CN104849384B - 建立健肝乐制剂指纹图谱的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了建立健肝乐制剂指纹图谱的方法及其应用，其中，该方法为高效液相色谱法，包括：将10微升含有健肝乐制剂的供试品溶液注入高效液相色谱仪，并按照如下色谱条件进行检测：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％甲酸水溶液(V/V)，洗脱方式为梯度洗脱，检测波长为232纳米，柱温为30摄氏度。发明人发现，利用该方法能够快速有效地获得健肝乐制剂的指纹图谱，能够全面反映出健肝乐制剂的质量信息，具有良好的***性、特征性和稳定性。

Description

建立健肝乐制剂指纹图谱的方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体地，涉及建立健肝乐制剂指纹图谱的方法及其应用，更具体地，涉及建立健肝乐制剂指纹图谱的方法、检测健肝乐制剂的方法以及建立健肝乐制剂指纹图谱的方法在检测建立健肝乐制剂质量或真伪中的用途。

背景技术

健肝乐颗粒出自东汉张仲景《伤寒论》中“芍药甘草汤”，由甘草和白芍两味中药组方而成，临床上用于改善各类肝炎临床症状的作用，是武汉康乐药业股份有限公司独家生产品种。2012年仅湖北省地区的销售就已经超过1000万元。但随着科学技术的快速发展及中药研究的不断深入，仅用芍药苷这一种活性成分来说明健肝乐制剂的内在质量，具有一定的片面性，因此必须从该复方的物质群整体上有效的表征中药质量。指纹图谱作为中草药及其提取物的质量控制方法，目前已经成为国际共识。现在对白芍中活性成分如芍药苷、芍药内酯苷等的测定方法较多，对甘草中活性成分如甘草苷、甘草酸等的测定方法较多，但如何能从更宏观的角度以健肝乐制剂中化学成分为指标建立宏观指纹图谱的方法却未见报道。

因而，目前关于建立健肝乐制剂指纹图谱的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种建立健肝乐制剂指纹图谱的方法。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种建立健肝乐制剂指纹图谱的方法。根据本发明的实施例，该方法为高效液相色谱法，包括：将10微升含有健肝乐制剂的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以便获得所述健肝乐制剂的指纹图谱，其中，色谱条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％甲酸水溶液(V/V)，洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：

时间(min)	0.05％甲酸水溶液(％)	乙腈(％)
			0～10	86	14

10～32	86至82	14至18
			32～60	82至60	18至40
60～70	60	40
			70～80	86	14

检测波长为232纳米，柱温为30摄氏度。发明人发现，利用该方法能够快速有效地获得健肝乐制剂的指纹图谱，健肝乐制剂中各组分的分离度高，获得的指纹图谱能够全面反映出健肝乐制剂的质量信息，避免了以单一组分反应健肝乐制剂质量的片面性，且该方法步骤简单、操作方便快捷，检测成本低、重现性好、信息量大，具有良好的***性、特征性和稳定性。

根据本发明的一些实施例，流速可以为1.0mL/min。由此，有利于提高分离度，获得的指纹图谱的能够达到全面、有效地控制健肝乐制剂的质量的目的。

根据本发明的一些实施例，以芍药苷峰计，理论塔板数不低于2000。由此，能够有效提高该方法的***性、特征性和稳定性，获得的指纹图谱分各组分离度高，能够全面、有效地反应健肝乐制剂的质量信息。

根据本发明的一些实施例，所述供试品溶液是按照以下步骤制备的：利用50％乙醇水溶液(V/V)，将所述健肝乐制剂配成浓度为10mg/mL的溶液。由此，获得的指纹图谱中各色谱峰分离度和峰形较好，且采用50％乙醇水溶液(V/V)更经济环保。

根据本发明的一些实施例，色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。由此，获得的指纹图谱分离度高、峰形好，能够全面反映健肝乐制剂的质量信息。

根据本发明的一些实施例，本发明的建立健肝乐制剂指纹图谱的方法包括以下步骤：

a)利用50体积％乙醇水溶液，将所述健肝乐制剂配成浓度为10mg/mL的溶液，并将所得到的溶液超声处理10min，以便获得所述供试品溶液；

b)色谱条件：

色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，

流动相A为乙腈，

流动相B为0.05％甲酸水溶液(V/V)，

洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：

时间(min)	0.05％甲酸水溶液(％)	乙腈(％)
			0～10	86	14
10～32	86至82	14至18
			32～60	82至60	18至40

60～70	60	40
			70～80	86	14

检测波长为232纳米，

柱温为30摄氏度，

流速为1.0mL/min，

以芍药苷峰计，理论塔板数不低于2000；

c)测试法：将10微升所述供试品溶液注入所述高效液相色谱仪，记录80分钟内的色谱图，以便获得所述健肝乐制剂的指纹图谱。

发明人发现，利用该方法能够快速有效地获得健肝乐制剂的指纹图谱，健肝乐制剂中各组分的分离度高，峰形较好，获得的指纹图谱能够全面反映出健肝乐制剂的质量信息，避免了以单一组分反应健肝乐制剂质量的片面性，且该方法步骤简单、操作方便快捷，检测成本低、重现性好、信息量大，具有良好的***性、特征性和稳定性。

根据本发明的一些实施例，所述指纹图谱至少具有12个特征峰，以芍药苷的色谱峰为参照，得到的相对保留时间依次为：1号峰相对保留时间为：0.661±5％，相对峰面积为：0.039±5％，2号峰相对保留时间为：0.798±5％，相对峰面积为：0.514±5％，3号峰相对保留时间为：1.000±5％，相对峰面积为：1.000±5％，4号峰相对保留时间为：1.461±5％，相对峰面积为：0.402±5％，5号峰相对保留时间为1.640±5％，相对峰面积为：0.188±5％，6号峰相对保留时间为：2.226±5％，相对峰面积为：0.233±5％，7号峰相对保留时间为：2.315±5％，相对峰面积为：0.089±5％，8号峰相对保留时间为：2.841±5％，相对峰面积为：0.040±5％，9号峰相对保留时间为：3.344±5％，相对峰面积为：0.038±5％，10号峰相对保留时间为：3.859±5％，相对峰面积为：0.037±5％，11号峰相对保留时间为：3.925±5％，相对峰面积为：0.023±5％，12号峰相对保留时间为：4.827±5％，相对峰面积为：0.056±5％。由此，该指纹图谱包括了反映了健肝乐制剂有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，能够全面、有效地反映健肝乐制剂的质量信息。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种健肝乐制剂的检测方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)利用前面所述的方法建立合格健肝乐制剂的指纹图谱；(2)利用前面所述的方法建立待测健肝乐制剂的指纹图谱；(3)将步骤(2)中得到的指纹图谱和步骤(1)中得到的指纹图谱进行比对，计算相似度，相似度不低于0.9为合格。发明人发现，利用该方法，能够快速、有效地检测健肝乐制剂的质量，且该方法反映了健肝乐制剂有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，能够全面地反应健肝乐制剂的质量信息，具有较好的***性、特征性和稳定性。另外，前面所述的建立健肝乐制剂指纹图谱的方法的全部特征和优点均适用于该健肝乐制剂的检测方法，在此不再一一赘述。

在本发明的第三方面，本发明提供了前面所述的方法在检测健肝乐制剂质量或真伪中的用途。具体而言，前面所述的建立健肝乐制剂指纹图谱的方法能够反映健肝乐制剂有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，能够全面地反应健肝乐制剂的质量信息，且步骤简单、操作方便快捷，检测成本低、重现性好、信息量大，具有良好的***性、特征性和稳定性，能够有效的用于检测检测健肝乐制剂质量或真伪。

附图说明

图1显示了根据本发明的实施例1，色谱条件考察实验中供试品溶液的色谱图；

图2显示了根据本发明的实施例1，色谱条件考察实验中供试品溶液的色谱图；

图3显示了根据本发明的实施例1，色谱条件考察实验中对照品溶液的色谱图；

图4显示了根据本发明的实施例2，提取溶剂考察实验中供试品溶液的色谱图；

图5显示了根据本发明的实施例2，提取时间考察实验中供试品溶液的色谱图；

图6显示了根据本发明的实施例4，稳定性实验中供试品溶液的色谱图；

图7显示了根据本发明的实施例4，精密度实验中供试品溶液的色谱图；

图8显示了根据本发明的实施例4，重复性实验中供试品溶液的色谱图；

图9显示了根据本发明的实施例4，二十批次健肝乐颗粒；

图10显示了根据本发明的实施例4，芍药苷和健肝乐颗粒比较图谱；

图11显示了根据本发明的实施例4，甘草苷和健肝乐颗粒比较图谱；

图12显示了根据本发明的实施例4，甘草酸和健肝乐颗粒比较图谱；

图13显示了根据本发明的实施例4，甘草药材和健肝乐颗粒比较图谱；

图14显示了根据本发明的实施例4，白芍药材和健肝乐颗粒比较图谱；

图15显示了根据本发明的实施例4，健肝乐制剂指纹图谱的峰归属结果图；以及

图16显示了根据本发明的实施例5，7个单体粗品的色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下面描述的实施例中，所涉及到的仪器与试药如下所示：

1、仪器与试药：

1.1仪器：

Waters e2695-2489型高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)

1.2试药：

(1)甘草酸铵对照品(批号：110731-201317，中国药品生物制品检定所制，用于含量测定)；甘草苷对照品(批号：111610-201106，中国药品生物制品检定所制，用于含量测定)；芍药苷对照品(批号：110736-201337，中国药品生物制品检定所制，用于含量测定)；芍药内酯苷、芍药新苷、苯甲酸、对羟基苯乙酸(均为自制，纯度95％)；

(2)乙腈(fulltime公司，色谱纯)，无水甲酸(阿拉丁公司，98％)，水为娃哈哈纯净水。

(3)健肝乐颗粒(批号：1401062、1402061、141071、1404042、1401072、1403031、1401052、1404032、1403012、1401051、1402062、1401022、1405041、1404012、1403022、1309122、1403042、1402031、1401061、1402032)。

实施例1：色谱条件的考察

供试品溶液的配制：取健肝乐颗粒适量，研磨粉碎，用50％乙醇，配成浓度为10mg/mL的溶液，并将所得到的溶液超声10min，即得供试品溶液。

对照品溶液的配制：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg芍药苷对照品的溶液，即得。

测试方法：将10微升待测溶液注入高效液相色谱仪，分别以磷酸-乙腈***(即以磷酸为流动相B，以乙腈为流动相A)，甲酸-乙腈***，磷酸-甲醇***，水-乙腈***，水-甲醇***，醋酸铵-乙腈***和醋酸铵-甲醇***，并针对每种***尝试不同的梯度洗脱条件(分别见表1-表5)，然后按照以下色谱条件分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长232nm；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000；Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，记录80分钟内的色谱图。

表1：0.05％甲酸水溶液-乙腈***的梯度洗脱条件

时间(min)	0.05％甲酸溶液(％)	乙腈(％)
			0～10	86	14

10～32	86至82	14至18
			32～60	82至60	18至40
60～70	60	40

表2：10mmol/ml乙酸铵-乙腈***的梯度洗脱条件

时间(min)	乙腈(％)	10mmol/ml乙酸铵(％)
			0～10	14	86
10～32	14至18	86至82
			32～60	18至40	82至60
60～70	40	60

表3：0.1％磷酸水溶液-乙腈***的梯度洗脱条件

时间(min)	乙腈(％)	0.1％磷酸水溶液(％)
			0～10	14	86
10～32	14至18	86至82
			32～60	18至40	82至60
60～70	40	60

表4：0.1％磷酸水溶液-甲醇***的梯度洗脱条件

时间(min)	甲醇(％)	0.1％磷酸水溶液(％)
			0～10	16	84
10～20	16至23	84至77
			20～35	23至40	77至60
35～50	40	60

表5：0.1％磷酸水溶液-乙腈***的梯度洗脱条件

时间(min)	乙腈(％)	0.1％磷酸水溶液(％)
			0～10	15	85
10～60	15至70	85至30

结果：部分色谱图如图1-图3所示，其中，图1中谱图1为在表2所示的梯度洗脱条件下供试品溶液的色谱图，谱图2为在表3所示的梯度洗脱条件下供试品溶液的色谱图，谱图3为在表4所示的梯度洗脱条件下供试品溶液的色谱图，谱图4为在表5所示的梯度洗脱条件下供试品溶液的色谱图。图2和图3均是以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，在表1所示的梯度洗脱条件下，供试品溶液的色谱图(图2所示)、以及对照品溶液的色谱图(图3所示)。从图1-图3可以看出，以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，表1所示的梯度洗脱条件下，能够获得分离度较高、峰形较好的色谱图，而磷酸-乙腈***，磷酸-甲醇***，水-乙腈***，水-甲醇***，醋酸铵-乙腈***，醋酸铵-甲醇***，以及其他各种梯度洗脱条件，效果均不理想。

实施例2：供试品溶液制备的考察：

1、提取溶剂的考察

取健肝乐颗粒粉末适量，分别加入甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇，配成浓度约为10mg/mL的溶液，并将所得到的溶液超声30min，并冷却后定容、过滤，即得不同的供试品溶液。

分别将10微升上述制备获得的各种供试品溶液注入高效液相色谱仪中，然后按照如下色谱条件进行检测：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，洗脱条件如表1所示，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长232nm；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000；Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，记录80分钟内的色谱图。色谱图见图4。

从图4的结果可以看出，甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇均能够得到分离度和峰形较好的色谱图，结合四种不同溶剂的提取效果及环保经济的角度考虑，选择50％乙醇作为提取溶剂。

2、提取时间的考察

取健肝乐颗粒粉末适量，加入50％乙醇，将所得到的溶液分别超声10min、20min、30min和40min，然后将10微升经过不同时间超声处理的供试品溶液分别注入液相色谱仪，按照与1中相同的色谱条件进行检测，获得的色谱图见图5。

由图5的结果可知，超声10min即可获得较好的结果。

综上，供试品溶液制备方法为：取健肝乐颗粒适量，研磨粉碎，用50％乙醇，配成浓度约为10mg/ml的溶液，然后将所得到的溶液超声10min，即得。

实施例3：健肝乐制剂指纹图谱的建立

1、色谱条件与***适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱如表1所示，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长232nm；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000；Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。

2、供试品溶液的制备：

取健肝乐颗粒粉末适量，加50％乙醇，配成浓度约为10mg/ml的溶液，并将所得到的溶液超声10min，然后依次放冷、定容，即得供试品溶液。

3、对照品溶液的制备：

取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg芍药苷的溶液，即得对照品溶液。

4、测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录80分钟内的色谱图，然后用指纹图谱软件对记录得到的色谱图谱进行处理，即得健肝乐制剂的指纹图谱。

实施例4：方法验证：

综合比较二十批次健肝乐颗粒的色谱图，选取3号峰高较大，分离度较好的芍药苷色谱峰为S峰，记录其他色谱峰与其比较所得相对保留时间与相对峰面积，考察样品溶液的稳定性，精密度与重复性。

1、稳定性：

按照实施例3中的方法只制备获得供试品溶液，然后分别在制得供试品溶液后的0，4，8，12，16，20，24h，按照实施例3中的色谱条件对供试品溶液进行检测，以考察供试品溶液的稳定性。色谱图见图6，相对保留时间和相对峰面积的检测结果分别见表6和表7。

表6：健肝乐颗粒稳定性实验——相对保留时间

表7：健肝乐颗粒稳定性实验——相对峰面积

图6、表6和表7的结果表明，其共有峰的相对保留时间的RSD在0.032％～0.185％之间，小于1％，相对峰面积的RSD在0.379％～3.599％之间，小于5％，符合色谱指纹图谱研究的技术要求，供试品溶液在24h内基本稳定。

2、精密度：

按照实施例3中的方法制备获得备健肝乐颗粒供试品溶液，连续进样6次，考察仪器的精密度。精密度实验色谱图见图7，相对保留时间和相对峰面积的结果分别见表8和表9。

表8：健肝乐颗粒精密度实验——相对保留时间

表9：健肝乐颗粒精密度实验——相对峰面积

图7、表8和表9的结果表明，共有峰的相对保留时间的RSD在0.040％～0.304％之间，小于1％，相对峰面积的RSD在0.743％～3.583％之间，小于5％，符合指纹图谱的技术要求。表明仪器精密度良好。

3、重复性：

按照实施例3中的方法制备6份健肝乐颗粒供试品溶液并进行检测，考察实验方法的重复性，重复性实验色谱图见图8，相对保留时间和相对峰面积检测结果见表10和表11。

表10：健肝乐颗粒重复性实验——相对保留时间

表11：健肝乐颗粒重复性实验——相对峰面积

结果表明，共有峰的相对保留时间的RSD在0.041％～0.149％之间，小于1％，相对峰面积的RSD在0.424％～3.856％之间，小于5％，符合色谱指纹图谱研究的技术要求，表明该方法的重复性良好。

4、二十批次健肝乐颗粒的色谱图

将二十批次的健肝乐颗粒(编号为S1-S20)分别在实施例3中的条件下进样，并将记录获得的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2004A版，以1309122(S1)为参照图谱，时间窗为0.1min，得到的图谱见图9，相似度结果见表12。

表12：相似度结果：

S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	对照
											1	0.931	0.981	0.983	0.923	0.9	0.908	0.909	0.906	0.903	0.944
S11	S12	S13	S14	S15	S16	S17	S18	S19	S20
											0.937	0.918	0.915	0.918	0.910	0.934	0.938	0.952	0.939	0.939

结果表明：20批次的健肝乐颗粒的相似度在0.910～0.983之间，相似度良好。

5、色谱峰的归属

将白芍药材，甘草药材按照健肝乐颗粒水提醇沉工艺同步进行提取，分别得到白芍水提醇沉提取物和甘草水提醇沉提取物，然后将健肝乐供试品溶液、甘草苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液、甘草酸铵对照品溶液以及得到白芍水提醇沉提取物和甘草水提醇沉提取物按照实施例3中的方法，将其注入液相色谱仪进行检测，记录得到的色谱图见图10-图13，其中，图10为芍药苷和健肝乐颗粒比较图谱，图11为甘草苷和健肝乐颗粒比较图谱，图12为甘草酸铵和健肝乐颗粒比较图谱，图13为甘草药材和健肝乐颗粒比较图谱，图14为白芍药材和健肝乐颗粒比较图谱。

通过将芍药苷色谱图、甘草苷色谱图与健肝乐颗粒色谱图进行比较，健肝乐制剂指纹图谱的峰归属情况如图15所示。

实施例5：单体分离

按照实施例3中的指纹图谱条件下，对其中相对峰面积较大，含量较高的色谱峰进行单体分离检测，得到7个纯度为90％以上的单体粗品，并对得到的7个单体粗品进行色谱检测，色谱图见图16，各单体的具体化学成分见表13。

表13：单体化学成分

单体编号	化学名称
		1	甘草酸

2	芍药新苷
		3	苯甲酸
4	甘草苷
		5	芍药苷
6	芍药内酯苷
		7	对羟基苯乙酸

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种建立健肝乐制剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述方法为高效液相色谱法，包括：

将10微升含有健肝乐制剂的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以便获得所述健肝乐制剂的指纹图谱，其中，色谱条件为：

流动相A为乙腈，

流动相B为0.05体积％甲酸水溶液，

洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～10min，86％的0.05体积％甲酸水溶液，14％的乙腈；10～32min，86-82％的0.05体积％甲酸水溶液，14-18％的乙腈；32～60min，82-60％的0.05体积％甲酸水溶液，18-40％的乙腈；60～70min，60％的0.05体积％甲酸水溶液，40％的乙腈；70～80min，86％的0.05体积％甲酸水溶液，14％的乙腈，

检测波长为232纳米，

色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，

流速为1ml/min，

柱温为30摄氏度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以芍药苷峰计，理论塔板数不低于2000。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液是按照以下步骤制备的：

利用50体积％乙醇水溶液，将所述健肝乐制剂配成浓度为10mg/mL的溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

a)利用50体积％乙醇水溶液，将所述健肝乐制剂配成浓度为10mg/mL的溶液，并将所得到的溶液超声处理10min，以便获得所述供试品溶液；

b)色谱条件：

色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，

流动相A为乙腈，

流动相B为0.05体积％甲酸水溶液，

洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0～10min，86％的0.05体积％甲酸水溶液，14％的乙腈；10～32min，86-82％的0.05体积％甲酸水溶液，14-18％的乙腈；32～60min，82-60％的0.05体积％甲酸水溶液，18-40％的乙腈；60～70min，60％的0.05体积％甲酸水溶液，40％的乙腈；70～80min，86％的0.05体积％甲酸水溶液，14％的乙腈，

检测波长为232纳米，

柱温为30摄氏度，

流速为1.0mL/min，

以芍药苷峰计，理论塔板数不低于2000；

c)测试法：将10微升所述供试品溶液注入所述高效液相色谱仪，记录80分钟内的色谱图，以便获得所述健肝乐制剂的指纹图谱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述指纹图谱至少具有12个特征峰，以芍药苷的色谱峰为参照，得到的保留时间依次为：

1号峰相对保留时间为：0.661±5％，相对峰面积为：0.039±5％，

2号峰相对保留时间为：0.798±5％，相对峰面积为：0.514±5％，

3号峰相对保留时间为：1.000±5％，相对峰面积为：1.000±5％，

4号峰相对保留时间为：1.461±5％，相对峰面积为：0.402±5％，

5号峰相对保留时间为1.640±5％，相对峰面积为：0.188±5％，

6号峰相对保留时间为：2.226±5％，相对峰面积为：0.233±5％，

7号峰相对保留时间为：2.315±5％，相对峰面积为：0.089±5％，

8号峰相对保留时间为：2.841±5％，相对峰面积为：0.040±5％，

9号峰相对保留时间为：3.344±5％，相对峰面积为：0.038±5％，

10号峰相对保留时间为：3.859±5％，相对峰面积为：0.037±5％，

11号峰相对保留时间为：3.925±5％，相对峰面积为：0.023±5％，

12号峰相对保留时间为：4.827±5％，相对峰面积为：0.056±5％。

6.一种健肝乐制剂的检测方法，其特征在于，包括：

(1)利用权利要求1-5中任一项所述的方法建立合格健肝乐制剂的指纹图谱；

(2)利用权利要求1-5中任一项所述的方法建立待测健肝乐制剂的指纹图谱；

(3)将步骤(2)中得到的指纹图谱和步骤(1)中得到的指纹图谱进行比对，计算相似度，所述相似度不低于0.9为合格。

7.权利要求1-5中任一项所述的方法在检测健肝乐制剂质量或真伪中的用途。