CN106479970A - 一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞领域，公开了一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法。本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法向玻璃培养瓶中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO₂的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM搅拌2h；升温至37℃于15RPM‑40RPM、5％CO₂条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。与现有方法相比，本发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，且能很好保持脂肪间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性。

Description

一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。

目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经***疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。

脂肪间充质干细胞(ADMSCs)是存在于人脂肪组织中的一种干细胞。来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。

然而脂肪间充质干细胞无论是用于临床还是用于组织工程都需要大量的细胞。临床应用常需要达到10⁸-10¹⁰数量级。由于间充质干细胞需要贴壁生长，这种规模的细胞数量如果在实验室中使用培养瓶扩增，耗材消耗量大，人工的付出也是惊人的。

生物反应器是利用生物体所具有的生物功能，在体外或体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置***、细胞、组织器官等等。生物反应器可用于大规模扩增细胞，但是通常生物反应器用于悬浮细胞的大规模扩增，而且是开放式***，需要很多支持设备，不但操作复杂，还容易导致污染等问题，临床应用存在相当大的风险。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法脂肪间充质干细胞的培养方法，本发明所述方法可短时间获得大量高纯度脂肪间充质干细胞，且能保持脂肪间充质干细胞良好的干细胞特性。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1)向培养容器中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO₂的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；

2)调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM的速度搅拌2h；

3)升温至37℃，于15RPM-40RPM的搅拌速度、5％CO₂条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。

在一些实施方案中，本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法中所述预处理的微载体的加入量为至微载体终浓度为0.5mg/mL-5.0mg/mL。

在一些实施方案中，本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法中所述微载体为Cytodex1微载体、Cytodex2微载体、Cytodex3微载体、Cytopore微载体或Cytoline微载体。在一些实施方案中，所述微载体预处理的方法为微载体先用pH 7.4的磷酸缓冲液浸泡膨胀，灭菌；使用前，无菌的微载体用温热的培养基润洗后用少量的培养基重悬。

在一些实施方案中，所述微载体预处理的方法为微载体先用pH 7.4的磷酸缓冲液浸泡膨胀，灭菌；使用前，无菌的微载体用温热的培养基润洗后用少量的培养基重悬。

在一些具体实施例中，所述微载体预处理的方法为干燥的微载体在无Ca²⁺、Mg²⁺、pH 7.4的磷酸缓冲液中在室温下浸泡膨胀至少3小时，弃去上清液，用新配制的无Ca²⁺、Mg^{2 +}、pH 7.4的PBS洗涤微载体数分钟，弃去PBS，换上新的无Ca²⁺、Mg²⁺、pH 7.4的PBS，然后微载体溶液用高压灭菌法灭菌；使用之前，先让无菌的微载体沉降，倾去上清，然后用温热的培养基润洗，然后让微载体沉降，弃去上清，然后用少量的培养基重悬后备用。

在一些实施方案中，本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法中所述脂肪间充质干细胞的加入量为至脂肪间充质干细胞终浓度为0.5cells/mL-2×10⁵cells/mL。

本发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法中，在培养期间需要补加脂肪间充质干细胞培养基。在一些实施方案中，所述补加脂肪间充质干细胞培养基具体为48h更换50％的培养基。

本发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法中所述脂肪间充质干细胞培养基的配方为DMEM/F12+15％FBS。

本发明所述脂肪间充质干细胞的获取方法为：培养的人脂肪间充质干细胞停止搅拌，微载体沉降，弃去上清培养基，用pH7.6的含有EDTA的无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS洗涤，然后用胰酶-EDTA溶液消化，15min后，加入含有10％(v/v)血清FBS的细胞培养液终止消化，得到P2代细胞，可得到2.1×10⁶个细胞/mL，细胞数量扩增约10倍。

其中，所述EDTA-PBS溶液的总量应在(50-100)mL/g Cytodex3。

本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法向培养容器中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO₂的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM的速度搅拌2h；升温至37℃，于15RPM～40RPM的搅拌速度、5％CO₂条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。本发明所述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，且能很好保持脂肪间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，适用于脂肪间充质干细胞的大量培养。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例5流式细胞术检测冻存复苏后细胞各表面标志的结果图，其中图a为细胞标志CD73、图b为CD90、图c为CD105、图d为CD11b、图e为CD19、图f为CD34、图g为CD45、图h为HLA-DR-A。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步说明本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中，各实施例中的操作均在严格无菌环境下进行。

实施例1、脂肪间充质干细胞分离提取

取新鲜采集的人脂肪，PBS清洗2次后，采用I型胶原酶消化分离，在含血清替代物细胞培养液的培养器皿中，于37℃、5％CO₂条件下静置培养，48小时后PBS清洗换液，得到原代脂肪间充质干细胞。

其中，所述含血清替代物细胞培养液的配方为DMEM/F12+15％FBS。

实施例2、脂肪间充质干细胞的培养器皿培养扩增

当原代脂肪间充质干细胞长满平皿的80％时，弃去原培养液，用PBS洗涤2遍，加入覆盖皿底量的含有EDTA的胰蛋白酶，消化1-2min，期间不间断用倒置显微镜观察，见胞质回缩，细胞间隙增大，细胞变圆，立即加入相应体积的细胞培养基终止消化，用移液管反复吹打贴壁细胞，将细胞吹打下来，1500r/min离心5min，再用细胞培养液重悬细胞，按照密度为6×10⁴个细胞/mL，接种到平皿中，加入新鲜细胞培养液于37℃、5％CO₂条件下培养，3天换液，得到P1代细胞。即可得到2×10⁵个细胞/mL细胞，细胞数量扩增约3倍。

实施例3、脂肪间充质干细胞在含微载体生物反应器中培养扩增

①玻璃培养瓶预处理：工作体积为500mL的玻璃培养瓶清洗干净，烘干至完全干燥，加入硅化液于瓶中，缓慢旋转培养瓶使硅化液浸润瓶壁，吸去硅化液后，将转瓶置于通风处风干12h，蒸馏水冲洗备用。

②微载体预处理：干燥的微载体Cytodex-3在无Ca²⁺、Mg²⁺、pH 7.4的磷酸缓冲液中在室温下浸泡膨胀至少3小时，弃去上清液，用新配制的无Ca²⁺、Mg²⁺、pH 7.4的PBS洗涤微载体数分钟，弃去PBS，换上新的无Ca²⁺、Mg²⁺、pH 7.4的PBS，然后微载体溶液用高压灭菌法灭菌；使用之前，先让无菌的微载体沉降，倾去上清，然后用温热的培养基润洗，然后让微载体沉降，弃去上清，然后用少量的培养基重悬后备用。

③脂肪间充质干细胞的接种：玻璃培养瓶中加入1/3-1/2终体积的细胞培养基，在湿度95％、5％CO₂的培养箱中于35.5℃温育平衡30分钟；调整细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体至浓度为0.5mg/mL-5.0mg/mL后，缓慢加入原代脂肪间充质干细胞至浓度为0.5cells/mL-2×10⁵cells/mL，以5RPM～20RPM的搅拌速度在黑暗条件下搅拌4小时，之后在1小时之内将温度均匀升至37℃，搅拌速度提升至15～40RPM，加入细胞培养基至终体积，于37℃、5％CO₂条件下培养。每48h更换50％的培养基，。

④脂肪间充质干细胞的获取：停止搅拌，微载体沉降，弃去上清培养基，用pH7.6的含有EDTA的无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS洗涤，EDTA-PBS溶液的总量应在(50-100)mL/gCytodex3。弃去EDTA-PBS溶液，然后用胰酶-EDTA溶液在37℃温育，不时地搅拌，15min后，加入含有10％(v/v)血清替代物的培养液终止胰酶的作用，可得到2.1×10⁶个细胞/mL，细胞数量扩增约10倍。

实施例4、脂肪间充质干细胞的冷冻保存

将平皿中长满至80-90％的脂肪间充质干细胞，去除旧的培养液，用PBS清洗2遍，接着加入含有EDTA的胰酶37℃消化1-2min，待细胞全部脱落后，加入细胞培养液终止消化，1500rpm/min离心5min，去除上清，再用干细胞冻存液将细胞重悬，获得的脂肪间充质干细胞悬液加入到细胞冻存管中，置于含异丙醇的程序式降温盒中-80℃过夜，第二天转移到-196℃的液氮中长期保存。

实施例5、流式细胞术检验复苏细胞表面标记

取1管冻存细胞37℃复苏后加入脂肪间充质干细胞培养基(DMEM/F12+15％FBS)于37℃、5％CO₂条件下培养3天后收获3×10⁶cell，用作流式检测。检测结果如图1所示。统计检测结果见表1。

表1流式细胞术检测冻存复苏后细胞各表面标志的结果

CD73

CD90

CD105

CD11b

CD19

CD34

CD45

HLA-DR

100.0％

100.0％

100.0％

1.2％

0.1％

0.2％

0.0％

0.2％

结果显示，冻存复苏后的脂肪干细胞表面标记物表达正常，符合典型的脂肪干细胞表面标记物表达。

Claims (7)

1.一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1)向培养容器中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO₂的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；

2)调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM的速度搅拌2h；

3)升温至37℃，于15RPM-40RPM的搅拌速度、5％CO₂条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，所述预处理的微载体的加入量为至微载体终浓度为0.5mg/mL-5.0mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述微载体为Cytodex1微载体、Cytodex2微载体、Cytodex3微载体、Cytopore微载体或Cytoline微载体。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，所述微载体预处理的方法为微载体先用pH7.4的磷酸缓冲液浸泡膨胀，灭菌；使用前，无菌的微载体用温热的培养基润洗后用少量的培养基重悬。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，所述脂肪间充质干细胞的加入量为至脂肪间充质干细胞终浓度为0.5cells/mL-2×10⁵cells/mL。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，所述补加脂肪间充质干细胞培养基具体为每48h更换50％的培养基。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，所述脂肪间充质干细胞培养基的配方为DMEM/F12+15％FBS。