表达ZmNac111。在一个实施方案中，ZmNac111启动子或其变体具有序列SEQ ID NO:24。
根据本发明的多个方面，也可以在核酸构建体中包含促进靶标核酸序列向表达载体中的克隆的额外核酸序列。这包括某些密码子的改变以引入促进克隆的特异性限制性位点。也可以在构建体中包含终止子序列。
在一个实施方案中，植物是玉米并且可以在玉米植物中通过重组方法表达包含ZmNac111的核酸构建体。在另一个实施方案中，在另一种物种的第二植物中通过重组方法表达外源性ZmNac111核酸。因此，包括遗传改变的、例如转基因的植物和本发明的方法在内的本发明的所有方面还扩展至表达包含ZmNac111核酸序列的核酸构建体的除玉米外的植物。
在一个实施方案中，植物是单子叶或双子叶植物。在一个实施方案中，植物是作物植物或生物燃料植物。
在本发明的多个方面的一个实施方案中，植物是双子叶植物。双子叶植物可以选自多个科，包括但不限于菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)(例如欧洲油菜(Brassica napus))、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)、Aesalpiniaceae、含羞草科(Mimosaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)或豆科(Fabaceae))、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，植物可以选自莴苣、向日葵、拟南芥、花椰菜、菠菜、西瓜、角瓜、卷心菜、番茄、马铃薯、山药、辣椒、烟草、棉花、黄秋葵、苹果、玫瑰、草莓、苜蓿、菜豆、大豆、蚕豆(field bean，fava bean)、豌豆、小扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄藤或柑橘属物种。在一个实施方案中，植物是油菜。
还包括生物燃料和生物能作物如油菜/canola、玉米、甘蔗、棕榈树、麻风树属、大豆、高粱、向日葵、棉籽、柳枝稷(Panicum virgatum,switchgrass)、亚麻籽、小麦、羽扇豆和柳树、杨树、杂交杨树、芒属或裸子植物如火炬松。还包括用于青贮饲料(玉米)、牧草或饲料(草、三叶草、红豆草(sanfoin)、苜蓿)、纤维(例如，棉花、亚麻)、建筑材料(例如，松树、橡树)、纸浆(例如，杨树)、用于化工的原料(例如，高芥酸油菜、亚麻籽)和用于设施目的的原料(例如，用于高尔夫球场的草坪草)、用于公共和私人花园的观赏植物(例如，例如金鱼草、矮牵牛、玫瑰、天竺葵、烟草(Nicotiana sp.))及用于家居的植物和切花(非洲紫罗兰(African violet)、秋海棠(Begonia)、菊花、天竺葵、彩叶吊兰(Coleus spider plant)、龙血树(Dracaena)、橡胶植物)的作物。
在本发明的多个方面的一个实施方案中，植物是双子叶植物。单子叶植物可以例如选自以下科：槟榔科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，植物可以是谷物作物，如小麦、水稻、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、粟、荠麦、草坪草、多花黑麦草(Italian rye grass)、甘蔗或羊茅属(Festuca)物种、或作物如洋葱、韭葱、山药或香蕉。
在本发明的多个方面的优选实施方案中，植物是作物植物。作物植物意指以商业规模生长以用于人或动物消费或使用的任何植物。
在本发明的多个方面的优选实施方案中，植物选自粮食植物、油籽植物、和豆科植物。
根据本发明的多个方面的最优选的植物是玉米、水稻、小麦、油菜籽、高粱、大豆、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、菜豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他芸薹属植物或杨树。
如在本文中所使用的术语“植物”包括完整的植物、植物的原种和子代以及植物部分，包括种子、果实、新枝、茎、叶、根(包括块茎)、花、和组织和器官，其中前述中的每一个包含目标基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区域、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次其中前述中的每一个包含目标基因/核酸。
如在本文中所使用的术语“玉米(maize)”是指Zea mays L.ssp.mays的植物，并且也被称为“玉米(corn)”。术语“玉米植物”包括：整体玉米植物、玉米种质、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、玉米植物可以由其再生的玉米植物细胞或玉米组织培养物、玉米植物愈伤组织、以及在玉米植物中完整的玉米植物细胞或玉米植物的一部分，如玉米种子、玉米棒、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。玉米可以是自交系，或玉米混合物如玉米单交混合物。
在本文中所述的本发明的多种方面明确地扩展至通过在本文中所述的方法制备、得到或可以得到的任何植物细胞或任何植物，并且扩展至所有植物部分和其繁殖体，除非另外指定。本发明进一步扩展以包括已经通过前述方法中的任何一种制备的初级转化或转染的细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一的要求是子代展现出与在根据本发明的方法中的亲代所产生的那些的相同的一种或多种基因型和/或表型特征。
本发明还扩展至如上所述的本发明的植物的可收获部分，如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。本发明此外涉及源自，优选直接源自这样的植物的可收获部分的产品，如干燥球粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及产品，所述产品包括包含本发明的植物或其部分的食品和食物补充剂。
根据本发明的植物显示出与对照植物相比对干旱或缺水增加的抗性或耐受性。
在一个实施方案中，所述胁迫中度或严重胁迫。根据本发明的植物还显示出与对照植物相比在中度胁迫下降低的生长/产量不利后果。
在一个实施方案中，本发明的方法因此涉及增加对中度(非致死)胁迫或严重胁迫的抗性或耐受性。在前一个实施方案中，根据本发明的遗传改变的、或在一个实施方案中转基因的植物显示出对胁迫增加的抗性或耐受性，并且因此与在暴露于胁迫时降低的野生型产量相比，植物产量不受或较少受胁迫的影响。换句话说，可以观察到在中度胁迫条件下的产量的提高。
例如，耐旱性主要在其中在长时间段的土壤干燥之后对植物存活评分的非常严苛的条件下进行评估。然而，在温带气候中，有限的水可利用性很少导致植物死亡，但是限制生物量和种子产量。作为对于生长来说非最佳的水可利用性的中度水胁迫可能在灌注事件之间的数天或数周的间歇间隔期间出现，并且可能限制叶生长、光截获、光合作用以及因此的产量潜力。由于水胁迫的叶生长抑制在早期定苗期间是特别不希望的。需要用于在中度胁迫条件下制备具有增加的产量的植物的方法。换句话说，尽管在制备耐胁迫植物方面的植物研究通常目标是鉴别在将会导致野生型植物死亡的严苛条件下显示出增加的耐胁迫性的植物，这些植物在中度胁迫条件下表现得不好并且通常显示出导致不需要的产量损失的生长降低。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，以下中度胁迫条件下提高了产量。根据本发明的多个方面的遗传改变的、如转基因的植物显示出与对照植物相比对这些类型胁迫增强的耐受性并且能够缓解任何产量/生长方面的损失。如在实施例中所示，耐受性因此可以作为产量的增加来测量。术语中度或轻度胁迫/胁迫条件可互换使用并且是指非严重胁迫。换句话说，不同于严重胁迫，中度胁迫不导致植物死亡。在非致死的中度胁迫条件下，野生型植物能够存活，但是显示出生长和种子产量的降低，并且长时间的中度胁迫可能会造成发育停滞。降低可以是至少5％-50％以上。对严重胁迫的耐受性作为存活百分比来测量，而中度胁迫不影响存活，但是影响生长速率。限定中度胁迫的精确条件在植物之间不同，并且也在气候带之间不同，但是最终这些中度条件不导致植物死亡。重要的是，发明人已经确认没有在本文中所述的遗传改变的植物中观察到生长不利后果。
一般来说，中度干旱胁迫由在-1至-2Mpa之间的水势限定。
在一个实施方案中，在95-100％的玉米相对叶片水含量(RLWC)是水分充足或有利的生长条件；在大约70-65％的RLWC是中度干旱胁迫；在大约58-55％的RLWC是严重干旱胁迫。
可以使用在本领域中已知的方法测量耐旱性，例如通过叶片水电势或通过确定膨压(turgor pressure)、莲座(rosette)半径、叶片中的水损失、生长或产量来评估与对照植物相比遗传改变的植物的存活。也可以通过在基础条件下评估整个植物中的气孔导度(Gst)和蒸腾作用来测量耐旱性。
根据本发明，遗传改变的植物，如在一个实施方案中转基因植物，如果存活率比在暴露于干旱之后和/或在暴露于干旱并且重新浇水之后的对照植物的存活率高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，则具有增强的耐旱性。还根据本发明，遗传改变的植物，如转基因植物，如果莲座半径比在暴露于干旱之后和/或在暴露于干旱并且重新浇水之后的对照植物的莲座半径大至少10、20、30、40、50％，则转基因植物具有增强的耐旱性。可以剥夺植物的水10-30天，例如20天，并且之后重新浇水。还根据本发明，遗传改变的植物，如转基因植物，如果气孔导度(Gst)和蒸腾作用比在对照植物中低，例如低至少10、20、30、40、50％，则转基因植物具有增强的耐旱性。
术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的。例如，与对照植物相比，产量增加了至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％或50％或更多。术语“产量”通常意指经济价值的可测量的产生，通常与指定的作物、面积、和时间段相关。个体植物部分基于它们的数量、大小和/或重量直接构成产量，或者实际产量是对于作物和一年来说每平方米的产量，其通过总产量(包括收获的和评估的产量二者)除以种植的平方米确定。植物的术语“产量”可以涉及营养器官生物量(根和/或新枝生物量)，涉及生殖器官，和/或该植物的繁殖体(如种子)。因此，根据本发明，产量包括下列各项中的一种或多种并且可以通过评估下列各项中的一种或多种来测量：每个植物的增加的种子产量、增加的种子饱满率、增加的饱满种子的数量、增加的收获指数、增加的种皮和/或荚的数量、增加的种子大小、增加的生长或增加的分支，例如具有更多分支的花序。优选地，产量包括增加的种皮/荚的数量和/或增加的分支。产量相对于对照植物增加。
在另一个方面中，本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体，或者由其组成。在另一个方面中，本发明涉及分离的氨基酸序列，所述分离的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4或其功能同源物或变体，或者由其组成。
在另一个方面中，本发明涉及载体，所述载体包含含有SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体的核酸构建体。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。用于在植物中表达核酸序列的表达载体是公知的。实例是pGXX。例如，可以在pGXX载体的SmaI和SalI限制性位点之间***如在本文中所描述的ZmNac111核酸序列。植物表达载体还包括双元农杆菌载体和植物微弹轰击载体，如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pSBII、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。
载体可以还包含引导核酸的表达的调控序列。这样的序列在本文中其他地方描述。在一个实例中，调控序列是引导核酸序列的过度表达的启动子。也可以包括标志基因(例如Gus)和抗性基因。
在另一个方面中，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含如在本文中所描述的载体。宿主细胞可以选自植物细胞或细菌细胞，例如农杆菌属(Agrobacterium)。本发明还涉及培养基或包含培养基和如上所述的分离的宿主细胞的试剂盒。
在另一个方面中，本发明涉及包含SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体或者由其组成的核酸构建体或在本文中所述的载体在为植物赋予耐旱性中的用途。
在另一个方面中，本发明涉及包含SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体或者由其组成的核酸构建体或在本文中所述的载体在干旱胁迫条件下增加植物的产量/生长中的用途。
在另一个方面中，本发明涉及用于赋予或增加植物的耐旱性的方法，所述方法包括在所述植物中引入并且表达包含SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体或者由其组成的核酸构建体。在另一个方面中，本发明涉及用于例如在中度干旱胁迫下增加植物的产量的方法，所述方法包括在所述植物中引入并且表达包含SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体或者由其组成的核酸构建体。
术语植物在本文中其他地方限定。
在一个实施方案中，所述构建体还包含调控序列。这样的序列在本文中其他地方描述。在一个实例中，调控序列是引导核酸序列的过度表达的启动子。
上述核酸或载体用于使用在本领域中已知的转化方法产生遗传改变的、并且在一个实施方案中转基因的植物。因此，根据本发明的多个方面，将包含ZmNac111核酸或其功能同源物或变体的核酸引入至植物中并且作为转基因表达。核酸序列通过被称为转化的过程引入至所述植物中。如在本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不用考虑用于转移的方法。可以用本发明的遗传构建体和由其再生的整个植物来转化能够随后克隆繁殖(通过器官发生或胚胎发生)的植物组织。所选择的特定组织将会取决于可用于并且最适于被转化的特定物种的克隆繁殖***而改变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽、和根分生组织)、和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞中，并且可以保持非整合，例如作为质粒。备选地，其可以整合至宿主基因组中。所得的转化的植物细胞之后可以用于以本领域技术人员已知的方式再生被转化的植物。
外源基因向植物的基因组中的转移被称为转化。在许多物种中，植物的转化现在是常规技术。有利地，多种转化方法中的任何一种可以用于将目标基因引入至适合的祖细胞中。对于从植物组织或植物细胞转化和再生植物所描述的方法可以用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接将DNA注入至植物中、粒子枪轰击、使用病毒或花粉的转化和显微喷射(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法、原生质体的电穿孔、向植物材料中的显微注射、涂布有DNA或RNA的粒子轰击、用病毒感染(非整合性)等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化而制备。
为了选择转化的植物，通常使在转化中得到的植物材料经历选择性条件，从而可以将转化的植物与未转化的植物区分。例如，可以种植以上述方式得到的种子，并且在初始生长期之后，通过喷雾进行适合的选择。进一步的可能性是，如果适当，在灭菌之后使用适合的选择剂使种子在琼脂平板上生长，从而仅转化的种子可以生长为植物。备选地，筛选转化的植物的可选择标记物(如以上描述的可选择标记物)的存在。在DNA转移和再生之后，例如，也可以使用Southern分析来评价推定转化的植物的目标基因的存在、拷贝数和/或基因组组织。备选地或另外地，可以使用Northern和/或Western分析来监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员公知的。
所产生的转化的植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交，并且选择纯合的第二代(或T2)转化子，并且T2植物之后可以进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化的生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如，所有细胞被转化以含有表达盒)；转化和未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的砧木嫁接至未转化接穗上)。
本发明涉及用于制备具有与对照植物相比提高的耐旱性的遗传改变的植物的方法，所述方法包括
a)向所述植物中引入并且表达包含ZmNac111核酸序列(例如，包含SEQ ID NO:1、2、3，SEQ ID NO:1、2或3的功能同源物或变体的核酸序列)的核酸构建体，和
b)获得来源于步骤a)的植物或植物细胞的子代植物。
在一个实施方案中，所述方法是用于制备转基因植物的方法。
因此，本发明涉及用于制备在缺水或干旱胁迫下具有提高的产量的遗传改变的植物的方法，所述方法包括
a)向所述植物中引入并且表达包含ZmNac111核酸序列(例如，包含SEQ ID NO:1、2或3，SEQ ID NO:1、2或3的功能同源物或变体的核酸序列)的核酸构建体，和
b)获得来源于步骤a)的植物或植物细胞的子代植物。
同样地，在一个实施方案中，所述方法是用于制备转基因植物的方法。
在一个实施方案中，所述干旱胁迫是中度的。
以上方法可以包括另外的步骤：
-通过在本领域中已知的方法检测遗传改变或转基因的存在；
-将植物暴露于胁迫条件，如干旱；
-评估产量/生长；
-选择具有增加的胁迫抗性/改善的产量/生长的植物或其部分；
-任选收获植物的部分。
本发明还涉及利用所述方法获得或可通过的植物。术语植物在本文中其他地方限定。
本发明还涉及具有如在SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体中所定义的内源性核酸的增加的表达的植物，其中所述内源性启动子(SEQID NO:24)携带通过诱变或基因组编辑引入的突变，所述突变引起如在SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体中所定义的核酸的增加的表达。
本发明还涉及用于增加植物中如在SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体中所定义的核酸的表达、制备植物的方法，用于缓解胁迫条件对植物生长和产量的影响的方法，和用于制备在胁迫条件下具有改善的产量/生长的植物的方法，所述方法包括以下步骤：使植物群体突变，鉴别和选择在胁迫条件下具有改善的产量/生长的植物，和鉴别引导如在SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体中所定义的核酸的表达的变体ZmNac111启动子序列。以上可以使用靶向基因组编辑实现。
靶向的基因组修饰或靶向的基因组编辑是使用靶向的DNA双链断裂(DSB)以通过同源重组(HR)介导的重组事件促进基因组编辑的基因组工程技术。为了通过引入位点特异性DNA DSB来实现有效的基因组编辑，可以使用四种主要类型的可定制DNA结合蛋白：来源于微生物可移动基因元件的大范围核酸酶(meganuclease)、基于真核转录因子的ZF核酸酶、来自黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌的转录激活因子样效应物(TALE)、和来自II型细菌适应性免疫***CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)的RNA指引的DNA核酸内切酶Cas9。大范围核酸酶、ZF和TALE蛋白全部通过蛋白质-DNA相互作用来识别特定的DNA序列。尽管大范围核酸酶整合其核酸酶和DNA-结合结构域，ZF和TALE蛋白分别由靶向DNA的3个或1个核苷酸(nt)的个体模块组成。ZF和TALE可以以所需组合组装并且连接至FokI的核酸酶结构域以指导针对特定基因组基因座的溶核活性。
在通过细菌III型分泌***递送至宿主细胞中时，TAL效应物进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应物特异性序列结合并且激活转录。其靶向特异性通过串联的33-35个氨基酸重复序列的中央结构域确定。这之后是20个氨基酸的单个截短的重复序列。所检查的大多数自然存在的TAL效应物具有12个至27个之间的完整重复序列。
这些重复序列彼此仅两个相邻氨基酸不同，即它们的重复可变双残基(repeat-variable di-residue,RVD)。确定TAL效应物将会识别哪个单一核苷酸的RVD：一个RVD对应于一个核苷酸，并且四种最常见的RVD各自优先与四种碱基中的一种结合。自然存在的识别位点均匀地在所需TAL效应物的T之后。TAL效应物可以与FokI核酸酶的催化结构域融合以形成TAL效应物核酸酶(TALEN)，其使得靶向的DNA双链断裂(DSB)在体内用于基因组编辑。在本领域中充分描述了这种技术在基因组编辑中的用途，例如在US 8,440,431、US 8,440,432和US 8,450,471中。参考文献71描述了一组定制的质粒，其可以与Golden Gate克隆方法一起使用以组装多个DNA片段。如在其中描述的，Golden Gate方法使用IIS型限制性核酸内切酶，其在它们的识别位点外侧切割以形成独特的4 bp突出端。通过在相同反应混合物中消化和连接来加速克隆，因为正确的组装消除了酶识别位点。定制TALEN或TAL效应物构建体的组装包括两个步骤：(i)将重复序列模块组装为1-10个重复序列的中间阵列和(ii)将中间阵列连接为骨架以制备最终构建体。
可以根据本发明的多个方面使用的另一种基因组编辑方法是CRISPR。在本领域中充分描述了这种技术在基因组编辑中的用途，例如在US 8,697,359和在本文中引用的参考文献中。简而言之，CRISPR是参与针对入侵的噬菌体和质粒的防御的微生物核酸酶***。在微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割的特异性的非编码RNA元件(sgRNA)的组合。已经在大范围的细菌宿主中鉴别了三种类型(I-III)的CRISPR***。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在由非重复序列的短区段(间隔区)间隔的重复序列(直接重复序列)的阵列。非编码CRISPR阵列在直接重复序列被转录并且切割为含有个体间隔区序列的短crRNA，其将Cas核酸酶引导至靶位点(原型间隔区)。II型CRISPR是最充分表征的***之一并且在四个连续步骤中进行靶向的DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，pre-crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与pre-crRNA的重复序列区域杂交并且介导将pre-crRNA加工为含有个体间隔区序列的成熟crRNA。第三，通过在crRNA上的间隔区和紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)(用于靶标识别的额外要求)的靶标DNA上的原型间隔区之间的沃森-克里克碱基配对，成熟的crRNA:tracrRNA复合物将Cas9引导至靶标DNA。最后，Cas9介导靶标DNA的切割以在原型间隔区内形成双链断裂。
因此Cas9是II型CRISPR-Cas***的标志蛋白，并且是通过两个非编码RNA：CRIPSRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的复合物引导至与PAM(原型间隔区相邻基序)序列基序相邻的DNA靶序列的大的单体DNA核酸酶。Cas9蛋白含有与RuvC和HNH核酸酶同源的两个核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补链，并且作为结果，在靶标DNA中引入钝性切割(blunt cut)。Cas9连同sgRNA一起的异源表达可以将位点特异性双链断裂(DSB)引入至来自多种生物的活细胞的基因组DNA中。对于在真核生物中的应用来说，已经使用Cas9的密码子优化的形式，其最初来自细菌酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
单向导RNA(sgRNA)是与Cas9核酸酶形成复合物的CRISPR/Cas***的第二成分。sgRNA是通过将crRNA与tracrRNA融合形成的合成的RNA嵌合体。位于其5'末端的sgRNA向导序列赋予DNA靶标特异性。因此，通过修饰向导序列，可以形成具有不同靶标特异性的sgRNA。向导序列的典型长度是20bp。在植物中，已经使用植物RNA聚合酶III启动子如U6和U3来表达sgRNA。
可以如在本领域中所描述的来构建用于在本发明的方法中使用的Cas9表达质粒。
因此，本发明的多个方面包括靶向的诱变方法，具体是基因组编辑，并且在优选的实施方案中排除了仅基于通过常规育种方法产生植物的实施方案。
因此，在本发明的一个方面中，提供用于制备对干旱具有抗性的突变体植物的方法，所述方法包括使用靶向的基因组修饰将突变引入至内源性ZmNac111启动子或其功能同源物或变体的核酸序列中。在优选的实施方案中，使用ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9引入所述突变。
在一个实施方案中，ZmNac111启动子或其功能同源物或变体从抗旱玉米自交系中分离。在备选的实施方案中，ZmNac111启动子或其功能同源物或变体从对干旱敏感的玉米自交系中分离。
在一个实施方案中，ZmNac111启动子由SEQ ID NO:24表示。
在备选的实施方案中，ZmNac111启动子由SEQ ID NO:25(该序列包括MITE)表示。
在一个实施方案中，如以上所限定的靶向的基因组编辑或修饰用于从ZmNac111启动子或其功能同源物或变体的核酸序列中删除至少一个残基。在优选的实施方案中，靶向的基因组编辑用于从含有以下的序列(例如，SEQ ID NO:26)或其功能同源物或变体的ZmNac111启动子中删除以下序列。
在另一个实施方案中，靶向的基因组编辑用于在ZmNac111启动子或其功能同源物或变体的核酸序列中***至少一个核酸。在优选的实施方案中，这种突变增强了内源性启动子的活性。例如，靶向的基因组修饰可以用于***至少一个增强子或启动子位点，如TATA框(TATAAA)、GC框(GGGCGG)或CAAT(GGCCAATCT)框、或其功能变体。
本发明还涉及利用所述方法获得或可通过的植物。术语植物在本文中其他地方限定。还提供了如上所述的突变的内源性ZmNac111启动子或其功能同源物或变体用于在干旱胁迫条件下增加植物的产量和/或生长的用途。备选地，还提供了如上所述的突变的内源性ZmNac111启动子或其功能同源物或变体用于赋予耐旱性的用途。
在本发明的最终方面中，提供遗传改变的植物，所述遗传改变的植物表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3或其功能同源物或变体中所定义的核酸的核酸构建体，其中核酸还包含以下突变中的至少一种：SNP1532:C/A和/或SNP1535:A/G。在一个实施方案中，植物是突变体植物。还提供用于制备对干旱具有抗性的遗传改变的植物的方法，所述方法包括将突变引入至SEQ ID NO:1、2或3的核酸序列中，其中所述突变是SNP1532:C/A和/或SNP1535:A/G。同样地，在优选的实施方案中，植物是突变体植物。
在其中我们讨论赋予耐旱性的本发明的所有方面中，本发明可以等同地用于赋予抗旱性。
本发明的进一步实施方案
本发明的进一步的目的是提供植物耐旱相关蛋白ZmNAC111，其编码基因以及其应用。
在本发明中提供的蛋白来源于玉米(Zea mays L.)并且具有ZmNAC111的名称。所述蛋白是a)或b)的蛋白：
a)由在序列表中的SEQ ID NO.27中示出的氨基酸序列组成的蛋白；
b)衍生自蛋白a)的蛋白，其中置换、移除和/或加入在SEQ ID NO.27中示出的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，并且所述蛋白涉及耐旱性。
在SEQ ID NO.27中示出的氨基酸由475个氨基酸残基组成。为了使(a)中的蛋白更容易纯化，可以应用在表1中示出的标签以将由在SEQ ID NO.27中示出的氨基酸序列组成的蛋白的氨基末端或羧基末端连接。
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常5) RRRRR
Poly-His 2-10(通常6) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-标签II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
(b)中的蛋白可以通过人工合成得到或者通过首先合成编码基因并且之后生物学表达该基因而得到。蛋白(b)的编码基因可以通过以下方式得到：删除氨基酸残基的一个或多个密码子，进行一个或多个碱基的错义突变，和/或将如在表1中所示的标签加入至由SEQID No.28的基因座157-1584示出的DNA序列的5’末端和/或3’末端。
蛋白的上述DNA分子的编码也落在本发明的保护范围内。
所述DNA分子是1)、2)、3)或4)的DNA分子：
1)包含如在SEQ ID NO:28中所示的编码区的DNA分子；
2)包含如在SEQ ID NO.28的基因座157-1584中所示的编码区的DNA分子；
3)与在1)或2)中所定义的DNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性并且编码在本文中所述的蛋白的DNA分子；
4)在严格条件下与在1)、2)或3)中所定义的DNA序列杂交并且编码上述蛋白的DNA分子。
SEQ ID No.28由1824个脱氧核苷酸组成，并且其是编码所述蛋白的全长cDNA序列，其中基因座157-1584是编码区。
上述严格条件可以是如下：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃下进行杂交，并且在2×SSC和0.1％SDS中在50℃下洗涤；或在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃下进行杂交，并且在1×SSC和0.1％SDS中在50℃下洗涤；或在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃下进行杂交，并且在0.5×SSC和0.1％SDS中在50℃下洗涤；或在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃下进行杂交，并且在0.1×SSC和0.1％SDS中在50℃下洗涤；或在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃下进行杂交，并且在0.1×SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤；或在6×SSC、0.5％SDS的混合溶液中在65℃下进行杂交并且在2×SSC和分别0.1％SDS和1％SDS中洗涤膜。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组细菌或重组病毒也落在本发明的保护范围内。
可以用现有的植物表达载体来构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体含有双元农杆菌载体和可以用于植物轰击的载体等。实例是pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA 2301、pCAMBIA 1301、pCAMBIA 1300、pBI121、pCAMBIA 1391-Xa或pCAMBIA 1391-Xb(CAMBIA Cor.)等。所述植物表达载体也可以在外源基因的3’末端中含有非翻译结构域，即含有多聚腺苷酸化信号或参与mRNA修饰或基因表达过程的任何其他DNA片段。所述多聚腺苷酸化信号可以将多聚腺苷酸引导至mRNA前体的3’末端中，例如3’末端转录的非翻译结构域，如农杆菌根癌病(crown gall)可诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶Nos基因)，并且植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)都具有类似功能。
当使用所述基因以构建重组植物表达载体时，可以在初始核苷酸转录之前加入任何种类的增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米泛素启动子(泛素))、组成型启动子或组织特异性表达启动子(如种子特异性表达启动子)，其全部均可以单独使用或与其他启动子组合使用。此外，当使用本申请中的基因以构建植物表达载体时，也可以使用包括翻译增强子或转录增强子在内的增强子。这些增强子结构域可以是在相邻结构域中的ATG初始启动子或初始启动子，但是它们必须与编码序列的阅读框相同，从而确保全部序列的正确翻译。所述翻译控制信号和初始启动子具有广泛的来源并且它们可以从天然来源得到或者可以人工合成。翻译初始结构域可以来源于转录结构域或结构基因。
为了鉴别或选择转基因植物细胞或植物，可以将植物表达载体修饰，例如通过加入可以在植物中表达并且编码能够产生颜色变化或发光化合物的酶的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)；针对抗生素的标签基因(如提供对卡那霉素(kanamycin)和相关抗生素的抗性的nptII基因、提供对除草剂草丁膦的抗性的bar基因、提供对抗生素潮霉素(hygromycin)的抗性的hph基因和提供对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因以及提供对草甘膦的抗性的EPSPS基因)或针对用于抗化学剂的标签基因(如抗除草剂基因)；以及提供对甘露糖的代谢能力的磷酸甘露糖异构酶基因。
在一个实施方案中，重组载体是pGZ或pSBIII。
重组载体pGZ是在ZmNAC111置换型载体pGKX的Not I和Xho I切割位点之间由在SEQ ID NO.28中的基因座157-1584所示的DNA片段(35S启动子的下游)，而在载体上的其他序列保持不变。
重组载体pSBIII是在ZmNAC111置换型载体pSB II的Sma I和Hind III切割位点之间由在SEQ ID NO.28中的基因座157-1584所示的DNA片段(Zmubil启动子的下游)，而在载体上的其他序列保持不变。
上述蛋白、DNA分子或重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组细菌或重组病毒在调节植物的抗逆性(adversity resistance)中的用途也在本发明的范围内。
在所述用途中，调节植物的胁迫抗性是为了提高植物的胁迫抗性，并且所述胁迫抗性是耐旱性。在一个实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物。
上述蛋白、DNA分子或重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组细菌或重组病毒在栽培具有胁迫抗性的转基因植物中的用途也在本发明的范围内。同样地，优选地，所述胁迫抗性是耐旱性，并且优选地，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
本发明的另一个目的是提供栽培具有胁迫抗性的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：将上述DNA分子引入至目标植物中以获得转基因植物；所述转基因植物具有比目标植物高的胁迫抗性。在以上方法中，胁迫抗性是耐旱性，并且所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
在以上方法中，所述DNA分子通过重组载体pGZ或pSBIII引入至目标植物中。
优选地，在以上方法或用途中，所述双子叶植物具体可以是拟南芥(Arabidopsisthaliana)并且所述单子叶植物具体可以是玉米(Zea mays L.)。
耐旱性可以利用以下性质表述：
1)在干旱胁迫下，转基因植物的存活率高于目标植物；
2)在ABA胁迫下，转基因植物种子的萌发晚于目标植物；
3)在ABA胁迫下，转基因植物的气孔闭合的程度和速率高于目标植物；
4)在干旱胁迫下，净光合速率、气孔导度和/或蒸腾速率低于目标植物。
因此，可以在以下方面中描述本发明：
1.蛋白，所述蛋白是a)或b)的蛋白：
a)由在SEQ ID NO.27中示出的氨基酸序列组成的蛋白；或
b)衍生自蛋白a)的蛋白，其中置换、移除和/或加入在SEQ ID NO.27中示出的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，并且所述蛋白涉及耐旱性。
2.编码根据第1方面的蛋白的DNA分子。
3.根据第2方面的DNA分子，其特征在于所述DNA分子是1)、2)、3)或4)的DNA分子：
1)包含如在序列表中的SEQ ID No.28中所示的编码区的DNA分子；
2)包含如在序列表中的SEQ ID No.28的基因座157-1584中所示的编码区的DNA分子；
3)与在1)或2)中所定义的DNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性并且编码在第1方面中的蛋白的DNA分子；
4)在严格条件下与在1)、2)或3)中所定义的DNA序列杂交并且编码上述蛋白的DNA分子。
4.包含根据第2或3方面的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组细菌或重组病毒。
5.根据第1方面的蛋白、或根据第2或3方面的DNA分子、或根据第4方面的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组细菌或重组病毒在调节植物的胁迫抗性中的用途。
6.根据第5方面的用途，其特征在于所述胁迫抗性是耐旱性，并且优选地所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
7.根据第1方面的蛋白、或根据第2或3方面的DNA分子、或根据第4方面的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组细菌或重组病毒在栽培具有胁迫抗性的转基因植物中的用途。
8.根据第7方面的用途，其特征在于所述胁迫抗性是耐旱性，并且优选地所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
9.栽培具有胁迫抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：将根据第2或3方面的DNA分子引入至目标植物中以获得转基因植物；所述转基因植物具有比目标植物高的胁迫抗性。
10.根据第9方面所述的用途，其中所述胁迫抗性是耐旱性，并且优选地所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
尽管前述公开内容提供了在本发明的范围内包括的主题的概括描述，包括方法制造和使用本发明的方法以及其最佳方式，提供了以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并且提供其全部书面描述。然而，本领域技术人员将会理解的是，这些实施例的细节不应被理解为限制本发明，其范围应当根据本公开所附的权利要求及其等同物理解。考虑到本公开，本发明的多种另外的方面和实施方案对本领域技术人员来说将会是显而易见的。
在本说明书中提及的全部文献，包括序列数据库编号的引用，通过引用整体结合在本文中。除非另外指定，当引用序列数据库编号时，版本号是1。
在本文中使用的情况下，“和/或”应理解为具体公开了两指定特征或要素中的每一个，并且具有或不具有另一个特征或要素。例如，“A和/或B”应理解为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种，如同各自在本文中单独给出一样。
除非上下文另外指出，以上给出的特点的描述和定义不限于本发明的任何具体的方面或实施方案并且等同地应用于所描述的所有方面和实施方案。在以下非限制性实施例中进一步描述了本发明。
实施例1：玉米幼苗的ZmNac111相关的耐旱性
为了鉴别与玉米耐旱性相关的基因，我们通过分析由从世界的热带/亚热带(TST)和温带区域收集的368个自交系组成的天然玉米群体进行了GWAS[19]。将大约560,000个单核苷酸多态性(SNP)[19]应用于研究。考虑到受施加至植物的胁迫的时间周期和强度二者影响的植物耐旱性的复杂性，我们决定在幼苗阶段关注对严重干旱胁迫的耐受性。幼苗存活率(SR)可以反映植物耐受性机制和对干旱的细胞应答。其较少受环境波动影响，这有助于鉴别一个或多个潜在的遗传定子(genetic determinant)。通过在幼苗阶段在严重干旱胁迫下计算SR指数(在重新浇水之后存活的植物的百分比)来测定每个基因型的耐旱性[24]。平均来说，与来自温带区域的那些相比，来自TST的自交系展现出较高的SR，表明来源于原产地附近区域的玉米种质可能比在温带区域中栽培的那些更耐旱。在全基因组尺度上，考虑到群体结构(Q)和群体的亲本相关性(K)，确认在染色体10上的GRMZM2G127379内的SNP与植物耐旱性明显相关(图7)。GRMZM2G127379编码NAC型转录因子(TF)，属于在玉米基因组中具有多于100个成员的家族，并且之前已经将GRMZM2G127379称为ZmNAC11135。由ZmNac111编码的氨基酸序列的进化分析表明，其在水稻中最接近的鉴别的同源基因是OsNAC10(LOC_Os11g03300)36(图8)。
NAC蛋白调节植物中的多个生物过程，包括子叶[37]和根发育[38]、次生壁的形成[39]、叶片衰老[40]、营养物向谷粒的再转移[41]、和胁迫应答[42]。考虑到NAC型基因在植物耐旱性方面的可能的作用，我们之后对262个玉米自交系中的ZmNac111基因进行测序。对横跨ZmNAC111的5’至3’-非翻译区(UTR)的2.3-kb基因组区域进行分析。进一步鉴别总计157个SNP和119个InDel(***和缺失)。发现位于ZmNAC111的起始密码子上游572-bp的新鉴别的82-bp InDel(InDel-572)具有与幼苗SR最显著的关联(P＝5.52×10-6，在混合线性模型下计算，参见方法，图1a)，贡献了天然群体中7.27％的表型变异。在外显子3中的两个非同义变异也被鉴别为略微显著的。SNP1532引起脯氨酸(Pro)向谷氨酰胺(Gln)的氨基酸残基变化，并且SNP1535引起Gln向精氨酸(Arg)的改变。处于强LD中的两种突变位于C端转录调控区中，而不是位于ZmNac111蛋白的N末端DNA结合结构域中。InDel-572与在5’-UTR和第一外显子中的变异处于LD中(r2>0.4)，而不是与两个非同义SNP处于LD中(图1a)。所有其他变异不与具有统计学显著性的性状相关。
实施例2：InDel-572是在ZmNac111基因的启动子中的82-bp MITE***
在ZmNac111基因的启动子区域中的InDel-572的序列分析显示，其由长末端反向重复序列(TIR)(每个为38-bp)、4-bp环以及在最后的两个额外核苷酸“TA”构成。发现另一个“TA”序列直接在这个***之前(图1b)。其表示在基因组内的MITE***的典型结构，其通常是短的，具有大约数百个bp，并且由TIR和靶位点直接重复序列组成，并且优先在TA或TAA27***。我们使用82-bp序列作为查询(query)对玉米TE数据库进行搜索(blast)(http://maizetedb.org/～maize/)，并且发现其属于MITE的Tc1/Mariner超家族。80-bpDNA序列(不包括靶位点直接重复序列)可以形成完美的茎-环完美茎-环结构(图1b)。其存在于对干旱敏感的基因型如B73和Mo17的ZmNac111的启动子中，而其不存在于耐旱基因型如CIMBL55、92、70和CML118中(图1b)。
实施例3：MITE***抑制ZmNac111表达
因为MITE***位于ZmNAC111的启动子区域中，我们假设其引起在不同基因型之间的改变的ZmNac111表达。为了检验这个假说，我们在水分充足、中度、和严重干旱条件下分析了在133个自交系之间的ZmNac111基因的表达。总计399个RNA样品的定量RT-PCR(qRT-PCR)分析显示，ZmNac111表达在中度和严重干旱胁迫二者下与植物存活率正相关，但是在水分充足条件下不是正相关(图2a)。这个发现表明，ZmNac111的增加的表达可以有助于在水胁迫下的在本研究中检验的天然玉米变种的耐旱性。此外，qRT-PCR结果显示，无论施加的胁迫水平，与具有MITE***(MITE+)的那些相比，不具有MITE(MITE-)的基因型具有明显更高的ZmNac111表达(图2b)。示出了耐旱性的差异明显的表型和多种代表性基因型的差异ZmNac111表达(图9)。基于这个数据，我们证实了，MITE***可以抑制ZmNac111表达，引起MITE+玉米变种对干旱胁迫的较高的敏感度。
为了进一步检验MITE***是否是在ZmNac111基因座上的致病性变体，我们构建了三个双亲F2:3群体。每个群体的双亲在ZmNac111基因座上的基因型是MITE+或MITE-。我们观察到，MITE-等位基因与在三个双亲F2:3群体中的耐旱性共分离(图10)。另一方面，当我们比较由区别为两个非同义变异SNP1532和SNP1535的等位基因编码的ZmNac111蛋白的反式激活活性时，我们发现在不同等位基因中的这两个变异未明显地影响ZmNac111的反式激活活性(图11)。总而言之，基于我们的结果，我们证实了，MITE***可能是与ZmNAC111相关的耐旱性的差异的原因，而不是在编码的蛋白中的氨基酸变化，并且MITE+是ZmNAC111的对干旱敏感的等位基因并且MITE-是耐旱的等位基因。
实施例4：MITE导致在ZmNac111基因座上的DNA和组蛋白甲基化
为了理解82-bp MITE如何降低ZmNac111表达，我们之后检查了在MITE-和MITE+基因型中的ZmNac111的DNA和组蛋白甲基化状态。代表性地分析在两个自交系B73(对干旱敏感的，MITE+)和CIMBL55(耐旱的，MITE-)中横跨ZmNac111基因和启动子的八个区域(R1-R8)。结果显示，仅离MITE***最近的R1和R2在ZmNAC111-B73中超甲基化，而在ZmNAC111-CIMBL55中则不，无论胁迫处理如何(图3a)。这些区域的亚硫酸氢盐测序检测DNA超甲基化，尤其是针对CHH含量(图3b)。此外，使用特异性H3K9me2抗体的染色质免疫沉淀(ChIP)以及之后的qPCR分析证实，与在ZmNAC111-CIMBL55中相比，H3K9me2在ZmNAC111-B73中的R1至R4中明显富集。然而，另一个区域的H3K9me2水平保持相当。基于这个数据，我们证实了，MITE***通过其附近区域的DNA和组蛋白甲基化来抑制ZmNac111表达(图3c、d)。
实施例5：MITE通过RdDM通路抑制ZmNac111表达
鉴别了大量的21-nt至24-nt小干扰RNA(siRNA)物种，其可以与在玉米小RNA数据库(http://sundarlab.ucdavis.edu/smrnas/)中的MITE序列进行比对(图12)。在检验82-bp MITE***可以通过RdDM通路介导DNA和组蛋白甲基化的假说的尝试中，将gZmNAC111-B73和gZmNAC111-CIMBL55的基因组片段转化至拟南芥中并且用CaMV 35S启动子表达(图4a)。分析针对每个构建体的所得到的48个独立的T2转基因品系。与35S:gZmNAC111-B73转基因植物相比，含有35S:gZmNAC111-CIMBL55的转基因植物通常展现出明显较高的ZmNac111表达水平(图4b)。在35S:gZmNAC111-B73中，而不是在35S:gZmNAC111-CIMBL55转基因品系中，预期地观察到在MITE***附近区域中的DNA超甲基化和H3K9me2富集(图4c-e)。之后在这两种类型的转基因植物之间比较植物耐旱性。与用35S:gZmNAC111-B73转化的那些相比，含有35S:gZmNAC111-CIMBL55的转基因拟南芥显示出更高的耐旱性(图13)。
为了确认MITE***通过RdDM通路介导ZmNac111抑制，将参与RdDM通路的关键基因缺陷的五个拟南芥突变体与两个独立的纯合35S:gZmNAC111-B73-2和-23品系杂交以将35S:gZmNAC111-B73构建体转移至RdDM缺陷背景。在drm1-2；drm2-2、ago4-5、和rdr2-2突变体中，ZmNAC111-B73表达大幅增强，而其DNA甲基化和H3K9me2降低至与在野生型背景下的ZmNAC111-CIMBL55的那些相当的水平。在suvh4-3突变体中，ZmNAC111-B73的H3K9me2水平明显降低，但是DNA超甲基化保持与在野生型背景下相对相似，这与SUVH4起组蛋白甲基转移酶的作用的事实一致。在dcl2-1；dcl4-2中，ZmNAC111-B73的基因表达、DNA甲基化和H3K9me2水平仍然与对于在野生型背景下的ZmNAC111-CIMBL55观察到的那些不同；这最可能归因于在这个突变体中完整的DCL3功能(图4f-i)。当将35S:gZmNAC111-CIMBL55-5和-12转基因拟南芥植物与RdDM突变体杂交时，未观察到基因表达、DNA甲基化和H3K9me2水平的明显变化(图14)。总而言之，这些数据明确地表明，当在拟南芥中异源表达时，MITE通过RdDM通路抑制ZmNac111表达。
实施例6：ZmNac111的过度表达赋予耐旱性
假设ZmNac111表达与玉米耐旱性正相关，我们产生过度表达ZmNac111(来自B73基因型)的编码序列的转基因拟南芥和玉米二者。对于转基因拟南芥来说，分析三个独立35S:ZmNAC111品系的表型。与空载体转化的植物(VC)相比，在正常生长条件下，转基因拟南芥显示出明显增强的耐旱性，而没有明显的形态变化。当VC的存活是大约20％时，大约80％的转基因植物在平行的断水实验中存活(图15a-c)。如通过种子萌发和气孔闭合测定示出的，转基因拟南芥植物还对外源性ABA超敏感，表明在转基因植物中ABA信号传导的增强(图15e-g)。
还在由ZmUbi:ZmNAC111转化的盆栽转基因玉米中观察到了类似的提高的耐旱性。在干旱胁迫下，大约80％的T2代转基因玉米植物存活；然而，转基因阴性同胞植物(WT)的存活率仅为30％(图5c、d)。在转基因玉米中未观察到与WT相比在正常生长条件下明显异常的变化，尽管我们承认这些生长条件可能不能准确地表示田间条件(图5a、b和图17)。接下来，我们比较了转基因玉米和WT之间在渐进式水胁迫下的气孔应答和蒸腾作用。当土壤水含量(SWC)从40％降低至接近2％时，在WT和转基因玉米二者中，在12天内每隔一天对叶片光合速率(PS)、气孔导度(SC)、和蒸腾速率(TR)进行记录。在前两天期间(SWC>30％)，在转基因植物和WT之间的三个生理参数相当，支持了它们在无胁迫条件下生长方面没有不同的观察(图5e-g)。当SWC降低至约20％时，首先测量到转基因植物的TR降低，得到转基因玉米植物相对于WT明显更高的WUE(作为与TR相关的PS计算)(图5g、h)。在SWC降低至～15％的情况下，与在WT中的那些相比，在转基因植物中SC和TR变得明显较小，而PS仍然相当(图5e)。因此，转基因玉米的WUE保持大于WT的WUE(图5g)。之后，与WT的PS相比，转基因植物的PS更大程度地降低；然而，归因于更明显地降低的SC和TR，转基因植物的WUE仍然明显大于WT的WUE，直到SWC降低至大约2％(图5h)。这些数据显示，与WT相比，转基因玉米植物在缺水下具有较高的WUE，这为转基因玉米赋予了增强的耐旱性。
在我们的研究的下一个品系中，我们比较了转基因玉米和WT植物在有利和干旱条件下的转录组。发现以下水分充足条件下，与WT相比，在转基因植物中总计628和443个基因分别被上调和下调两倍(图16)。在干旱胁迫下，相对于WT，在转基因玉米中547和425个基因分别被上调和下调2倍(图6a、b)。对脱落酸、乙烯和非生物刺激应答的生物途径在这些鉴别的上调基因中大幅富集，而对氧化变化和赤霉素应答的那些尤其在下调基因中富集(图6c)。与未处理的相比，对非生物和水胁迫应答的基因更明显地在干旱胁迫的样品中的上调基因中富集(图6c和图70c)。这些转录组变化可以有助于在干旱胁迫下的TR的早期降低、快速气孔闭合、和转基因玉米的光合机构的更好保护。在转基因玉米中确认了多种公知的干旱可诱导基因如NCED343、AFP344、RAB1845、RD29B46、AHG147、RD1745、DREB1D48的玉米同源物的增加的表达形式(图6d)。这些基因中的大多数在其启动子中含有NAC识别核心序列(CACG)[49、50]的拷贝，说明它们可以引导ZmNac111的靶基因。
实施例7：ZmNac111基因座的进化方面
基于类蜀黍和玉米的天然杂交可育以及大量遗传驯化信息的可得性8、9，类蜀黍(Zea mays ssp.)，一类野生墨西哥禾本植物被认为是玉米的直接祖先。在从类蜀黍驯化之后，玉米栽培从TST传播温带区域并且玉米成为向人类消费提供营养卡路里的主要作物植物。我们有兴趣知道82-bp MITE***在类蜀黍ZmNac111基因座中的存在和分布。当对96个类蜀黍添加物进行基因分型时，发现它们均不在ZmNAC111上携带MITE***，表明这个***可以在玉米驯化之后出现。此外，在116个TST自交系中，它们的10.34％是MITE+。然而，在146个温带品系中(包括硬茎(SS)、非硬茎(NSS)、和混合来源51)，41.78％是MITE+(图6e)。发现在ZmNac111基因座上的核苷酸多样性从类蜀黍到TST并且之后到温带玉米降低(图6f)。这个发现表明，随着玉米栽培从TST向温带区域传播，MITE+基因型累积，尤其是在温带玉米种质中。在ZmNac111基因座中的MITE***可能会损害温带玉米变种的耐旱性，这是根据在整个天然变异群体中温带亚群平均上来说比TST亚群对干旱更易感的观察。因此，我们提出，MITE-基因型的选择可以有助于提高温带玉米自交系中的耐旱性。
实施例8：转化的ZmNAC111拟南芥的RNA-seq分析
结果在图26和图27中示出。结果证实，在正常条件下和在干旱处理下生长的转基因拟南芥中，调节与对水胁迫、脱落酸(ABA)胁迫的应答相关的基因和与生物途径相关的转录调节的基因的表述。
以上结果显示，蛋白ZmNAC111及其编码基因具有调节植物的耐旱性的功能。在植物中的蛋白ZmNAC111的编码基因的过度表达可以提高植物的耐旱性。
讨论
在本研究中，我们报道了，在全基因组尺度上，ZmNac111基因的天然变异与玉米耐旱性相关。通过使用GWAS和转基因研究的组合方法，我们证实了，在ZmNac111基因座上的致病性变异可能是在基因启动子中的82-bp MITE***，其通过经由RdDM通路的DNA和组蛋白超甲基化来抑制基因表达。我们的发现突出了TE在玉米胁迫应答中的可能的调控功能，并且提出了对玉米耐旱性的天然变异的遗传基础的重要见解；以及用于提高这种性状的新的遗传策略。
我们鉴别了在与较低的ZmNac111表达和干旱易感性相关的ZmNac111编码区上游572-bp位置中的82-bp MITE***(图2b)。亚硫酸氢盐-seq和ChIP-qPCR分析显示，在携带MITE的玉米自交系中，在ZmNac111基因座中DNA和组蛋白超甲基化(图3)。当将含有MITE和ZmNac111的基因组片段转入拟南芥中时，可以重现ZmNac111表达的抑制，表明潜在的分子机制可能在整个植物物种中是保守的。重要的是，使用拟南芥RdDM缺陷型突变体，我们证实了，至少当异源表达时，MITE介导的ZmNac111抑制依赖于RdDM(图4)；其植物中充分表征的RNA干扰相关的转录基因沉默机制[32]。这种修饰诱导并且增强TE以及含有或邻接TE的基因的转录沉默26。近来，在玉米中的全基因组DNA甲基化和RdDM调查表明，24-nt siRNA与倾向于接近基因而不是异染色质区域的转座子更加高度相关[52]。尽管大多数玉米基因组以由H3K9me2和H3K27me2标记的异染色质状态存在，仅在基因编码区附近观察到RdDM[53]。作为结果，其引起主要在基因附近而不是在重复的基因间DNA区域中的CHH岛的形成[52、53]。我们的发现针对82-bp MITE如何与其相邻的基因相互作用从而有助于天然玉米群体中的耐旱性差异提供了潜在的分子机制。
TF在对非生物胁迫应答的基因表达的调节中起重要作用，并且提出它们的分子工程作为作物中耐胁迫性的遗传改善的潜在策略[54、55]。NAC蛋白构成了植物特异性超家族，其成员参与多种调控和发育过程，包括胁迫应答和耐受性[42]。典型的NAC蛋白共享保守的N末端DNA结构域，但是在其他区域中大幅变化；得到不同蛋白的不同功能。在玉米中，已经鉴别了至少116个预测的NAC成员[35]。尽管在所检验的注释的NAC蛋白中将ZmNac111分类为具有OsNAC10的相同的进化枝(图8)，ZmNac111和OsNAC10在全蛋白水平上仅共享48％的序列同一性，表明在它们之间的功能相似性和多样性二者。之前的反向遗传研究报道，在干旱下，在根中增加OsNAC10表达提高了转基因水稻的产量[36]。在133个天然玉米变种的叶样品中的ZmNac111的表达分析表明，在中度和严重胁迫下，ZmNac111表达与耐旱性正相关(图2)。这些数据表明了在暴露于水胁迫的玉米幼苗中的ZmNac111的正向调控作用。此外，在拟南芥和玉米二者中的转基因研究证实，通过调节气孔闭合和对干旱应答的基因表达，ZmNac111基因的过度表达可以提高转基因植物的耐旱性。这些观察支持我们的发现，ZmNac111基因的提高的表达有助于玉米耐旱性并且ZmNac111起到玉米中干旱应答的正向调节物作用(图5和图15)。转基因玉米和WT的比较转录组分析确定，涉及ABA应答的多种基因如ZmNCED3、ZmRAB18、ZmRD29B、ZmRD17和ZmPP2C上调；表明ZmNac111可以在依赖ABA的胁迫应答通路中发挥作用(图6d)。根据这个结果，就萌发和气孔闭合而言，拟南芥转基因植物对外源性ABA处理更敏感(图15)。在转基因玉米中，在干旱处理中SWC从15％降低至～2％期间，叶片SC和TR更易对缺水应答(图5e-h)。基于这些结果，我们证实了，在ZmNac111转基因植物中增强了依赖ABA的调节。
人们认为，提高水分的有效利用(EUW)，意味着最大的土壤水分捕获、减低的非气孔水损失和用于最小土壤蒸发的管理，对于在田间条件下的耐旱性提高是重要的。然而，通过降低SC和TR来提高WUE可能会使田地中的植物产量降低[56]。在本研究中，当在有利的温室条件下将它们盆栽时，我们未在过度表达ZmNac111的转基因植物中观察到与对照植物相比明显的形态变化(图5a)。这得到在转基因植物和WT植物之间的叶片PS的可比较的测量的支持(图5e)。仅在干旱胁迫时，在转基因玉米中显示出与WT相比更高的WUE(图5h)。在过度表达SNAC150的转基因水稻中也观察到类似的现象。当SC在转基因玉米和WT之间保持相当时(SWC>20％)，在转基因玉米中观察到TR的早期降低；这很可能归因于更好或更快的渗透调节(图5g)。尽管与WT相比在转基因玉米中SC和TR大幅降低，当SWC为～15％时叶片PS几乎不受影响(图5e、f)。这些结果表明了在转基因玉米中在干旱胁迫下光合机构的更好保护或细胞氧化状态的维持。因此，转基因玉米的提高的耐旱性和更高的WUE可能归因于增强的ABA信号传导、更快的渗透调节、对干旱胁迫应答的更好的细胞保护，而不是植物生长保持的结果。这些发现还表明，可以通过生理和遗传二者提高植物的高效的水分利用。然而，针对基因应用于玉米生产的担忧，需要进一步深入评价在田间条件下转基因植物的重要农艺性状。
除了SNP以外，TE存在/不存在的变异在玉米基因组中是常见的并且广泛分布的，其被认为是作物进化和驯化的驱动力[57]。MITE***仅存在于玉米种质中，而不存在于我们检验的类蜀黍添加物中(图6e)。这个发现表明，在玉米由其野生祖先驯化之后，MITE可以***至ZmNac111基因座中。作物由其野生祖先的驯化可能会导致负责对多种环境胁迫的耐受性的基因或等位基因的丧失。近来已经报道，在玉米驯化期间ZmWAK基因的缺失增加了驯化的栽培品种对作为玉米生产中的主要疾病的丝黑穗病的易感性[12]。如果在其中主要目标是高产量而不是耐胁迫性的育种程序的选择期间不存在胁迫压力，则植物耐胁迫性的降低可能会被夸大。未观察到对在有利条件下的ZmNac111转基因拟南芥和玉米的植物正常生长和发育的明显不利影响。然而，需要进一步研究以测试在田间条件下ZmNac111表达的增强是否引起额外的不希望的表型。此外，通过分析513个玉米自交系，未发现ZmNac111基因座与17种重要农艺性状相关[58]。因此，ZmNac111可以是基因工程中的潜在的候选物，并且其MITE-等位基因可以是针对玉米中耐旱性的遗传改善的选择目标。应当注意的是，在当前研究中，在盆栽植物中在幼苗阶段评价玉米耐旱性，这限制了地上组织和营养生长的表征。ZmNac111及其MITE-等位基因是否可以明显有助于在干旱下田地中的玉米产量需要进一步的基于田地的研究。此外，MITE***在温带玉米种质中似乎是特别常见的，并且这个等位基因是否在目标用于温带区域的育种程序中赋予任何优点可能会是用于将来研究的令人感兴趣的主题。
方法
ZmNAC111基因关联作图。
通过分析由收集自TST和温带区域的368个自交系组成的玉米天然变异组，进行玉米耐旱基因的GWAS 19。如之前描述的，对不同自交系的植物耐旱性进行表型确定24。简而言之，将由368个玉米自交系组成的玉米天然变异组种植在其中将5吨壤土与0.25吨鸡粪混合的栽培池(6×1.4×0.22m，长度×宽度×深度)中。为了对每个基因型的耐旱性进行表型确定，当幼苗发育出三个真叶时停止浇水。当观察到明显的萎蔫差异时，进行重新浇水以使存活的植物恢复。在再水合6天之后，对每个基因型的存活率进行评分。表型数据从6个重复实验中得到。将最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥0.05的56,110基因组和525,105转录组SNP用于GWAS。应用标准混合线性模型(TASSEL 3.1.0)59，其中如之前描述的，估算群体结构(Q)和亲属关系(kinship,K)24。简而言之，使用具有MAF≥0.0561的高质量的52,5105SNP数据通过EIGENSTRAT60计算关联组的主成分。在主成分分析(PCA)中使用前两个维度以估算群体结构，这可以解释11.01％的表型变异。这些结果可与通过STRUCTURE计算的那些相比通过R程序中的lm函数完成分析。首先进行单标记关联分析以将与性状无关的标记物过滤掉(p≥0.995)。随后，选择在每个染色体上的1,822SNP标记物以通过SPAGeDi估算亲属关系系数(K)。基于SNP精简(pruning)(窗口尺寸50，步长50，LD R2阈值是0.2)根据PLINK62确定彼此处于近似连锁平衡的标记物，并且子集标记物的数量是85,806。用于控制全基因组第1类误差率的暗示的P值阈值是1.17×10-5，其被认为是针对关联的显著性临界值。在代表整个群体的146个温带和116个TST玉米自交系内进行基于ZmNAC111的关联作图。对ZmNac111启动子(～0.7kb)、编码区(包括内含子)、以及5'和3'-UTR序列进行扩增和测序。这些序列使用ContigExpress在Vector NTI Advance 10(Invitrogen)中组装并且使用MEGA版本5(http://megasoftware.net/)进行比对。鉴别多态性(SNP和InDel)并且再次通过TASSEL 3.1.0、在标准MLM下、在MAF≥0.05的情况下计算它们与耐旱性的关联。
在不同自交系中的ZmNAC111基因表达分析
在133个玉米自交系中分析ZmNAC111表达。通过停水将干旱处理应用于在3叶幼苗阶段的土壤栽培的植物。当相对叶片水含量(RLWC)从大约98％降低至70％并且降低至58％时，收集叶样品。使用TRIZOL试剂(Biotopped)从最少3个幼苗中分离399个样品的总RNA。用无RNA酶DNaseI(Takara)处理RNA，并且使用重组M-MLV逆转录酶(Promega)合成单链cDNA。使用量化方法(2-ΔCt)63并且使用三个生物重复来估算表达的差异。使用玉米Ubi-2(UniProtKB/TrEMBL；ACC：Q42415)基因作为内部对照以将数据归一化。PCR条件由以下组成：初始变性步骤在95℃下10min，接着进行在95℃下15秒、在60℃下10秒的40次循环。
在玉米分离群体中的ZmNac111的等位基因效应
构建三个F2:3分离群体(CIMBL91×BY4944、CIMBL55×GEMS54和CIMBL55×CIMBL9)。在每个群体中的大约200个个体F2植物中分析在ZmNac111基因座上的基因型。在2％琼脂糖凝胶上使在PCR产物中的多态性可视化。使在耐受等位基因(MITE-)和敏感等位基因(MITE+)的ZmNac111基因座上的纯合F2个体自花受粉以获得F3子代。分别将在InDel-572基因座上纯合(MITE-/-或MITE+/+)的F3子代混合。将两种类型的F3植物在塑料盒(0.70×0.50×0.18m，长度×宽度×深度)中的肥沃土壤中生长(土壤比蛭石的比率为1:1)并且评价它们的耐旱性。对于每种类型的F3植物来说，每个盒容纳90个幼苗。使用16h光/8h暗、28/22℃和60％的室内湿度在温室中进行三个独立的重复，以获得统计学数据。通过停水向10日龄的植物施加干旱。当SWC从40％降低至接近0％并且幼苗的萎蔫和死亡可见时，将植物重新浇水从而鉴别存活的植物。记录每个基因型的存活率。进行三个重复以用于统计学分析。
蛋白ZmNAC111及其编码基因的获取
使玉米自交系B37种子在28℃下在三天内萌发，并且之后将发芽的种子转移至具有营养物质的土壤或溶液进行3周的栽培。将整个植物快速冷冻并且研磨，并且之后提取总RNA并且对其进行反转录从而获得cDNA。之后使用cDNA作为模板以及5’-ATGCCGAGAAGCGGCGGCG-3’(SEQ ID NO.29)和5’-CTACTGCATCCCGATGTGGC-3’(SEQ IDNO.30)作为引物进行PCT扩增。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并且得到1.4kb的PCR扩增产物。在测序之后，PCR产物具有由在SEQ ID NO.28中的157至1584的基因座示出的核酸，基因被表示为ZmNAC111；由所述基因编码的蛋白被称为ZmNAC111；并且蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.27。在SEQ ID NO.28中，从1至156的基因座是5’非编码区，基因座157-1584是编码序列并且基因座1585-1824是3’非编码区。
针对不同单体编码蛋白ZmNAC111的转录激活活性分析
携带不同基因型的耐旱玉米自交系CIMBL55、CIMBL91、CIMBL19、CIMBL22和CIMBL23和敏感玉米自交系Mo17、D863F、BY4944、SHEN5003，以及玉米自交系B73的CDNA充当模板。使用5’-ATGCCGAGAAGCGGCGGCG-3’(SEQ ID NO.29)和5’-CTACTGCATCCCGATGTGGC-3’(SEQ ID NO.30)作为用于PCR扩增的引物；将靶基因克隆结合至酵母表达载体pGBKT7中，并且分别转化至酵母菌株AH109(含有报告基因HIS3和ADE2)中。转化空载体pGBKT7充当参比，并且分别获得重组酵母菌株ZmNAC111-CIMBL55、ZmNAC111-CIMBL91、ZmNAC111-CIMBL19、ZmNAC111-CIMBL22、ZmNAC111-CIMBL123、ZmNAC111-Mo17、ZmNAC111-D863F、ZmNAC111-BY4944、ZmNAC111-SHEN5003、ZmNAC111-B73和pGBKT7-对照。将AH109重组酵母菌株涂布在营养缺陷型培养基的平板上。之后，将由不同单型(monotype)编码的ZmNAC111的转录激活活性与细菌斑的生长进行比较。
如在图11中所示，所有11个重组酵母菌株都可以在SD-Trp(单缺)培养基的平板上生长。含有pGBKT7-对照质粒的酵母菌株通常不能生长，而所有重组酵母菌株通常可以在SD/-T-H(两缺)和SD/-T-H-A(三缺)营养缺陷型培养基上生长，这表明由不同单型编码的蛋白ZmNAC111具有类似的转录激活活性。
基于McrBC的DNA甲基化测定。
在干旱处理之前(RLWC＝98％)或之后(RLWC＝70％)从收集自B73和CIMBL55玉米品系的新鲜嫩叶中分离基因组DNA。在进行模拟反应(mock reaction)的同时，用10单位的McrBC酶(DNA甲基化敏感酶(Takara))将DNA(1μg)在37℃下消化16小时。将50ng的消化的DNA用于qPCR反应。通过在qPCR分析中的较低量的扩增产物证实的DNA超甲基化。所有结果通过消化至少两个生物学重复和两个独立的McrBC消化物而得到。qPCR使用以下条件进行：步骤1：95℃，10min；步骤2：95℃，15秒，60℃，30秒(40次循环)。将在ZmNac111基因上的McrBC消化针对参考基因玉米Ubi-2和Actin1归一化，并且之后针对未消化的对照归一化。在收集之前，拟南芥植物在MS琼脂平板上生长二十一天。使用Actin8作为在拟南芥中的参考基因64。已经将消化水平取倒数以表示甲基化水平。
亚硫酸氢盐分析。
通过使用EZ DNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research,Orange,CA)对200ng的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。在亚硫酸氢盐转化之后，通过PCR扩增被处理的DNA。将扩增的片段克隆至pGEM-T载体(Promega)中以用于测序。对每个基因型的至少八个克隆进行测序。
ChIP测定。
从如上所述在正常和干旱条件下生长的B73和CIMBL55玉米品系中收集新鲜嫩叶。从在MS琼脂平板上生长二十一天的35S:ZmNAC111-B73和35S:ZmNAC111-CIMBL55品系收集拟南芥的完整植物。如之前描述的，进行ChIP测定65。将抗H3(Abcam；ab1791)或抗H3K9me2(Abcam；ab1220)的7μl抗体用于ChIP测定。通过在ZmNac111基因座的不同区域上的qPCR来确定的免疫沉淀的ZmNac111染色质的量。分别使用玉米Ubi-2和Actin8作为玉米和拟南芥的内部对照。将相对丰度针对通过组蛋白3特异性抗体免疫沉淀的DNA的量归一化。
在转基因植物在RdDM突变体背景下的生成。
将两个35S:gZmNAC111-B73-2、-23和35S:gZmNAC111-CIMBL55-5、-12纯合T2品系与五个突变体杂交：dcl2-1；dcl3-1；dcl4-2(CS16391)、drm1-2；drm2-2(CS16383)、ago4-5(CS9927)、rdr2-2(SALK_059661)，和suvh4-3(Salk_105816)(http://www.arabidopsis.org)。通过基于PCR的基因分型分析，每次杂交获得并且收获至少三个独立的F2纯合植物。因为DCL3基因座是杂合的，仅获得在dcl2-1；dcl4-2突变体背景下的35S:gZmNAC111-B73-2和-23。使用将两个独立的转基因拟南芥与RdDM突变体杂交得到的F3RdDM突变体纯合植物进行ChIP测定。将在卡那霉素选择性培养基上萌发的F3植物用于进一步DNA甲基化和ChIP分析。拟南芥T-DNA***品系从拟南芥生物资源中心(ArabidopsisBiological Resource Center)获得。
转基因拟南芥的耐旱性
在CaMV 35S启动子下，使用NotI和XhoI限制性位点，将在B73和CIMBL55自交系中的ZmNac111基因组区域以及在B73中的编码区扩增并且***至pGreen载体66。将构建的质粒转化至含有pSoup辅助质粒的GV3101根癌农杆菌菌株中。通过农杆菌介导的转化将拟南芥生态型Col-0转化并且使用基于卡那霉素的选择得到独立的T2转基因品系。通过qRT-PCR确定在转基因植物中的ZmNac111基因表达，其中使用Actin8作为用于归一化的内部对照。对于耐旱性测定来说，将七日龄植物转入含有250g土壤的花盆中。将在有利水条件下生长的三十二日龄植物暴露于干旱胁迫。将植物停水14天。之后恢复浇水以使植物恢复。六天之后，记录存活的植物的数量。在每个试验中将每个品系的至少64个植物与空载体转化的(VC)植物比较，并且统计学数据基于从三个独立实验得到的数据。
ZmNAC111拟南芥的获取
通过使用花蕾浸渍法将重组根癌农杆菌(recombinant tumefaciens)X用于转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥以获得T1代种子；通过使用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选T1代种子，并且之后栽培并且收获显示出对卡那霉素的抗性的幼苗以获得T2代种子；通过使用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选T2代种子，选择显示出3:1的卡那霉素抗性分离比的卡那霉素抗性幼苗作为T2代转化的ZmNAC111拟南芥。
提取T2代转化的ZmNAC111拟南芥的RNA并且反转录以获得作为模板的cDNA。之后使用特异性引物F1和R1对基因ZmNAC111的cDNA进行PCR扩增，其中拟南芥的Actin2的基因是内部参考并且引物是FC和RC。
上述引物的序列如下：
F1：5’-ATGCCGAGAAGCGGCGGCG-3’(SEQ ID NO.29)；
R1：5’-CTACTGCATCCCGATGTGGC-3’(SEQ ID NO.30)；
FC1：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.31)；
RC1：5’-GCATCAATTCGATCACTCAGAG-3’(SEQ ID NO.32)。
由此得到1428bp阳性T2代转化的ZmNAC111拟南芥。
收获阳性T2代转化的ZmNAC111拟南芥以获得T3转化的ZmNAC111拟南芥种子，其之后通过使用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选以获得3个纯合T3转化的ZmNAC111拟南芥品种，其分别命名为TL1、TL2和TL3，并且这些品种不提供卡那霉素抗性分离。
应用类似的方法以使用重组农杆菌CK通过花蕾浸渍法转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥。基于以上筛选方法，得到不提供卡那霉素抗性分离的纯合T3转化的空载体拟南芥并且命名为CK或VC(空载体)。
T1代表示将一般代转化而得到的种子以及由所述种子生长的植物；T2代表示将T1转化而得到的种子以及由所述种子生长的植物；T3代表示将T2转化而得到的种子以及由所述种子生长的植物。
上述花蕾浸渍的具体操作如下：
将重组农杆菌X或CK接种在含有50mg/L卡那霉素和5mg/L四环素的LB液体培养基中，并且在28℃在振荡下温育，直到OD600达到0.8。之后将混合物以25℃、5000rpm离心2分钟以移除上清液。用重悬溶液(溶剂是水，并且蔗糖和silwet77的溶质的浓度分别是50g/L和0.02％(体积百分比))将叶状体(thallus)重悬，以得到浸渍溶液。用浸渍溶液借助移液管点植物的花蕾和生长点并且用薄膜覆盖。在将植物的花蕾和生长点润湿2天之后，它们之后在正常条件下生长2天以收获种子。
提取以上产物——T3转化的ZmNAC111拟南芥品种(TL1-TL3)。得到T3转化的空载体拟南芥(CK或VC)的总RNA并且反转录以获得cDNA，cDNA充当模板。利用特异性引物F1和R1对基因ZmNAC111的cDNA进行PCR扩增，其中拟南芥的Actin2的基因是内部参考并且引物是FC和RC。
PCR扩增产物的电泳结果在图15b中示出，其中所有T3转化的ZmNAC111拟南芥品种都可以扩增靶标片段1428bp并且CK(VC)植物不表达靶基因ZmNAC111。这表明，可以在T3转化的ZmNAC111拟南芥中表达ZmNAC111，并且表达的量非常高。
转化的ZmNAC111拟南芥的耐旱表型分析
获得以下7日龄幼苗的植物：T3转化的ZmNAC111拟南芥品种(TL1-TL3或OE6、OE7、OE8)，野生型拟南芥(CK或VC)和T3转化的空载体拟南芥(CK或VC)。将这些植物转移至含有100g营养土壤的碗并且使其在正常条件下生长25天。之后，对这些植物进行干旱处理(即停止浇水)。14天后，关于植物的表型存在明显差异，即CK/VC品种莲座叶严重干燥，而TL1-TL3品种的莲座叶严重萎蔫，之后将这些植物重新浇水。在重新浇水6天之后，得到每个品种中的每个植物的存活率的统计数据(将正常生长并且可以被收获的植物定义为存活植物；将无法正常生长并且不能被收获的、以及被干旱严重影响的植物定义为死亡植物；存活率是在每个品种中存活植物的数量除以植物的总数量的百分比)。将实验重复3次。在每个重复的实验中，在每个品种中具有不少于30个植物，并且对于统计学分析来说，评价平均值。
结果在表2和图15中示出。在干旱处理之后，T3转化的ZmNAC111拟南芥品种(TL1-TL3)的存活率高于野生型拟南芥的存活率。
T3转化的空载体拟南芥(CK或VC)的结果与野生型拟南芥的结果不具有明显差异。
表2.在干旱处理之后转化的ZmNAC111拟南芥的存活率(％)结果
品种 重复1 重复2 重复3 平均值±S.D.
TL1(OE6) 100 75.00 96.88 90.62±8.62**
TL2(OE7) 87.55 87.55 78.12 84.38±5.41**
TL3(OE8) 75.02 90.63 90.00 85.42±4.02**
CK 25.00 33.33 25.00 27.78±4.81
注释：*表示与CK结果相比p<0.05的统计学上显著；**表示与CK结果相比p<0.01的统计学上极显著；
在转基因拟南芥中的ABA敏感度。
平行生长并且收获VC和35S:ZmNAC111转基因植物。将从这些植物得到的种子种植在含有1％蔗糖的1/2×MS平板上并且补充或不补充不同浓度的ABA(0、0.5和1μM ABA)。将平板在4℃在暗处冷却5天以分层，并且以16h光/8h暗的循环移动至22℃。在萌发之后第3天对萌发(根出现)进行评分，并且进行三次重复测定。
如之前描述的，进行气孔开度测定[67]。简而言之，莲座叶剥落并且漂浮在气孔张开溶液(10mM MES-Tris，pH 6.15，100μM CaCl2，和10mM KCl)中2小时，并且之后转移至补充有多种浓度的ABA(0、0.1、1和10μM)的溶液中额外2小时。随后，将每个叶片的背轴表面涂覆至3M透明胶带，以剥离表皮层。使用Image J软件对气孔开度进行成像和测量。在每个实验中分析四十五个气孔开度并且报告值表示平均值±s.d.。
结果在图15f和e中示出，其中15e示出了关于表型的结果，并且15f示出了气孔开度程度的统计学结果。在0μM ABA的气孔张开溶液中，T3转化的ZmNAC111拟南芥和野生型拟南芥叶片的气孔开度不具有明显差异。然而，随着ABA的浓度增加，野生型植物的气孔开度没有明显变化，而T3转化的ZmNAC111拟南芥的气孔开度明显减小。这个结果显示，在ABA的诱导下，在T3转化的ZmNAC111拟南芥中的气孔关闭明显比野生型植物的气孔关闭快。在T3转化的空载体和野生型拟南芥之间没有明显差异。因此，ZmNAC111促进在ABA胁迫下的孔闭合。
转基因玉米的产生和分析。
总而言之，由B73扩增ZmNac111的编码区，并且在Zmubi1启动子的控制下将序列确认的PCR片段***至pSBII载体中。之后将pSBI质粒***至LBA4404根癌农杆菌品种中。之后使用具有整合pSBIII质粒的LBA4404品种将Zmubi1:ZmNAC111表达盒传递至如描述的A188玉米自交系中68。转基因T0、T1和T2植物在温室中在16h光/8h暗的条件下生长。在每一代中通过对转基因的PCR分析来确定转基因阳性和同胞转基因阴性(WT)植物。通过qRT-PCR确定在转基因植物中的ZmNac111的表达。选择三个独立的T2品系ZmNAC111-OE1、ZmNAC111-OE3、和ZmNAC111-OE7用于进一步分析。
更详细地，重组根癌农杆菌Y通过由农杆菌介导的基因转化方法将玉米自交系A188转化以获得在温室(16小时光照/6小时暗)中生长的T0代植物。
提取T2转化的ZmNAC111玉米植物的RNA并且反转录以获得cDNA。使用特异性引物F2和R2对基因ZmNAC111的cDNA进行PCR鉴别。
上述引物的序列如下：
F2：5’-CTACTATGACGACGACAACT-3’(SEQ ID NO.33)；
R2：5’-CACTCGCTTCCTCTTGTT-3’(SEQ ID NO.34)；
得到1125bp阳性T0代转化的ZmNAC111玉米。
在阳性T0代转化的ZmNAC111玉米自体受精之后，得到T1代种子。在使用相同的对T1植物实施PCR鉴别的方法之后，得到阳性植物。在自体受精之后，得到T2种子。
提取T2转化的ZmNAC111玉米的RNA并且反转录以获得cDNA。利用特异性引物F2和R2对基因ZmNAC111的cDNA进行qPCR量化，其中使用玉米基因Zmubi2作为内部参考并且使用野生型玉米作为对照。
上述引物的序列如下：
F2：5’-CTACTATGACGACGACAACT-3’(SEQ ID NO.33)；
R2：5’-CACTCGCTTCCTCTTGTT-3’(SEQ ID NO.34)；
FC2：5’-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3’(SEQ ID NO.35)；
RC2：5’-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3’(SEQ ID NO.36)。
结果如在图5b中所示。在T2代ZmNAC111玉米TML1(或OE1)、TML2(OE3)和TML3(OE7)中的ZmNAC111的基因表达水平比野生型玉米的基因表达水平高。这表明T2代ZmNAC111玉米TML1、TML2和TML3是阳性转基因玉米。
以上T0代表示通过将当前世代转化而得到的植物；T1代表示通过T0代的自体受精产生的种子和由种子生长的植物；T2代表示通过T1代的自体受精产生的种子和由种子生长的植物；
通过上述农杆菌介导的遗传转化方法的具体操作如下：
将重组根癌农杆菌Y接种在含有25mg/L奇霉素(spectinomycin)的YEB液体培养基中并且在28℃在振荡的情况下温育，直到其OD600变为0.5。将玉米幼胚放置在填充有保存液的2mL离心管中并且在46℃下进行热处理3分钟，接着以4℃和2000rpm离心10分钟。然后在处理之后将制备的重组农杆菌加入至幼胚中，在暗处在22℃下温育3天，并且之后转移至新培养基以在暗处在28℃温育7至10天。通过用在不同浓度的草丁膦筛选，最终将其转移至差异培养基(differential medium)并且随后转移至用于栽培的生根培养基。一旦植物生长至某一尺寸，即将其转移至具有营养物质的土壤。
重组根癌农杆菌CK1利用由农杆菌介导的遗传转化方法将玉米自交系A188转化，并且进行栽培，直到获得T2代转化的空载体玉米。
将转基因阳性(通过基于转基因的PCR分析单独基因分型)和WT植物并排种植在肥沃土壤(土壤与蛭石的比率为1:1)中。通过停水将干旱处理应用于在3叶幼苗阶段的土壤栽培的植物。在大约20天之后，恢复浇水以使植物恢复。七天之后记录存活的植物的数量。在每个试验中对每个品系的至少15个植物进行比较，并且统计学分析基于从三个独立实验得到的数据。在幼苗的充分消耗的叶片上，在3叶阶段，使用LICOR-6400CO2气体交换分析仪(LICOR-6400,Lincoln,NE)，测量T2转基因和WT植物的气孔导度、光合速率和蒸腾速率。在开始停水之后，每隔一天记录SWC。统计学分析基于从每个植物品系的七个幼苗得到的数据并且实验重复两次。
结果在表3以及图5c和5d中示出。与在野生型玉米中的叶片干燥相比，在T2代转化的ZmNAC111玉米中的叶片干燥较不严重。对于存活率统计数据来说，T2代转化的ZmNAC111玉米的存活率比野生型玉米的存活率高。在T2代转化的空载体玉米的结果和野生型玉米的结果之间没有明显差异。
表3.在干旱处理之后转化的ZmNAC111玉米的存活率(％)结果。
注释：*表示与WT结果相比p<0.05的统计学上显著；**表示与WT结果相比p<0.01的统计学上极显著。
因此，ZmNAC111可以提高玉米的耐旱性。
针对转化的ZmNAC111玉米的光合作用分析
利用Li6400便携式光合作用***(LICOR-6400,Lincoln,NE)测量净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)。在第三叶阶段中，对T2代转化的ZmNAC111玉米品种(TML1-TML3(OE1、OE3、OE7))和野生型玉米植物(WT)的第三个展开的叶进行测量并且进行不浇水的处理，之后每两天测量一次。记录土壤中的相应水含量。在每个转化时间内随机测量7个植物并且将测量重复2次。测量结果以平均值表示。
结果在图5e至h中示出，并且分别是光合速率、气孔导度、蒸腾速率和水分利用效率的统计学结果。与野生型玉米相比，T2代转化的ZmNAC111玉米的光合速率、气孔导度和蒸腾速率在干旱处理下降低，所述干旱处理进一步增加水分利用效率并且引起存活率的明显增加。
转基因玉米的RNA-seq分析。
对于玉米RNA-seq分析来说，在洁净工作台上进行2小时脱水之前或之后，从转基因和WT植物中收集来自三个八日龄玉米幼苗的汇集的组织，以进行RNA-seq分析。使用TRIZOL试剂(Biotopped)分离总RNA并且使用Bioanalyzer 2100(Agilent)评价RNA完整性。在贝瑞基因(Berry Genomics,北京)进行100-bp配对末端Illumina测序。对于每个样品生成平均3gigabase的原始数据。使用Strand NGS 2.0软件确定差异基因表达。鉴别总计31,501个基因，相当于玉米中所有预测的基因的～79％。使用DAVID软件程序69(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行生物途径的基因本体(GOBP)的富集分析，以计算代表由基因表示的每个GOBP的显著性的P值。将具有P<0.01的GOBP鉴别为富集过程。进行待确定对耐旱性关键的所选择的基因的qRT-PCR，以确认RNA-seq数据。
转化的ZmNAC111拟南芥的RNA-seq分析
获得以下20日龄的植物：转化的ZmNAC111拟南芥品种(TL1-TL3)和T3转化的空载体拟南芥品种(CK)。分别对它们进行干燥0小时和1hr，其中每个品种具有至少10个幼苗。通过TRIZOL(Biotopped)方法分离总RNA并且通过使用Nanodrop1000(Thermo Scientific产品,美国)测量浓度。之后，将总RNA发送至北京的贝瑞基因公司(BerryGenomicCorporation)，从而以3GB的测序深度进行转录组分析(profiling)。最后，利用Strand NGS2.0软件评价数据。
核苷酸多样性和针对中性的试验。
在42个类蜀黍添加物中对ZmNac111的基因组区域进行扩增和测序。使用DnaSP版本5.070计算核苷酸多样性(π)和Tajima D统计数据。
进化树构建。
使用Clustal X 1.83程序利用默认参数对在玉米、水稻、拟南芥、和高粱中鉴别的55个NAC TF编码基因的全长氨基酸序列进行比对。基于该比对结果，使用MEGA版本5中的邻接(neighbor joining,NJ)方法，利用以下参数构建进化树：泊松校正、成对缺失、均匀速率和bootstrap(1000个重复)。
反式激活活性测定。
将来自十个玉米自交系的ZmNac111的cDNA单独克隆至pGBKT7载体中以用于评价在AH109酵母菌株中的蛋白反式激活活性。将酵母转化体的细胞浓度调节至0.1的OD600，并且之后接种在多个选择平板(SD/-T、SD/-T-H、SD/-T-H-A)上，以比较它们的存活。将平板在30℃下温育2-5天，之后拍照。在该研究中使用的所有引物在图18中列出。
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序列信息
SEQ ID NO:1：ZmNac111核酸序列(基因组)
AAAAATTTCAATGCCTCTCTAGATCTTTCAAGCTATCCTTGCTTCCTAGCTCCCTTTGGCGTGCTGTACCGGACGACAGGGGTAGGTAGGTAGGTAGGTGTAGCTAGCTCGGCGAGCGAGGGAGCAATCCGGCCAACAGCACACGCGTCGATCGCCATGCCGAGAAGCGGCGGCGGCGGCAATGGCGGTGGCATTAGTAGTAGTAGTAGGGTGATGCCCAACCTCCCGGCCGGGTTCCGCTTCCACCCCACGGACGAGGAGCTCATGGTGCACTACCTCATGAGGCAGGCCGCCTCCATGCCGTGCCCCGTCCCCATCATCGCCGAGGTCAACATCTACCAGTGCAACCCCTGGGATCTCCCTGGTACGTGATTCTTTATTTCTTTCTTCCCTCTCTTATTCGTTCATTGTCACTTGAGTTGAGTCGTTCAGACTAGTTGTGTTATTCCTAGCTAATCCAAATCTGCACCCAGTTGAATCTCATATGATTTAATTATTCTTTCTTCCTCCTGTGGTATCGTGTTCGTTCTTCAGCCAAGGCATTGTTCGGCGACAAGGAGTGGTTTTTCTTCAGCCCCCGGGACCGCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCGCCGCCGGGTCCGGGTACTGGAAGGCCACCGGCACCGACAAGGCCATCCTGTCGTCGTCCACGCCCACGAGCCACGGCGGCGCCAACATCGTCGTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGGCGGCAGGCCGCCCAAGGGCACCAAGACGGACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCTCGGGCGCGGCGGACGACGACTGCAAGGGCAGCACCAGGCGCAGAGTGTCTTCCTCCTCGTCGTCCTCCATGAGGGTGAGTGAGACTTTCTTTTTCTTTTTCTTCTTTTTTTTTTAATTGCACTTGCTTGCACGGCTCCAGACCTGACTGAAGCGTTTCGCATGGTTTCAGCTGGACGACTGGGTGCTGTGCAGGATCCACAAGAAGAGCAACGATTTCCAGTTGTCGTCGTCGTCGGAGCATGAGCACGAGCAGGAGGAGCCGGCGGCGGGCGGCTCAGCGACGACTGTGGAGGAACTAGACGCTCTCGTCGTCGTCGACAACAGCAGCAGCAGCGACACCACCACCACCACCATCACCACCAACGACAACAACTCTACTGAAACAGCTGCGACTCATCACGATCCTCAGACGATGATGATGCTGAGCAAGTCGTGCTCGCTCACCGACCTCCTCGACAGCATCGACTACGCGGCGCTCTCCTCGCAGATGCTCCTCCTCGACGCGCCCCACCCCCACGCTGATGACCCGCCGCCACACATGGTCTACTACCCACCGGCGGCGTCGGCGACGCACCAGCAAGCAATAATAGCTAATAACACCAACAGTAATGACGACTACTATGACGACGACAACTTGTTGCCGACTGCTGCTGCTACTGCGGTAGACGCGGCGGCGGCGGCGGTGCTACTCAGCTCGTCGCCTGCAGACACCAACGGTGTGAACAAGAGGAAGCGAGTGACGGCCGTGGACTACTACGGCGCCGCTGAACCGCCGACCTTCTTCCACCACCACCTCGATGATGGCGGCAACAGCTTCTTCAGTACGACCAAGAAGCTCAAGCCGCCGCCGCCAAGTGATTCGAGGCATGGCGGCCATTTCGGCACCGCCACAGCGAGCAGCTACCGCGACAGCCAGCAGCTCGTGGACAGCGCGAGCAGCAGCGGCGTCTTCTTCCATCAGTATGGGTACGGCTACAGCAGCAGCAACCCGTTCTTGAACTTGAACCAGCAGCAGCAGCTGCTACTCAACAGCCACATCGGGATGCAGTAGAGCTCGAGAGATCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATGATATATCATTGGAAGGATCAGCACGCGTACGTGCAGATTAATTGCAGCGAGTTCTATCTTGTTTGCTTTCATTATTATATACTCCGTATGTGTCGTTCATGTAAAATTAGTTTAAATTGTAAATTAGTGTGCTGAAATTCATGTGCCTGCTCTCTGCTCATCAATGAATGGATGATGACGACCCATGCACGTTGCTTGTGTGG
SEQ ID NO:2：GRMZM2G127379(ZmNAC111)；核酸序列(编码序列)
ATGCCGAGAAGCGGCGGCGGCGGCAATGGCGGTGGCATTAGTAGTAGTAGTAGGGTGATGCCCAACCTCCCGGCCGGGTTCCGCTTCCACCCCACGGACGAGGAGCTCATGGTGCACTACCTCATGAGGCAGGCCGCCTCCATGCCGTGCCCCGTCCCCATCATCGCCGAGGTCAACATCTACCAGTGCAACCCCTGGGATCTCCCTGCCAAGGCATTGTTCGGCGACAAGGAGTGGTTTTTCTTCAGCCCCCGGGACCGCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCGCCGCCGGGTCCGGGTACTGGAAGGCCACCGGCACCGACAAGGCCATCCTGTCGTCGTCCACGCCCACGAGCCACGGCGGCGCCAACATCGTCGTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGGCGGCAGGCCGCCCAAGGGCACCAAGACGGACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCTCGGGCGCGGCGGACGACGACTGCAAGGGCAGCACCAGGCGCAGAGTGTCTTCCTCCTCGTCGTCCTCCATGAGGCTGGACGACTGGGTGCTGTGCAGGATCCACAAGAAGAGCAACGATTTCCAGTTGTCGTCGTCGTCGGAGCATGAGCACGAGCAGGAGGAGCCGGCGGCGGGCGGCTCAGCGACGACTGTGGAGGAACTAGACGCTCTCGTCGTCGTCGACAACAGCAGCAGCAGCGACACCACCACCACCACCATCACCACCAACGACAACAACTCTACTGAAACAGCTGCGACTCATCACGATCCTCAGACGATGATGATGCTGAGCAAGTCGTGCTCGCTCACCGACCTCCTCGACAGCATCGACTACGCGGCGCTCTCCTCGCAGATGCTCCTCCTCGACGCGCCCCACCCCCACGCTGATGACCCGCCGCCACACATGGTCTACTACCCACCGGCGGCGTCGGCGACGCACCAGCAAGCAATAATAGCTAATAACACCAACAGTAATGACGACTACTATGACGACGACAACTTGTTGCCGACTGCTGCTGCTACTGCGGTAGACGCGGCGGCGGCGGCGGTGCTACTCAGCTCGTCGCCTGCAGACACCAACGGTGTGAACAAGAGGAAGCGAGTGACGGCCGTGGACTACTACGGCGCCGCTGAACCGCCGACCTTCTTCCACCACCACCTCGATGATGGCGGCAACAGCTTCTTCAGTACGACCAAGAAGCTCAAGCCGCCGCCGCCAAGTGATTCGAGGCATGGCGGCCATTTCGGCACCGCCACAGCGAGCAGCTACCGCGACAGCCAGCAGCTCGTGGACAGCGCGAGCAGCAGCGGCGTCTTCTTCCATCAGTATGGGTACGGCTACAGCAGCAGCAACCCGTTCTTGAACTTGAACCAGCAGCAGCAGCTGCTACTCAACAGCCACATCGGGATGCAGTAG
SEQ ID NO:3：ZmNac111核酸序列(cDNA)
AAAAATTTCAATGCCTCTCTAGATCTTTCAAGCTATCCTTGCTTCCTAGCTCCCTTTGGCGTGCTGTACCGGACGACAGGGGTAGGTAGGTAGGTAGGTG
TAGCTAGCTCGGCGAGCGAGGGAGCAATCCGGCCAACAGCACACGCGTCGATCGCCATGCCGAGAAGCGGCGGCGGCGGCAATGGCGGTGGCATTAGTAG
TAGTAGTAGGGTGATGCCCAACCTCCCGGCCGGGTTCCGCTTCCACCCCACGGACGAGGAGCTCATGGTGCACTACCTCATGAGGCAGGCCGCCTCCATG
CCGTGCCCCGTCCCCATCATCGCCGAGGTCAACATCTACCAGTGCAACCCCTGGGATCTCCCTGCCAAGGCATTGTTCGGCGACAAGGAGTGGTTTTTCT
TCAGCCCCCGGGACCGCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCGCCGCCGGGTCCGGGTACTGGAAGGCCACCGGCACCGACAAGGCCATCCTGTC
GTCGTCCACGCCCACGAGCCACGGCGGCGCCAACATCGTCGTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGGCGGCAGGCCGCCCAAGGGCACCAAGACG
GACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCTCGGGCGCGGCGGACGACGACTGCAAGGGCAGCACCAGGCGCAGAGTGTCTTCCTCCTCGTCGTCCTCCATGA
GGCTGGACGACTGGGTGCTGTGCAGGATCCACAAGAAGAGCAACGATTTCCAGTTGTCGTCGTCGTCGGAGCATGAGCACGAGCAGGAGGAGCCGGCGGC
GGGCGGCTCAGCGACGACTGTGGAGGAACTAGACGCTCTCGTCGTCGTCGACAACAGCAGCAGCAGCGACACCACCACCACCACCATCACCACCAACGAC
AACAACTCTACTGAAACAGCTGCGACTCATCACGATCCTCAGACGATGATGATGCTGAGCAAGTCGTGCTCGCTCACCGACCTCCTCGACAGCATCGACT
ACGCGGCGCTCTCCTCGCAGATGCTCCTCCTCGACGCGCCCCACCCCCACGCTGATGACCCGCCGCCACACATGGTCTACTACCCACCGGCGGCGTCGGC
GACGCACCAGCAAGCAATAATAGCTAATAACACCAACAGTAATGACGACTACTATGACGACGACAACTTGTTGCCGACTGCTGCTGCTACTGCGGTAGAC
GCGGCGGCGGCGGCGGTGCTACTCAGCTCGTCGCCTGCAGACACCAACGGTGTGAACAAGAGGAAGCGAGTGACGGCCGTGGACTACTACGGCGCCGCTG
AACCGCCGACCTTCTTCCACCACCACCTCGATGATGGCGGCAACAGCTTCTTCAGTACGACCAAGAAGCTCAAGCCGCCGCCGCCAAGTGATTCGAGGCA
TGGCGGCCATTTCGGCACCGCCACAGCGAGCAGCTACCGCGACAGCCAGCAGCTCGTGGACAGCGCGAGCAGCAGCGGCGTCTTCTTCCATCAGTATGGG
TACGGCTACAGCAGCAGCAACCCGTTCTTGAACTTGAACCAGCAGCAGCAGCTGCTACTCAACAGCCACATCGGGATGCAGTAGAGCTCGAGAGATCGAG
AGAGAGAGAGAGAGAGAGATGATATATCATTGGAAGGATCAGCACGCGTACGTGCAGATTAATTGCAGCGAGTTCTATCTTGTTTGCTTTCATTATTATA
TACTCCGTATGTGTCGTTCATGTAAAATTAGTTTAAATTGTAAATTAGTGTGCTGAAATTCATGTGCCTGCTCTCTGCTCATCAATGAATGGATGATGAC
GACCCATGCACGTTGCTTGTGTGG
SEQ ID NO:4GRMZM2G127379(ZmNAC111)；蛋白
MPRSGGGGNGGGISSSSRVMPNLPAGFRFHPTDEELMVHYLMRQAASMPCPVPIIAEVNIYQCNPWDLPAKALFGDKEWFFFSPRDRKYPNGARPNRAAGSGYWKATGTDKAILSSSTPTSHGGANIVVGVKKALVFYGGRPPKGTKTDWIMHEYRLSGAADDDCKGSTRRRVSSSSSSSMRLDDWVLCRIHKKSNDFQLSSSSEHEHEQEEPAAGGSATTVEELDALVVVDNSSSSDTTTTTITTNDNNSTETAATHHDPQTMMMLSKSCSLTDLLDSIDYAALSSQMLLLDAPHPHADDPPPHMVYYPPAASATHQQAIIANNTNSNDDYYDDDNLLPTAAATAVDAAAAAVLLSSSPADTNGVNKRKRVTAVDYYGAAEPPTFFHHHLDDGGNSFFSTTKKLKPPPPSDSRHGGHFGTATASSYRDSQQLVDSASSSGVFFHQYGYGYSSSNPFLNLNQQQQLLLNSHIGMQ
SEQ ID NO:5水稻(Oryza sativa)；LOC_Os11g03300
ATGCCGAGCAGCGGCGGCGCCATGCCTGCCCTTCCACCAGGCTTCCGCTTCCACCCCACCGACGAGGAGCTCATCGTTCACTACCTCATGAACCAGGCCGCCTCCGTCAAGTGCCCCGTGCCAATCATCGCCGAGGTCAACATCTACAAGTGCAACCCATGGGACCTTCCTGGTAAGGCTTTGTTCGGCGAGAACGAATGGTACTTCTTCAGCCCGAGGGACCGCAAGTACCCCAACGGCGCTCGCCCCAACCGCGCCGCCGGCTCGGGGTACTGGAAGGCCACCGGCACCGACAAGTCCATCCTCTCCACTCCGACCAGCGACAACATCGGCGTCAAGAAGGCCCTCGTCTTCTACAAGGGCAAGCCTCCCAAGGGCGTCAAGACCGACTGGATCATGCACGAGTACCGTCTCACCGGCACATCAGCTAACAGCACCACCACCACAAAGCAGCGTAGAGCGTCATCCATGACCATGAGGCTGGACGACTGGGTGCTGTGCAGAATCCACAAGAAGAGCAACGACTTCAATTCCTCTGACCAACACGACCAAGAACCCGAGGAATCAACCGTCGAACAGCTTGAAGACATCCATGACAACAACTCCTCTGAACAACCTCCAGCTCCAGCTGACATGAACAACCAACAGTCAGATTTCCAGCCCATGACGGCGATGAGCATGAGCAAGTCATGCTCCCTCACCGATCTCCTCAACACCATCGACTGCGCCGCGCTCTCGCAGTTTCTCCTCGACGGCTCATCCGACGCCATCGCTGAGCCTCCTGCTCCTCCCAGCCCCCTAATATACACAACACCTCATCCAAATTACCAAACACTAAACTATAACATTAACAGCAACAGCAGCATGCCACACGCCTTCGAGTCACGCCTAGATCATCACGATGGTTACGTTAACAATTATAATGTTAATGGCCTGAGGAGGAAGAGAATGATGGCGTGTAGTGCAACTTCCTTTGATGATGGCAGCAGCAGCAATGACTTTGTGCATGCCGTTGTCAAGAAACCGCAGCTGCTGCCAAGTGATTCGAGGGGTAGTGGTTTTGGAGGAGGTTACTGCAACCAGCAGCTTTCAGAGACTGCGACTGGCTTTCAGTTTCAGAACGGCAATCTGCTGAGCCATCCATTTCCTCTGAACAATCATCTGCAGATGCAGTAG
SEQ ID NO:6；水稻(Oryza sativa)；LOC_Os11g03300
MPSSGGAMPALPPGFRFHPTDEELIVHYLMNQAASVKCPVPIIAEVNIYKCNPWDLPGKALFGENEWYFFSPRDRKYPNGARPNRAAGSGYWKATGTDKSILSTPTSDNIGVKKALVFYKGKPPKGVKTDWIMHEYRLTGTSANSTTTTKQRRASSMTMRLDDWVLCRIHKKSNDFNSSDQHDQEPEESTVEQLEDIHDNNSSEQPPAPADMNNQQSDFQPMTAMSMSKSCSLTDLLNTIDCAALSQFLLDGSSDAIAEPPAPPSPLIYTTPHPNYQTLNYNINSNSSMPHAFESRLDHHDGYVNNYNVNGLRRKRMMACSATSFDDGSSSNDFVHAVVKKPQLLPSDSRGSGFGGGYCNQQLSETATGFQFQNGNLLSHPFPLNNHLQMQ
SEQ ID NO:7：大豆(Glycine max)；Glyma.13G279900
ATGGGAGTTCCAGAGAAAGACCCTCTTTCCCAATTGAGTTTGCCTCCTGGTTTTCGGTTTTACCCCACCGACGAGGAGCTTCTCGTTCAGTATCTGTGCC
GCAAGGTCGCTGGCCACCATTTCTCTCTTCCAATCATTGCCGAAATTGACTTGTACAAGTTCGACCCATGGGTTCTTCCAAGTAAAGCGATTTTCGGTGA
AAAAGAGTGGTACTTTTTCAGCCCCAGAGACAGGAAATACCCGAACGGGTCTCGACCCAACAGAGTAGCTGGGTCGGGTTATTGGAAAGCCACCGGAACC
GACAAGATCATCACCACCGAAGGTAGAAAAGTTGGCATAAAAAAAGCCCTCGTTTTCTACGTTGGCAAAGCCCCCAAGGGCACCAAAACCAATTGGATCA
TGCACGAGTATCGCCTCCTCGACTCTTCCCGAAAGAACACTGGCACCAAGCTTGATGATTGGGTTCTGTGTCGTATATACAAGAAGAACTCGAGTGCACA
GAAGACGGCGCAAAACGGCGTGGTTCCGAGCAACGAGCACACTCAATACAGCAACGGTTCCTCTTCTTCTTCTTCGTCCCAGCTGGAGGACGTTCTGGAA
TCTCTGCCATCGATTGATGAAAGGTGTTTCGCGATGCCACGCGTCAACACGCTGCAACAACAACAGCACCACGAGGAGAAGGTCAATGTTCAGAACTTGG
GTGCAGGGGGTTTAATGGATTGGACCAACCCTTCGGTTCTGAATTCGGTCGCCGATTTCGCTTCGGGGAATAATCAAGTGGTACAGGACCAGACTCAGGG
GATGGTGAACTACAACTGCAATGACCTTTATGTCCCTACGTTATGCCACTTGGACTCATCGGTTCCGTTAAAGATGGAGGAAGAGGTGCAAAGCGGCGTG
AGAAACCAACGGGTCGGGAATAATAATTCGTGGTTTCTTCAGAATGATTTCACACAGGGGTTTCAGAATTCGGTTGACACGTGTGGGTTTAAATACCCGG
TTCAGCCGGTCGGGTTCGGGTTCAGAAATTGA
SEQ ID NO:8：大豆(Glycine max)；Glyma.13G279900
MGVPEKDPLSQLSLPPGFRFYPTDEELLVQYLCRKVAGHHFSLPIIAEIDLYKFDPWVLPSKAIFGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRVAGSGYWKATGTDKIITTEGRKVGIKKALVFYVGKAPKGTKTNWIMHEYRLLDSSRKNTGTKLDDWVLCRIYKKNSSAQKTAQNGVVPSNEHTQYSNGSSSSSSSQLEDVLESLPSIDERCFAMPRVNTLQQQQHHEEKVNVQNLGAGGLMDWTNPSVLNSVADFASGNNQVVQDQTQGMVNYNCNDLYVPTLCHLDSSVPLKMEEEVQSGVRNQRVGNNNSWFLQNDFTQGFQNSVDTCGFKYPVQPVGFGFRN
SEQ ID NO:9：双色高粱(Sorghum bicolor)；Sb08g001940
ATGGCGAGTGGTGGCGGCAGTAGCAGTAGAGTGCCCGGCGGCGGTGGCAACCTGAACCTCCCAGCTGGGTTCCGGTTCCACCCCACTGACGAGGAGCTGATCGTGCACTACCTCATGAACCAGGCCGCCTCCATTCCGTGCCCTGTCCCCATCATCGCCGAGGTCAACATCTACCAGTGCAACCCCTGGGATCTCCCTGCAAAAGCATTGTTTGGCGAGAACGAGTGGTACTTCTTCAGCCCACGAGACCGCAAGTACCCCAATGGCGTCCGCCCCAACCGCGCCGCCGGGTCAGGGTACTGGAAGGCCACCGGCACCGACAAGGCCATCCTGTCCACGCCGACGAGCCAGAACATCGGCGTCAAGAAGGCCCTCGTCTTCTACGGCGGCAGGCCTCCCAAGGGCGTCAAGACCGACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCACCGGCGGCACGACCGCCGCAGCGGCCGATGACAAGAACAGCAGCATCAAACGCAGATCAGGGTCCTCCATGAGGCTGGACGACTGGGTGCTGTGCAGGATCCACAAGAAGAGCAACGATTTCCAGTTGTCGGACCAGGAGCAGGAGAAGGAGGGCTCAACCGTGGAGGAATTAGACACTCTTGCCAACACCACCAACACCGACAACAGCATGAACGACTCTACTGAAACAACAACTCTTGGTCATCATGACCAGCTCCGTCATGAAACGGCGGCCATGACGACGATGAGCAAGTCGTGCTCGCTCACCGACCTCCTCAACAGCATCGACTACGCGTCGCTCTCGCAGATGTTCCTTGACATCCCTGCCGAGGCCGAGGAGCCTGCACAACAGCAAAGCACTCCACTAATCTACCCACCAGCAACACAAACAACACACCAAGCAGCACTTACTAGTAATAATAACTATGACAACAACGTGATGAACAACAGCAACTTGCCGATTGCTGCAGTAGACGCAGTGATAGCAGGCTCGGATAACAGCGGTGTGAAGAAGAGGAATAAGAGAGTGATGGCCGTGGACGGCGCCGCCGCTGAATCGTGCTTCGATGATGGCAGCAGCGACAGTTTCAGTAGCAAGAAACTGAAGCTGCCAAGTGATTCGAGGATCGCCGGCCATTTCGGCACCACAGCAAGCAGCTACTACTACTGCAACAACCAGCTGCAGCTTGTGGACAGCGCGATGAGTAGTGGCTTTCATCAGTACAGCAGCCTGTTGCTGAGCAGCAGCAATCCGTTCTTGAGCCAGCAGCAGCAGCTGCTACTCAACAGCCACATCGGGATGCAGTAG
SEQ ID NO:10：双色高粱(Sorghum bicolor)；Sb08g001940
MASGGGSSSRVPGGGGNLNLPAGFRFHPTDEELIVHYLMNQAASIPCPVPIIAEVNIYQCNPWDLPAKALFGENEWYFFSPRDRKYPNGVRPNRAAGSGYWKATGTDKAILSTPTSQNIGVKKALVFYGGRPPKGVKTDWIMHEYRLTGGTTAAAADDKNSSIKRRSGSSMRLDDWVLCRIHKKSNDFQLSDQEQEKEGSTVEELDTLANTTNTDNSMNDSTETTTLGHHDQLRHETAAMTTMSKSCSLTDLLNSIDYASLSQMFLDIPAEAEEPAQQQSTPLIYPPATQTTHQAALTSNNNYDNNVMNNSNLPIAAVDAVIAGSDNSGVKKRNKRVMAVDGAAAESCFDDGSSDSFSSKKLKLPSDSRIAGHFGTTASSYYYCNNQLQLVDSAMSSGFHQYSSLLLSSSNPFLSQQQQLLLNSHIGMQ
SEQ ID NO:11：雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)；Gorai.011G030600
TTCAGATTCCATCCTACTGATGAAGAGCTTATCATTCATTATCTAAACCAGAAGGTTTTCCCTTCCTCCAATCATCACCTAATGTTCTCCATTATAGCTGATGTTAATATCTACAAGTTCAATCCATGGGAACTTCCTGATAAGGCTTTATTTGGTGAGAACGAGTGGTTTTTCTTTAGTCCAAGAGAAAGGAAGTATCCAAACGGAACACGCCCGAACCGAGCAGCGGCATCGGGATACTGGAAGGCTACCGGGACCGATAAACCGATCATCGCTTCTGTTGGTTCACAATGCCTTGGAATGAAGAAAGCTTTAGTGTTTTACAAAGGACGTCCTCCTAAAGGTGTAAAAACCGATTGGATGATGATTGAATATAGACTGCTCGATGATTGCTTTGTATCTCAAAGACCTAAAGGATCAATGCAATTGGATGATTGGGTTCTATGCCGAGTTAGTCACAAAGGCAAAGCTCCATTGGCTGGTGGGTACTTACAAGGTCAAGAGATGGCAATACAAATCACCATTGGAATCAATGAATATGATCATCAGTTACCTACAATGGACCAGATGATTGGCCTTGAAAGTGAAGAGCTCGATGAAAAGGTGTTTCAAGAAGGGTCCCCAGAGTATCCTCCAACACCCATAGATACCAGTGTGAGAGAGGTGCTAAAGTCCATTGAAAGGGTACTGTCTGTTGGAGCTTTGGATGAACTGGTAATGGCTTCTTCAAGTGACGATGCTGTGTGA
SEQ ID NO:12：雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)；Gorai.011G030600
FRFHPTDEELIIHYLNQKVFPSSNHHLMFSIIADVNIYKFNPWELPDKALFGENEWFFFSPRERKYPNGTRPNRAAASGYWKATGTDKPIIASVGSQCLGMKKALVFYKGRPPKGVKTDWMMIEYRLLDDCFVSQRPKGSMQLDDWVLCRVSHKGKAPLAGGYLQGQEMAIQITIGINEYDHQLPTMDQMIGLESEELDEKVFQEGSPEYPPTPIDTSVREVLKSIERVLSVGALDELVMASSSDDAV
SEQ ID NO:13：芜菁(Brassica rapa)；Brara.E03468
ATGATAAGCAAGGATCCAAGATCAAGTTTGCCACCAGGGTTTCGATTTCATCCAACTGATGAAGAACTCATTCTCCATTACCTAAGGAAGAAGGTTTCCTCTTTACCAGTCCCGCTTTCGGTCATCGAAGATGTCGATATCTATAAATCTGATCCATGGGATTTACCAGCTAAGGCTCCCTTTGGAGAGAAAGAATGGTATTTTTTCAGTCCGAGGGACAGGAAATATCCAAACGGAGCAAGACCAAACCGAGCAGCTGCGTCAGGGTATTGGAAAGCCACCGGAACAGATAAATTAATTGCGGTACCAAACGGTGGAGTTAATGAAAACATTGGTATAAAAAAAGCTCTTGTGTTTTATAGAGGAAAGCCTCCAAAAGGTGTTAAAACCAATTGGATCATGCATGAATATCGACTTGCTGAAACCCTATCGCCCAAAAGAGTGGACCATTCGAGCGACAGCCAATTCAATAATCTTGGAGACAGGAGTTTGAAATCTAGAGAATACTCTATGAGGCTGGATGATTGGGTTCTTTGCCGGATTTACAAGAAATCACACATTTCACTGTCACCACCACATGTTGCTACTGATACAAGCAACCAAGAACATGAGGAAAATGACAAAGAACCATTCATAGTCAGCGAAACCCTCTTGCCAAATTTGGAAAACAATCAAACACTTAAACGCCAGAAGTCTTCTTTCTCGAACTTATTAGACGCTACAGATTTGACGTTCCTCACAAACTTTCTAAACGAAACTCCGGAACATCATACTGAACAAGAGTTTTCTTTCATGTTTGAAAATTTCTCAAACCCTAACATCTACGGAAACCCTTACTTGGATCAAAAGTTACCTCGGTTAAGCCCTCCTAGTTCTGAGACCAGCTTTATCGGAAACAAAAGAGAAAGAATGGATTATGCAGAAGAAACGACGAGCACTTCCAAGAAGATGATCAACAACTTTAGTTACAATATATAA
SEQ ID NO:14：芜菁(Brassica rapa)；Brara.E03468
MISKDPRSSLPPGFRFHPTDEELILHYLRKKVSSLPVPLSVIEDVDIYKSDPWDLPAKAPFGEKEWYFFSPRDRKYPNGARPNRAAASGYWKATGTDKLIAVPNGGVNENIGIKKALVFYRGKPPKGVKTNWIMHEYRLAETLSPKRVDHSSDSQFNNLGDRSLKSREYSMRLDDWVLCRIYKKSHISLSPPHVATDTSNQEHEENDKEPFIVSETLLPNLENNQTLKRQKSSFSNLLDATDLTFLTNFLNETPEHHTEQEFSFMFENFSNPNIYGNPYLDQKLPRLSPPSSETSFIGNKRERMDYAEETTSTSKKMINNFSYNI
SEQ ID NO:15：普通小麦(Triticum aestivum)；Traes_5BL_CC18CAD72
ATGCCAATGGGCAGCAGCGCCGCCATGCCCGCCCTCCCTCCCGGCTTCCGGTTCCACCCCACCGACGAGGAGCTCATCGTCCACTACCTCCGCAGGCAGGCCGCGTCCATGCCCAGCCCCGTGCCCATCATCGCCGAGGTCAACATCTACAAGTGCAACCCATGGGACCTCCCCGGCAAAGCTTTGTTCGGGGAGAATGAGTGGTACTTCTTCAGCCCCCGGGATCGCAAGTACCCCAACGGCGCGCGCCCGAACCGCGCCGCCGGGTCCGGCTACTGGAAGGCCACCGGCACCGACAAGGCCATCCTGTCCACGCCGGCCAACGAGAGCATCGGGGTCAAGAAGGCGCTCGTGTTCTACAGGGGCAAGCCGCCCAAGGGCGTCAAGACCGACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCACCGCAGCCGACAACCGGACCACCAAGCGCAGAGGATCCTCCATGAGGCTGGATGACTGGGTGCTGTGTAGGATCCACAAGAAGTGCGGCAACTTGCCCAACTTCTCCTCCTCTGACCAGGAACAGGAGCATGAGCAGGAGAGCTCCACCGTGGAGGACTCGCAGAACAACCACACCGTGTCGTCGCCCAAGTCCGAGGCCTTCGACGGCGACGGCGACGACCACCTCCAGTTGCAGCAGTTCCGCCCCATGGCGATCGCCAAGTCGTGCTCCCTCACCGACCTGCTCAACACCGTCGACTACGCCGCGCTCTCGCACCTCCTCCTCGACGGCGCCGGCGCCTCGTCGTCGGACGCCGGAGCAGACTACCAGCTGCCTCCCGAAAACCCACTCATCTACTCGCAGCCTCCATGGCAACAAACGCTACACTATAATAACAACAACGGCTACGTGAACAACGAGACCATCGACGTGCCTCAGCTACCCGAGGCGCGCGTAGATGACTACGGCATGAATGGCGATAAGTATAACGGCATGAAGAGGAAGAGATCCAGCGGCAGCTTGTACTGCAGCCAGCTGCAGCTCCCAGCGGATCAGTACAGCGGCATGCTGATCCATCCGTTCCTCAGCCAGCAGCTGCACATGTGA
SEQ ID NO:16：普通小麦(Triticum aestivum)；Traes_5BL_CC18CAD72
MPMGSSAAMPALPPGFRFHPTDEELIVHYLRRQAASMPSPVPIIAEVNIYKCNPWDLPGKALFGENEWYFFSPRDRKYPNGARPNRAAGSGYWKATGTDKAILSTPANESIGVKKALVFYRGKPPKGVKTDWIMHEYRLTAADNRTTKRRGSSMRLDDWVLCRIHKKCGNLPNFSSSDQEQEHEQESSTVEDSQNNHTVSSPKSEAFDGDGDDHLQLQQFRPMAIAKSCSLTDLLNTVDYAALSHLLLDGAGASSSDAGADYQLPPENPLIYSQPPWQQTLHYNNNNGYVNNETIDVPQLPEARVDDYGMNGDKYNGMKRKRSSGSLYCSQLQLPADQYSGMLIHPFLSQQLHM
SEQ ID NO:17：亚结构域A
LPPGFRFHPTDEELICHYL
SEQ ID NO:18：亚结构域B
IIAEVDLYKCEPWDLPEKCKI
SEQ ID NO:19：亚结构域C
WYFFCPRDRKYPNGTRTNRATGSGYWKATGKDKEI
SEQ ID NO:20：亚结构域D
VGMRKTLVFYMGRAPRGTKTNWVMHEFRL
SEQ ID NO:21：亚结构域E
DEWVVCKVHHK
SEQ ID NO:22：NAC DNA-结合结构域
LPAGFRFHPTDEELMVHYLMRQAASMPCPVPIIAEVNIYQCNPWDLPAKALFGDKEWFFFSPRDRKYPNGARPNRAAGSGYWKATGTDKAILSSSTPTSHGGANIVVGVKKALVFYGGRPPKGTKTDWIMHEYRLSGAADDDCKGSTRRRVSSSSSSSMRLDDWVLCRIHKK
SEQ ID NO:23：Zmubi1启动子
TGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG
SEQ ID NO:24：ZmNac111启动子
TCTGAAAGAAATAAATATTGCTAAGATTTTTTCTAAAATTTAGTCAAAATCAAGAAAGTTTAACCATCATGAACATCGTAGCGACACTGATTCTAGGTATTAATTAAGTATTCCTACAGGCTAGACGAAGCAATTAATATGAGAAAGGTTGACGGAGGTCCGGGGACGAAGGTCATAACCCTTGGGACCATTTTAATCTCTAAAACAATAACTAGAAGCCATTTTTATTAGTTTGACAGTTAAACTAAATTACGGTTGCACTATTCCTTCTATTGATACGACGCAATTCCCATGATTCTAAGCCTGGTATGTCTGGCTTTTTTCGACTCTGGTTATTAAAAGCTGTTGCGGACTATCAAATACCTCATCTTTTCGGTCCGCTTCTATAAGAATCGTTTTGGTAAAAACCTATTCGAAATCAACATAAACACAAAATCGGTCGAGCCGTCACGATAGAAGTAATCATCTCTTTCCTAAACCTTTTAGACCACTTCATGTTTCTCCACACGTATTGTTCACGATACTCGGTCAGATTCTCCATAAAAAAAGTTGAGCTAAACGGCCCCTAAAGTATATGTAGATAAGCACGATTCTAGTACGACTAACCGCAGGACTTCTTGAGCAGAGCAAAAGATGGATATTAATTACAGAAGAACTGACGGGGCGCATGGTTTCCACGAGGTGGGCGCACCCCGGCCACATGCACCGGCGAAAAACAAAATGGCAGTCGCGAATCGAAAGCTGCCAAGCTAGGCCGCATGCTGGGGATGTGTGACACACATATCATTGGCGGTCATGGCAGGTCGACACGTGTAGGCGGACGTCATCCATCGTCTTCATCCCTATCTATCTATCTATCACTCAGTACAAGCCATTGCTTTCGTTATCTTCCGAGGCGGGCAGGGCAGGGCAGGTTCTTCCCCCCTTGGCACGCACGGCTTGCGTGGAGCCAGGCCAGCTCGACGATGACTACGCGGCCCAGTCCTCCTCTTCGATCCTATAAAAGCGAGGCCCAGTCCCTCCATCTCAAAAATTTCAATGCCTCTCTAGATCTTTTAAGCTAGCTATCCTTGCTTCCTCCCTTCACTTTCTTATTGAGAGCTCTCTGGCGTGCTGTACCGGACGACAGGGGTTGGTAGGTCGTAGGTGTAGCTAGCTCGGCGAGCGAGCAATCCGGCCAACAGCACACGCGTCGATCGCC
SEQ ID NO:25(ZmNac111启动子和MITE)。
TCTGAAAGAAATAAATATTGCTAATATTTTTTCTAAAATTTAGTCAAAATCAAGAAAGTTTAACCATCATGAACATCGTAGCGACACTGATTCTAGGTATTAATTATCTGCATTCAAGTATTCCTACAGGCTAGACGAAGCAATTAATATGAGAAAGGTTGACGGAGGTCCGGGGACGAAGGTCATAACCCTTGGGACCATTTTAATCTCTTTGTCTAAAACAATAACTAGAAGCCATTTCTATTAGTTTGACAGTTAAACTAAATTACGGTTGCACTATTCCTTCTATTGATACGACGCAATTCCCATGATTCTAAGCCTGGTATGTCTGGCTTTTTTCGACTCTGGGTATTAAAAGCTGTTGCGGACTATCAAATACCTCATCTTTTCGGTCCGCTTCAAAACCTATTCGAAATCAACATAAACACAAAATCGGTTGAGCCGTCACGTCACGATAGAAGTAATCATCTCTTTCCTAAACCTTTTAGACCACTTCATGTTTCTGCACACGTATTGTTCACGATACTCGGTCAGATTCTCCATAAAAAAAGTTGAGCTAAACAGCCCCTAAAGTATATGTAGATAAGCACGATTCTAGTACTAACCGCAGGACTTCTTGAGCAGAGCAAAAGATGGATACTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCACTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTATTAATTACAGAAGAACTGACGGGGCGCATGGTTTCCACGAGGTGGGCGCACCCCGGCCACATGCATCGGCGAAAACAAAATGGCAGTCGCGAATCGAAAGCTGCCAAGCTAGGCCGCATGCTGGGGATGTGTGACACACATATCATTGGCGGTCATGGCAGGTCGACACGTGTAGGCGGACGTCATCCATCGTCTTCATCCCTATCTATCTATCTATCACTCAGTACAAGCCATTGCTTTCGTTATCTTCCGAGGCGGGCAGGGCAGGGCAGGTTCTTCCCCCCTTGGCACGCACCGCACGCACGGCTTGCGTGGAGCCAGGCCAGCTCGACGATGACTACGCGGCCCCGGCCCCGCGGCCCAGTCCTCCCTCCTCTTCGATCCTATAAAAGCGAGGCCCAGTCCCTCCATCTCAAAAATTTCAATGCCTCTCTAGATCTTTCAAGCTATCCTTGCTTCCTAGCTCCCTTTGGCGTGCTGTACCGGACGACAGGGGTAGGTAGGTAGGTAGGTGTAGCTAGCTCGGCGAGCGAGGGAGCAATCCGGCCAACAGCACACGCGTCGATCGCC
SEQ ID NO:26(MITE)
CTCCCTCCGTTTCTTTTTATTAGTCGCTGGATAGTGCAATTTTGCACTATCCAGCGACTAATAAAAAGAAACGGAGGGAGTA
SEQ ID NO:27自交玉米(Zea Mays L.)
SEQ ID NO:28自交玉米(Zea Mays L.)

Claims (37)

1.遗传改变的植物，所述遗传改变的植物表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。
2.根据权利要求1所述的植物，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:4的多肽或其功能同源物或变体。
3.根据权利要求1或2所述的植物，其中所述功能同源物或变体与由SEQ ID NO:1、2、3或4表示的序列具有至少75％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的整体序列同一性。
4.根据前述权利要求所述的植物，其中所述构建体还包含调控序列。
5.根据权利要求4所述的植物，其中所述调控序列是组成型启动子、强启动子、诱导型启动子、胁迫诱导型启动子或组织特异性启动子。
6.根据权利要求5所述的植物，其中所述调控序列是胁迫诱导型启动子。
7.根据前述权利要求所述的植物，其中所述植物是单子叶或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的植物，其中所述植物是作物植物或生物燃料植物。
9.根据权利要求8所述的植物，其中所述作物植物选自玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、菜豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他芸苔属蔬菜或杨树。
10.根据权利要求9所述的植物，其中所述作物植物是玉米。
11.根据前述权利要求所述的植物，其中所述植物具有增加的耐旱性。
12.产品，所述产品来源于如在前述权利要求中所定义的植物或来源于其部分。
13.载体，所述载体包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体。
14.根据权利要求13所述的载体，其中所述载体是表达载体。
15.根据权利要求13或14所述的载体，所述载体还包含指引所述核酸的表达的调控序列。
16.根据权利要求15所述的载体，其中所述调控序列是组成型启动子、强启动子、诱导型启动子、胁迫诱导型启动子或组织特异性启动子。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述调控序列是胁迫诱导型启动子。
18.宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求13至17中任一项所述的载体。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌或植物细胞。
20.如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体或同源物或根据权利要求13至17中任一项所述的载体在赋予耐旱性中的用途。
21.如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体或根据权利要求13至17中任一项所述的载体在增加植物在干旱胁迫条件下的产量/生长中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述干旱胁迫是中度的。
23.用于增加植物的耐旱性的方法，所述方法包括在所述植物中引入并且表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。
24.用于在干旱或缺水条件下增加植物的产量的方法，所述方法包括在所述植物中引入并且表达包含如在SEQ ID NO:1、2或3中所定义的核酸或其功能同源物或变体的核酸构建体。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:4的多肽或其功能同源物或变体。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述功能同源物或变体与由SEQID NO:1、2、3或4表示的序列具有至少75％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的整体序列同一性。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述构建体还包含调控序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述调控序列是组成型启动子、强启动子、诱导型启动子、胁迫诱导型启动子或组织特异性启动子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述调控序列是胁迫诱导型启动子。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述植物是单子叶或双子叶植物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物是作物植物或生物燃料植物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述作物植物选自玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、菜豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他芸苔属蔬菜或杨树。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述作物植物是玉米。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，所述胁迫是中度或严重胁迫。
35.用于制备耐旱的突变体植物的方法，所述方法包括使用靶向的基因组修饰将突变引入至内源性ZmNAC111启动子或其功能同源物或变体的核酸序列中。
36.权利要求35所述的方法，其中使用ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9引入所述突变。
37.遗传改变的植物，其中所述植物在内源性NAC111启动子中携带突变。
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