CN110157638B - 一种克里布所类芽孢杆菌yy-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种克里布所类芽孢杆菌及其应用，菌株为克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）YY‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年4月8日，保藏编号为CCTCC NO.M2019242。该菌株对果树树干的病原真菌梨轮纹病菌具有显著的抑制作用，能够有效的防治梨轮纹病，而且该菌株对生态环境无害，不会引起病原的抗药性，培养条件简单，容易保存；本发明提供的生防菌剂制备方法简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种克里布所类芽孢杆菌YY-1及其应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，特别的涉及一种克里布所类芽孢杆菌YY-1及其应用。

背景技术

梨轮纹病，亦称粗皮病，在我国各梨产区分布广泛，是我国梨树的重要病害之一。该病主要危害梨树枝干、果实和叶片，枝干受害可促使树枝早衰，叶片受害会引起叶片早落，果实受害能造成大量烂果，严重影响产量和品质。由梨轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）引起的轮纹病是梨产区常年发生且为害严重的病害之一，尤以储藏期导致的烂果损失最重，而且侵染梨树枝干时难以清除，为再侵染提供了病菌来源。我国每年因为梨轮纹病造成梨果减产约25%，严重时烂果率超过80%。该病菌不但侵染梨树，在苹果、葡萄、桃、猕猴桃、蓝莓等果树上也均有危害。

梨轮纹病菌为子囊菌门葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）的模式种，可腐生或寄生于植物体内，或以内生真菌形态存在。该菌在世界各地广泛分布，能够侵染多种果树和林木，导致柑橘果腐病、猕猴桃果腐病、苹果轮纹病、梨轮纹病、梨干腐病、猕猴桃枝枯病、葡萄枝干溃疡病、蓝莓枝枯病、桃流胶病、樱桃溃疡病、核桃溃疡病、杨树溃疡病和樟树溃疡病等多种病害。葡萄座腔菌主要通过花芽、皮孔、气孔和伤口等侵染寄主维管束组织，初期引起寄主枝干溃疡或者新梢枯萎，后期病斑连片导致整株死亡，给生态林木及经济果树生产造成了毁灭性的后果。

对于梨轮纹病的防治，目前主要依靠栽培管理措施和化学农药进行防治。但由于梨轮纹病多具有较长的潜伏期、较长的发病周期和多点危害的特点，在防治中需要一个生长周期多次处理、多次施用化学农药，才能较好的控制其危害。存在防治成本高、耗时长、污染环境等问题。因此，寻求新的经济高效、绿色环保的防治技术与途径已成为当前果树种植产业需迫切解决的问题。

类芽孢杆菌属（Paenibacillus）细菌是一类兼性厌氧、内芽孢形成的细菌种类，该类细菌最初属于芽孢杆菌属（Bacillus），随后被重新分类为一个单独的属。类芽孢杆菌属的菌株分布广泛，从土壤、水、根际、蔬菜、饲料和昆虫幼虫等多种环境及材料中均有检出。类芽孢杆菌属细菌生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆能力的芽孢，且有效活菌数较非芽孢杆菌属细菌高、性能稳定，故被大量应用于产品开发中。这类细菌能够产生各种细胞外酶，如多糖降解酶和蛋白酶等，催化生物燃料生产领域的各种合成反应，也可以产生抗菌代谢物质，抑制病原物的生长，并诱导植物产生***抗性。另外，一些类芽孢杆菌作为植物根际促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR），能够竞争性地定植在植物根系，既作为生物肥料，又可对植物根系病原细菌、真菌和线虫起到抑制作用。另外，克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）还具有拮抗植物病原菌的特点和解钾、解磷和固氮等多种作用，在农业生产中可以提高作物产量，改善农产品品质。因此克里布所类芽孢杆菌在农业上具有很好的应用前景。

目前，利用克里布所类芽孢杆菌防治植物病害在国内外已有报道，如何亮等从泰山土壤中分离到的克里布所类芽孢杆菌4-531对烟赤星病菌（Alternaria alternate）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和棉立枯病菌（Rhizoctonia solani）均表现出较强的抑菌活性；克里布所类芽孢杆菌POC115产生的磷酸酯类物质对红毛癣菌（Trichophyton rubrum）具有抗菌活性（1株植物病原真菌拮抗细菌的鉴定，西北农林科技大学学报，2007）；王雯等从土壤中筛选得到的高效解磷解钾克里布所类芽孢杆菌株CX-7 对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌等具有抑菌活性（拮抗克里布所类芽孢杆菌CX-7菌株的筛选与抗菌蛋白的分离，河北农业大学, 2012）；从土壤中分离的克里布所类芽孢杆菌T-9可以严重抑制灰霉菌（Botrytis cinerea）、炭疽菌（Colletotricum acutatum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和白腐小核菌（Sclerotium cepivorum）的菌落生长，并能防治这些病害在寄主植物上造成的危害；廖美德等从土壤中分离的克里布所类芽孢杆菌PS04对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）具有较强的抑菌活性，该菌株主要通过抑制病原菌生长和诱导寄主植物产生抗性起到防病的作用（PS04菌株的抗真菌活性，长江大学学报，2008）。由此可见克里布所类芽孢杆菌因菌种不同防治植物病害也有所不同，没有预见性以及相应的启示。并且目前还未有关于克里布所类芽孢杆菌具有防治果树轮纹病的相关报道。

发明内容。

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种克里布所类芽孢杆菌YY-1，该菌株可以防治果树树干病原真菌梨轮纹病菌，抑制梨轮纹病菌的生长、繁殖和定植，丰富了生防菌库，为植物的遗传改造提供了更多的选择。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种克里布所类芽孢杆菌菌株，该菌株为克里布所类芽孢杆菌菌株（Paenibacillus kribbensis）YY-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年4月8日，保藏编号为CCTCC NO.M2019242。

本发明还提供了上述克里布所类芽孢杆菌YY-1在防治果树树干病原真菌中的应用。

进一步，所述病原真菌为梨轮纹病菌。

一种生防菌剂，有效成分为上述克里布所类芽孢杆菌YY-1。

进一步，所述克里布所类芽孢杆菌YY-1为该菌株的培养菌悬液、发酵液或发酵分离上清液。

进一步，所述发酵液和培养菌悬液中克里布所类芽孢杆菌YY-1的活菌数不小于1×10⁵cfu/mL。

进一步，所述发酵液分离上清液采用以下步骤制得：将克里布所类芽孢杆菌YY-1活化后用无菌PD液体培养基重悬得到菌悬液，再将所述菌悬液以5%的接种量接种于PD液体培养基中，于120～200r/min，25～30℃下振荡培养48h～72h，然后将得到的发酵液于4℃6000~8000rpm离心取上清，最后将上清采用0.22 nm无菌滤膜过滤即得所述发酵液分离上清液。

本发明还提供了上述生防菌剂在防治苹果轮纹病、梨轮纹病、梨干腐病、猕猴桃枝枯病、葡萄枝干溃疡病或蓝莓枝枯病上的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明在健康的鸡冠花叶片上筛选得到克里布所类芽孢杆菌YY-1，该菌株通过产生抑菌物质来抑制梨轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）的生长和侵染，因此克里布所类芽孢杆菌YY-1不仅能直接抑制病原菌的生长和繁殖，而且可以拮抗真菌在寄主上的定植，从而抑制植物病害的发生程度。

2、本发明使用克里布所类芽孢杆菌YY-1发酵液对梨树枝条处理后，接种梨轮纹病菌后发病率明显下降，病斑直径显著降低，证实克里布所类芽孢杆菌YY-1能高效的抑制梨轮纹病菌菌株，具有较好的生物防治作用，对防治梨轮纹病害有良好的效果，而且该菌株对生态环境无害，不会引起病原的抗药性，培养条件简单，容易保存。

3、本发明提供的生防菌剂，具有制备简单，成本低，易于工业化生产，防治效果良好，且不会造成环境污染，能够代替农药对梨轮纹病进行防治，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1 为克里布所类芽孢杆菌YY-1在PDA培养基上的菌落形态图；

图2 为克里布所类芽孢杆菌YY-1在LB培养基上的菌落形态图；

图3 为克里布所类芽孢杆菌YY-1的电镜扫描图；

图4 为克里布所类芽孢杆菌YY-1的16S rDNA序列进化分析图；

图5 为克里布所类芽孢杆菌YY-1发酵液对梨轮纹病菌JNT1111菌丝形态的影响；

图A为对照组；图B为实验组；

图6 为克里布所类芽孢杆菌的不同浓度发酵液分离上清液对梨轮纹病菌菌丝生长的影响；

图7为接种克里布所类芽孢杆菌YY-1菌悬液对梨轮纹病菌致病性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1 菌株克里布所类芽孢杆菌YY-1的分离筛选及鉴定

分离方法：从重庆市涪陵区采取集健康的鸡冠花叶片，取健康的梨树枝条组织清洗消毒，切取直径大小为5 mm的组织，依次用次氯酸钠处理45 s，75%酒精处理1 min，无菌水处理1 min，无菌水处理1 min，置于无菌滤纸晾干后接种于PDA固体培养基28℃培养。该平板在28℃静置培养2-3天。根据平皿上筛选到的细菌菌落的形态、颜色、大小挑选出不同的细菌并转移至PD液体培养基。

筛选方法：采用对峙培养法筛选拮抗细菌，灭菌接种环蘸取少量菌液，于PDA平板中央划线，并于两侧接种直径为5 mm的梨轮纹病菌JNT1111菌丝块，置于28℃培养5 d，观察菌落之间的直径，每组三次重复，将只在两侧接种JNT1111菌丝块的平板设为对照。对平皿上筛选到的具有抑菌活性的细菌转移至 PD液体培养基，进行纯化、培养，即得到纯化的抑制活性菌株命名为YY-1。

鉴定方法：菌株YY-1在PDA培养基上为光滑、边缘规则、中间呈球状突出的乳白色菌落（图1），在LB固体培养基上则为光滑、边缘锯齿状、扁平的白色菌落（图2）。菌株YY-1的菌体在扫描电子显微镜下呈杆状（图3），为革兰氏染色可变菌。

用生工生物有限公司的细菌总DNA提取本发明菌株YY-1的 DNA，然后采用细菌16srDNA通用引物16sF/R 进行 PCR 扩增，获得扩增片段，扩增片段测序，具体序列如SEQ IDNO.1所示。序列经 GenBank 中 BLAST 比对，与克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）亲缘关系最近。通过对YY-1和类芽孢杆菌属其他代表中的16s rDNA序列构建***进化发育树，结果表明YY-1和Paenibacillus kribbensis代表菌株聚在同一分支（图4）且为新菌种，本发明菌株为克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis），命名为克里布所类芽孢杆菌YY-1。

实施例2 菌株克里布所类芽孢杆菌YY-1的应用

发酵液分离上清液的制备：将克里布所类芽孢杆菌YY-1活化后用无菌的PD液体培养基重悬得到菌悬液，再将所述菌悬液以5%的接种量接种于PD液体培养基中，于180r/min，28℃下振荡培养72h，然后将得到的发酵液于4℃ 6000rpm离心取上清，最后将上清采用0.22 nm无菌滤膜过滤即得所述发酵液分离上清液，备用。

1、YY-1对孢子萌发的影响。

用无菌水冲洗梨轮纹病菌菌株JNT1111孢子角，在40倍显微镜调整孢子液至合适浓度。取等体积发酵液分离上清液与孢子液混匀，吸取20 uL混合液与载玻片中央，置于无菌平板内，28℃萌发2.5 h，作为实验组；对照组用无菌水代替发酵液分离上清液，其它步骤相同。观察记录，计算萌发率，结果如图5所示。

从显微镜下观察得出：与对照组相比，经发酵液分离上清液处理后能引起菌株JNT1111的菌丝生长畸形，菌丝节间缩短，并有膨大的现象，并且50%浓度的发酵液分离上清液对菌株JNT1111孢子萌发的抑制率为100%。

2、菌株YY-1的抑菌防效测定

将PDA培养基熔化冷却至40~50℃，将发酵液分离上清液分别以0%、2%、3%、4%、5%的比例加入培养基制备得到含不同浓度发酵液分离上清液的PDA平板，然后将直径为5 mm的梨轮纹病菌菌株JNT1111菌丝块接种于上述PDA平板中央，28℃培养，观察记录菌丝生长情况。结果如图6所示。

从图中可以看出，在培养基中加入不同浓度的发酵液后菌株JNT1111的生长受到不同程度的抑制，且发酵液分离上清液的浓度越高菌株JNT1111生长抑制越强，且菌株JNT1111菌落生长不规则。而对照组的菌株生长迅速、菌落生长旺盛、气生性强。结果表明菌株YY-1的发酵液分离上清液中的抑菌物质浓度较高，抑菌活力较强。

3、菌株YY-1的活体防效测定

截取新鲜、健康、大小形态基本一致的梨树枝条为材料，清水洗净，75%酒精消毒晾干，石蜡封口保湿，用消毒的打孔器对其表面打孔，实验组在伤口处接种10 uL菌株YY-1的菌悬液（活菌数约1×10⁵cfu/mL）晾干后，接种直径为5 mm的梨轮纹病菌菌株JNT1111菌丝块，菌丝面朝伤口，保鲜膜保湿；对照组以无菌水代替菌株YY-1菌悬液，其它步骤同实验组，实验设置3次重复，28℃保湿培养3d，记录伤口发病情况，结果如图7所示。

从图7可以看出，培养3d后，实验组（YY-1+JNT1111）的病斑直径与接种时梨轮纹病菌菌株JNT1111菌丝块的直径变化不明显，说明实验组均未发病；而对照组（PD+JNT1111）的病斑直径变化较为明显，约为接种菌块直径的7倍，表明菌株YY-1可以拮抗真菌克里布所类芽孢杆菌在寄主上的定植。

综上，本发明克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）YY-1能高效的抑制梨轮纹病菌菌株，具有较好的生物防治作用，且不会造成环境污染，能够代替农药对梨轮纹病进行防治。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种克里布所类芽孢杆菌YY-1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> 克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）

<400> 1

cctcaagcta cttgttcgac ttcaccccaa tcatctaccc caccttcggc ggctggctcc 60

ttgcggttac ctcaccgact tcgggtgttg taaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt 120

acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag caattccgac 180

ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagac cggcttttct aggattggct 240

ccacctcgcg ccttcgcttc ccgttgtacc ggccattgta gtacgtgtgt agcccaggtc 300

ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct 360

gcttagagtg cccagcttga cctgctggca actaagcata agggttgcgc tcgttgcggg 420

acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtctcctctg 480

tcccgaagga aaggtctatc tctagaccgg tcaaagggat gtcaagacct ggtaaggttc 540

ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatact ccactgcttg tgcgggtccc cgtcaattcc 600

tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggaat gcttaatgtg ttaacttcgg 660

caccaagggt atcgaaaccc ctaacaccta gcattcatcg tttacggcgt ggactaccag 720

ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta cagcccagag 780

agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa 840

ttccactctc ctcttctgca ctcaagctcc ccagtttcca gtgcgacccg aagttgagcc 900

tcgggattaa acaccagact taaagagccg cctgcgcgcg ctttacgccc aataattccg 960

gacaacgctt gccccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggggctttc 1020

ttctcaggta ccgtcacttc aagagcagtt actctatcaa gcgttcttcc ctggcaacag 1080

agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag gctttcgccc 1140

attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1200

tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtaggc ctttacccca 1260

ccaactagct aatgcgccgc aggcccatcc acaagtgaca gattgctccg cctttcctcc 1320

ttctcccatg caggaaaagg atgtatcggg tattagctac cgtttccggt agttatccct 1380

gtcttgtggg caggttgcct acgtgttact cacccgtccg ccgc 1424

Claims (7)

1.一种克里布所类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）YY-1，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M2019242。

2.如权利要求1所述克里布所类芽孢杆菌YY-1在防治果树树干病原真菌中的应用，所述病原真菌为梨轮纹病菌。

3.一种生防菌剂，其特征在于：有效成分为权利要求1所述克里布所类芽孢杆菌YY-1。

4.根据权利要求3所述生防菌剂，其特征在于，所述克里布所类芽孢杆菌YY-1为该菌株的培养菌悬液、发酵液或发酵分离上清液。

5.根据权利要求4所述生防菌剂，其特征在于，所述发酵液和培养菌悬液中克里布所类芽孢杆菌YY-1的活菌数不小于1×10⁵cfu/mL。

6.根据权利要求4所述生防菌剂，其特征在于，所述发酵液分离上清液采用以下步骤制得：将克里布所类芽孢杆菌YY-1活化后用无菌PD液体培养基重悬得到菌悬液，再将所述菌悬液以5%的接种量接种于PD液体培养基中，于120～200r/min，25～30℃下振荡培养48h～72h，然后将得到的发酵液于4℃ 6000~8000rpm离心取上清，最后将上清采用0.22 nm无菌滤膜过滤即得所述发酵液分离上清液。

7.如权利要求3所述生防菌剂在防治梨轮纹病中的应用。

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