CN102978130B - 一种短小芽孢杆菌gbsc66及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离于西藏具促生和防病作用的低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379及其在防治油菜菌核病害中的应用。所述的短小芽孢杆菌是从西藏工布加达镇松多草根根围土中分离获得的生防芽孢杆菌，其在低温条件下生长良好，利于促生和生防作用的发挥，对于油菜菌核病的生防效果可达69%，增加产量17%，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物和农业病害防治技术领域，涉及短小芽孢杆菌，具体涉及一种低温适生短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）GBSC66及其在防治油菜菌核病害中的应用。
背景技术
油菜是我国主要的油料作物，油菜菌核病是由子囊菌亚门真菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜生产中的重要病害之一。油菜菌核病在油菜的整个生育期均可发病，结实期发生最重。茎、叶、花、角果均可受害，茎部受害最重。茎部染病初现浅褐色水渍状病斑，后发展为具轮纹状的长条斑，边缘褐色，湿度大时表生棉絮状白色菌丝，偶见黑色菌核，病茎内髓部烂成空腔，内生很多黑色鼠粪状菌核。油菜菌核病在我国为油菜三大病害之首，冬、春栽培区域均有发生，给生产带来了严重损失。常年株发病率高达10%-30%，严重的达80%以上；病株一般减产70%-100%。
目前防治油菜菌核病的主要手段为喷洒化学农药，后者的大量应用不仅造成了空气、水源、土壤和食物的污染，更重要的是经过化学农药的定向选择使许多病原菌产生了抗药性，为该病的防治带来了更大的困难，严重威胁我国油菜生产安全。近年来，越来越多的地区采用综合防治的方法来防治油菜菌核病，其中尤以生物农药发挥着重要的作用。根际微生物种类繁多，其中有很多种类能够促进植物生长、防治植物病害、增加作物产量，这类微生物一般被称为植物根围促生细菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR）。PGPR与植物之间有很好的互利共生关系，不仅能使植物产生诱导抗病性，而且可以提高作物的产量和品质。所以，从PGPR分离和利用具有促生和防病作用的益生菌并应用于植物病害的防治和增加产量，具有很重要的理论意义和应用价值。
CN 101270344A公开了一株对油菜菌核病有抑制作用的拮抗菌X-01菌株的分离筛选，抗菌活性物质的分离与应用。该发明的X-01菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，能够分泌一种分子量为1042.9DA的脂肽类抗生素ITURIN A。该发明还公开了利用X-01菌株制备脂肽类抗生素ITURIN A的方法。离体生防试验表明，该发明制备的脂肽类抗生素ITURINA对油菜菌核病菌具有明显的抑制效果，脂肽类抗生素ITURIN A浓度为100ΜG/ML时防治油菜菌核病的效果达100%，浓度为10ΜG/ML时的防治效果达到40.7%。
CN 101603009B公开了一株对核盘菌菌核具有强寄生、致腐活性的盾壳霉菌株的分筛选、鉴定及在微生物菌剂中的应用，还公开了ZS-1SB菌剂的半敞开式固体发酵培养方法及在防治油菜菌核病中的应用。该发明的微生物菌剂对油菜菌核病等植物真菌病害具有良好的生防效果。
CN 101935620A公开了一种具有抑制油菜菌核病菌的绿色产色链霉菌JZG117(Streptomyces viridochromogenes)，还提供了利用该菌株来有效抑制菜菌核病菌在油菜体内的扩散，减少发病率，提高产量和品质，并有助于生物防治产品开发，进而促进该病害的安全控制。
发明内容
本发明目的之一在于针对当前油菜菌核病防治中存在的问题，提供一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），其对油菜菌核病菌等病原菌具有良好的抑菌效果，有潜在的生防价值。本发明目的之二在于提供该短小芽孢杆菌在防治油菜菌核病中的应用。
为达到上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
一种短小芽孢杆菌，分类命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66，于2009年11月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3379。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379，是从西藏工布加达镇的松多草根围土中分离获得。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的形态特征和生理生化特征：革兰氏染色阳性，杆状，能在10℃生长，是一种低温适生菌，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7%NaCl的培养，接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的分子鉴定特征：利用PCR技术扩增短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379的部分16S rRNA序列，获得长度为487bp的片段，其测序结果如序列表所示，在GenBank中经与已知的16S rRNA序列进行同源性比较，发现与Bacillus pumilus GQ911554.1的相似性为99%。
根据菌株的革兰氏染色、形态特征、生理生化特征以及16S rRNA序列分析的结果，参照《芽孢杆菌属》（蔡妙英等译，农业出版社，1988年）和《微生物分类学》（张继忠，上海复旦大学出版社，1995）的检索表进行检索，本发明的菌株经多相分类鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），命名为GBSC66。
含有短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的菌剂也属于本发明的保护范围。
为达到上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379在防治油菜菌核病中的应用。具体的技术方案如下：
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对于油菜菌核病菌具有显著的抑菌效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对于酵母菌具有显著的抑菌效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对于油菜具有显著的促进生长效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379菌株的应用方法为：发酵培养→稀释→喷洒→效果测定。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379菌株的发酵培养，其培养基组成为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸5g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，KH2PO41g/L，Fe2SO4·6H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 5.0mg/L，CuSO4·5H2O0.16mg/L，其余为过滤水，调节至pH7.0。
本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379是一种对油菜菌核病有良好防治效果的芽孢杆菌，并且是一种低温适生菌，可以在10℃的温度下生长，对环境无污染，能够显著抑制油菜菌核病菌和酵母菌，还能够显著促进油菜生长，具有潜在的生防价值。
附图说明
图1是实施例2的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的芽孢照片。
图2是实施例6的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对油菜菌核病菌的抑菌作用照片。
图3是实施例7的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对酵母菌的抑菌作用照片。
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1：
采用五点取样法，于西藏工布加达镇的松多草根围土中深5-25mm处采取土样装入采样袋内，标记好采样时间、地点、植被。称取土样5g，溶于45ml生理盐水，摇床上震荡混匀30min，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度，80℃水浴10min。吸取200μl涂LB平板，37℃过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划线纯化后编号保存，筛选得到短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379。
实施例2：
参照《芽孢杆菌属》（蔡妙英等译，农业出版社，1988年）和《微生物分类学》（张继忠，上海复旦大学出版社，1995）的试验方法，对实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的形态特征和生理生化特征进行检测。
结果表明，该菌革兰氏染色阳性，杆状，产芽孢如附图1所示。能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7%NaCl的培养，接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
实施例3：
将实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379接种于液体LB培养基，180rpm，37℃震荡培养10h，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA。
以基因组DNA为模板，用正向引物PRB1601（5’-GGATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3’）（SEQ ID NO:1）和反向引物PRB 1602（5’-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCTGGC-3’）（SEQ ID NO:2）对16S rRNA进行PCR扩增。PCR条件为：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。回收PCR产物后送测序，经确认16S rRNA部分基因序列长度为487bp，其结果如序列表所示，在GenBank中与Bacillus pumilus GQ911554.1相似性为99%。
实施例4：
按照表1配方配制1C培养基：
表1
| 组成成分 | 浓度 | 1×1C | 5×1C |
| 蛋白胨 | 0.7 | 4.2g | 21g |
| 氯化钠 | 0.5 | 3g | 15g |
| 大豆粉 | 0.3 | 1.8g | 9g |
| 终体积 | 600ml | 600ml |
按照如下方法配制土壤浸出液：
将500g土壤加入到1L蒸馏水中，98℃加热45min，滤纸过滤，高压灭菌后于4℃保藏。
按照表2配方配制主要培养基：
表2
| 组成成分 | 终浓度 | 体积（ml） |
| 5×1C | 1× | 50 |
| 20%葡萄糖 | 0.1% | 1.25 |
| 土壤浸出液 | 10% | 25 |
| 水 | 173.75 |
将实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379接种到上述主要培养基中，37℃培养过夜，取5μl菌液点到距离固体培养基平板中心2.5cm的十字交叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培养箱中培养，每天记录菌株生长情况，记录15天。
结果表明，本发明的的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66 CGMCCNo.3379能够在温度≤10℃的环境中生长。将在10℃的温度下能够在一周内显现菌落的菌株记为低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379，进一步测试的结果表明其可以在4℃的条件下生长。
实施例5：
将实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379接种到接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为38小时，得到短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的发酵液。
其中发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸5g/L，MgSO40.5g/L，KCl0.5g/L，KH2PO41g/L，Fe2SO4·6H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 5.0mg/L，CuSO4·5H2O0.16mg/L，其余为过滤水，调节至pH7.0。
实施例6：
采用平板对峙法，倒好PDA平板，在平板中央放置直径1cm的油菜菌核病菌菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上打5μl的实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的发酵液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养3天，观察短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对油菜菌核病菌的抑菌效果。
结果如附图2所示，可见抑菌圈平均直径为22mm，即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对油菜菌核病菌具有显著的抑菌作用。
实施例7：
将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379接种到1C培养基中培养8h，然后以1：100的比例转接到10ml的Landy培养基中，发酵约40小时，离心收集上清液，于4℃贮藏备用。
将待测真菌菌株酵母菌接种到适宜培养基中培养过夜，测定OD值后将菌液稀释到107cfu/ml，混合培养基制成含菌平板。待冷却完全后，十字交叉打孔（距平板中心2.5cm），接种低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379于Landy培养基发酵上清液。放置室温下培养2d，观察对于酵母菌的抑菌效果。
结果如附图3所示，可见抑菌圈平均直径为29mm，即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379对酵母菌具有显著的抑菌作用。
实施例8：
油菜种子用清水浸泡2h，于28℃潮湿条件下催芽，播种于装有无菌土壤的周转箱，待油菜苗长到5片真叶的时候灌根，平均每株苗浇20ml实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的发酵液（浓度为108cfu/ml），用清水做对照。两周后抽取10株苗，测定株高、根长和植株鲜重。
结果表明，经菌液处理过的油菜苗明显比对照组的长势好。经测定，株高增加率达到58%，根长增加率达到8.2%，鲜重增加率达到121.3%。即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379能够显著促进油菜生长。
实施例9：
将实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCC No.3379的发酵液稀释100倍，在开花前10天开始向油菜喷雾施发酵液，之后每间隔7天喷1次，共喷3次。
结果表明，本发明的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）GBSC66CGMCCNo.3379的发酵液具有显著的防治油菜菌核病和提高油菜产量的效果，其生防效果可达69.3%，增加油菜产量达17.2%。
应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的原料配比及制备步骤，但本发明并不局限于上述配比及制备步骤，即不意味着本发明必须依赖上述制备步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表：（SEQ ID NO:3）
TTGGCGTAGTTGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCGAGCAGTTACTCTCGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGTAGCTTTACGATCCGAAGACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAAAGATCCAA
Claims (1)
1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GBSC66CGMCC No.3379在抑制酵母菌中的应用；
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GBSC66于2009年11月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3379，从西藏工布加达镇的松多草根围土中分离获得；其形态特征和生理生化特征为：革兰氏染色阳性，杆状，能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7％NaCl的培养，接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
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