CN116115663A - 一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，它以植物心叶淫羊藿(Epimedium brevicornum)为原料，采用炮制法加提取的方法制备成心叶淫羊藿提取物，将制成的心叶淫羊藿提取物作为抗ED活性成分在ED治疗中进行应用。本发明活性提取物工艺简单实用，抗ED疗效好，并且无毒副作用，为淫羊藿应用提供了广泛的途径。

Description

一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于中药活性成分提取技术领域，具体涉及一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法及其应用。
背景技术
心叶淫羊藿(E.brevicornum Maxim)具有补肾阳，强筋骨等功效。值得关注的是：淫羊藿有生、炙异用的特性，生品主要用于强筋健骨，而其羊油炒制品用于“温肾助阳”。传统理论认为：肾为先天之本，“元气”发源于肾，而淫羊藿之“温肾”指“温肾阳”，并通过“温肾阳”来大补元阳，以奏“助阳”之功。现代研究也认为“肾阳”关乎人体生殖、免疫、新陈代谢等各项基本机能，是人体的生理和病理基础。
目前，可以通过注射皮质酮构建“肾阳虚”大鼠模型，给该模型鼠喂食相关中药后，观测其对模型鼠“下丘脑-垂体-肾上腺轴”(HPA)以及性器官中关键靶点PDE5A1酶的调节活性，以此筛选出具有“温肾壮阳”功效的中药活性组分，虽然心叶淫羊藿很早就被发现具有温肾壮阳的功效，但是直接食用其叶片或者其煎煮物效果并不明显，如果要产生较为明显的效果，需要长期食用大量淫羊藿叶片，具有一定的副作用。采用炮制的方法虽然可以增加药效，但用量还是比较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法及其应用。
一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)炮制：将羊板油放入炼油锅里120℃加热炼制2.5小时，去渣，加入羊油量1/4的热水，将羊油和热水混合并搅拌，搅拌后再均匀淋在药材上，再将心叶淫羊藿药材和油搅拌均匀，润置2-3小时；将炒药机温度开至240-280℃，把润置好的淫羊藿药材投入炒药机中，炒制2-3分钟，取出，摊凉；
(2)活性组分提取：采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法中的一种或几种的组合提取炮制好的药材中的活性组分，经浓缩、干燥，即得。
优选地，羊板油和心叶淫羊藿药材的重量比例为20-30:100-120。
优选地，所述溶剂提取法选用水、甲醇、乙醇、异丙醇或者正丁醇，在室温下浸润提取或者用超声波振荡仪超声振荡提取；或者在加热状态下浸润提取或回流提取1-6次。
优选地，所述溶剂萃取法是将经石油醚、二氯甲烷或三氯甲烷脱脂后的炮制药材，用正丁醇或含水正丁醇进行萃取1-6次。
优选地，所述树脂吸附法选用LSA-12S型吸附树脂、XAD-2型吸附树脂或者CHP-20P型吸附树脂，洗脱溶媒用水、甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇、含水乙醇或者含水丙酮中的一种或多种，洗脱时以等浓度洗脱或者梯度洗脱。
优选地，所述正相柱层析法选用常压或加压硅胶柱层析或者氧化铝柱层析，所用柱填料可选柱层析用硅胶或氧化铝，或者薄层层析用硅胶或氧化铝，洗脱选用苯/丙酮、二氯甲烷/丙酮、苯/甲醇、二氯甲烷/甲醇、三氯甲烷/甲醇.乙酸乙酯/甲醇，苯/丙酮/水、二氯甲烷/丙酮/水、三氯甲烷/丙酮/水、二氯甲烷/甲醇/水、三氯甲烷/甲醇/水或者乙酸乙酯/甲醇/水中的一种或者多种，洗脱时以等浓度洗脱或者梯度洗脱。
优选地，所述反相柱层析法选用常压或加压反相柱层析，所用柱填料为十八烷基键合相(ODS)或八烷基键合相，洗脱剂用含水甲醇或含水乙腈，洗脱时以等浓度洗脱或梯度洗脱。
优选地，所得提取物中活性成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的总含量大于56％。
作为本发明的另一发明目的，本发明还提供了采用上述方法制备得到的心叶淫羊藿活性提取物在制备抗男性性功能障碍的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明以植物心叶淫羊藿为原料，采用炮制法、溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法、凝胶层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合常用干燥方法制备成活性提取物，活性提取物工艺简单实用，所得提取物中抗ED有效成分含量高，相对于常规提取方法，最终有效物质的含量能提高10倍以上，并且无毒副作用，为淫羊藿应用提供了广泛的途径。
附图说明
图1和图2分别为各组小鼠CRH和ACTHmRNA表达水平比较示意图，其中，#同正常组相比，p＜0.05；*同肾阳虚组相比，p＜0.05；
图3为各组小鼠血清中ACTH浓度比较，#同正常组相比示意图，p＜0.05；其中，*同肾阳虚组相比，p＜0.05，***同肾阳虚组相比，p＜0.001；
图4和图5分别为各组小鼠海绵体中eNOS和PDE5A1水平比较示意图，其中，#,###同正常组相比，p＜0.05,p＜0.001；*,**,***同肾阳虚组相比，p＜0.05，p＜0.01,p＜0.001。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)炮制：取5kg淫羊藿叶片，将1.2kg羊板油放入炼油锅里加热炼制2.5小时，去渣，再加入羊油量1/4的热水混合并搅拌，搅拌后淋在淫羊藿药材上，润置3h；将炒药机温度开至260℃，把润置好的心叶淫羊藿药材投入炒药机中，炒制3min，取出，摊凉；
(2)活性组分提取：取步骤(1)炮制好的药材在50％乙醇、83℃条件下回流提取2次，每次1.5h，每次所用50％乙醇的质量为药材质量的15倍、10倍，合并提取液，浓缩得到2.56kg乙醇提取物，将乙醇提取物再经干燥得到心叶淫羊藿活性提取物1.03kg，收率为20.6％。
实施例2
一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)炮制：取5kg淫羊藿叶片，将1.2kg羊板油放入炼油锅里加热炼制2.5小时，去渣，再加入羊油量1/4的热水混合并搅拌，搅拌后淋在淫羊藿药材上，润置3h；将炒药机温度开至260℃，把润置好的心叶淫羊藿药材投入炒药机中，炒制3min，取出，摊凉；
(2)取步骤(1)淫羊藿炮制品用50％乙醇在90℃下回流提取2次，合并提取液，浓缩得到乙醇提取物，乙醇提取物上LSA-12S型吸附树脂柱，先用水、5％乙醇/水洗脱以除去色素和杂质，而后用60％乙醇/水洗脱，其中60％乙醇/水洗脱部分减压浓缩除乙醇，再经冷冻干燥可得到淫羊藿提取物1.18kg，收率为23.6％。
对比例1
一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
取5kg心叶淫羊藿叶片，打浆，在50％乙醇、83℃条件下回流提取2次，每次1.5h，每次所用50％乙醇的质量为药材质量的15倍、10倍，合并提取液，浓缩得到乙醇提取物，将乙醇提取物再经干燥得到心叶淫羊藿活性提取物0.05kg，收率为1.0％。
对比例2
一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
取5kg心叶淫羊藿叶片，打浆，用50％乙醇在90℃下回流2次，合并提取液，浓缩得到乙醇提取物。乙醇提取物上LSA-12S型吸附树脂柱，先用水、5％乙醇/水洗脱以除去色素和杂质，而后用60％乙醇/水洗脱。其中60％乙醇/水洗脱部分减压浓缩除乙醇，再经冷冻干燥可得到心叶淫羊藿活性提取物0.065kg，收率为1.3％
实验例1：
对淫羊藿提取物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的含量进行检测。
仪器：
高效液相色谱仪：配有紫外检测器；
电子天平：十万分之一电子天平。
纯水/超纯水一体***。
药品及试剂：
样品：实施例和对比例制备的淫羊藿提取物；
对照品：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ；
试剂：无水乙醇：分析纯。乙腈、甲醇：色谱纯。超纯水。
实验步骤：
1.供试品溶液的制备
精密称取提取物10mg于10mL容量瓶中，加入50％乙醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，经0.22微米微孔滤膜过滤后取续滤液作为供试品溶液备用。
2.对照品溶液的制备
2.1对照品储备液：分别精密称取朝藿定A对照品约10mg于25mL容量瓶中、朝藿定B对照品约20mg于25mL容量瓶中、朝藿定C对照品约20mg于25mL容量瓶中、淫羊藿苷对照品约40mg于25mL容量瓶中、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ对照品约5mg于25mL容量瓶中、宝藿苷Ⅰ对照品约5mg于25mL容量瓶中、分别用甲醇溶解并定容，混匀。
2.2混合对照品使用液：分别精密吸称取朝藿定A对照品1mL、朝藿定B对照品1mL、朝藿定C对照品2mL、淫羊藿苷对照品2mL、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ对照品1mL、宝藿苷Ⅰ对照品1mL于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀。
3.标准曲线的制备
分别吸取混合对照品使用液(3.2.2)0.1mL、0.2mL、0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、10.0mL于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，用0.45微米微孔滤膜过滤后作为对照品溶液备用。按照3.4色谱条件进行色谱分析，经色谱分析分别得到各浓度朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ对照品色谱峰的峰面积，分别以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ对照品溶液浓度为横坐标，以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ对照品溶液峰面积为纵坐标建立标准曲线。
4.色谱条件
4.1色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，5μm)或相当者(如Sepex C18色谱柱)。
4.2流动相：乙腈-水，按下表梯度洗脱。
时间(min) 水(％) 乙腈(％)
0 78 22
15 72 28
30 71 29
56 0 100
4.3流速：1.0mL/min。
4.4检测波长：270nm。
5.含量测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液各10uL，注入液相色谱仪，以保留时间定性，以峰面积进行定量。
6.计算：
淫羊藿提取物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的含量按下式计算：
Figure BDA0003947391870000081
式中：
X—淫羊藿提取物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ成分的含量，％；
c—由标准曲线求得供试品溶液淫羊藿提取物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的浓度，mg/L；
V—试样溶剂体积，mL；
m—试样质量，mg。
检测结果如下表所示。
有效成分总含量
实施例1 56.34％
实施例2 57.18％
对比例1 5.12％
对比例2 5.87％
实验例2：
对实施例1和对比例1制备的淫羊藿提取物进行抗ED实验。
心叶淫羊藿炮制前后对“肾阳虚”模型鼠下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴紊乱调节作用比较
①肾阳虚模型鼠经心叶淫羊藿炮制前后提取物给药后的存活结果
共40只C57BL/6小鼠分为4组，依次为正常组10只，肾阳虚组10只，实施例1组10只，对比例1组10只。除正常组皮下注射生理盐水，其余3组均皮下注射20mg/kg皮质酮，每日一次，持续21天。给药四组灌胃给药2倍人体剂量的提取物(50％含水乙醇提取)，正常组和肾阳虚组灌胃等体积生理盐水，持续21天。
肾阳虚模型鼠经淫羊藿各提取物给药后的死亡率
Figure BDA0003947391870000091
Figure BDA0003947391870000101
21天后小鼠存活情况如表1所示，正常组、肾阳虚组和实施例1组无小鼠死亡，对比例1组有1只小鼠死亡，死亡率分别为10.0％。
②淫羊藿各提取物对肾阳虚模型鼠HPA轴指标的影响
各组小鼠均剥离下丘脑和垂体，-80℃冷冻保存，采用荧光定量PCR法分别检测下丘脑中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和垂体中促肾上腺皮质激素(ACTH)的mRNA表达水平。
图1和图2结果显示，同正常组CRH和ACTH mRNA表达水平相比，肾阳虚组的CRH和ACTH mRNA均明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)；同肾阳虚组的CRH和ACTH mRNA水平相比，心叶炮制组显著上升，差异有统计学意义(p<0.05)；同肾阳虚组的CRH mRNA水平相比，心叶生品组表达显著上升，差异有统计学意义(p<0.05)。
结果提示，对比例1、实施例1明显改善下丘脑的CRH mRNA水平，实施例1明显改善ACTH mRNA水平，对比例1和实施例1具有改善紊乱的HPA轴的效果。
③淫羊藿各提取物对肾阳虚模型鼠血清ACTH ELISA水平的影响
对各组小鼠视网膜下取血，经4℃过夜静止后，1500rpm 5分钟离心，取血清。采用CUSABIO TECHNOLOGY公司的ACTH ELISA试剂盒，检测血清中ACTH的水平。
图3结果显示，同正常组血清中ACTH表达水平相比，肾阳虚组的ACTH浓度明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)；同肾阳虚组的ACTH水平相比，实施例1组极显著上升，差异有统计学意义(p<0.001)；对比例1组血清中ACTH的水平也显著上升，差异有统计学意义(p<0.05)。
结果提示，实施例1可明显改善血清中ACTH的水平，具有改善紊乱的HPA轴的效果。
④.淫羊藿各提取物对模型鼠海绵体eNOS和PDE5A1的调节作用
牺牲小鼠，剥离对各组小鼠***，取海绵体，经组织研磨后，-80℃冷冻保存，采用荧光定量PCR法分别检测eNOS和PDE5A1的mRNA表达水平。
图4结果显示，同正常组eNOS表达水平相比，肾阳虚组的eNOS mRNA明显升高，差异有统计学意义(p<0.05)；同肾阳虚组的eNOS mRNA水平相比，实施例1组显著上升，差异有统计学意义(p<0.001),对比例1组也有上升，具有统计学意义(p<0.05)；
图5结果显示，同正常组PDE mRNA表达水平相比，肾阳虚组的PDE5A1 mRNA均明显升高，差异有统计学意义(p<0.001)；同肾阳虚组的PDE5A1 mRNA水平相比，实施例1组下降极为显著，差异有统计学意义(p<0.001)。
结果提示，实施例1能有效改善肾阳虚小鼠海绵体eNOS和PDE5A1的紊乱情况。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种心叶淫羊藿活性提取物的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)炮制：将羊板油放入炼油锅里120℃加热炼制2.5小时，去渣，加入羊油量1/4的热水，将羊油和热水混合并搅拌，搅拌后再均匀淋在药材上，再将心叶淫羊藿药材和油搅拌均匀，润置2-3小时；将炒药机温度开至240-280℃，把润置好的淫羊藿药材投入炒药机中，炒制2-3分钟，取出，摊凉；
(2)活性组分提取：采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法中的一种或几种的组合提取炮制好的药材中的活性组分，经浓缩、干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，羊板油和心叶淫羊藿药材的重量比例为20-30:100-120。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取法选用水、甲醇、乙醇、异丙醇或者正丁醇，在室温下浸润提取或者用超声波振荡仪超声振荡提取；或者在加热状态下浸润提取或回流提取1-6次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂萃取法是将经石油醚、二氯甲烷或三氯甲烷脱脂后的炮制药材，用正丁醇或含水正丁醇进行萃取1-6次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树脂吸附法选用LSA-12S型吸附树脂、XAD-2型吸附树脂或者CHP-20P型吸附树脂，洗脱溶媒用水、甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇、含水乙醇或者含水丙酮中的一种或多种，洗脱时以等浓度洗脱或者梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正相柱层析法选用常压或加压硅胶柱层析或者氧化铝柱层析，所用柱填料可选柱层析用硅胶或氧化铝，或者薄层层析用硅胶或氧化铝，洗脱选用苯/丙酮、二氯甲烷/丙酮、苯/甲醇、二氯甲烷/甲醇、三氯甲烷/甲醇.乙酸乙酯/甲醇，苯/丙酮/水、二氯甲烷/丙酮/水、三氯甲烷/丙酮/水、二氯甲烷/甲醇/水、三氯甲烷/甲醇/水或者乙酸乙酯/甲醇/水中的一种或者多种，洗脱时以等浓度洗脱或者梯度洗脱。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反相柱层析法选用常压或加压反相柱层析，所用柱填料为十八烷基键合相(ODS)或八烷基键合相，洗脱剂用含水甲醇或含水乙腈，洗脱时以等浓度洗脱或梯度洗脱。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所得提取物中活性成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、2”-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的总含量大于56％。
9.权利要求1-8任一项方法制备得到的心叶淫羊藿活性提取物在制备抗男性性功能障碍的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104749306A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 广州白云山陈李济药厂有限公司 一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法
CN111557963A (zh) * 2020-06-05 2020-08-21 天津中医药大学 淫羊藿的炮制方法以及用于炮制淫羊藿的羊脂油

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