CN104593283A - 一株解淀粉芽孢杆菌株dppg-74及其防病促生应用 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌株dppg-74及其防病促生应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌株DPPG-74，所述菌株的保藏号为CGMCC No.9396。该菌株是从加工番茄根腐病严重的根际土壤和植株根部筛选获得，该菌为革兰氏阳性菌，具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生，是对病原物有很高毒性的物质，能够有效的防治新疆加工番茄苗期根腐病的发生。本发明的发酵菌液其处理过植株的株高、鲜重和干重分别增加了50.39％、91.98％和40.41％，防治效果为67.74％，能有效增加植株的营养体生物量。本发明的菌株培养条件简单，易保存，对环境友好，具有良好的开发和推广应用潜力。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌株DPPG-74及其防病促生应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域。更具体的，本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌株DPPG-74及防病促生应用。
背景技术
番茄又名西红柿，原产于南美洲秘鲁和厄瓜多尔一带。由于其具有适应性广、栽培容易、产量高和供应期长等特点，同时其营养丰富、风味独特，除可鲜食外还可以加工成番茄酱、番茄汁、番茄丁、番茄罐头和番茄沙司等，同时还具有防止癌症发生的作用，已经成为重要的功能食品。在番茄种植过程中，病害发生非常普遍，可以危害番茄生产的病害达到近百种，其中常见的有早疫病、叶霉病、枯萎病、根腐病：细菌性斑点病、疮痂病、溃疡病、脐腐病、花叶病毒病、条斑病毒病等，这些病害一旦严重发生，都将给番茄生产造成毁灭性的损失。
引起植物土传病害的病原物种类很多(包括真菌、细菌、线虫、病毒等)，它们通常侵染植物根部，引起作物根部乃至全株的病害，对加工蕃茄根腐病来说，致病菌包括腐霉病菌、疫霉病菌、立枯丝核菌和镰刀菌等多种土壤习居菌。由于这些病原菌能以多种形式在土壤中越冬存活，一旦定殖于土壤中很难根治，而且缺乏有效的抗病品种。采用化学农药防治这些病原菌导致的根腐病已经取得了一定的防治效果，但化学农药使用时间过长病原菌会产生抗药性导致防治效果下降，同时大量化学农药施用到田间土壤会破坏土壤中微生物种群结构，造成环境和食品污染，与人们目前倡导的绿色食品、绿色消费的理念相违背，另外由于新疆加工番茄生产的最终产品主要用于出口，国外对农药残留的检测相当严格，许多化学农药都不能在加工番茄种植过程中使用，为此，寻求安全有效的防治措施成为加工番茄种植过程中亟待解决的重要问题，采用生物防治无疑成为病害防治的一条较为理想的途径。
利用有益微生物防治植物病害始于1921年，Hartely利用拮抗真菌防治棉苗猝倒病。随后，世界各地都试图筛选有益微生物用于植物病害的防治。我国植物病害生物防治的研究和应用起步于20世纪50年代初，现已筛选出许多对土传病害具有良好防效的生防菌株，其中以芽孢杆菌和假单胞菌居多。目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillu、Pseudomonas等属的一些菌株。
国内已有研究报道筛选生防菌及应用，2001年，马平等人从棉花铃内部分离到2株镰刀菌 VL-21和VL-22，能有效抑制黄萎菌的生长和棉花黄萎菌微菌核的产生(马平,李社增等.利用棉花体内非致病镰刀菌防治棉花黄萎病[J].中国生物防治，2001，17(2):71-74)。2006年，郝树站从渤海海水中分离、筛选到41株具有不同抗菌谱的菌株(郝树站,王素英,王璐.具抗植物病原真菌活性海洋霉菌的筛选与鉴定亚热带农业研究[J].2006,2(1):45-48)。其中，青霉属67#菌株不但抗菌谱广，而且抗菌活性极其明显，具有良好的开发前景。2007年，侯晓丹等人对枯草芽孢杆菌进行了磁场诱变，获得对番茄灰霉病菌有高效拮抗作用的菌株3株，分别为枯草芽孢杆菌BS0.25-1，BS1.25和BSO.10-1(侯晓丹,檀根甲,刘淑芳等.枯草芽孢杆菌磁场诱变株对采后番茄灰霉病的控制效果研究[J].激光生物学报,2007,16(5):576-582)。2007年，董红强等人从黄瓜田土壤中分离得到拈抗细菌枯草芽孢杆菌Sh34及其无菌滤液对黄瓜蔓枯病菌、黄瓜枯萎菌、黄瓜菌核、瓜果腐霉菌、立枯丝核菌等多种植物病原真菌均有良好稳定的抑制作用(董红强,慕卫,刘峰等.细菌Sh34的鉴定及其对几种植物病原真菌的拮抗作用测定[J].农药,2007,46(11):779-780)。2009年，辛春艳从番茄植物组织内分离到1株对番茄灰霉病菌有拮抗作用的放线菌株No.37，此菌株产生的抗菌物质能显著抑制番茄灰霉病菌的菌丝生长和孢子萌发，对盆栽番茄幼苗的预防保护作用和治疗作用分别达到89.7％和80.3％，10倍稀释液的田间防治效果达到84.1％(辛春艳,张丽萍,谢莉等.内生拮抗放线菌防治番茄灰霉病的研究[J].河南农业科学,2009(2):68-71)。
国外防病菌的分离、筛选研究比较成熟，1965年，Lovrekovich利用细菌的无毒变异株作为诱导物，成功的诱导出了植物的抗病性，开创了利用细菌无毒变异株进行生物防治的先河(Lovrekovich L,Farkas G L.Induced protection against wildfire disease in tobacco leaves treated with heat-killed bacteria[J].Nature,1965,205:823-824)。1980年，Kerr用放射土壤杆菌84菌株成功防治由根癌土壤杆菌引起的果树冠澳病，植物病害的生物防治研究逐渐成为热点(Kerr A.Biological control of crown gall through production of agrocin 84[J].Plant disease,1980,64:25-28)。1995年，Silveria等发现蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等3个菌株具有对番茄青枯病的防病作用的同时，还可以提高种子的发芽率(Siveira EBD,Marianov R de LR,M icheref SJ,et al.Antagoinsm of Bacillus spp.against Pseudomonas solanacearurn and effect on tomato seedling growth[J].Fitopatologia Brasileira,1995,20(4):605-612)。
微生物农药能够对土壤中病原物产生一定抑制作用从而起到防病功能，但土壤中存在的大量微生物以及环境条件也能影响功能活性微生物的存活从而影响其防病效能，防治作物土传病害的微生物农药存在很强的地域适应性，因此许多在其它地方具有很好防病效能的功能菌株，到了新疆很多时候表现不稳定。这就迫切需要利用从新疆本地筛选出的适合本土的高 效防病微生物，开发适宜于西北干旱半干旱地理气候条件下使用的新的生物农药，不但可以很好地控制以加工番茄和棉花为主的经济作物上的土传病害的发生，还会保证新疆农业和经济可持续发展，同时将会取得良好的经济和生态效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种适宜于西北干旱、半干旱地理气候条件，特别是可以很好地控制以加工番茄为主的经济作物的根腐病害发生的生防菌株的用途。
本发明所述的菌株DPPG-74为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏日期为2014年6月30日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC No.9396。其特点在于该菌为革兰氏阳性菌，呈白色，圆形或近似圆形，四周突起，中间凹陷，无荧光。具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，是对病原物有很高的毒性，有效抑制病菌生长，控制病害发生，促进植株生长，提高作物产量。能够有效的防治加工番茄苗期根腐病的发生，具有广阔的推广应用前景。
具体内容如下：
在本发明中，首先解淀粉芽孢杆菌株(Bacillus amyloliquefaciens)DPPG-74是从加工番茄根腐病严重的土壤中采集，再在加入目标病原真菌的PDA的培养基上进行筛选获得。经过生理生化试验鉴定，菌株DPPG-74经革兰氏染色和芽孢染色后镜检，结果发现，该细菌经芽孢染色后可以看见红色短杆状的菌体中间有绿色芽孢，形状近似椭圆形，经革兰氏染色后均呈蓝紫色，KOH实验没有丝状物拉出，为革兰氏阳性菌。菌株的16SrDNA鉴定表明，基因测序获得的菌株DPPG-74的16 SrDNA序列片段在NCBI网站进行序列同源性比对分析，结合生理生化特征的鉴定结果，DPPG-74为解淀粉芽孢杆菌株(Bacillus amyloliquefaciens)。
将活化的DPPG-74，用LB液体培养基发酵至1011cfu/mL备用。
采用本发明的发酵菌液浸种加工番茄种子和苗期菌液灌根接种处理后，能明显增加工番茄种子的发芽率、出苗率及幼苗的鲜重和干重，进一步说明该菌株具有一定的防病促生作用。
用初筛对瓜果腐霉有较好拮抗作用的DPPG-74菌株的发酵原液(1011cfu/mL)浸泡加工番茄种子，设三个对照：CK1(灭菌培养液浸种，病土)，CK2(灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土)，CK3(化学农药PCNB、甲霜灵、卫福种衣剂和敌克松浸泡加工番茄种子，病土)。调查成苗率、生长和发病情况。对结果进行统计分析。本发明的发酵菌液的防治效果为67.74％，而PCNB的防治效果为37.63％，对各处理的干重和鲜重进行了测定，结果表明本发明该菌的发酵菌液其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了50.39％、91.98％和40.41％，能有效增加植株的营养体生物量。
防病促生菌防治加工番茄腐霉根腐病诱导防病的作用效果：
通过防病促生菌对腐霉菌菌丝形态影响的观察、对番茄种子活力的影响、对番茄种子酶活性的影响等实验，经研究表明，对该生防菌观察了其对瓜果腐霉病菌菌丝生长的影响，确定了其可以导致瓜果腐霉菌丝的降解和原生质的浓缩，很好地解释了平皿对峙实验过程中防病促生菌抑制病原菌生长的作用。证明了防病促生菌能够帮助加工番茄种子保持细胞膜透性，维持种子活力的时间延长。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种适宜于西北干旱、半干旱特殊地理气候条件应用的防病促生菌株DPPG-74(CGMCC No.9396)，具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，防病能力强、应用效果稳定。特别是可以很好地控制以加工番茄为主的经济作物的根腐病发病的生防菌株，具有较强潜力开发适宜于新疆特殊地理气候条件下使用的新型生物农药。
附图说明
图1：DPPG-74对瓜果腐霉菌丝体生长的影响(A：CK灭菌培养液；B：DPPG-74)。
图2：DPPG-74对发芽加工番茄种子电导率的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1防病促生菌DPPG-74的筛选与鉴定 
筛选的步骤如下：
第一步：采样 
从加工番茄早春苗期根腐病严重的土壤中采集。
第二步：富集 
将从加工番茄产区采来的土样各称取10g，加入l00mL灭菌水中，再加入适量玻璃珠剧烈振荡30min(将土壤颗粒充分打散)后，静置l0min，取上清液1mL加入盛有99mL灭菌水的三角瓶中，进行梯度稀释。分离细菌取10-4、10-6浓度。将上述稀释液各200μl分别加入PDA、NA和高氏1号培养基平板上，用涂布器均匀涂布，冷却后倒置于28℃温箱内培养， 重复三次。3-7d后从每个皿中挑取不同形态的单菌落于试管斜面上纯化待测。
第三步：初筛 
将目标病原菌接种子PDA培养基平板上，28℃生化培养箱中培养。待菌丝长满后用打孔器制成直径为6mm菌块待用。筛选采用平板对峙法：在PDA平板中央接种目标病原真菌，同时在病原菌周围距菌丝边缘2cm处等距离接种供试菌株，25-28℃下培养2-4d后检查结果，记录抑菌带宽。
第四步：复筛 
盆栽试验设计，用初筛对瓜果腐霉有较好拮抗作用的菌株的发酵原液(1011cfu/ml)浸泡加工番茄种子，浸泡12h后晾干备用。然后将处理好的加工番茄种子均匀播入营养钵中，CK1(灭菌培养液浸种，病土)，CK2(灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土)，CK3(化学农药PCNB、甲霜灵、卫福种衣剂和敌克松浸泡加工番茄种子，病土)。每钵20粒种子，每处理三个重复，定期浇水：种子出苗后30d调查成苗率和发病情况。对结果进行统计分析，选择处理后发芽率显著高于对照的菌株进行菌体鉴定。
表1 拮抗菌对加工番茄成苗率和发病情况的测定
注：各处理各列不同字母为P<0.05水平差异显著。
表1结果可以看出，DPPG-74能提高加工番茄种子的发芽率，发芽率提高了48.20％又可显著抑制病原菌，降低番茄苗期腐霉病菌的发病率，发病率降低了40％，具有促生和防病双重功能。
第五步：鉴定 
根据菌体形态特征、菌落形态及革兰氏染色结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》(Bergey’s Manual of etermitive Bacteriology)第八版和《常见细菌鉴定手册》进行生理生化特性的鉴定。以及芽孢杆菌的16SrDNA鉴定。
经过生理生化试验鉴定，菌株DPPG-74为红色短杆状的菌体中间有绿色芽孢，形状近似椭圆形，经革兰氏染色后均呈蓝紫色，KOH实验没有丝状物拉出，为革兰氏阳性菌。综合分 析该菌株DPPG-74的形态学、生理生化特征，符合解淀粉芽孢杆菌株(Bacillus amyloliquefaciens)特征。
表2 菌株DPPG-74的生理生化特性
“十”：反应呈阳性或者可以生长、利用；“一”反应呈阴性或者不可以生长、利用。
16S rDNA鉴定
测序获得的DPPG-74的16 S rDNA序列片段大小为1456bp，经序列分析表明，菌株DPPG-74与Bacillus amyloliquefaciens 17的同源性最高，同源性在99％以上。由此鉴定，菌株为解淀粉芽孢杆菌株(Bacillus amyloliquefaciens DPPG-74) 
实施例2解淀粉芽孢杆菌DPPG-74对加工番茄防病促生特性
用初筛对瓜果腐霉有较好拮抗作用的DPPG-74菌株的发酵原液(1011cfu/ml)浸泡加工番茄种子，浸泡12h后晾干备用。然后将处理好的加工番茄种子均匀播入营养钵中，设三个对照：CK1(灭菌培养液浸种，病土)，CK2(灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土)，CK3(化学农药PCNB、甲霜灵、卫福种衣剂和敌克松浸泡加工番茄种子，病土)。每钵20粒种子，每处理三个重复，定期浇水：种子出苗后30d调查成苗率、生长和发病情况。对结果进行统计分析。
表3 拮抗菌对番茄腐霉根腐病防治效果测定
注：各处理各列不同字母为P<0.05水平差异显著。
表3结果可以看出，DPPG-74能提高加工番茄种子的发芽率，促进加工番茄苗期的生长，又可显著抑制病原菌，降低番茄苗期腐霉病菌的发病率，具有促生和防病双重功能。DPPG-74相对防治效果为67.74％，高于化学农药PCNB的防治效果，该菌的发酵菌液其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了50.39％、91.98％和40.41％，能有效增加植株的营养体生物量。
实施例3解淀粉芽孢杆菌DPPG-74对腐霉菌菌丝形态影响
在直径为90mm的无菌培养皿中加入20mL PD培养液，接入一片直径8mm的菌片，置于6℃恒温培养2d，将培养好的菌丝片用解淀粉芽孢杆菌DPPG-74发酵液和菌体处理24h后，挑取菌丝在显微镜下观察菌丝形态，并与未经防病促生菌处理过的菌丝形态做比较。各处理重复四次，并设清水对照。
将供试生防菌DPPG-74，对瓜果腐霉菌丝体进行处理进行抑菌机制的初步研究。如图1所示，生防菌对瓜果腐霉病菌菌丝体的影响在显微镜下可以观察到，用防病促生菌处理了48h后的瓜果腐霉病菌菌丝体形态与未处理的菌丝体形态上有很大差异。未经防病促生菌处理的腐霉病菌菌丝饱满，细胞壁光滑，但经防病促生菌处理48h后，病原菌菌丝体发生解体，部分菌丝细胞发生扭曲，有原生质浓缩的现象发生，说明防病促生菌对病原菌的菌丝生长产生了不利影响。
实施例4解淀粉芽孢杆菌DPPG-74对番茄种子活力的影响
选取大小一致且无机械损伤的加工番茄种子，每处理选20粒种子，用双蒸水冲洗数次，用滤纸吸干表面的水分。分别装入25mL三角瓶中，瓶中分别加入l0mL供试生防菌发酵液(浓度为l×l010cfu/mL)，对照加入l0mL双蒸水，于25℃浸泡。测定刚开始浸泡种子时浸泡液的电导率，作为初始值(a1)，浸泡8小时后(种子充分吸胀)，测定浸泡液的电导率(a2)。然 后将种子及其浸泡液置于100℃水浴中煮沸30-90min，取出冷却至25℃，测煮沸后种子浸泡液的电导率(a3)。
种子的相对电导率(％)＝(a2.a1)×100/(a3.a1) 
如图2所示，用解淀粉芽孢杆菌DPPG-74处理番茄种子后的电导率都比对照低。可见，防病促生菌具有保持种子细胞膜稳定和维持活力的作用。
序列表
 

Claims (7)

1.一株解淀粉芽孢杆菌株(Bacillus amyloliquefaciens)DPPG-74菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年6月30日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.9396。
2.权利要求1所述菌株，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌株DPPG-74是从加工番茄根腐病严重的根际土壤或植株根部中采集，再在加入目标病原真菌的PDA的培养基上进行筛选获得。
3.权利要求1所述菌株，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌株DPPG-74为革兰氏阳性菌，最适生长温度为25-30℃，在培养基上呈白色，圆形或近似圆形，四周突起，中间凹陷，无荧光。
4.权利要求1所述菌株，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌株具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能使病原菌菌丝体发生解体，部分菌丝细胞发生扭曲，造成原生质浓缩发生，有效抑制病菌生长。
5.根据权利要求2所述菌株，其特征在于所述的目标病原真菌是病原真菌：瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、菌核病菌(Sclerotini asclerotioum)。
6.根据权利要求2所述菌株，其特征在于所述的PDA培养基是由下列成分组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH6.8。
7.根据权利要求4所述菌株，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌株DPPG-74的发酵菌液其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了50.39％、91.98％和40.41％，防治效果为67.74％，能有效增加植株的营养体生物量。
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