CN106591230A - 人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法 - Google Patents

人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞培养液，包括体积比为4～6:100:0.8～1.2的浓缩血小板裂解液、伊斯科夫改良培养液和胰岛素转铁蛋白***盐补充液，4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。采用本发明的培养液对脐带组织进行贴壁培养；然后用TrypLE消化液消化；再传代培养。本发明得到的人脐带间充质干细胞纯度较高，可直接用于临床研究，且本发明的培养方法扩增效率高，取材方便，可避免道德争议。并且本发明所述的人脐带间充质干细胞的培养体系不含人血清及动物源性蛋白成份，大大降低了临床治疗时因引入外源蛋白而引起的不良反应，可直接应用于临床研究。

Description

人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。
脐带间充质干细胞来源主要有：
1)骨髓来源：成人骨髓源间充质干细胞细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制。
2)脐血来源：存在较多争议，且脐血间充质干细胞的分离会损失脐血中造血干祖细胞，影响脐血冻存。
3)脐带来源：取材方便，来源广泛，对供者无不利影响，无道德伦理问题的限制，适应症范围广。
间充质干细胞用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞，这两类细胞都具有MSC共同的特点低免疫源性，特别是后者更为明显。脐带中组织结构简单，除了主要的大血管，其余均以***为主，造成了脐带间充质干细胞基本未与抗原接触，所以免疫源性很低。无论是骨髓间充质干细胞还是脐带间充质干细胞在目前的临床研究中异体移植时均不需要配型，受体也无明显的排异反应，这极大的增加了临床应用的可能性。
但是，现有技术中人脐带间充质干细胞培养体系都含有人血清和/或动物源性蛋白，在临床治疗时易引入外源蛋白而引起不良反应。
发明内容
因此，本发明针对现有技术中人脐带间充质干细胞培养体系都含有人血清和/或动物源性蛋白，在临床治疗时易引入外源蛋白而引起不良反应的技术问题，目的在于提供一种新的人脐带间充质干细胞培养液。
本发明的人脐带间充质干细胞培养液包括：体积比为4～6:0.8～1.2:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白***盐补充液(ITS，购自sigma，货号I3146)和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液(IMDM)，以及4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。本发明的培养液由于采用浓缩血小板裂解液代替牛血清蛋白并且无动物源性蛋白，可以很好地避免外源蛋白引起的不良反应，而且本发明的培养液培养得到的人脐带间充质干细胞纯度较高，可直接用于临床研究。
在本发明一较佳实施例中，本发明的人脐带间充质干细胞培养液包括：体积比为5:1:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白***盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及5ng/mL胰蛋白酶抑制剂、15ng/mL重组人表皮生长因子和15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。伊斯科夫改良培养液即IMDM培养基里含有L-谷氨酰胺成份，不含α-硫代甘油、也不含有2-巯基乙醇；或者伊斯科夫改良培养液即IMDM培养基里也可以含有L-谷氨酰胺成份和酚红成份，不含α-硫代甘油、也不含有2-巯基乙醇，如Thermo Fisher公司销售的IMDM培养基(货号为12440053)，具体的配方参见其官网(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053)
本发明的浓缩血小板裂解液可以根据下列方法制备得到：将血小板在20～24℃振荡保存1～5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离心、收集上清液、去除纤维蛋白并浓缩获得浓缩血小板裂解液，具体可参见文献：Soffer E,Ouhayoun JP,Dosquet C,etal.Effects of platelet lysates on select bone cell functions.Clin OralImplants Res.2004；15(5):581-588。
本发明的另一目的在于提供一种人脐带间充质干细胞的培养方法，由该方法培养得到的人脐带间充质干细胞可符合临床治疗级别。
本发明的技术方案概述如下：
本发明的培养人脐带间充质干细胞的方法依次包括以下步骤：
A)用本发明的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行贴壁培养；
B)用TrypLE消化液消化；
C)再本发明的人脐带间充质干细胞培养液传代培养。
步骤A)所述的脐带组织为去除血管和内皮细胞并清洗干净的脐带碎块，可由下列方法制备得到：将人脐带剪成2～4cm优选2cm的脐带小段，再用75％酒精迅速冲洗3遍，在含有抗生素GA-1000(G表示庆大霉素，Gentamicin，浓度为30mg/mL；A表示两性霉素，Amphotericin，浓度为15μg/mL，1000表示使用时按照1:1000比例稀释使用)的无Ca2+和Mg2+的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)中去除三根血管；然后用刮片刮2遍内层以去除单层内皮细胞，再用含有抗生素GA-1000的无Ca2+和Mg2+的DPBS洗3遍；最后将脐带小段剪成1～3mm3优选2mm3的脐带碎块。
步骤A)中贴壁培养时，脐带组织在培养皿上的贴块密度为50％～70％优选60％，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO2条件下，用本发明的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行原代培养6～10天优选8天得到初级原代培养物，原代培养期间每隔3～5天优选4天更换一次培养液。
初级原代培养物继续用本发明的人脐带间充质干细胞培养液原代培养2～6天优选4天，细胞密度可达到80％，得到原代脐带间充质干细胞。
步骤B)中，用例如10～20mL优选15mLTrypLE消化液于35～39℃优选37℃消化3～7分钟优选5分钟。
步骤C)中，传代培养1～3代优选2代。其中传代培养前，先过滤TrypLE消化液，然后用2倍的本发明的人脐带间充质干细胞培养液稀释，再用本发明的人脐带间充质干细胞培养液按照1:3～7优选1:5比例传代培养得到大量的传代脐带间充质干细胞。
所述方法还包括：步骤D)，用无动物源性蛋白且内含5％DMSO的CryoStore CS5冻存液(购自Hemacare，货号205102)冻存传代脐带间充质干细胞；和/或，步骤E)，体外检测传代脐带间充质干细胞，所述体外检测例如包括体外功能性与免疫原性检测等，具体为人脐带间充质干细胞向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，人类白细胞DR、DQ、DP抗原(HLA-DR,DQ,DP)检测；和/或，步骤F)，传代脐带间充质干细胞用于临床治疗。
本发明的积极进步效果在于：本发明培养人脐带间充质干细胞的方法，可得到纯度较高的脐带间充质干细胞。一方面取材方便，所述脐带可取自足月胎儿，可避免道德争议；另一方面，与现有的培养方法相比，本发明所述的人脐带间充质干细胞培养体系不含人血清及动物源性蛋白成份，大大降低了临床治疗时因引入外源蛋白而引起的不良反应，可直接应用于临床研究。
附图说明
图1为人脐带间充质干细胞的显微镜照片；
图2为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD73的流式细胞仪分析图；
图3为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD90的流式细胞仪分析图；
图4为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD105的流式细胞仪分析图；
图5为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD166的流式细胞仪分析图；
图6为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD14的流式细胞仪分析图；
图7为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD34的流式细胞仪分析图；
图8为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD45的流式细胞仪分析图；
图9为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD73的流式细胞仪分析图；
图10为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD90的流式细胞仪分析图；
图11为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD105的流式细胞仪分析图；
图12为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD166的流式细胞仪分析图；
图13为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD14的流式细胞仪分析图；
图14为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD34的流式细胞仪分析图；
图15为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD45的的流式细胞仪分析图；
图16为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD73的流式细胞仪分析图；
图17为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD90的流式细胞仪分析图；
图18为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD105的流式细胞仪分析图；
图19为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD166的流式细胞仪分析图；
图20为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD14的流式细胞仪分析图；
图21为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD34的流式细胞仪分析图；
图22为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD45的流式细胞仪分析图；
图23为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞的成骨细胞分化图；
图24为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞的成骨细胞分化图；
图25为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞的成骨细胞分化图；
图26为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞的软骨细胞分化图；
图27为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞的软骨细胞分化图；
图28为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞的软骨细胞分化图；
图29为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞的脂肪细胞分化图；
图30为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞的脂肪细胞分化图；
图31为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞的脂肪细胞分化图；
图32为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原HLA-DR、DQ、DP的流式细胞仪分析图；
图33为实施例2培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原HLA-DR、DQ、DP的流式细胞仪分析图；
图34为实施例3培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原HLA-DR、DQ、DP的流式细胞仪分析图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1～3利用组织块贴壁法培养人脐带间充质干细胞
培养过程
1.脐带组织处理
将脐带剪成n1cm的小段，用75％酒精迅速冲洗3遍，在含有GA-1000的无Ca2+和Mg2+的DPBS中尽量去除三根血管；用刮片轻轻刮2遍内层，去掉单层内皮细胞，再用含有GA-1000的无Ca2+和Mg2+的DPBS洗3遍，将处理好的脐带移入新的培养皿，将脐带剪成n2mm3的脐带碎块。
2.人脐带间充质干细胞的原代培养
将剪好的脐带碎块移入新的培养皿，使其一块块分散贴在培养皿上，整个培养皿贴块密度达到C3％。打开培养皿盖子晾干4分钟，于37℃、5％CO2条件下，用人脐带间充质干细胞培养液(实施例1、实施例2和3的培养基配方如表1)对脐带组织进行原代培养n4天，原代培养期间每n5天更换一次培养基，得到初级原代培养物。将初级原代培养物继续培养n6天，细胞密度达到80％左右，得到原代脐带间充质干细胞。
3.人脐带间充质干细胞的消化与传代
将原代脐带间充质干细胞使用V7mL的TrypLE消化液进行消化，然后过滤离心消化液。然后用2倍的人脐带间充质干细胞培养液稀释，再按照1:5比例于37℃、5％CO2条件下传代培养得到大量的传代脐带间充质干细胞。
图1中的干细胞显微镜照片是实施例1得到的最初原代培养物
其中实施例1～3的培养液配方如表1所示，培养过程中的时间参数如表2所示。
表1各实施例的培养液配方
表2各实施例的参数取值
效果实施例1流式细胞术鉴定人脐带间充质干细胞表面标记物的表达
分别对实施例1～3所得的细胞按照以下步骤进行纯度分析。
取培养完成的150mm培养皿，吸去培养基后，加入15mL无Ca2+和Mg2+的DPBS(不含有GA-1000)洗1次；然后加入15mL的TrypLE消化液(购自life technologiesTM，货号12563-011)，缓慢晃动培养皿，使消化液覆盖整个底部。将培养皿置于37℃、5％CO2孵育5分钟，加入30mL培养基稀释消化液。用移液管轻柔吹打使细胞成单细胞。将细胞悬液收集到50mL离心管中。室温下200×g离心2分钟，吸去上清液。向离心管中加入3mL FACS缓冲液洗一遍，室温下200×g离心2分钟，用真空吸引泵吸去上清。向离心管中加入100μL用FACS缓冲液稀释好的一抗，室温孵育30分钟后用2mL FACS缓冲液洗1次。室温下200×g离心2分钟，弃去上清液。向离心管中加入100μL用FACS缓冲液稀释好的二抗(二抗稀释比例为1:1000)，避光室温孵育30分钟后用2mL的FACS缓冲液洗1次。室温下200×g离心2分钟，弃去上清液。向离心管中加入450μL的FACS缓冲液，将离心管置于冰上进行流式细胞仪分析。
使用的一抗分别为CD14(购自Life technologies)、CD105(购自Sigma)、CD73(购自Life technologies)、CD166(购自Life technologies)、CD34-PE(购自Sigma)、CD45-PE(购自Sigma)、CD90-PE(购自Life technologies)、稀释比例为1:100；对应的二抗为488抗老鼠抗体、抗老鼠抗体、抗山羊抗体(均购自Life technologies)。其中CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE本身带有荧光标记，所以不用操作孵育二抗步骤。
纯度检测结果如图2～22，各图中前面的峰为阴性对照，后面的峰即是阳性样本。图2～8显示实施例1培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达CD73、CD90、CD105、CD166的细胞纯度分为99.48％、99.99％、99.69％、98.48％，不表达CD14、CD34、CD45(<1％)；图9～15显示实施例2培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达CD73、CD90、CD105、CD166的细胞纯度分为99.33％、100％、99.77％、97.98％，不表达CD14、CD34、CD45(<1％)；图16～22显示实施例3培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达CD73、CD90、CD105、CD166的细胞纯度分为99.94％、99.95％、99.94％、94.11％，不表达CD14、CD34、CD45(<1％)。得到的人脐带间充质干细胞流式分析的纯度较高，可低温贮藏或者用于医学研究。
效果实施例2人脐带间充质干细胞体外分化能力检测
分别对实施例1～3所得的细胞按照以下步骤进行体外分化能力检测。
1、向成骨细胞分化实验
细胞密度达到80％～90％左右即可进行检测。
吸去培养基后向培养瓶中加入15mL无Ca2+和Mg2+的DPBS(不含有GA-1000)洗2遍。加入15mL TrypLE消化液，于37℃孵箱消化5分钟，吸去消化液。加入30mL新鲜培养基终止消化，轻柔吹打重悬细胞，尽量避免产生气泡。200×g离心3分钟。细胞并计数并将细胞浓度调整至2×103细胞/mL。向12孔板中加入1mL细胞悬液，每孔加入1mL成骨细胞分化培养基(Osteogenesis Differentiation Kit，购自Life technologies)。摇匀后于37℃孵箱培养，此后每3天更换2mL新鲜的成骨细胞分化培养基，21天后按以下步骤进行鉴定。
1)吸去培养基；
2)沿孔壁缓慢加入1×PBS，每孔1mL，洗2次；
3)沿孔壁缓慢加入4％PFA，每孔0.5mL，室温固定15min；
4)轻柔吸去PFA；
5)沿孔壁缓慢加入Milli-Q水，每孔1mL，室温放置5分钟，洗3次；
6)沿孔壁缓慢加入2％茜素红S工作液，每孔0.5mL，染色5min；
7)吸去工作液，沿孔壁缓慢加入去离子水，每孔1mL，室温放置5分钟，洗3次；
8)苏木精(GHS-3)处理2min，并回收苏木精；
9)沿孔壁缓慢加入自来水，洗至溶液无色透明(一般先用自来水快速洗2～3次，再每次5min洗2次)；
10)吸去自来水，沿孔壁缓慢加入DPBS(无Ca2+和Mg2+，且不含有GA-1000)，每孔1mL；
11)在显微镜下观察染色情况，拍照。
拍照结果如图23～25，染色结果均为阳性。
2、软骨细胞分化实验
细胞密度达到80％-90％左右即可进行检测。
吸去培养基后向培养瓶中加入15mL无Ca2+和Mg2+的DPBS(不含有GA-1000)洗2遍。加入15mL TrypLE消化液，于37℃孵箱消化5分钟，吸去消化液。加入30mL新鲜培养基终止消化，轻柔吹打重悬细胞，尽量避免产生气泡。200×g离心3分钟。细胞并计数并将细胞浓度调整至2×103细胞/mL。向12孔板中加入1mL细胞悬液，每孔加入1mL软骨细胞分化培养基(Chondrogenesis Differentiation Kit，购自Life technologies)。摇匀后于37℃孵箱培养，此后每3天更换2mL新鲜的软骨细胞分化培养基，21天后按以下步骤进行鉴定。
1)沿孔壁缓慢加入DPBS，每孔1mL，洗1次；
2)沿孔壁缓慢加入4％PFA，每孔0.5mL，室温固定15min；
3)轻柔吸去PFA；
4)沿孔壁缓慢加入DPBS，每孔1mL，洗1次；
5)向孔中加入0.1N HCl配制的1％阿利新蓝工作液，每孔0.5mL，室温孵育30分钟；
6)吸去工作液，向孔中加入0.1N HCl，每孔0.5mL，洗3遍；
7)沿孔壁缓慢加入Milli-Q水，每孔1mL；
8)在显微镜下观察染色情况，拍照。
拍照结果如图26～28，染色结果均为阳性。
3、脂肪细胞分化实验
细胞密度达到80％～90％左右即可进行检测。
吸去培养基后向培养瓶中加入15mL无Ca2+和Mg2+的DPBS(不含有GA-1000)洗2遍。加入15mL TrypLE消化液，于37℃孵箱消化5分钟，吸去消化液。加入30mL新鲜培养基终止消化，轻柔吹打重悬细胞，尽量避免产生气泡。200×g离心3分钟。细胞并计数并将细胞浓度调整至2×103细胞/mL。向12孔板中加入1mL细胞悬液，每孔加入1mL脂肪细胞分化培养基(Chondrogenesis Differentiation Kit，购自Life technologies)。摇匀后于37℃孵箱培养，此后每3天更换2mL新鲜的脂肪细胞分化培养基，21天后按以下步骤进行鉴定。
1)吸去培养基
2)沿孔壁缓慢加入1×PBS，每孔1mL，洗2次；
3)沿孔壁缓慢加入4％PFA，每孔0.5mL，室温固定15min；
4)轻柔吸去PFA；
5)沿孔壁缓慢加入1×PBS，每孔1mL，室温放置5分钟，吸去PBS，洗3次；
6)沿孔壁缓慢加入中性脂质染色工作液，每孔0.5mL，室温避光染色30min；
7)回收中性脂质染色工作液，每孔用1×PBS洗3次；
8)沿孔壁缓慢加入1×DAPI，每孔0.5mL，室温染色1.5min；
9)吸去DAPI，快速用1×PBS洗两次；
10)每孔沿孔壁缓慢加入1mL 1×PBS；在荧光显微镜下观察，拍照。
拍照结果如图29～31，染色结果均为阳性。
效果实施例3人脐带间充质干细胞免疫原性因子检测
分别对实施例1～3所得的细胞按照以下步骤进行分析。
细胞密度达到80％左右即可进行检测。
吸去12孔板中培养基，加入1mL无Ca2+和Mg2+的DPBS(不含有GA-1000)洗1次；然后加入1mL的TrypLE消化液，缓慢晃动培养皿，使消化液覆盖整个底部。将培养皿置于37℃、5％CO2孵育5分钟，加入2mL培养基稀释消化液。用移液管轻柔吹打使细胞成单细胞。将细胞悬液收集到15mL离心管中。室温下200×g离心2分钟，吸去上清液。向离心管中加入3mLFACS buffer洗一遍，室温下200×g离心2分钟，用真空吸引泵吸去上清。向离心管中加入100μL用FACS缓冲液稀释好的一抗，室温孵育30分钟后用2mL FACS缓冲液洗1次。室温下200×g离心2分钟，弃去上清液。向离心管中加入100μL用FACS缓冲液稀释好的二抗(二抗稀释比例为1:1000)，避光室温孵育30分钟后用2mL的FACS缓冲液洗1次。室温下200×g离心2分钟，弃去上清液。向离心管中加入450μL的FACS缓冲液，将离心管置于冰上进行流式细胞仪分析。
使用的一抗为鼠源抗人HLA-DR、DQ、DP抗体(购自BD公司)，抗体稀释倍数为1:200。
纯度检测结果如图32～34，流式细胞仪分析结果显示用上述方法培养的人脐带间充质干细胞不表达HLA-DR、DQ、DP(<1％)，符合低免疫原性的标准，可低温贮藏或者用于医学研究。

Claims (10)

1.一种人脐带间充质干细胞培养液，其包括：体积比为4～6:0.8～1.2:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白***盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
2.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液，其特征在于包括：体积比为5:1:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白***盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及5ng/mL胰蛋白酶抑制剂、15ng/mL重组人表皮生长因子和15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
3.一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于依次包括以下步骤：
A)用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行贴壁培养；
B)用消化液消化；
C)再用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液传代培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A)所述的脐带组织为去除血管和内皮细胞并清洗干净的脐带碎块。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A)中贴壁培养时，脐带组织在培养皿上的贴块密度为50％～70％优选60％，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO2条件下，用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行原代培养6～10天优选8天得到初级原代培养物，原代培养期间每隔3～5天优选4天更换一次培养液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A)中，初级原代培养物继续用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液原代培养2～6天优选4天得到原代脐带间充质干细胞。
7.如权利要求3或6所述的方法，其特征在于，步骤B)中，用TrypLE消化液于35～39℃优选37℃消化3～7分钟优选5分钟。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤C)中，传代培养1～3代优选2代。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤C)中，传代培养前先过滤TrypLE消化液，然后用2倍的权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液稀释，再用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液按照1:3～7优选1:5比例传代培养得到大量的传代脐带间充质干细胞。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A)所述的脐带组织由下列方法制备得到：将人脐带剪成2～4cm优选2cm的脐带小段，再用75％酒精迅速冲洗3遍，在含有抗生素GA-1000的无Ca2+和Mg2+的DPBS中去除三根血管；然后用刮片刮2遍内层以去除单层内皮细胞，再用含有抗生素GA-1000的无Ca2+和Mg2+的DPBS洗3遍；最后将脐带小段剪成1～3mm3优选2mm3的脐带碎块，得到脐带组织。
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