CN102048906A

CN102048906A - 鸡骨草胶囊的含量测定方法

Info

Publication number: CN102048906A
Application number: CN 201110001988
Authority: CN
Inventors: 汪豪; 叶志文; 欧彪; 蒙毅
Original assignee: YULIN PHARMACEUTICAL CO Ltd GUANGXI
Current assignee: GUANGXI YULIN PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD.
Priority date: 2011-01-06
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2031-01-06
Also published as: CN102048906B

Abstract

本发明公开了一种鸡骨草胶囊的含量测定方法，该方法采用HPLC-UV法在同一色谱条件下对鸡骨草胶囊中君药毛鸡骨草中的芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷的含量进行测定，步骤包括：供试品溶液的制备，对照品溶液的制备以及采用梯度洗脱的测定方法，该方法专属性强、准确度、精密度、重现性均较好，并且简便易行，对于进一步完善鸡骨草胶囊的质量标准具有重要的意义。

Description

鸡骨草胶囊的含量测定方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种鸡骨草胶囊的含量测定方法。

背景技术

鸡骨草胶囊是为广西玉林制药有限公司根据民间验方，经多年试制改进而成的中药名优产品，是国家中药保护品种，曾获国家优质产品银质奖。在长达二十多年的生产、销售及临床使用中，已经证明具有良好的临床疗效，在市场上享有一定的美誉，目前已成为中成药中治疗急、慢肝炎、胆囊炎属肝胆湿热证者及老百姓日常用于清热解毒、清肝保肝的常用药。本方由毛鸡骨草、栀子、茵陈等药味组成，具有疏肝利胆、清热解毒的功能，适用于治疗急、慢性肝炎和胆囊炎。毛鸡骨草为本方君药，性味甘凉，具有清热解毒，舒肝散瘀的功效。本方鸡骨草的药材来源为广西特产药材毛鸡骨草(Abrus mollis Hance)，又名毛相思子、牛日藤等，毛鸡骨草药用部位为豆科相思子属植物毛鸡骨草去除荚果后的干燥全草，主要分布于两广、福建及海南等地区。

鸡骨草胶囊为国内肝胆用药的重要品种，现行国家标准为部颁标准(中药成方制剂第18册，151页)，该标准仅收载了方中药材茵陈的薄层色谱鉴别项，未收录含量测定项。中国药典一部2005年版药材鸡骨草质量标准收载了显微、化学法鉴别及浸出物检查等项目，无含量测定项。本发明在对广西特产药材毛鸡骨草化学成分及质量控制研究基础上，采用HPLC-UV法在同一色谱条件下测定制剂鸡骨草胶囊中君药毛鸡骨草的芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(apigenin-6，8-di-C-β-D glucopyranoside，Vicenin，1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin 6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside，Isoschaftoside，2)芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(apigenin 6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside，Schaffoside，3)的含量，目前，未有文献报道相关技术。化合物1～3的结构式具体如下^[2，3]所示：

1：R₁＝Glc，R₂＝Glc；2：R₁＝Ara，R₂＝Glc；3：R₁＝Glc，R₂＝Ara；

发明内容

本发明的目的是针对目前鸡骨草胶囊质量检测存在缺陷，提供一种采用HPLC-UV法在同一色谱条件下测定鸡骨草胶囊中君药毛鸡骨草中的芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷的含量方法，该方法专属性强，稳定性好，测定准确，有助于鸡骨草胶囊质量标准的完善。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种鸡骨草胶囊的含量测定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取0.2～0.8g，加50％以上的甲醇30～70ml，加热回流1～3小时，滤过，残渣用50％以上的甲醇10～20ml分多次洗涤，滤过，合并滤液及洗液并蒸干，残渣加4～6ml水分4～6次溶解，定量加于聚酰胺柱，静置8～12分钟，用水5～15ml洗脱，弃去水洗液，再用50～80％甲醇30～50ml洗脱，收集50～80％甲醇洗脱液，蒸干，残渣加50％以上的甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％以上的甲醇稀释至刻度，即得；

b)对照品溶液的制备：称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷对照品、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷对照品及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷对照品适量，加50％以上的甲醇制成每1ml分别含15～35μg、35～65μg及15～35μg的混合溶液，摇匀，即得；

c)测定法：采用HPLC-UV法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-异丙醇(8～10∶1)为流动相A，以1～3％醋酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：0.8～1.2ml/min；柱温：35～40℃；检测波长为270～274nm；

上述采用浓度50％以上的甲醇优选为浓度为50～70％甲醇。

上述鸡骨草胶囊的含量测定方法优选包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取0.5g，加50％甲醇50ml，加热回流2小时，滤过，残渣用50％甲醇15ml分次洗涤，滤过，合并滤液及洗液并蒸干，残渣加水分4次溶解，依次2.0，1.0，1.0，1.0ml，定量加于聚酰胺柱，静置10分钟，用水10ml洗脱，弃去水洗液，再用60％甲醇40ml洗脱，收集60％甲醇洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，即得；

b)对照品溶液的制备称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷对照品、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷对照品及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷对照品适量，加50％甲醇制成每1ml分别含20、40及20μg的混合溶液，摇匀，即得；

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-异丙醇(9∶1)为流动相A，以2％醋酸为流动相B，按下表所述3个阶段进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长为272nm；

上述聚酰胺柱内径1.0～1.5cm，长度10～15cm，聚酰胺60～90目，采用湿法装柱。

本发明所述的甲醇的浓度均为体积百分比浓度。

与现有技术比较本发明的有益效果：本法对于测定鸡骨草胶囊中的芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(C₂₇H₃₀O₁₅)，芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)，芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)专属性强、准确度、精密度、重现性均较好，是值得推广的简便易行的方法，对于进一步完善鸡骨草胶囊的质量标准具有重要的意义。

以下为含量测定研究过程：

仪器与试药：Agilent 1100型高效液相色谱仪：二元高压梯度泵、VWD紫外检测器、G1316A型柱温箱，Chemstation色谱数据处理***；色谱柱：Zorbax SB，C₁₈，5μm，4.6×250mm，AlltechAll-Guard预柱(C₁₈)；Mettler Toledo XS105DU电子天平(0.01mg)；聚酰胺为柱层析用(60～90目，浙江台州生化厂)；甲醇为色谱纯；重蒸水。芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)对照品：中国药科大学天然药物化学教研室自制，纯度＞98％；其他所用试药与溶剂均为分析纯。鸡骨草胶囊：广西玉林制药有限责任公司生产，批号：250280，250277，250243，625075。

(1)提取溶剂与提取方法的确定

本法考察提取溶剂、提取方法及提取时间对含量测定的影响。指标成分芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)在甲醇-水中溶解度较好，考察50％甲醇、70％甲醇、甲醇各回流提取2hr，依法进行含量测定，结果以50％甲醇为回流提取溶剂时测得的含量值最高；同时考察以50％甲醇为提取溶剂，超声提取30min对含量测定结果的影响，结果显示50％甲醇为提取溶剂，超声提取含量测定值明显低于回流提取；比较甲醇回流提取，采用2、3hr等不同提取时间，结果显示提取2hr后，其含量值无明显变化。试验结果见表1。

表1提取条件优化试验结果表

综合以上试验结果，同时考虑试验时滤过、水浴蒸干等步骤操作，确定提取方法为：取鸡骨草胶囊内容物，研细，取0.2～0.8g，优选0.5g，精密称定，加50％以上(优选50～70％，最优选50％)甲醇30～70ml，水浴加热回流1～3小时(优选2小时)，滤过，残渣用50％以上(优选50～70％)甲醇10～20ml分次洗涤(最优选采用50％甲醇15ml分次洗涤)，滤过，合并滤液及洗液置水浴上蒸干，即得。

(2)样品前处理方法的确定

样品经50％以上(优选浓度50～70％，最优选浓度50％)甲醇回流提取后，直接进样采用HPLC-UV法进行测定，结果在指标成分色谱峰位置上干扰较大，需增加必要的分离步骤以除去干扰。参考文献，分别采用C₁₈固相萃取以及聚酰胺柱层析进行纯化，结果显示采用聚酰胺柱层析进行预处理，测得的样品含量值较高，能较好地除去样品中的干扰成分。

为了确定聚酰胺柱层析洗脱条件，将样品的甲醇提取液，水浴蒸干，残渣加水溶解，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60～90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，分别加水20ml，20％MeOH 20ml，30％MeOH 20ml，40％MeOH 20ml，50％MeOH 20ml，60％MeOH20ml进行梯度洗脱，收集洗脱液(5ml/流分)，分别进样HPLC进行检识，结果显示所测试的被洗脱下来的部位集中在30％甲醇部位，洗脱20ml即可洗脱完全。

综合考虑样品中含量差别及方法准确度等因素，故确定优选样品预处理方法为：样品50％以上(优选50～70％)甲醇提取液及洗液，蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60～90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，用水5～15ml洗脱，弃去水洗液，再用50～80％甲醇30～50ml洗脱，收集50～80％甲醇洗脱液，蒸干，残渣加50％以上(优选50～70％)甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％以上(优选50～70％)甲醇稀释至刻度，即得。

最优方法为：样品50％甲醇提取液及洗液，水浴上蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60～90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，用水10ml洗脱，弃去水洗液，再用60％甲醇40ml洗脱，收集60％甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加50％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，即得。

以下采用本发明最优方案进行***适应性实验：

1)供试品溶液的制备

取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取约0.5g，精密称定，加50％甲醇50ml，水浴加热回流2小时，滤过，残渣用50％甲醇15ml分次洗涤，滤过，合并滤液及洗液置水浴上蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60～90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，静置10分钟，用水10ml洗脱，弃去水洗液，再用60％甲醇40ml洗脱，收集60％甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加50％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，即得。

2)对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷真空干燥24hr的芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)、及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)对照品各适量，加50％甲醇制成每1ml含33.0μg(1)、62.0μg(2)、31.8μg(3)的混合对照品溶液，即得。

3)阴性对照溶液的制备

按处方组成，取除毛鸡骨草外的其余药味，按制备工艺要求制成不含毛鸡骨草的模拟制剂，按供试品溶液制备项下的方法制备阴性对照溶液。

4)紫外检测波长的确定

精密称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)对照品各适量，分别加50％甲醇溶解制成20μg/ml的对照品溶液，按照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2005年版二部附录IVA)分别在波长200～500nm范围内进行扫描，结果见图1～4及表2。

表2化合物1～3的紫外最大吸收波长表

综合图1～4及表2试验结果显示化合物1～3均在272nm左右有最大吸收，确定HPLC-UV法的最佳紫外检测波长为272nm。

5)色谱条件和***适用性试验

色谱条件的优选分别采用甲醇-2％醋酸，乙腈-2％醋酸，乙腈-0.2％磷酸等流动相***，同时考察不同色谱柱、柱温等因素对色谱峰分离度及对称度等影响确定的色谱条件为：Agilent Zorbax C₁₈(4.6×250mm，5μm)，Alltech All-guard C₁₈保护柱；以甲醇-异丙醇(9∶1)为流动相A，以2％醋酸为流动相B，按表3进行梯度洗脱，在40min以后，设计高浓度有机相色谱柱清洗程序；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长为272nm；进样体积：20μl。

表3梯度洗脱程序表

在上述色谱条件，化合物1～3与其他组分均能达到基线分离，分离度(R)均＞1.5，供试品溶液的指标色谱峰的色谱性能参数见表4。对照品混合溶液、鸡骨草胶囊供试品溶液、及缺毛鸡骨草阴性对照溶液的HPLC图谱见图4～6。通过另一色谱柱(Shimadzu CLC C₁₈6.0 ×150mm)测得的理论塔板值最小的指标成分芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)的理论塔板数n＝6000，化合物1-3色谱峰均能与其他组分均能达到较好的分离度(R＞1.5)。故确定理论板数按芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷峰计算，应不低于6000。

结果表明，供试品溶液各指标色谱峰的保留时间与对照品一致，阴性对照无干扰。

表4色谱性能参数表

6)线性关系的考察

精密称取经五氧化二磷真空干燥24hr的芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)对照品6.10mg，芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)对照品5.80mg，芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)对照品5.85mg，置同一25ml容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合储备溶液(化合物1～3浓度分别为244.0，232.0及234μg/ml)。精密吸取上述对照品混合储备溶液适量，加50％甲醇依次稀释为原浓度1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64的对照品混合稀释溶液，吸取上述各个浓度混合对照品溶液各20μl，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图，以进样量(μg)为横座标，峰面积积分值(A)为纵座标，绘制标准曲线，数据见表5～7，结果见图7～9。

表5芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)标准曲线数据

表6芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)标准曲线数据

表7芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)标准曲线数据

结果表明，芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)进样量分别在0.08～4.88，0.07～4.64，及0.07～4.68μg范围内具有良好的线性关系。

7)最小检测限测定及定量限测定

取以上混合对照品溶液，用50％甲醇逐步稀释，依法进样分析，取(S/N≥10)和(S/N≥3)信噪比时的进样量分别为最小定量限和检测限，芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的最低定量限分别为0.019、0.018、0.018μg，最低检测限均约为0.01μg。

8)精密度试验

精密吸取上述混合对照品溶液连续进样6次，计算各指标色谱峰的峰面积的相对标准偏差(RSD)，芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的RSD值分别为0.70，0.92，及0.90％，表明本法精密度较好。

9)稳定性试验

取制剂鸡骨草胶囊，按上述方法制备供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，16h依法测定，计算各峰峰面积的RSD(％)，结果芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的RSD(％)值分别为1.92，2.17和0.90，结果表明，供试品溶液在放置16hr内基本稳定，建议供试品溶液在放置16hr内测定。

10)重现性试验

精密称取同一批号制剂样品6份，按含量测定项下操作并分别依法测定样品中芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的含量，结果芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的RSD(％)值分别为1.32，1.27，1.35，相对标准偏差均＜2％，结果表明本法重现性较好。

11)加样回收率

采用加样回收法，取已知含量的鸡骨草胶囊样品6份(1：0.133％；2：0.143％；3：0.087％)，分别添加芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)对照品适量，按上述含量测定项下的方法依法测定，计算回收率，计算回收率，结果见表8～10。芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)的平均回收率为99.10％，RSD＝2.12％；芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)的平均回收率为97.79％，RSD＝2.79％；芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的平均回收率为98.74％，RSD＝4.32％。结果表明，本法具有良好的回收率，准确度较好。

表8芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)回收率测定结果

表9芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)回收率测定结果

表10芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)回收率测定结果

12)样品测定

取不同批号鸡骨草胶囊样品，每个批号的样品各称取二份，按含量测定项下方法依法测定，计算样品中芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)。结果见表11。

表11鸡骨草胶囊含量测定结果

利用建立的方法对不同批号的鸡骨草胶囊进行测定，从含量测定的结果可以看出，不同批号的制剂样品中化合物1-3的含量差别较大。建议鸡骨草胶囊的含量限度为：内容物含芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(C₂₇H₃₀O₁₅)不得少于0.03％，芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)不得少于0.03％，芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)不得少于0.02％。

附图说明

图1芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)的紫外吸收光谱图(20.25μg/ml，50％MeOH)

图2芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)的紫外吸收光谱图(20.21μg/ml，50％MeOH)

图3芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)的紫外吸收光谱图(21.53μg/ml，50％MeOH)

图4对照品混合溶液HPLC色谱图

其中，1为芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷

2为芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷

3为芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷

图5鸡骨草胶囊供试品溶液HPLC色谱图

其中，1为芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷

2为芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷

3为芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷

图6缺鸡骨草阴性对照溶液HPLC色谱图

图7芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(1)标准曲线图

图8芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(2)标准曲线图

图9芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(3)标准曲线图

具体实施方式

通过以下方式进一步阐述本发明：

实施例1

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

a)供试品溶液的制备取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取约0.5g，精密称定，加50％甲醇50ml，水浴加热回流2小时，滤过，残渣用50％甲醇15ml分多次洗涤，滤过，合并滤液及洗液置水浴上蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60-90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，静置10分钟，用水10ml洗脱，弃去水洗液，再用60％甲醇40ml洗脱，收集60％甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加50％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，即得。

b)对照品溶液的制备称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷对照品、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷对照品及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml分别含20、40及20μg的混合溶液，摇匀，即得。

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-异丙醇(9∶1)为流动相A，以2％醋酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长为272nm。理论板数按芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷峰计算不低于6000。

测得鸡骨草胶囊中内容物含芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(C₂₇H₃₀O₁₅)不少于0.03％，芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)不少于0.03％，芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)不少于0.02％。

采用该方法测定芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(C₂₇H₃₀O₁₅)，芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)和芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)的最低检测限均约为0.01μg，3种溶液均在16小时内稳定，芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷(C₂₇H₃₀O₁₅)，芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)和芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷(C₂₆H₂₈O₁₄)的精密度均良好。

实施例2

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

a)供试品溶液的制备取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取约0.6g，精密称定，加70％甲醇50ml，水浴加热回流3小时，滤过，残渣用70％甲醇15ml分次洗涤，滤过，合并滤液及洗液置水浴上蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60-90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，静置10分钟，用水15ml洗脱，弃去水洗液，再用70％甲醇30ml洗脱，收集70％甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加60％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，即得。

b)对照品溶液的制备称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷对照品、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷对照品及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml分别含30、60及30μg的混合溶液，摇匀，即得。

实施例3

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

a)供试品溶液的制备取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取约0.4g，精密称定，加50％甲醇50ml，水浴加热回流2小时，滤过，残渣用30％甲醇20ml分次洗涤，滤过，合并滤液及洗液置水浴上蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60-90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，静置10分钟，用水8ml洗脱，弃去水洗液，再用50％甲醇40ml洗脱，收集50％甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加40％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加40％甲醇稀释至刻度，即得。

b)对照品溶液的制备称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷对照品、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷对照品及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷对照品适量，精密称定，加40％甲醇制成每1ml分别含25、35及25μg的混合溶液，摇匀，即得。

实施例4

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

a)供试品溶液的制备取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取约0.8g，精密称定，加甲醇70ml，水浴加热回流1小时，滤过，残渣用甲醇15ml分次洗涤，滤过，合并滤液及洗液置水浴上蒸干，残渣加水分次溶解(2.0，1.0，1.0，1.0ml)，定量加于已处理好的聚酰胺柱(60-90目，内径1.0cm，长度10cm，湿法装柱)，静置12分钟，用水5ml洗脱，弃去水洗液，再用80％甲醇50ml洗脱，收集80％甲醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

b)对照品溶液的制备称取芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷对照品、芹菜素-6-C-***糖-8-C-葡萄糖苷对照品及芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-***糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含20、40及20μg的混合溶液，摇匀，即得。

参考文献

[1]中国药科大学.中药辞海.北京：中国医药科技出版社，1996：506，1114.

[2]刘卓伟，阙兆麟，叶志文，张晓琦，汪豪，叶文才，赵守训.毛鸡骨草地上部分的化学成分，中国天然药物，2008，6(6)：416～419.

[3]汪豪，熊非，刘卓伟，叶文才，张陆勇，尚靖，江振洲，赵守训.黄酮碳苷类化合物在制备治疗和预防肝炎药物中的应用，中国发明专利，CN101161668.

[4]汪豪.等.鸡骨草总黄酮碳苷有效部位、其制备方法和用途，中国发明专利，CN101250207。

Claims

1.一种鸡骨草胶囊的含量测定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的鸡骨草胶囊的含量测定方法，其特征在于该方法所述的浓度为50％以上的甲醇均具体为浓度为50～70％的甲醇。

3.根据权利要求1所述的鸡骨草胶囊的含量测定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：取鸡骨草胶囊的内容物，研细，取0.5g，加50％甲醇50ml，加热回流2小时，滤过，残渣用50％甲醇15ml分多次洗涤，滤过，合并滤液及洗液并蒸干，残渣加水分4次溶解，依次2.0、1.0、1.0、1.0ml，定量加于聚酰胺柱，静置10分钟，用水10ml洗脱，弃去水洗液，再用60％甲醇40ml洗脱，收集60％甲醇洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇分次溶解，定量移入10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，即得；

4.根据权利要求1、2或3所述的鸡骨草胶囊的含量测定方法，其特征在于所述的聚酰胺柱内径1.0～1.5cm，长度10～15cm，聚酰胺60～90目，采用湿法装柱。