CN105420185A - 一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速分离提取人脐带间充质干细胞(human？Umbilical？Cord？mesenchymal？stem？cells，hUC-MSC)的方法。该方法包括以下步骤：取新鲜采集的健康新生儿的脐带组织，在含双抗的脐带保存运输液中冰上运输，经75％酒精和生理盐水清洗消毒，剔除血管后钝性分离外层羊膜，机械粉碎，经红细胞裂解液处理3分钟，IV型胶原酶消化，过100-200目筛后以无血清培养基悬浮培养，每3-5天进行换液，取上清检测细胞污染，待平皿内贴壁率达30-70％，胰酶消化后，离心收集细胞进行传代扩增，至细胞汇合率达90％以上汇合，收集细胞冻存并检测hUC-MSC的生物学特性。

Description

一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法

技术领域

本发明涉及脐带间充质干细胞的高效快速分离提取方法，特别是从新鲜脐带外层羊膜组织中提取间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有高度自我更新和多向分化潜能，广泛存在于全身***和器官间质中。目前已有研究表明，不同的培养方法可使MSC表现为神经元表型、胰岛样细胞表型、内皮细胞表型，或表达心肌细胞标记，从而揭示MSC在免疫抑制、内分泌***调节、神经***调节以及心血管功能改善中具有广泛的临床应用前景。因此MSC已逐渐成为细胞治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。特别是与其他来源的MSC相比，源于人脐带的人脐带间充质干细胞(humanUmbilicalCordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)具有生长环境单一、采集方便、增殖分化能力强、免疫原性低、无伦理问题等诸多优点。

鉴于hUC-MSC的多向分化潜能以及在疾病治疗领域的应用潜力，目前国内市场的hUC-MSC的存储业务具有广阔的前景。但是，如何高效规范的保证干细胞的分离提取率以及保证干细胞优质，从而满足未来干细胞移植的临床需求，是目前国内干细胞存储业务的亟待解决的问题。

目前hUC-MSC多采用酶消化法和组织贴壁法来制备。然而，目前国内外关于hUC-MSC的分离和扩增方法混乱，且大多步骤相当复杂，使得快速提取大数量、高纯度hUC-MSC仍存在一定困难。

发明内容

本发明的目的是针对本领域的需要，提供一种能够高效、快速地分离提取hUC-MSC的方法。

本发明的另一目的是提供通过本发明的方法获得的hUC-MSC。

具体而言，因此，本发明针对目前国内外人脐带间充质干细胞的提取现状，利用红细胞裂解液处理对hUC-MSC原代生长影响较大的红细胞，同时利用胶原酶进行消化来缩短原代细胞培养时间，从而实现快速高效地提取高纯度hUC-MSC。并且，整个过程采用无血清培养体系，更有利于干细胞的未来临床转化应用。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供了从新鲜脐带离体外层羊膜组织中分离和提取间充质干细胞的方法，其为一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，所述方法包括：采用红细胞裂解液与胶原酶处理外层羊膜组织。

本发明采用的红细胞裂解液为包含NH₄Cl和Na₂-EDTA的水溶液，优选为包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更优选为包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mmol/LNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4。在使用之前，过0.22μm微滤膜，平衡至室温。

本发明采用的胶原酶为IV型胶原酶，优选为包含IV型胶原酶的消化液，优选为包含IV型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’s液，更优选为包含1％IV型胶原酶、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶和2％血清替代物的D-Hank’s液。其中百分数按重量百分数计。

本发明的方法具体包括：将获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，在室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入包含IV型胶原酶的消化液再次处理。

优选地，所述方法还包括：经胶原酶消化后，采用间充质干细胞无血清培养基培养，以获得原代间充质干细胞。

间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。

根据本申请的具体实施方式，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。

根据本申请的具体实施方式，所述血清替代物可以采用KnockOut^TMSerumReplacement(Gibco公司产品，货号10828-010)。

优选地，所述方法包括：将获得的脐带外层羊膜组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入2-3倍体积的包含IV型胶原酶的消化液，在37℃和5％浓度的CO₂下消化8-12小时；

优选地，所述方法还包括：以1-5×10⁴细胞/cm²培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，每3-4天更换新鲜培养基。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)脐带组织的预处理：

将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，加入PBS缓冲液清洗；

(2)红细胞裂解液处理：

将经步骤(1)获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗；

(3)胶原酶消化：

将经步骤(2)获得的组织块中加入包含IV型胶原酶的消化液再次处理，然后加入PBS缓冲液稀释，无菌筛过滤收集细胞；

(4)原代培养：

采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(3)获得的细胞，以获得原代间充质干细胞；

优选地，所述方法还包括以下步骤：

(5)上清液检测：

取步骤(4)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；

(6)传代培养：

取步骤(5)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞或继续传代；

(7)细胞检测：

取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。

优选地，所述步骤(1)包括：将新鲜脐带分割成2-3cm长的小段，去除血管中淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，加入1.5-2倍体积的PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；

优选地，所述步骤(2)包括：

将经清洗的脐带外层羊膜组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟，离心收集组织块，PBS缓冲液清洗2-3次；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4℃下离心6分钟；

优选地，所述步骤(3)包括：

向经处理的外层羊膜组织块中加入2-3倍体积的包含IV型胶原酶的消化液，在37℃和5％浓度的CO₂下消化8-12小时，然后加入PBS缓冲液稀释后经100目或200目无菌筛过滤，收集滤过液，PBS清洗离心；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4℃下离心6分钟；

优选地，所述步骤(4)包括：

以1-5×10⁴细胞/cm²培养皿面积的密度将经步骤(3)获得的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，每3-4天更换新鲜培养基；

优选地，所述步骤(5)包括：

取步骤(4)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的全部：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；

优选地，所述步骤(6)包括：

取步骤(5)中全部检测项目为阴性的培养细胞，待贴壁细胞汇合率达30-60％时，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养至汇合率达90％以上，收集细胞冻存或继续传代；其中优选地，所述胰酶的使用浓度为质量百分比为0.125％，消化1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；并且其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4℃下离心6分钟；

优选地，将收集的细胞以2-3×10⁶细胞/ml的密度冷冻保存在-196℃液氮中；或者优选地，将收集的细胞以1:3-1:4的比率进行细胞传代；

优选地，所述步骤(7)包括：

取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的全部：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。

优选地，所述方法中在步骤(1)之前还进行脐带清洗、保存和使用前处理，优选包括：

无菌条件下采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，经表面无菌生理盐水清洗后，放入脐带保存运输液中，优选在6小时内冰上运输至洁净细胞实验室；在使用前，将新鲜脐带以75％乙醇水溶液冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；

其中优选地，所述脐带保存运输液为包含注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的无钙镁D-Hank's液；更优选地，其中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为100-200U/mL，优选150U/ml；两性霉素B的浓度为200-400U/mL，优选300U/mL。

根据本发明的具体实施方式，所述从新鲜脐带外层羊膜组织中分离和提取间充质干细胞的方法包括以下步骤：

(1)样本的采集与运输：无菌采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，放入保存运输液中，冰上运输；

(2)脐带组织的清洗和消毒：将新鲜脐带样本放入50ml无菌离心管中，75％酒精冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；

(3)脐带组织的预处理：用眼科剪将脐带剪成2-3cm长短左右小段，用镊子除去血管中淤血，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳剔除两条脐动脉和一条脐静脉，钝性分离外层羊膜，将外层羊膜组织块置于50ml离心管，加1.5-2倍体积PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；

(4)红细胞裂解液处理：将PBS清洗的脐带外层羊膜组织转移至洁净无菌的100mm培养皿，剪成1-3mm³大小组织块；将肉糜状脐带外层羊膜组织块重新转移至离心管，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液；室温处理2-5分钟，离心收集组织块；PBS缓冲液清洗2-3次；

(5)IV型胶原酶消化：向离心管中加入组织块体积2-3倍的IV型胶原酶溶液，移入CO₂浓度为5％的37℃恒温培养箱中，8-12小时后从培养箱中移至洁净工作台，加PBS缓冲液稀释后过100或200目无菌筛，收集滤过液于50ml离心管，PBS缓冲液清洗离心，去残留酶；

(6)hUC-MSC原代培养：轻弹离心管底细胞团，加入hUC-MSC无血清培养基，制成细胞悬液，转移至100mm培养皿，移入CO₂浓度为5％的37℃恒温培养箱中，每3天更换新鲜培养基；

(7)取步骤(6)中培养上清，检测以下项目：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体、内毒素；

(8)hUC-MSC传代培养：待平皿内贴壁细胞汇合率达60-80％左右时，胰酶消化，离心去上清收集细胞，再接种于T75细胞培养瓶继续进行传代培养，直至汇合率达90％以上，收集细胞冻存或继续进行传代培养；

(9)针对步骤(8)所得的hUC-MSC，检测以下项目：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染、增殖特性。

上述方法中，所述样本为新鲜脐带组织。

上述方法中，所述脐带保存运输液为临用现配的加入注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素、两性霉素B的无钙镁D-Hank's液，其中青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素在保护液中的终浓度均为100-200U/mL，两性霉素B终浓度为300U/ml；40-60mL保护液装于无菌样本瓶，封口膜封口。

上述方法中，所述间充质干细胞培养基为无血清培养基，包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的b-FGF。

所述红细胞裂解液为包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mmol/LNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4，过0.22μm微滤膜，平衡至室温备用。

IV型胶原酶消化液为含1％胶原酶IV、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶、2％血清替代物的D-Hank’s液。

并且步骤(6)中，接种密度为2-3×10⁴细胞/cm²。

步骤(8)中，胰酶浓度为0.125％，消化时间为1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；所述传代比例为1:3-1:4；所述冻存为每ml冻存液保存2-3×10⁶个细胞。

另一方面，本发明还提供通过上述方法获得的hUC-MSC。

优选地，所述hUC-MSC具有以下特征：

(1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长；

(2)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC的阳性比例大于99.0％；CD45、CD34和HLA-DR的阳性比例小于1.0％；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞；

(4)活细胞检测比率达99％以上；

(5)呈典型的“S型”生长曲线特性；

(6)表达多能性基因，所述多能性基因为选自SSEA-4、OCT-4、NANOG和SOX-2中的一种或多种。

又一方面，本发明提供本文所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或所述间充质干细胞无血清培养基在制备用于分离培养间充质干细胞的试剂中的用途。

再一方面，本发明提供一种用于分离培养间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或所述间充质干细胞无血清培养基。

本发明提出了一种采用红细胞裂解液辅助胶原酶消化的脐带间充质干细胞提取方法，其中用红细胞裂解液处理能够去除对hUC-MSC原代细胞生长影响较大的红细胞，在很大程度上提高了所提取的hUC-MSCs纯度；而胶原酶消化显著缩短了原代细胞的培养时间，因而这一提取方法实现了优良效果。综合而言，本发明的提取方法在6-8天便可收获原代细胞，并且在第二代后细胞纯度便可达到99％以上。此外，本发明的方法简单易行，成本低廉，采用的培养基无血清组分，且组成明晰，避免了在培养细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况，也排除了传播异种病原体危险的可能，基于此的无血清培养使得hUC-MSC的安全性更高，具有良好的应用前景。

经流式细胞仪测定，经活力检测、分化能力鉴定以及多能性基因分析，通过本发明方法获得的间充质干细胞活率高，纯度高，分化能力强，建立的细胞库可直接用于科学研究和临床辅助治疗。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是在培养基组成筛选过程中的细胞图，其中图1A为低浓度血清替代物培养基接种48小时后细胞形态，图1B为高浓度血清替代物培养基接种24小时后细胞形态，图1C为低浓度bFGF培养基接种24小时后细胞形态，图1D为高浓度bFGF培养基培养细胞在传代后细胞形态。

图2为所培养的hUC-MSC的细胞形态，其中图2A为原代细胞的初始汇合形态，图2B为传代后培养的成纤维状细胞形态，图2C为不使用红细胞裂解液处理的细胞形态。

图3(3A至3I)为获得的hUC-MSC经流式细胞仪分析细胞表面分子的结果，显示所述hUC-MSC表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC，阳性比例大于99.0％；不表达CD45、CD34、HLA-DR，阳性比例小于1.0％。

图4为Vi-Cell细胞活力分析仪对获得的hUC-MSC的细胞活力、生长特性分析，其中图4A为hUC-MSC的实时活力分析，图4B为hUC-MSC的生长曲线，图4C为hUC-MSC的直径分布图，图4D为hUC-MSC的消化后圆度分布图。结果表明hUC-MSC的活性在99.7％以上，细胞直径分布在9-15μm，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。

图5为获得的hUC-MSC向成骨细胞的定向诱导分化，其中图5A为茜素红与成骨过程的钙结节发生显色反应产生的深红色化合物，图5B为油红O对成脂细胞的脂肪泡特异性着色。

图6为获得的hUC-MSC多能性基因在转录水平的RT-PCR分析。其中M为核酸分子量标准，1为内参基因β-Actin，2为NANOG，3为OCT-4，4为SOX-2，5为SSEA-4。

图7为免疫荧光染色分析获得的hUC-MSC多能性特异蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

未注明具体条件的，按照本发明所属领域的常规条件或仪器试剂供应商的建议条件进行；未注明商购来源的，为可以市售购得的常规产品。

实施例1间充质干细胞无血清培养基组成的筛选

(一)血清替代物的含量筛选

受试培养基：0.1体积份的β-巯基乙醇，10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，1、2、5、8、10、12、15或20体积份的KnockoutFBS血清替代物(10828-028，Gibco公司)，89体积份的a-MEM。

在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSC，以2×10⁴个细胞/cm²密度接种于T75细胞培养瓶，加12-15ml常规市售培养基培养细胞。培养并观察细胞已完全贴壁后，更换15mL受试培养基。观察细胞生长情况。

结果：在培养基中分别含1、2、5体积份血清替代物的三个浓度组中，细胞增殖缓慢，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC部分细胞聚集，细胞扁平，折光率差，汇合度达20％左右，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达60％左右汇合后，基本停止增殖(见图1A)；在培养基中分别含8、10、12体积份血清替代物的三个浓度组中，细胞生长状态良好，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60％，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达90％以上汇合；在培养基中分别含15、20体积份血清替代物的两个浓度组中，出现和低浓度组相同的状况，细胞生长缓慢，细胞扁平化，轮廓清晰(见图1B)。

(二)重组人碱性成纤维生长因子的含量筛选

受试培养基：0.1体积份的β-巯基乙醇，1、2、5、8、10、12、15、18或20ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，10体积份的KnockoutFBS血清替代物(10828-028，Gibco公司)，89体积份的a-MEM。

参考第(一)部分方法，以相同细胞源、相同密度接种，加12-15mL常规市售培养基培养细胞。培养并观察细胞已完全贴壁后，更换15mL受试培养基。观察细胞生长情况。

结果：在培养基中分别含1、2ng/mlbFGF的两个浓度组中，细胞增殖缓慢，细胞状态差，呈现营养不足状态(参见图1C)；在培养基中分别含5、8、10、12、15ng/mlbFGF的浓度组中，细胞正常生长，亮度高，生长好；在培养基中分别含18、20ng/mlbFGF的浓度组中，细胞增殖良好，明亮，但经过多次传代过程中，细胞易分化，细胞会成团状汇集，或触角变长(参见图1D)。

实施例2红细胞裂解液辅助胶原酶提取hUC-MSC的方法

样本的采集与运输：无菌条件下采集自然分娩新生儿脐带样本，放入含青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的脐带保存运输液，(D-Hank's液中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为150U/ml；两性霉素B的浓度为300U/mL)中，6小时内冰上运输至洁净细胞房；

样本的清洗和消毒：在生物安全柜柜内，将新鲜脐带样本放入50ml无菌离心管中，75％酒精冲洗2遍，再用无菌生理盐水冲洗3次；

脐带组织的预处理：用眼科剪将脐带剪成2-3cm长短左右小段，用镊子除去血管中淤血，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳去除两条脐动脉和一条脐静脉，将脐带外层羊膜组织置于50ml离心管，加1.5-2倍体积PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；

红细胞裂解液处理：将PBS清洗的脐带外层羊膜组织转移至洁净无菌的100mm培养皿，剪成1-3mm³大小组织块；将肉糜状脐带外层羊膜组织块重新转移至离心管，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温处理3分钟，然后1200rpm、4℃下离心6分钟，弃上清，收集组织块；PBS缓冲液清洗2次；其中红细胞裂解液包含5g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA，pH为7.2-7.4；

IV型胶原酶消化：向离心管中加入组织块2倍体积的包含IV型胶原酶的消化液(包含1％IV型胶原酶、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶、2％血清替代物的D-Hank’s液)，移入CO₂浓度为5％的37℃恒温培养箱中，消化8小时后从培养箱中移出洁净工作台，加PBS缓冲液稀释后过200目无菌筛过滤，收集滤过液，放入50ml离心管，PBS清洗后1200rpm、4℃下离心6分钟，去残留酶；

hUC-MSC原代培养：轻弹离心管底细胞团，加入脐带间充质干细胞无血清培养基，制成细胞悬液，以3×10⁴细胞/cm²接种于100mm培养皿，共得6个皿，移入恒温培养箱中，每3天更换新鲜培养基；所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、10体积份的Knockout^TM血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的b-FGF；

移入恒温培养箱中培养第5天，用移液器缓慢吸取培养上清液，检测以下项目：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒，支原体、衣原体、内毒素；

细胞传代：移入恒温培养箱中培养，原代培养第6天贴壁细胞汇合率达50％左右时(图2A)，加0.125％胰酶消化1-2分钟(消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁)后，4℃下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，再以1:4比例接种于T75细胞培养瓶继续进行传代培养，直至汇合率达90％，收集细胞冻存或继续进行传代培养。

检测得知，待细胞传至第2代后细胞纯度大于99％。传代后培养的成纤维状细胞形态见图2B。

实施例3红细胞裂解液辅助胶原酶提取hUC-MSC的方法

采用的红细胞裂解液包含10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA，pH为7.2-7.4。

参考实施例2的方法进行，包含IV型胶原酶的消化液消化12小时，原代细胞共铺8个培养皿，培养至第2天有间充质干细胞贴壁，在第7天左右汇合率达60％，胰酶消化后传代；传至第三代后细胞纯度大于99.2％，活力为99.7％。

实施例4不使用红细胞裂解液提取脐带间充质干细胞的方法

样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成1-3mm³肉糜状组织块，不经红细胞裂解液处理，仅采用包含IV胶原酶的消化液消化8h，过200目筛后均匀接种在100mm无菌培养皿上，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入CO₂浓度为5％的37℃培养箱进行培养。移入培养箱第3天有间充质干细胞贴壁，但有大量红细胞贴在皿底，占据干细胞贴壁空间，细胞生长状况不佳(图2C)。

实施例5不同浓度红细胞裂解液提取间充质干细胞的方法

样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成1-3mm³肉糜状组织块，分别加入含1、2、5、7、10、15或20g/L的NH₄Cl与0.1mMNa₂-EDTA的红细胞裂解液(pH为7.2-7.4)，处理2分钟，采用包含IV胶原酶的消化液消化8h，过200目筛后均匀接种在100mm无菌培养皿上，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入CO₂浓度为5％的37℃培养箱进行培养。观察细胞生长情况。

结果：经其中NH₄Cl浓度为1或2g/L的红细胞裂解液处理后，平皿底仍有明显可见的红细胞影响间充质干细胞贴壁；经其中NH₄Cl浓度为5、7或10g/L的红细胞裂解液处理后，皿底红细胞较少，间充质干细胞贴壁时间短(2-3天)；经其中NH₄Cl浓度为15或20g/L的红细胞裂解液处理后，平皿底无红细胞，但间充质干细胞贴壁数量极少，大量漂浮死亡细胞，贴壁时间晚(4-5天)。

实施例6不同时间红细胞裂解液处理脐带提取间充质干细胞的方法

样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成1-3mm³肉糜状组织块，加入含5g/L的NH₄Cl与0.1mMNa₂-EDTA的红细胞裂解液(pH为7.2-7.4)，分别处理脐带组织块1、2、5、7或10分钟后，采用包含IV胶原酶的消化液消化8h，过200目筛后均匀接种在100mm无菌培养皿上，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入CO₂浓度为5％的37℃培养箱进行培养。观察细胞生长情况。

结果：在处理时间为1分钟的组中，平皿底仍有明显可见的红细胞影响间充质干细胞贴壁；在处理时间为2或5分钟的组中，皿底红细胞较少，间充质干细胞贴壁数量多，细胞明亮，快速贴壁(2-3天)；在处理时间为7或10分钟的组中，平皿底无红细胞，间充质干细胞数量极少，贴壁的间充质干细胞生长缓慢。

实施例7不同浓度IV型胶原酶的消化液提取间充质干细胞的方法

样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成1-3mm³肉糜状组织块，加入含5g/L的NH₄Cl与0.1mMNa₂-EDTA的红细胞裂解液(pH为7.2-7.4)，处理2分钟，离心收集组织块，向离心管中加入组织块2倍体积的包含IV型胶原酶的消化液(包含0.1％、0.5％、1％、2％或5％IV型胶原酶、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶、2％血清替代物的D-Hank’s液)，移入CO₂浓度为5％的37℃恒温培养箱中，消化8小时后从培养箱中移出洁净工作台。过200目无菌筛。加入脐带间充质干细胞无血清培养基，制成细胞悬液，以3×10⁴细胞/cm²接种于100mm培养皿，放入CO₂浓度为5％的37℃培养箱进行培养。观察细胞生长情况。

结果：经其中IV型胶原酶浓度为0.1％或0.5％的消化液处理8h后，消化液中仍有大量组织块未消化完全，200目筛困难，易堵塞；经其中IV型胶原酶浓度为1％的消化液处理8h后，组织块消化充分，少量残余组织块，易过筛，铺皿后，大部分细胞贴壁生长，死细胞少；经其中IV型胶原酶浓度为2％或5％的消化液处理8h后，组织块消化充分，过200目筛以相同密度铺皿后，有大量细胞消化死亡，不能贴壁生长。

实施例8不同时间IV型胶原酶的消化液提取间充质干细胞的方法

实施方法参照实施例5的条件，IV型胶原酶的消化液为包含1％IV型胶原酶、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶、2％血清替代物的D-Hank’s液，消化液处理时间分别为2、4、6、8、10、12、16、20、24h，其他条件相同，观察细胞生长情况。

结果：在处理时间为2、4或6h的组中，消化不充分，消化液中仍有大量组织块残留，200目筛困难，易堵塞，细胞数量少，原代细胞培养时间长；在处理时间为8、10或12h的组中，组织块消化充分，少量残留组织块，易过筛，铺皿后，大部分细胞贴壁生长，死细胞少，细胞生长快速；在处理时间为16、20或24h的组中，组织块消化充分，过200目筛以相同密度铺皿后，不能贴壁死细胞较多，贴壁细胞生长缓慢。

实施例9hUC-MSC形态学鉴定

通过实施例3的分离培养，在培养2天后，显微镜下可见明亮贴壁圆形细胞。培养3天后在显微镜下可见到明亮贴壁圆形细胞伸出触角，呈梭形贴壁状，在7天左右形成旋涡状细胞团出现。消化传代培养过程中，细胞形态均一，增殖快，传代过程细胞状态稳定。

实施例10流式细胞仪分析hUC-MSC的表面标志

取实施例3分离培养的第3代细胞，待细胞生长至90％汇合后，2mL0.125％胰酶消化，然后在4℃下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，PBS清洗两次，将细胞每管1×10⁵转移至流式管，分别加5μLCD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE、IgG1-PE(同型对照)和IgG1-FITC(同型对照)抗体，混匀4℃下避光孵育30分钟，PBS清洗一次，离心去上清，加500μLPBS缓冲液重悬混匀，上机检测(流式细胞仪XL，Beckman公司)，每个样本收集1×10⁴细胞。

细胞免疫表型如下：

阳性表达：CD29>99.0％，CD44>99.0％，CD73>99.0％，CD105>99.0％，CD90>99.0％，HLA-ABC99.0％；

阴性表达：CD34<1.0％，CD45<1.0％，HLA-DR<1.0％。

结果参见图3。

实施例11细胞活力仪分析hUC-MSC的细胞活力、生长特性

将实施例3分离培养的第二代细胞接种到T25培养瓶中，待细胞达到95％-100％汇合后，0.125％胰酶消化，收集细胞以1×10⁵/孔密度接种于两个6孔板。待细胞全部贴壁后且部分生长10小时后，收集两孔细胞加500μLPBS制成细胞悬液，上机分析(细胞活力分析仪Vi-CellXR，Beckman公司)。此后每12小时取样分析，绘制生长曲线。

结果参见图4，表明hUC-MSC活性在99.7％以上，细胞直径分布在9-12μm，成梭形旋涡状生长的hUC-MSC消化后具有完整圆度，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。

实施例12hUC-MSC多向分化潜能的鉴定

1)成骨诱导分化

将实施例2分离培养的第4代hUC-MSC以3×10⁴细胞/cm²接种至6孔细胞培养板，24小时后，每孔添加新鲜配制的人UCMSC成骨诱导分化培养基(HUXUC-90021，赛业产品)2mL，此后每3天更换新鲜的成骨分化诱导培养基，2周后多聚甲醛固定，茜素红染色3-5分钟。

结果参见图5A，表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成骨诱导两周后，茜素红与成骨过程的钙结节发生深红色显色反应，另外成骨标志基因OPN也在诱导前后出差异表达。

2)成脂诱导分化

将实施例2分离培养的第4代hUC-MSC以2×10⁴细胞/cm²接种至6孔细胞培养板，待细胞达到100％汇合后，每孔添加成脂诱导分化培养基A液(HUXUC-90031，赛业产品)开始诱导，3天后换成成脂诱导分化培养基B液进行维持24小时，如此循环。当脂滴出现较多但较小时，用成脂诱导液B维持7天，诱导结束后4％多聚甲醛固定，油红O染色。

结果参见图5B，表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成脂诱导两周后，油红O对成脂细胞着色明显。

实施例13RT-PCR分析hUC-MSC多能性基因

将实施例2分离培养的第3代hUC-MSC以5×10⁵细胞的密度接种于T25细胞培养瓶中，2-3天后至细胞100％汇合收集细胞，按总RNA提取试剂盒(R6834-01，OMRGA公司产品)抽提RNA，将抽提的RNA用反转录试剂盒(RR014A，TAKARA产品)反转录得到cDNA样本，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后移至凝胶成像仪观察。

结果参见图6，表明脐带多能性标志基因NANOG、OCT4、SOX2以及SSEA4有明亮程度不同的条带。

实施例14免疫荧光染色分析hUC-MSC特异性蛋白

将实施例2分离培养的第3代hUC-MSC以5×10³细胞每孔的密度接种于24孔细胞培养板，待细胞生长至30％～50％汇合，以4％多聚甲醛固定15分钟后用0.25％TritonX-100打孔处理20分钟，山羊血清封闭后加稀释好的鼠抗人一抗(抗-SOX2抗体、抗-OCT4抗体、抗-NANOG抗体和抗-NANOG抗体)，在4℃下过夜避光孵育；之后加FITC标记的山羊抗鼠二抗，在室温下避光孵育2小时；然后以DAPI/PI染核，在室温下避光孵育20分钟，荧光显微镜下观察。

结果参见图7，表明以本发明方法分离提取的hUC-MSC表达SOX-2、OCT-4、NANOG以及SSEA-4特异性蛋白。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (12)

1.一种分离提取hUC-MSC的方法，其特征在于，所述方法包括：采用红细胞裂解液与胶原酶处理脐带外层羊膜组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液为包含NH₄Cl和Na₂-EDTA的水溶液，优选为包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更优选为包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4；

优选地，所述胶原酶为IV型胶原酶，优选为包含IV型胶原酶的消化液，优选为包含IV型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’s液，更优选为包含1％IV型胶原酶、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶和2％血清替代物的D-Hank’s液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入所述包含IV型胶原酶的消化液再次处理。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：经胶原酶消化后，采用间充质干细胞无血清培养基培养，以获得原代间充质干细胞；其中所述间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物；

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；

最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的脐带外层羊膜组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入2-3倍体积的所述包含IV型胶原酶的消化液，在37℃和5％浓度的CO₂下消化8-12小时；

优选地，所述方法还包括：以1-5×10⁴细胞/cm²培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，每3-4天更换新鲜培养基。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)脐带组织的预处理：

将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，向羊膜组织中加入PBS缓冲液清洗；

(2)红细胞裂解液处理：

将经步骤(1)获得的脐带组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗；

(3)胶原酶消化：

将经步骤(2)获得的组织块中加入包含IV型胶原酶的消化液再次处理，然后加入PBS缓冲液稀释，无菌筛过滤收集细胞；

(4)原代培养：

采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(3)获得的细胞，以获得原代间充质干细胞；

优选地，所述方法还包括以下步骤：

(5)上清液检测：

取步骤(4)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；

(6)传代培养：

取步骤(5)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞备用、冻存或继续传代；

(7)细胞检测：

取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：将新鲜脐带分割成2-3cm长的小段，去除血管中淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，向羊膜组织中加入1.5-2倍体积的PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；

优选地，所述步骤(2)包括：

将经清洗的脐带外层羊膜组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟，离心收集组织块，PBS缓冲液清洗2-3次；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4℃下离心6分钟；

优选地，所述步骤(3)包括：

向经处理的外层羊膜组织块中加入2-3倍体积的包含IV型胶原酶的消化液，在37℃和5％浓度的CO₂下消化8-12小时，然后加入PBS缓冲液稀释后过100目或200目无菌筛过滤，收集滤过液，PBS清洗离心；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4℃下离心6分钟；

优选地，所述步骤(4)包括：

以1-5×10⁴细胞/cm²培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，每3-4天更换新鲜培养基；

优选地，所述步骤(5)包括：

取步骤(4)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的全部：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；

优选地，所述步骤(6)包括：

取步骤(5)中全部检测项目为阴性的培养细胞，待贴壁细胞汇合率达30-60％时，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养至汇合率达90％以上，收集细胞备用、冻存或继续传代；其中优选地，所述胰酶的使用浓度为质量百分比为0.125％，消化1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；并且其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4℃下离心6分钟；

优选地，将收集的细胞以2-3×10⁶细胞/ml的密度冷冻保存在-196液氮中；或者优选地，将收集的细胞以1:3-1:4的比率进行细胞传代；

优选地，所述步骤(7)包括：

取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的全部：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中在步骤(1)之前还进行脐带清洗、保存和使用前处理；

优选地，所述处理包括：

无菌条件下采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，经表面无菌生理盐水清洗后，放入脐带保存运输液中，优选在6小时内冰上运输至洁净细胞实验室；在使用前，将新鲜脐带以75％乙醇水溶液冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；

其中优选地，所述脐带保存运输液为包含注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的无钙镁D-Hank's液；更优选地，其中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为100-200U/mL，优选150U/ml；两性霉素B的浓度为200-400U/mL，优选300U/mL。

9.通过权利要求1至8中任一项所述的方法获得的hUC-MSC。

10.根据权利要求9所述的hUC-MSC，其特征在于，所述间充质干细胞具有以下特征：

(1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长；

(2)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC的阳性比例大于99.0％；CD45、CD34和HLA-DR的阳性比例小于1.0％；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞；

(4)活细胞检测比率达99％以上；

(5)呈典型的“S型”生长曲线特性；

(6)表达多能性基因，所述多能性基因为选自SSEA-4、OCT-4、NANOG和SOX-2中的一种或多种。

11.权利要求2所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或权利要求4所述的间充质干细胞无血清培养基在制备用于分离培养间充质干细胞的试剂中的用途。

12.一种用于分离培养间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或权利要求4所述的间充质干细胞无血清培养基。