CN110499282B

CN110499282B - 一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法

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Publication number: CN110499282B
Application number: CN201910827034.0A
Authority: CN
Inventors: 陈东煌; 陈海佳; 葛啸虎; 王小燕; 黄幸
Original assignee: Guangdong Guoke Cell Technology Co ltd; Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Guoke Cell Technology Co ltd; Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-09-03
Also published as: CN110499282A

Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。本发明将TGF‑β1、EGF和G‑CSF添加入基础培养基，作为肌腱干细胞成脂肪分化的诱导培养液。提高了肌腱干细胞向脂肪细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导肌腱干细胞，能够在21天内即出现脂肪细胞的特性，细胞形态发生改变且油红O染色细胞数目增多。诱导28天后，细胞形态逐渐改变，呈多角形，细胞间质内含有矿盐沉积的钙化结节，油红O染色呈阳性。

Description

一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。

背景技术

肌腱病在高运动量的人群中常见，以局部疼痛、肿胀、功能障碍为临床特征，常见发病部位为肩袖、岗上肌、髌腱及跟腱。目前肌腱病的发病机制尚未完全研究清楚，对肌腱病的治疗方法有限，疗效不明确，这与对该病病理机制缺乏深入了解有关。

2007年美国学者从人和兔的肌腱中分离出一种具有自我更新能力的细胞，将其命名为肌腱干细胞或祖细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)。2010年香港学者从鼠肌腱中也分离出肌腱干细胞。该细胞具有多向分化潜能，并且在外源性***素E2作用下异常分化。

目前，有学者提出肌腱干细胞的异常分化可能是肌腱病的发病基础，但目前对肌腱干细胞的分化机制尚未研究清楚。为了了解慢性腱病组织病理学变化提供细胞生物学依据，也为慢性腱病的临床治疗提供新思路，应当进一步研究肌腱干细胞的分化机制，开发肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。

本发明提供的培养基包括基础培养基、TGF-β1、EGF和G-CSF。

转化生长因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。转化生长因子-β属于转化生长因子-β超家族蛋白。转化生长因子-β可以结合到细胞表面的转化生长因子-β受体结合而激活其受体。本发明中，所述TGF-β1的浓度100ng/ml～200ng/ml。一些具体实施例中，所述TGF-β1的浓度为100ng/ml或200ng/ml。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。本发明中，所述G-CSF的浓度10ng/ml～20ng/ml。一些具体实施例中，所述G-CSF的浓度为10ng/ml或20ng/ml。

表皮细胞生长因子(EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。本发明中，所述EGF的浓度10ng/ml～20ng/ml。一些具体实施例中，所述EGF的浓度为10ng/ml或20ng/ml。

本发明中，所述基础培养基为DMEM培养液。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 100ng/ml、EGF 10ng/ml、G-CSF10ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 100ng/ml、EGF 10ng/ml、G-CSF20ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 100ng/ml、EGF 20ng/ml、G-CSF10ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 100ng/ml、EGF 20ng/ml、G-CSF20ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 200ng/ml、EGF 10ng/ml、G-CSF10ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 200ng/ml、EGF 10ng/ml、G-CSF20ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 200ng/ml、EGF 20ng/ml、G-CSF10ng/ml、DMEM培养基。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 200ng/ml、EGF 20ng/ml、G-CSF20ng/ml、DMEM培养基。

本发明提供的培养基在诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化中的应用。

本发明中，肌腱干细胞为人跟腱来源肌腱干细胞。

本发明还提供了一种诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法，以本发明提供的培养基诱导肌腱干细胞。

本发明提供的方法中，肌腱干细胞为人跟腱来源肌腱干细胞，其分离培养方法包括：

步骤1：将跟腱组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块，以浓度为3mg/mL的I型胶原酶37℃消化2h后，经70μm滤器过滤形成单细胞悬液；

步骤2：将单细胞悬液以300×g离心5min，将细胞沉淀以500个/cm²细胞密度接种至完全培养基(含10v％FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基)培养10d后，经质量分数为0.25％胰蛋白酶消化后，标记为原代细胞，以完全培养基传代。

本发明进行诱导的肌腱干细胞为第3代肌腱干细胞；诱导密度为5×10⁴个/孔。

本发明中诱导每3天更换培养基；所述诱导的时间为20天。

本发明将TGF-β1、EGF和G-CSF添加入基础培养基，作为肌腱干细胞成脂肪分化的诱导培养液。提高了肌腱干细胞向脂肪细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导肌腱干细胞，能够在21天内即出现脂肪细胞的特性，细胞形态发生改变且油红O染色细胞数目增多。诱导28天后，细胞形态逐渐改变，呈多角形，细胞间质内含有矿盐沉积的钙化结节，油红O染色呈阳性。

附图说明

图1示实验组5诱导17天后与阴性对照组染色比较；

图2示阳性对照组诱导25天后与阴性对照组染色比较。

具体实施方式

本发明提供了一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

无菌条件下取人跟腱组织，PBS冲洗3次，剪除表面部分***，分离跟腱组织。将跟腱剪成1mm×1mm×1mm的碎块，3mg/mLⅠ型胶原酶37℃消化2h，70μm滤器过滤形成单细胞悬液。将单细胞悬液以300×g离心5min，弃上清，将细胞沉淀在完全培养基(含10％FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基)中重悬，以500个/cm²细胞密度接种至直径10cm培养皿中，培养10d，0.25％胰蛋白酶消化后混合，标记为原代细胞。细胞铺满瓶底达90％后传代，弃培养液，无菌PBS清洗2次，0.25％胰蛋白酶消化3min，加入完全培养基终止消化；细胞悬液以180g离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，计数细胞按5×10³个/cm²细胞密度接种至细胞培养瓶。取第1～3代细胞用于后续实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

从跟腱组织消化获得的有核细胞以500个/cm²密度接种后，细胞呈克隆样生长。原代培养10d可见多个散在分布的簇状细胞集落，呈由中心向外辐射样贴壁生长，细胞形态不规则，以多角形为主，细胞核聚集于中心，细胞质形成的突起向外呈放射状。

取第3代细胞，用无菌PBS洗涤2次，0.25％胰蛋白酶消化，室温下以350×g离心5min，将细胞沉淀重悬于染色缓冲液，4℃放置15min。每100微升细胞悬液分别依次加入藻红蛋白标记的CD44、CD90、CD34、CD105一抗，FITC标记的CD45一抗，CD146一抗；同时每管样品设立同型阴性对照，4℃孵育15min。用含2％牛血清白蛋白的预冷PBS洗涤细胞3次后，流式细胞仪检测。结果表明，hATDSCs的MSCs特异性表面标志CD44、CD90和CD105阳性率分别为99.75％±0.21％、99.84％±0.12％和95.76％±0.64％；造血干细胞表面标志CD34、白细胞表面标志CD45以及内皮细胞表面标志CD146的阳性表达率分别为3.34％±0.36％、4.72％±0.24％和4.37％±0.17％。

实施例2

成脂诱导：取第3代细胞，以5×10⁴个/孔密度接种于6孔板，实验分为以下几组：

空白对照组继续以含有10％FBS的L-DMEM培养。

阳性对照组以含有10％FBS、500nmol/L***、500μmol/L异丁基甲基黄嘌呤、50μmol/L吲哚美辛、10μg/mL胰岛素的L-DMEM的培养基培养；

实验组1～8分别以表1中的8组培养基进行培养：

表1培养基配方

以上培养条件，37℃，5％CO₂条件下培养，每3天更换培养基，至20天时进行油红O染色鉴定，统计诱导成为脂肪细胞的天数。细胞诱导17天和诱导25天后的染色情况如图1～2。

表2细胞成脂分化天数

分组	成脂诱导天数
		空白对照	∞
阳性对照	25
		A1	22
A2	20
		A3	19
A4	20
		A5	17
A6	18
		A7	19
A8	19

结果显示，实验组1～8提供的培养基皆能够有效诱导细胞分化成为脂肪细胞，但相对于阳性对照，组1～8的培养基能够缩短成脂肪诱导天数，其中，其中A5效果最佳，成脂诱导的天数显著性的短于其他实验组。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1. 一种用于诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的培养液，其特征在于，由基础培养基、100ng/ml~200ng/ml TGF-β1、10ng/ml~20ng/ml EGF和10ng/ml~20ng/ml G-CSF组成。

2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述TGF-β1的浓度为200ng/ml。

3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述EGF的浓度为10ng/ml。

4.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述G-CSF的浓度为10ng/ml。

5.根据权利要求1~4任一项所述的培养液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养液。

6.权利要求1~5任一项所述的培养液在诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肌腱干细胞为人跟腱来源肌腱干细胞。

8.一种诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求1~5任一项所述的培养液诱导肌腱干细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述肌腱干细胞为第3代肌腱干细胞；诱导密度为5×10⁴个/孔。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导每3天更换培养液；所述诱导的时间为20天。