CN104428007A - 包含抗cd22抗体的免疫缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含共价连接于奈莫柔比星衍生物的抗CD22抗体的免疫缀合物及其使用方法。
Description
发明领域
本发明涉及包含抗CD22抗体的免疫缀合物及其使用方法。
背景
如CD19、CD22及CD52的B细胞抗原代表具有用于治疗淋巴瘤的治疗潜力的目标(Grillo-Lopez A.J.等人,Curr Pharm Biotechnol,2:301-11,(2001))。CD22为一种仅在成熟分化阶段表达在B细胞表面上的135-kDa B细胞限制性唾液酸糖蛋白(sialoglycoprotein)(Dorken,B.等人,J.Immunol.136:4470-4479(1986))。CD22在人类中的主要形式为CD22β,其在细胞外域中含有7个免疫球蛋白超家族域(Wilson,G.L.等人,J.Exp.Med.173:137-146(1991))。一种变体形式CD22α缺乏免疫球蛋白超家族域3和4(Stamenkovic,I.和Seed,B.,Nature 345:74-77(1990))。已显示人类CD22的配体结合与免疫球蛋白超家族域1和2(又称为表位1和2)相关(Engel,P.等人,J.Exp.Med.181:1581-1586,1995)。
B细胞相关病症包括但不限于恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphoma),NHL)、多发性骨髓瘤及慢性淋巴细胞性白血病(CLL,B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞))。非霍奇金淋巴瘤(NHL)为一组主要起因于B淋巴细胞的异质癌症,其占所有新近诊断癌症的约4%(Jemal,A.等人,CA-Cancer J Clin,52:23-47,(2002))。侵袭性NHL占成人NHL的约30-40%(Harris,N.L.等人,Hematol.J.1:53-66(2001))且包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、外周T细胞淋巴瘤及间变性大细胞淋巴瘤。一线组合化学疗法治愈的侵袭性NHL患者少于半数,且大多数患者最终死于其疾病(Fisher,R.I.Semin.Oncol.27(增刊12):2-8(2000))。
在B细胞NHL中,在侵袭性群体及无痛性群体中,CD22表达分别在91%至99%的范围内(Cesano,A.等人,Blood 100:350a(2002))。CD22可充当B细胞活化复合物的组分(Sato,S.等人,Semin.Immunol.10:287-296(1998))与粘着分子(Engel,Pl等人,J.Immunol.150:4719-4732(1993))两者。CD22缺乏小鼠的B细胞具有较短寿命及增强的细胞凋亡,这表明此抗原在B细胞存活中具有作用(Otipoby,K.L等人,Nature(Lond)384:634-637(1996))。在与其天然配体或抗体结合之后,CD22快速内化,从而在原代B细胞中提供共刺激信号并且在赘生性B细胞中提供促细胞凋亡信号(Sato,S.等人,Immunity 5:551-562(1996))。
本领域中对靶向CD22以供诊断及治疗CD22相关病状,如癌症的药剂存在需要。本发明满足这个需要且提供其它益处。
概述
本发明提供抗CD22抗体及免疫缀合物及其使用方法。
在一些实施方案中,提供一种包含共价连接于细胞毒性剂的结合CD22的抗体的免疫缀合物,其中所述抗体结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位。在一些实施方案中,细胞毒性剂为奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物。
在一些实施方案中,抗体包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2。在一些实施方案中,抗体包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:11的HVR-H3。在一些实施方案中,抗体包含:a)(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(iv)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(vi)包含氨基酸序列SEQID NO:14的HVR-L3;或b)(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1,(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。在一些实施方案中,抗体包含:a)(i)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3;或b)(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。在一些实施方案中,抗体包含:a)与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少95%序列同一性的VH序列;或b)与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少95%序列同一性的VL序列;或c)如(a)中的VH序列及如(b)中的VL序列。在一些实施方案中,抗体包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:7的VH序列。在一些实施方案中,抗体包含具有氨基酸序列SEQID NO:6的VL序列或具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL序列。在一些实施方案中,抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
在一些实施方案中,提供一种包含共价连接于细胞毒性剂的结合CD22的抗体的免疫缀合物,其中所述抗体包含(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VH序列及具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL序列,并且其中所述细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。
在一些实施方案中,免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p,其中:(a)Ab为抗体;(b)L为接头;(c)D为细胞毒性剂;且(d)p在1-8的范围内。
在一些实施方案中,D为奈莫柔比星衍生物。在一些这类实施方案中,D具有选自以下的结构:
在一些实施方案中,免疫缀合物包含可由蛋白酶裂解的接头。在一些这类实施方案中,接头包含val-cit二肽或Phe-高Lys二肽。在一些实施方案中,免疫缀合物包含酸不稳定性接头。
在一些实施方案中,免疫缀合物具有选自以下的式:
其中R1和R2独立地选自H及C1-C6烷基。在一些实施方案中,p在1-3的范围内。
在一些实施方案中,提供一种免疫缀合物,其中所述免疫缀合物具有选自以下的式:
其中Ab为抗体,其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1,(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3;并且其中p在1至3的范围内。在一些这类实施方案中,抗体包含VH序列SEQ ID NO:7及VL序列SEQ ID NO:8。在一些实施方案中,抗体包含重链SEQID NO:26及轻链SEQ ID NO:23。
在本文论述的任何实施方案中,抗体可为单克隆抗体。在一些实施方案中,抗体可为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中,抗体为结合CD22的抗体片段。在一些实施方案中,抗体结合人类CD22。在一些这类实施方案中,人类CD22具有序列SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:29。
在一些实施方案中,提供药物制剂,其中所述制剂包含本文所述的免疫缀合物及药学上可接受的载体。在一些实施方案中,药物制剂包含另一治疗剂。
在一些实施方案中,提供治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法。在一些实施方案中,方法包括向个体施用有效量的本文所述的免疫缀合物。在一些实施方案中,CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,方法还包括向个体施用另一治疗剂。在一些这类实施方案中,另一治疗剂包含结合CD79b的抗体。在一些实施方案中,另一治疗剂为包含共价连接于细胞毒性剂的结合CD79b的抗体的免疫缀合物。
在一些实施方案中,提供一种治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法,其中所述CD22阳性癌症对第一治疗剂具有抗性。在一些实施方案中,所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的免疫缀合物。在一些实施方案中,CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,第一治疗剂包含结合除CD22以外的抗原的第一抗体。在一些实施方案中,第一治疗剂为包含结合除CD22以外的抗原的第一抗体及第一细胞毒性剂的第一免疫缀合物。在一些实施方案中,第一抗体结合CD79b。在一些实施方案中,第一治疗剂包含结合CD22的第一抗体。在一些实施方案中,第一治疗剂为包含结合CD22的第一抗体及第一细胞毒性剂的第一免疫缀合物。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂与本文所述的免疫缀合物的细胞毒性剂不同。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂为MMAE。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂为美登木素生物碱(maytansinoid)。在一些实施方案中,对第一治疗剂具有抗性的CD22阳性癌症表达P-糖蛋白(P-gp)。
在一些实施方案中,提供一种治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法,其中所述CD22阳性癌症表达P-gp。在一些实施方案中,所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的免疫缀合物。在一些实施方案中,CD22阳性/P-gp阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,CD22阳性/P-gp阳性癌症比对照细胞或组织表达更高水平的P-gp mRNA和/或蛋白质。
在一些实施方案中,提供一种抑制CD22阳性细胞增殖的方法。在一些这类实施方案中,所述方法包括在容许本文所述的免疫缀合物结合细胞表面上的CD22的条件下使细胞暴露于所述免疫缀合物,由此抑制细胞的增殖。在一些实施方案中,细胞为赘生性B细胞。在一些实施方案中,细胞为淋巴瘤细胞。
附图简述
图1A-1B:图1A显示鼠类10F4抗CD22抗体(m10F4)的重链可变区的氨基酸序列与人源化10F4形式1(hu10F4v1)重链可变区及人源化10F4形式3(hu10F4v3)重链可变区的比对以及与人类亚组III序列的比对。对HVR加框(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)。包围HVR的序列为框架序列(FR-H1至FR-H4)。序列是根据Kabat编号加以编号。Kabat、Chothia及接触CDR在加框HVR附近加以指示。图1B显示鼠类10F4抗CD22抗体(m10F4)的轻链可变区的氨基酸序列与人源化10F4形式1(hu10F4v1)轻链可变区及人源化10F4形式3(hu10F4v3)轻链可变区的比对以及与人类κI序列的比对。抗体hu10F4v3在HVR-L1的氨基酸28(N28V)处不同于hu10F4v1。对HVR加框。FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4序列包围HVR(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。序列是根据Kabat编号加以编号。Kabat、Chothia及接触CDR在加框HVR附近加以指示。
图2显示人源化抗CD22抗体10F4v3(IgG1同种型)的轻链和重链的全长氨基酸序列(可变区及恒定区)。加下划线部分为恒定域。
图3显示抗CD22半胱氨酸改造抗体的氨基酸序列,其中改变轻链或重链或Fc区以将所选氨基酸位置上的氨基酸置换为半胱氨酸。所示半胱氨酸改造抗体包括抗CD2210F4变体轻链,其中使Kabat位置205上的缬氨酸(序列位置缬氨酸210)改变成半胱氨酸(“抗CD22V205C h10Fv3半胱氨酸改造轻链”);抗CD2210F4变体重链,其中使EU位置118上的丙氨酸(序列位置丙氨酸121)改变成半胱氨酸(“抗CD22A118C h10Fv3半胱氨酸改造重链”);以及抗CD2210F4变体Fc区,其中使EU位置400上的丝氨酸(序列位置丝氨酸403)改变成半胱氨酸(“抗CD22S400C h10Fv3半胱氨酸改造Fc区”)。在各图中,改变的氨基酸以加有双下划线的粗体文本显示。单下划线指示恒定区。可变区不加下划线。
图4显示实施例A中所述的(A)10F4v3-PNU-2;以及(B)10F4v3-PNU-1的接头及药物结构。
图5显示如实施例B中所述,各种抗体-药物缀合物在WSU-DLCL2小鼠异种移植物模型中的功效。
图6显示如实施例C中所述,各种抗体-药物缀合物在Granta-519小鼠异种移植物模型中的功效。
图7显示如实施例D中所述,各种抗体-药物缀合物在SuDHL4-luc小鼠异种移植物模型中的功效。
图8显示如实施例E中所述,在SuDHL4-1uc小鼠异种移植物模型中10F4v3-PNU-1对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。
图9显示如实施例F中所述,在Bjab-luc小鼠异种移植物模型中10F4v3-PNU-1对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。
图10显示如实施例G中所述,如通过FACS所测定,P-gp在BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1及BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1抗性细胞中及在稳定表达P-gp的Bjab-luc细胞中的表达。
图11显示如实施例G中所述,PNU-159682对稳定表达P-gp的Bjab-luc细胞的剂量依赖性抑制。
图12显示如实施例G中所述,10F4v3-MMAE及10F4v3-PNU-1在BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1抗性细胞异种移植物模型中的功效。
图13显示如实施例H中所述,如通过FACS所测定,P-gp在WSU-DLCL2-10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1及WSU-DLCL2-10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1抗性细胞中的表达。
图14显示如实施例H中所述,10F4v3-MMAE及10F4v3-PNU-1在WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1抗性细胞异种移植物模型中的功效。
详述
I.定义
出于本文的目的,“接受者人类框架”为以下框架:其包含源于如以下定义的人类免疫球蛋白框架或人类共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列。“源于”人类免疫球蛋白框架或人类共有框架的接受者人类框架可包含其相同氨基酸序列,或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化数目为10或10以下、9或9以下、8或8以下、7或7以下、6或6以下、5或5以下、4或4以下、3或3以下、或2或2以下。在一些实施方案中,VL接受者人类框架在序列方面与VL人类免疫球蛋白框架序列或人类共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示,否则如本文所用,“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的)加以测量。测量结合亲和力的具体说明性及示例性实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的”抗体是指相较于在一个或多个高变区(HVR)中不具有一个或多个改变的亲本抗体,具有这类改变的抗体,这类改变会导致抗体对抗原的亲和力得到改善。
术语“抗CD22抗体”及“结合CD22的抗体”是指能够以足以使抗体在靶向CD22时适用作诊断剂和/或治疗剂的亲和力结合CD22的抗体。在一个实施方案中,抗CD22抗体结合无关的非CD22蛋白质的程度小于抗体与CD22的结合的约10%,如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中,结合CD22的抗体的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5Nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或10-8M以下,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中,抗CD22抗体结合CD22中在来自不同物种的CD22中保守的表位。
术语“抗体”在本文中是以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段,只要其展现所要抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指非完整抗体的分子,其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2;双抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如scFv);以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
作为参照抗体的“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中使参照抗体与其抗原的结合被阻断50%或50%以上的抗体,且相反,参照抗体在竞争测定中使所述抗体与其抗原的结合被阻断50%或50%以上。本文提供一种示例性竞争测定。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于黑素瘤、癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金及非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤及白血病。癌症的更具体实例包括B细胞相关癌症,包括例如高级、中级及低级淋巴瘤(包括B细胞淋巴瘤,如黏膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、及霍奇金淋巴瘤和T细胞淋巴瘤)及白血病(包括继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞))、骨髓性白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病)、淋巴细胞性白血病(如急性淋巴母细胞性白血病(ALL))及脊髓发育不良)、及其它血液***癌症和/或B细胞或T细胞相关癌症。还包括其它造血细胞的癌症,所述细胞包括多形核白细胞(如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞)及单核细胞、树突细胞、血小板、红细胞及天然杀伤细胞。还包括选自以下的癌性B细胞增殖性病症:淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)及套细胞淋巴瘤。B细胞癌症的起源包括如下:边缘区B细胞淋巴瘤起源于边缘区中的记忆B细胞,滤泡性淋巴瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤起源于生发中心的明区(light zone)中的中心细胞,慢性淋巴细胞性白血病及小淋巴细胞性白血病起源于B1细胞(CD5+),套细胞淋巴瘤起源于套膜区中的幼稚B细胞且伯基特氏淋巴瘤起源于生发中心的暗区(darkzone)中的中心母细胞。在本文中称为“造血细胞组织”的包括造血细胞的组织包括胸腺及骨髓及外周淋巴组织,如脾、***、与黏膜相关的淋巴组织(如肠管相关淋巴组织、扁桃腺、派亚氏淋巴丛(Peyer’s patch及阑尾)及与其它黏膜相关的淋巴组织,例如支气管内衬(bronchial lining)。这类癌症的其它具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、***癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其它淋巴细胞增殖性病症及各种类型的头颈部癌。
本文的“B细胞恶性疾病”包括非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括低级/滤泡性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞性NHL、高级淋巴母细胞性NHL、高级小非***细胞NHL、巨大肿块疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤及瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞占优性霍奇金病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、无痛性NHL,包括复发性无痛性NHL及利妥昔单抗(rituximab)难治性无痛性NHL;白血病,包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病;伯基特氏淋巴瘤;套细胞淋巴瘤;以及其它血液学恶性疾病。这类恶性疾病可用针对B细胞表面标记(如CD22)的抗体治疗。这类疾病在本文中预期通过施用针对B细胞表面标记(如CD22)的抗体加以治疗,且包括施用未结合(“裸”)抗体或结合于如本文公开的细胞毒性剂的抗体。这类疾病在本文中还预期通过组合疗法加以治疗,所述组合疗法包括本发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体药物缀合物与同时或连续施用的另一抗体或抗体药物缀合物、另一细胞毒性剂、放射或其它治疗的组合。在一种示例性治疗方法中,抗CD22免疫缀合物是与抗CD79b抗体、免疫球蛋白或其CD79b结合片段组合共同或依序施用。抗CD79b抗体可为裸抗体或抗体药物缀合物。在另一示例性治疗方法中,抗CD22免疫缀合物是与抗CD20抗体、免疫球蛋白或其CD20结合片段组合共同或依序施用。抗CD20抗体可为裸抗体或抗体药物缀合物。在组合疗法的一些实施方案中,抗CD22免疫缀合物是与(利妥昔单抗)一起施用。
如本文所用的术语“非霍奇金淋巴瘤”或“NHL”是指除霍奇金淋巴瘤以外的淋巴***癌症。霍奇金淋巴瘤可通常根据在霍奇金淋巴瘤中存在里德-斯特恩伯格细胞(Reed-Sternberg cell)而在非霍奇金淋巴瘤中不存在所述细胞来与非霍奇金淋巴瘤进行区分。由如本文所用的所述术语涵盖的非霍奇金淋巴瘤的实例包括将由本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学家)根据本领域中已知的分类流程,如Color Atlasof Clinical Hematology(第3版),A.Victor Hoffbrand和John E.Pettit(编)(Harcourt Publishers有限公司,2000)中所述的修订欧洲-美国淋巴瘤(Revised European-American Lymphoma,REAL)流程鉴别为此淋巴瘤的任何淋巴瘤。特别参见图11.57、11.58及11.59中的清单。更具体实例包括但不限于复发性或难治性NHL、一线低级NHL、III/IV期NHL、化学疗法抗性NHL、前驱B淋巴母细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结外边缘区-MALT淋巴瘤、结节性边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低级/滤泡性淋巴瘤、中级/滤泡性NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)、中级弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性一线NHL及侵袭性复发性NHL)、在自体干细胞移植之后复发性或为自体干细胞移植所难治的NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高级免疫母细胞性NHL、高级淋巴母细胞性NHL、高级小非***细胞NHL、巨大肿块疾病NHL、伯基特氏淋巴瘤、前体(外周)大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样真菌病和/或塞扎莱综合征(Sezary syndrome)、皮肤(皮肤性)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源于特定来源或物种,而重链和/或轻链的其余部分源于不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要抗体类别:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且若干这些类别可进一步分成子类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素);化学治疗剂或药物(例如甲胺蝶呤(methotrexate)、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道诺霉素(daunorubicin)或其它***剂);生长抑制剂;酶及其片段,如核分解酶;抗生素;毒素,如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素,包括其片段和/或变体;以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“化学治疗剂”为适用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂,如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺烷基磺酸盐,如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及保释芬(piposulfan);氮丙啶,如本多帕(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多帕(meturedopa)及优多帕(uredopa);伸乙亚胺及甲基蜜胺(methylamelamine),包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)及三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine);多聚乙酰(acetogenin)(尤其布拉它辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone));δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol),MARIN);β-拉帕醌(beta-lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素(colchicine);桦木酸(betulinic acid);喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan),C)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、莨菪素(scopolectin)及9-氨基喜树碱(aminocamptothecin));苔藓抑素(bryostatin);凯利他汀(callystatin);CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);足叶草酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);念珠藻素(cryptophycin)(尤其是念珠藻素1和念珠藻素8);多拉司他汀(dolastatin);倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189及CB1-TM1);软珊瑚醇(eleutherobin);潘卡他汀(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海绵抑制素(spongistatin);氮芥,如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝基脲,如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine);抗生素,如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin),尤其是卡奇霉素γ1I及卡奇霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994));达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A;埃斯培拉霉素(esperamicin);以及新抑癌素(neocarzinostain)发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括N-吗啉基-阿霉素、氰基(N-吗啉基)-阿霉素、2-(N-吡咯基)-阿霉素及脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物,如甲胺蝶呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,如二甲叶酸(denopterin)、甲胺蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素(androgen),如二***(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺剂,如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸(folic acid)补充剂,如弗罗林酸(frolinic acid);乙酰葡醛酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);倍曲布西(bestrabucil);比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地佛法明(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);依利醋铵(elliptinium acetate);埃博霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓(gallium nitrate);羟基脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);洛尼代宁(lonidainine);美登木素生物碱,如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫匹丹莫(mopidanmol);二胺硝吖啶(nitraerine);喷司他汀(pentostatin);苯来美特(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2"-三氯三乙胺;新月毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);格塞图辛(gacytosine);***糖苷(arabinoside)(“Ara-C”);噻替派(thiotepa);紫杉烷(taxoid),例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM无聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor-free)的白蛋白改造太平洋紫杉醇纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及多西他赛(docetaxel)(Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chloranbucil);吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲胺蝶呤;铂类似物,如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin);长春花碱(vinblastine)铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱 奥沙利铂(oxaliplatin);甲酰四氢叶酸(leucovovin);长春瑞滨(vinorelbine)诺安托(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊班膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视色素(retinoid),如视黄酸(retinoic acid);卡培他滨(capecitabine) 任何上述各物的药学上可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或更多种上述各物的组合,如CHOP,即环磷酰胺、阿霉素、长春新碱及***龙(prednisolone)的组合疗法的缩写;CVP,即环磷酰胺、长春新碱及***龙的组合疗法的缩写;以及FOLFOX,即使用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU及甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC);Fc受体结合;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调;以及B细胞活化。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必需剂量下且持续必需时期,有效实现所要治疗或防治结果的量。
术语“表位”是指抗原分子上抗体所结合的特定位点。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C端区。所述术语包括天然序列Fc区及变体Fc区。在一个实施方案中,人类IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外规定,否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***,又称为EU索引,如Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR通常由四个FR域组成:FR1、FR2、FR3及FR4。因此,HVR及FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换使用来表示具有与天然抗体结构大致上类似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“CD22的糖基化形式”是指通过添加碳水化合物残基而被转译后修饰的CD22的天然存在的形式。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用且是指其中已引入外源性核酸的细胞,包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”及“转化细胞”,其包括初级转化细胞及源于其的子代而不考虑传代数目。子代在核酸内含物方面可能不完全与母细胞相同,而是可能含有突变。本文包括具有如在原始转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变型子代。
“人类抗体”为具有某一氨基酸序列的抗体,所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞产生或源于利用人类抗体全部组成成分或其它人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义明确排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有框架”为代表在人类免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的框架。一般说来,人类免疫球蛋白VL或VH序列选自可变域序列的亚组。一般说来,序列亚组为如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,亚组为如Kabat等人(上文)中的亚组κI。在一个实施方案中,对于VH,亚组为如Kabat等人(上文)中的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人类HVR的氨基酸残基及来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域的大致上全部,其中全部或大致上全部HVR(例如CDR)对应于非人类抗体的HVR,且全部或大致上全部FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体任选可包含源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人类抗体)的“人源化形式”是指已经受人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定环(“高变环”)的各区。一般说来,天然四链抗体包含六个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3),且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65及H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中的CDR1之外,CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“SDR”。SDR包含在CDR的称为缩短CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58及H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示,否则HVR残基及可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是根据Kabat等人(上文)加以编号。
“免疫缀合物”为结合于一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如母牛、绵羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如人类及非人类灵长类动物,如猴)、兔及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些实施方案中,个体或受试者为人类。
“分离的抗体”为已与天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中,将抗体纯化至纯度大于95%或99%,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或逆相HPLC)所测定。对于评估抗体纯度的方法的评述,参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的核酸”是指已与天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子,但核酸分子是存在于染色体外或存在于不同于其天然染色***置的染色***置上。
“编码抗CD22抗体的分离的核酸”是指一个或多个编码抗体重链及轻链(或其片段)的核酸分子,包括在单一载体或各别载体中的这类核酸分子及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的这类核酸分子。
除非另外指示,否则如本文所用的术语“CD22”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD22,所述脊椎动物来源包括哺乳动物,如灵长类动物(例如人类、食蟹猴(cynomolgus monkey)(cyno))及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。所述术语涵盖“全长”未加工CD22以及CD22的由在细胞中加工所产生的任何形式。所述术语还涵盖CD22的天然存在的变体,例如剪接变体、等位基因变体及亚型。CD22的主要亚型(CD22β)包含847个氨基酸且在细胞外域中包含7个免疫球蛋白样区(参见Wilson,G.L.等人,J.Exp.Med.173:137-146(1991))。次要亚型CD22α包含647个氨基酸且在细胞外域中缺乏免疫球蛋白样域3及4(参见Stamenkovic,I.和Seed,B.,Nature 345:74-77(1990))及Wilson等人(1991),上文)。示例性人类CD22β前体(具有信号序列)的氨基酸序列展示于SEQ ID NO:28中。示例性人类成熟CD22β(无信号序列)的氨基酸序列展示于SEQ ID NO:29中。示例性人类CD22α前体(具有信号序列)的氨基酸序列展示于SEQ ID NO:30中。示例性人类成熟CD22α(无信号序列)的氨基酸序列展示于SEQ ID NO:31中。
术语“CD22阳性癌症”是指包含在表面上表达CD22的细胞的癌症。
术语“CD22阳性细胞”是指在表面上表达CD22的细胞。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致上均质抗体的群体获得的抗体,即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在制造单克隆抗体制剂的期间产生的突变,这些变体通常以少量存在)之外,构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同,单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。因此,修饰语“单克隆”指示如从大致上均质抗体群体获得的抗体的特性,且不应解释为需要通过任何具体方法来制造抗体。举例来说,有待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备,所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现方法及利用含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,这类方法及制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文中描述。
“裸抗体”是指未缀合于异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。举例来说,天然IgG抗体为约150,000道尔顿(dalton)的杂四聚糖蛋白,由经二硫键键结的两个相同轻链及两个相同重链构成。从N端至C端,各重链具有可变区(VH),又称为可变重域或重链可变域,随后为三个恒定域(CH1、CH2及CH3)。类似地,从N端至C端,各轻链具有可变区(VL),又称为可变轻域或轻链可变域,随后为恒定轻(CL)域。抗体的轻链可基于其恒定域的氨基酸序列指定为称为κ及λ的两种类型中的一种。
术语“包装插页”用于代表惯常包括在治疗产品的商业包装中的说明书,其含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或涉及这些治疗产品的使用的警告的信息。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”被定义为在比对序列且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比,且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的多种方式实现,所述方式例如使用可公开获得的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。然而,出于本文目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性%值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创造,且原始码已与用户文件一起在美国版权办公室(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)备案,其中其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可公开从Genentech公司(South San Francisco,California)获得,或可从源代码编译。ALIGN-2程序应被编译以在UNIX操作***(包括数字UNIXV4.OD)上使用。所有序列比较参数皆由ALIGN-2程序设置且不改变。
在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情形下,给定氨基酸序列A对于、与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性%(其可替代地措词为给定氨基酸序列A具有或包含对于、与或相对于给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性%)如下计算:
100×分数X/Y
其中X为通过序列比对程序ALIGN-2在那个程序进行A与B比对时计分为相同匹配的氨基酸残基数,且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应了解当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时,A对于B的氨基酸序列同一性%将不等于B对于A的氨基酸序列同一性%。除非另外明确陈述,否则本文使用的所有氨基酸序列同一性%值皆是使用ALIGN-2计算机程序如前一段落中所述来获得。
术语“药物制剂”是指以下制剂:其呈允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式,且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用,“治疗(treatment)”(及其语法变化形式,如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指企图改变所治疗个体的天然病程,且可为实现防治或在临床病变过程中进行的临床介入。合乎需要的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发性、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病病况及缓和或改良预后。在一些实施方案中,本发明的免疫缀合物用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中参与抗体结合抗原的域。天然抗体的重链及轻链的可变域(分别为VH及VL)通常具有类似结构,其中各域包含四个保守框架区(FR)及三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。)单一VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外,结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL域来分离以分别筛选互补VL或VH域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指核酸分子,其能够使其所连接的另一核酸增殖。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体,以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
“烷基”为含有正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环状碳原子的C1-C18烃。实例为甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
如本文所用的术语“C1-C8烷基”是指具有1至8个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。代表性“C1-C8烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-伯丙基、-伯丁基、-伯戊基、-伯己基、-伯庚基、-伯辛基、-伯壬基及-伯癸基;而支链C1-C8烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基,不饱和C1-C8烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基。C1-C8烷基可未取代或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代:-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN;其中各R’独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用的术语“C1-C6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。代表性“C1-C6烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-伯丙基、-伯丁基、-伯戊基及-伯己基;而支链C1-C6烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基及2-甲基丁基;不饱和C1-C6烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基及3-己基。C1-C6烷基可未取代或被一个或多个如上对于C1-C8烷基所述的基团取代。
如本文所用的术语“C1-C4烷基”是指具有1至4个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。代表性“C1-C4烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-伯丙基、-伯丁基;而支链C1-C4烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基;不饱和C1-C4烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-异丁烯基。C1-C4烷基可未取代或被一个或多个如上对于C1-C8烷基所述的基团取代。
“烷氧基”为单键键结于氧的烷基。示例性烷氧基包括但不限于甲氧基(-OCH3)及乙氧基(-OCH2CH3)。“C1-C5烷氧基”为具有1至5个碳原子的烷氧基。烷氧基可未取代或被一个或多个如上对于烷基所述的基团取代。
“烯基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的含有正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环状碳原子的C2-C18烃。实例包括但不限于:乙烯基(ethylene/vinyl;-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH=CH2)、环戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)。“C2-C8烯基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的含有2至8个正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环状碳原子的烃。
“炔基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的含有正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环状碳原子的C2-C18烃。实例包括但不限于:乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。“C2-C8炔基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的含有2至8个正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环状碳原子的烃。
“亚烷基”是指具有1-18个碳原子且具有通过自母体烷烃的同一或两个不同碳原子除去两个氢原子所获得的两个单价基团中心的饱和支链或直链或环状烃基团。典型的亚烷基包括但不限于:亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)及其类似基团。
“C1-C10亚烷基”为具有式-(CH2)1-10-的直链饱和烃基团。C1-C10亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基及亚癸基。
“亚烯基”是指具有2-18个碳原子且具有通过自母体烯烃的同一或两个不同碳原子除去两个氢原子所获得的两个单价基团中心的不饱和支链或直链或环状烃基团。典型的亚烯基包括但不限于:1,2-亚乙基(-CH=CH-)。
“亚炔基”是指具有2-18个碳原子且具有通过自母体炔烃的同一或两个不同碳原子除去两个氢原子所获得的两个单价基团中心的不饱和支链或直链或环状烃基团。典型的亚炔基包括但不限于:亚乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“芳基”是指碳环芳族基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基及蒽基。碳环芳族基团或杂环芳族基团可未取代或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代:-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN;其中各R’独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C5-C20芳基”为在碳环芳族环中具有5至20个碳原子的芳基。C5-C20芳基的实例包括但不限于苯基、萘基及蒽基。C5-C20芳基可如上对于芳基所述取代或未取代。“C5-C14芳基”为在碳环芳族环中具有5至14个碳原子的芳基。C5-C14芳基的实例包括但不限于苯基、萘基及蒽基。C5-C14芳基可如上对于芳基所述取代或未取代。
“亚芳基”为如以下结构中所示,具有两个共价键且可呈邻位、间位或对位构型的芳基:
其中苯基可未取代或被至多四个包括但不限于以下的基团取代:-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN;其中各R’独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“芳基烷基”是指非环烷基,其中一个键结于碳原子(通常为末端或sp3碳原子)的氢原子被芳基置换。典型的芳基烷基包括但不限于苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基及其类似基团。芳基烷基包含6至20个碳原子,例如芳基烷基的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子且芳基部分为5至14个碳原子。
“杂芳基烷基”是指非环烷基,其中一个键结于碳原子(通常为末端或sp3碳原子)的氢原子被杂芳基置换。典型的杂芳基烷基包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及其类似基团。杂芳基烷基包含6至20个碳原子,例如杂芳基烷基的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子且杂芳基部分为5至14个碳原子以及1至3个选自N、O、P及S的杂原子。杂芳基烷基的杂芳基部分可为具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子)的双环,例如:双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]***。
“取代的烷基”、“取代的芳基”及“取代的芳基烷基”分别意指一个或多个氢原子各自独立地被取代基置换的烷基、芳基及芳基烷基。典型的取代基包括但不限于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2、-C(=S)NR2、-C(=NR)NR2,其中各X独立地为卤素:F、Cl、Br或I;且各R独立地为-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基或前药部分。如上所述的亚烷基、亚烯基及亚炔基也可类似地被取代。
“杂芳基”及“杂环”是指一个或多个环原子为杂原子(例如氮、氧及硫)的环***。杂环基团包含3至20个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子。杂环可为具有3至7个环成员(2至6个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子)的双环,例如:双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]***。
示例性杂环例如描述于Paquette,Leo A.,“Principles of ModernHeterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968),尤其是第1、3、4、6、7及9章;“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950出版),尤其是第13、14、16、19及28卷:以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中。
杂环的实例包括(例如而不限于)吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢苯硫基、硫氧化四氢苯硫基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、亚吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、氮杂环辛基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、吨基、菲噁噻基、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、菲噁嗪基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并***基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基及靛红酰基。
举例来说且不加限制地,碳键结杂环是在以下位置处键结:吡啶的2、3、4、5或6位;哒嗪的3、4、5或6位;嘧啶的2、4、5或6位;吡嗪的2、3、5或6位;呋喃、四氢呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位;噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位;异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位;氮丙啶的2或3位;氮杂环丁烷的2、3或4位;喹啉的2、3、4、5、6、7或8位;或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。更通常地,碳键结杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
举例来说且不加限制地,氮键结杂环是在以下位置处键结:氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位;异吲哚或异吲哚啉的2位;吗啉的4位;以及咔唑或β-咔啉的9位。更通常地,氮键结杂环包括1-氮丙啶基、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
“C3-C8杂环”是指芳族或非芳族C3-C8碳环,其中一至四个环碳原子独立地被来自由O、S及N组成的群的杂原子置换。C3-C8杂环的代表性实例包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、苯硫基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、***基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基及四唑基。C3-C8杂环可未取代或被至多七个包括但不限于以下的基团取代:-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN;其中各R’独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C3-C8杂环基”是指以上定义的C3-C8杂环基团,其中杂环基团的一个氢原子被键置换。C3-C8杂环基可未取代或被至多六个包括但不限于以下的基团取代:-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN;其中各R’独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“碳环”意指具有3至7个碳原子的呈单环形式,或具有7至12个碳原子的呈双环形式的饱和或不饱和环。单环碳环具有3至6个环原子,更通常具有5或6个环原子。双环碳环具有例如排列为双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]***的7至12个环原子、或排列为双环[5,6]或[6,6]***的9或10个环原子。单环碳环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基及环辛基。
“C3-C8碳环”为3、4、5、6、7或8员饱和或不饱和非芳族碳环。代表性C3-C8碳环包括但不限于-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-环庚基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基、-环辛基及-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可未取代或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代:-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2及-CN;其中各R’独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C3-C8碳环基”是指以上定义的C3-C8碳环基团,其中碳环基团的一个氢原子被键置换。
“接头”是指包含共价键或原子链的使抗体共价连接于药物部分的化学部分。在各种实施方案中,接头包括二价基团,如烷基二基、芳基二基、杂芳基二基、如-(CR2)nO(CR2)n-的部分、烷基氧基的重复单元(例如聚亚乙基氧基、PEG、聚亚甲基氧基)及烷基氨基的重复单元(例如聚亚乙基氨基,JeffamineTM);以及二酸酯和酰胺,包括丁二酸酯、丁二酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己酰胺。在各种实施方案中,接头可包含一个或多个氨基酸残基,如缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及高赖氨酸。
术语“手性”是指具有不能与其镜像配偶体重叠特性的分子,而术语“非手性”是指可与其镜像配偶体重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成,但关于原子或基团在空间中的排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心且分子不为彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理性质,例如熔点、沸点、光谱性质及反应性。非对映异构体的混合物可在如电泳及色谱的高分辨率分析程序下分离。
“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种立体异构体。
本文使用的立体化学定义及惯例通常遵循S.P.Parker编,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book公司,New York;以及Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of OrganicCompounds(1994)John Wiley&Sons公司,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在,即其能够使平面偏振光的平面旋转。在描述光学活性化合物时,前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和1或(+)和(-)用于表明化合物使平面偏振光旋转的记号,其中(-)或1意指化合物为左旋的。前缀为(+)或d的化合物为右旋的。对于给定化学结构,这些立体异构体为相同的,其为彼此的镜像除外。特定立体异构体还可称为对映异构体,且这类异构体的混合物常称为对映异构混合物。对映异构体的50∶50混合物称为外消旋混合物或外消旋物,其可在化学反应或过程中不存在立体选择性或立体特异性时出现。术语“外消旋混合物”及“外消旋物”是指两种对映异构物质的缺乏光学活性的等摩尔混合物。
“离去基团”是指可被另一官能团取代的官能团。某些离去基团在本领域中为熟知的,且实例包括但不限于卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲烷磺酰基(甲磺酰基)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(三氟甲磺酸酯基)及三氟甲基磺酸酯基。
术语“保护基”是指通常用于阻断或保护特定官能团而使化合物上的其它官能团反应的取代基。举例来说,“氨基保护基”为连接于氨基的阻断或保护化合物中的氨基官能团的取代基。适合的氨基保护基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)及9-茀基亚甲基氧基羰基(Fmoc)。对于保护基及其使用的一般性描述,参见T.W.Greene,Protective Groups in OrganicSynthesis,John Wiley&Sons,NewYork,1991或后期版本。
II.组合物和方法
一方面,本发明是部分地基于结合CD22的抗体及包含这类抗体的免疫缀合物。本发明的抗体及免疫缀合物例如适用于诊断或治疗CD22阳性癌症。
A.示例性抗CD22抗体
在一些实施方案中,提供结合CD22的分离抗体。CD22为一种在成熟分化阶段在B细胞表面上表达的135-kDa B细胞限制性唾液酸糖蛋白。CD22表达于各种B细胞相关病症及癌症,包括各种淋巴瘤,如非霍奇金淋巴瘤中。
具有信号序列(氨基酸1至19)的一个示例性天然存在的人类CD22前体序列提供于SEQ ID NO:28中,且相应成熟CD22序列显示于SEQ ID NO:29(对应于SEQ ID NO:28的氨基酸20至847)中。具有信号序列(氨基酸1至19)的另一示例性天然存在的人类CD22前体序列提供于SEQ ID NO:30中,且相应成熟CD22序列显示于SEQ ID NO:31(对应于SEQ ID NO:30的氨基酸20至670)中。
在某些实施方案中,抗CD22抗体结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位。非限制性示例性这类抗体包括10F4及其人源化形式。在一些实施方案中,抗CD22抗体结合人类CD22。在一些实施方案中,抗CD22抗体结合人类CD22及食蟹猴CD22。
在一些实施方案中,抗CD22抗体结合人类CD22的亲和力为≤10nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。非限制性示例性这类抗体包括mu10F4、hu10F4v1及hu10F4v3,其结合人类CD22的亲和力分别为2.4nM、1.1-1.7nM及1.6nM。参见例如US 2008/0050310。
测定
为确定抗CD22抗体是否“结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位”,使具有N端及C端缺失的CD22多肽在CHO细胞中表达且如先前所述,通过FACS测试抗体与截短多肽的结合。参见例如US 2008/0050310。相对于与在CHO细胞中表达的全长CD22的结合,抗体与截短多肽的结合实质性降低(≥70%降低)或消除指示抗体不结合那个截短多肽。
使用在表面上表达CD22的CHO细胞,在竞争测定中使用连续稀释的未标记抗CD22抗体来确定抗CD22抗体是否“以≤10nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM的亲和力进行结合”。参见例如US2008/0050310。抗体的结合亲和力KD可根据利用非线性曲线拟合程序进行的标准斯卡查德(Scatchard)分析来测定(参见例如Munson等人,Anal Biochem,107:220-239,1980)。
抗体10F4及其它实施方案
在一些实施方案中,本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗CD22抗体或免疫缀合物:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3;(d)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。在一些实施方案中,本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗CD22抗体或免疫缀合物:(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3;(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1;(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
一方面,本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的抗体或免疫缀合物:(a)包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2;以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3。在一个实施方案中,抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3。在另一实施方案中,抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3及含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。在另一实施方案中,抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3、含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2。在另一实施方案中,抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-H1;(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2;以及(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3。
另一方面,本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体或免疫缀合物:(a)包含选自SEQ IDNO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含氨基酸序列SEQID NO:13的HVR-L2;以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。另一方面,本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体或免疫缀合物:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。在一个实施方案中,抗体包含(a)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。在一个实施方案中,抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
另一方面,本发明的抗体或免疫缀合物包含(a)VH域,其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列:(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,及(iii)包含选自SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3;以及(b)VL域,其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列:(i)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。另一方面,本发明的抗体或免疫缀合物包含(a)VH域,其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列:(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,及(iii)包含选自SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3;以及(b)VL域,其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VLHVR序列:(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1,(ii)包含氨基酸序列SEQID NO:13的HVR-L2,及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
另一方面,本发明提供一种包含以下的抗体或免疫缀合物:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:10的HVR-H2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3;(d)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。另一方面,本发明提供一种包含以下的抗体或免疫缀合物:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3;(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1;(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
在任何以上实施方案中,抗CD22抗体被人源化。在一个实施方案中,抗CD22抗体包含如任何以上实施方案中的HVR,且还包含人类接受者框架,例如人类免疫球蛋白框架或人类共有框架。在某些实施方案中,人类接受者框架为人类VLκ1(VLKI)框架和/或VH框架VHIII。在一些实施方案中,人源化抗CD22抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3;(d)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(f)包含氨基酸序列SEQ IDNO:14的HVR-L3。在一些实施方案中,人源化抗CD22抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1;(b)包含氨基酸序列SEQID NO:10的HVR-H2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3;(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1;(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
另一方面,抗CD22抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参照序列,与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失,但包含那个序列的抗CD22抗体保留结合CD22的能力。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:7中,总计1至10个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:7中,总计1至5个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中,取代、***或缺失发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。
任选地,抗CD22抗体包含VH序列SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7,包括那个序列的转译后修饰。在一个具体实施方案中,VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3。
在一些实施方案中,提供一种抗CD22抗体,其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中,相对于参照序列,与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失,但包含那个序列的抗CD22抗体保留结合CD22的能力。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:8中,总计1至10个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:8中,总计1至5个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中,取代、***或缺失发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地,抗CD22抗体包含VL序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8,包括那个序列的转译后修饰。在一个具体实施方案中,VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(c)包含氨基酸序列SEQID NO:14的HVR-L3。在一些实施方案中,VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2;以及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
另一方面,提供一种抗CD22抗体,其中所述抗体包含如任何以上提供的实施方案中的VH及如任何以上提供的实施方案中的VL。在一些实施方案中,抗体包含分别SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8中的VH序列及VL序列,包括那些序列的转译后修饰。在一些实施方案中,抗体包含分别SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6中的VH序列及VL序列,包括那些序列的转译后修饰。在一些实施方案中,抗体包含分别SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:23中的重链序列及轻链序列,包括那些序列的转译后修饰。在一些实施方案中,抗体包含分别SEQID NO:26及SEQ ID NO:23中的重链序列及轻链序列,包括那些序列的转译后修饰。在一些实施方案中,抗体包含分别SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:23中的重链序列及轻链序列,包括那些序列的转译后修饰。在一些实施方案中,抗体包含分别SEQ ID NO:27及SEQ IDNO:23中的重链序列及轻链序列,包括那些序列的转译后修饰。
另一方面,本发明提供一种与本文提供的抗CD22抗体结合相同表位的抗体或免疫缀合物。举例来说,在某些实施方案中,提供一种与包含VH序列SEQ ID NO:7及VL序列SEQ ID NO:8的抗CD22抗体结合相同表位的抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中,提供一种结合SEQ ID NO:28的来自氨基酸20至240、在氨基酸20至240内或与氨基酸20至240重叠的表位的抗体。
在本发明的另一态样中,根据任何以上实施方案的抗CD22抗体为单克隆抗体,包括嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。在一个实施方案中,抗CD22抗体为抗体片段,例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中,抗体为大致上全长抗体,例如IgG1抗体或如本文定义的其它抗体类别或同种型。
在任何上述免疫缀合物中,抗体可缀合于药物部分。在一些实施方案中,抗体缀合于细胞毒性剂。在一些这类实施方案中,细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物,如PNU-159682。本文论述各种非限制性示例性奈莫柔比星衍生物。
另一方面,根据任何以上实施方案的抗CD22抗体或免疫缀合物可并有单一或呈组合形式的如以下章节1-7中所述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中,本文提供的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM,且任选地为≥10-13M。(例如10-8M或10-8M以下,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中,Kd是如以下测定所述,通过用相关抗体的Fab型式及其抗原进行放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量。Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过在一滴定系列的未标记抗原存在下,使Fab与最小浓度的(125I)标记的抗原平衡,接着用抗Fab抗体涂布的盘捕捉所结合抗原来测量(参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立测定条件,将多孔盘(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕捉抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)涂布过夜,且随后在室温(约23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白的PBS阻断2-5小时。在非吸附盘(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]-抗原与相关Fab的连续稀释液混合(例如与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。接着将相关Fab培育过夜;然而,培育可持续较长时期(例如约65小时)以确保达到平衡。此后,将混合物转移至捕捉盘中以在室温下培育(例如1小时)。接着除去溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20的PBS将盘洗涤八次。当盘已干燥时,每孔添加150μl闪烁体(MICROSCINT-20TM;Packard),且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对盘持续10分钟计数。选择各Fab的实现小于或等于最大结合的20%的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一实施方案,使用或(BIAcore公司,Piscataway,NJ),用固定的抗原CM5芯片在约10反应单位(RU)下在25℃下使用表面等离子体共振测定来测量Kd。简言之,根据供货商说明书用M乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及M羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE公司)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM),随后在流速5μl/min下注射以实现约10反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原之后,注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量,在25℃下在流速约25μl/min下注射Fab于含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合及解离传感器图,使用简单一对一朗缪尔结合模型(评估软件3.2版)计算缔合速率(k缔合)及解离速率(k解离)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率k解离/k缔合。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果由以上表面等离子体共振测定获得的缔合速率超过106M-1s-1,那么可通过使用荧光淬灭技术来测定缔合速率,所述技术测量在如在分光计(如停流配备分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的递增浓度的抗原存在下,在25℃下于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm,16nm带通)的增加或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中,本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下述其它片段。对于某些抗体片段的评述,参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的评述,参见例如Pluckthün,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994);还参见WO93/16185;以及美国专利号5,571,894及5,587,458。对于包含结合表位残基的补救受体且体内半衰期增加的Fab及F(ab′)2片段的论述,参见美国专利号5,869,046。
双抗体是可为二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体及四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人类单域抗体(Domantis公司,Waltham,MA;参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可通过各种技术制备,包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及如本文所述,通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
3.嵌合及人源化抗体
在某些实施方案中,本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体例如描述于美国专利号4,816,567;以及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实施例中,嵌合抗体包含非人类可变区(例如源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(如猴)的可变区)及人类恒定区。在另一实施例中,嵌合抗体为“类别转换”抗体,其中类别或子类已由亲本抗体的类别或子类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中,嵌合抗体为人源化抗体。通常,非人类抗体被人源化以降低对人类的免疫原性,同时保留亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般说来,人源化抗体包含一个或多个可变域,其中例如CDR的HVR(或其部分)源于非人类抗体,且FR(或其部分)源于人类抗体序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分人类恒定区。在一些实施方案中,人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代,例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如评述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中,且进一步例如描述于Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409;Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重修”);Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”);以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)中。
可用于人源化的人类框架区包括但不限于:使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993));源于轻链或重链可变区的特定亚组的人类抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993));人类成熟(体细胞突变)框架区或人类生殖系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));以及由筛选FR文库获得的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人类抗体
在某些实施方案中,本文提供的抗体为人类抗体。人类抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生。人类抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人类抗体可通过向已被修饰以响应于抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。这类动物通常含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座,其置换内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在这类转基因小鼠中,内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。对于从转基因动物获得人类抗体的方法的评述,参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181及6,150,584;描述技术的美国专利号5,770,429;描述K-M技术的美国专利号7,041,870以及描述技术的美国专利申请公布号US 2007/0061900)。来自由这类动物生成的完整抗体的人类可变区可例如通过与不同人类恒定区组合而进一步修饰。
人类抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系已有描述。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,第51-63页(MarcelDekker公司,New York,1987);以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体还描述于Li等人,Proc.Nail.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其它方法包括例如描述于美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤)中的方法。人类杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人类抗体还可通过分离从人类来源的噬菌体呈现文库选择的Fv克隆可变域序列来产生。这类可变域序列可接着与所要人类恒定域组合。用于从抗体文库选择人类抗体的技术在以下描述。
5.文库来源的抗体
抗体可通过筛选组合文库中具有一种或多种所要活性的抗体来分离。举例来说,本领域中已知多种用于产生噬菌体呈现文库及筛选这类文库中具有所要结合特征的抗体的方法。这类方法例如评述于Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中,且例如进一步描述于McCafferty等人,Nature 348:552-554;Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nail.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);以及Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体呈现方法中,通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH及VL基因的全部组成成分且随机重组于噬菌体文库中,可接着筛选所述文库中的抗原结合噬菌体,如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常呈现呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自免疫过的来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者,可克隆(例如从人类克隆)天然全部组成成分以提供单一来源的针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的抗体而不进行任何免疫,如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后,天然文库也可通过以下方式合成制备:从干细胞克隆未重排的V基因区段,及使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区及在体外实现重排,如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人类抗体噬菌体文库的专利公布包括例如:美国专利号5,750,373、以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936及2009/0002360。
从人类抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人类抗体或人类抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中,本文提供的抗体为多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中,一个结合特异性是针对CD22且另一个是针对任何其它抗原。在某些实施方案中,双特异性抗体可结合CD22的两个不同表位。双特异性抗体还可用于使细胞毒性剂定位于表达CD22的细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983);WO 93/08829及Traunecker等人,EMBOJ.10:3655(1991))及“孔中钮(knob-in-hole)”改造(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备:改造用于制备抗体Fc杂二聚分子的静电牵引效应(WO 2009/089004A1);交联两个或两个以上抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980及Brennan等人,Science,229:81(1985));使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992));使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994));以及如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造抗体,包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用性FAb”或“DAF”,其包含结合CD22以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中,涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。举例来说,可能需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。可对缺失、***及取代进行任何组合以获得最终构建体,其限制条件为最终构建体具有所要特征,例如抗原结合性。
a)取代、***及缺失变体
在某些实施方案中,提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代性诱变的相关位点包括HVR和FR。保守性取代展示于表1中的标题“优选取代”下。更实质性变化提供于表1中的标题“示例性取代”下,且如以下关于氨基酸侧链类别进一步所述。氨基酸取代可引入相关抗体中且筛选具有所要活性(例如维持/改善的抗原结合性、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)的产物。
表1
初始残基 | 示例性取代 | 优选的取代 |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val;Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 | Leu |
可根据共同的侧链性质对氨基酸分组:
(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)碱性:His、Lys、Arg;
(5)影响链定向的残基:Gly、Pro;
(6)芳族:Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。一般说来,选用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物性质方面具有改变(例如改善)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将实质上保留亲本抗体的某些生物性质。一个示例性取代变体为亲和力成熟抗体,其可例如使用基于噬菌体呈现的亲和力成熟技术(如本文所述的)便利地产生。简言之,使一个或多个HVR残基突变且使变体抗体呈现在噬菌体上并针对具体生物活性(例如结合亲和力)加以筛选。
可在HVR中进行改变(例如取代)例如以改善抗体亲和力。可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间以高频率经受突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行这些改变,且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并自其进行再选择来实现亲和力成熟已例如描述于Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,(2001)。)中。在亲和力成熟的一些实施方案中,通过多种方法(例如易出错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选用于成熟的可变基因中。接着生成二级文库。然后筛选文库以鉴别具有所要亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR定向方法,其中使若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性鉴别抗原结合中涉及的HVR残基。具体说来,通常以CDR-H3和CDR-L3为目标。
在某些实施方案中,取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内,只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说,可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。这类改变可在HVR“热点”或SDR以外。在以上提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中,各HVR未被改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种适用于鉴别抗体的可作为诱变的目标的残基或区域的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中,鉴别某一残基或一组目标残基(例如带电荷残基,如arg、asp、his、lys及glu)且置换为中性或带负电荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置上引入进一步取代。或者或另外,使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴别抗体与抗原之间的接触点。这类接触残基及相邻残基可作为取代的候选物而被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所要性质。
氨基酸序列***包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合、以及具有单一或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N端或C端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如用于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中,改变本文提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。对抗体添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得生成或除去一个或多个糖基化位点来便利地实现。
当抗体包含Fc区时,可改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-键联连接于Fc区的CH2域的Asn297的分支双触角寡糖。参见例如Wright等人TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸、以及连接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可对抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进性质的抗体变体。
在一个实施方案中,提供具有缺乏(直接或间接)连接于Fc区上的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。举例来说,岩藻糖在这类抗体中的量可为1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如通过MALDI-TOF质谱法所测量,通过相对于连接于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合及高甘露糖结构)的总和计算Asn297上的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量,如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中大致位置297(Fc区残基的Eu编号)上的天冬酰胺残基;然而,Asn297也可由于抗体中的微小序列变化而位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处,即在位置294与300之间。这类岩藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108号(Presta,L.);US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的公布的实例包括:US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化作用的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L;以及WO 2004/056312A1,Adams等人,尤其在实施例11中)及敲除细胞系,如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);以及WO2003/085107)。
进一步提供具有二等分寡糖的抗体变体,例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖是由GlcNAc二等分。这类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。这类抗体变体的实例例如描述于WO 2003/011878(Jean-Mairet等人);美国专利号6,602,684(Umana等人);以及US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可具有改进的CDC功能。这类抗体变体例如描述于WO 1997/30087(Patel等人);WO 1998/58964(Raju,S.);以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中,可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中,由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)的人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中,本发明涵盖具有一些而非所有效应子功能的抗体变体,所述效应子功能使所述抗体变体成为抗体的体内半衰期较为重要但某些效应子功能(如补体及ADCC)不必要或有害的应用所需要的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/去除。举例来说,可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合性(因此可能缺乏ADCC活性),但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3中。评估相关分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者,可采用非放射性测定方法,(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司Mountain View,CA);以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。适用于这类测定的效应子细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)及自然杀手(NK)细胞。或者或另外,相关分子的ADCC活性可例如在动物模型,如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中进行体内评估。还可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为评估补体活化,可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003);以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法对FcRn结合及体内清除率/半衰期进行测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能降低的抗体包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327及329的一个或多个中有取代的抗体(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297及327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体,包括残基265及297取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
与FcR的结合改善或削弱的某些抗体变体已有描述。(参见例如美国专利号6,737,056;WO 2004/056312及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中,抗体变体包含具有一个或多个改进的ADCC的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区。
在一些实施方案中,在Fc区中进行导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即改善或削弱)的改变,例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
半衰期延长且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))的结合改善的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有改进Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fc区。这类Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的变体:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434,例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988);美国专利号5,648,260;美国专利号5,624,821;以及WO 94/29351,涉及Fc区变体的其它实施例。
d)半胱氨酸改造抗体变体
在某些实施方案中,可能需要生成半胱氨酸改造抗体,例如“硫基单抗(thioMAb)”,其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中,取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基,反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点处且可用于使抗体缀合于其它部分(如药物部分或接头-药物部分)以生成免疫缀合物,如本文进一步所述。在某些实施方案中,任一个或多个以下残基可被半胱氨酸取代:轻链的V205(Kabat编号);重链的A118(EU编号);以及重链Fc区的S400(EU编号)。抗CD22抗体的非限制性示例性半胱氨酸改造重链和轻链展示于图3(SEQ ID NO:25至27)中。可如例如美国专利号7,521,541中所述来生成半胱氨酸改造抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中,本文提供的抗体可被进一步修饰以含有本领域中已知且容易获得的其它非蛋白质部分。适于使抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氯基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可具有制造优势。所述聚合物可具有任何分子量,且可分支或未分支。连接于抗体的聚合物的数目可变化,且如果连接一个以上聚合物,那么其可为相同或不同分子。一般说来,用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于有待改进的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在确定条件下用于疗法中等考虑因素加以确定。
在另一实施方案中,提供抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长,且包括但不限于不损害普通细胞但会将非蛋白质部分加热至邻近于抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物来产生抗体。在一个实施方案中,提供编码本文所述的抗CD22抗体的分离核酸。这类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中,提供一种或多种包含这类核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中,提供一种包含这类核酸的宿主细胞。在一个这类实施方案中,宿主细胞包含(例如已用以下转化):(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列及包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体,或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体及包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中,宿主细胞为真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中,提供一种制备抗CD22抗体的方法,其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如以上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞,及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
对于重组产生抗CD22抗体,分离编码例如如上所述的抗体的核酸且将其***一个或多个载体中以用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。这类核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和定序。
适于克隆或表达抗体编码性载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。举例来说,抗体可在细菌中产生,特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段及多肽在细菌中的表达,参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199及5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页,描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后,抗体可从细菌细胞糊状物分离于可溶性部分中且可进一步纯化。
除原核生物之外,如丝状真菌或酵母的真核微生物也为适于抗体编码性载体的克隆或表达宿主,包括糖基化路径已被“人源化”,从而产生具有部分或完全人类糖基化型态的抗体的真菌及酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004);以及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物及昆虫细胞。已鉴别众多可连同昆虫细胞一起使用的杆状病毒株,尤其是用于转染草地黏虫(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。举例来说,适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为适用的。适用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例为由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7);人类胚肾细胞系(如例如Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977)中所述的293或293细胞);幼小仓鼠肾细胞(BHK);小鼠赛托利细胞(sertoli cell)(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞);猴肾细胞(CV1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人类子***细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK);布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A);人类肺细胞(W138);人类肝细胞(Hep G2);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562);如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞;MRC 5细胞;以及FS4细胞。其它适用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));以及骨髓瘤细胞系,如Y0、NS0及Sp2/0。对于适于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的评述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定
可通过本领域中已知的各种测定来鉴别、筛选或表征本文提供的抗CD22抗体的物理/化学性质和/或生物活性。
一方面,例如通过已知方法,如ELISA、FACS或蛋白质印迹来测试抗体的抗原结合活性。
另一方面,竞争测定可用于鉴别与本文所述的任何抗体竞争结合CD22的抗体。在某些实施方案中,这种竞争性抗体结合由本文所述的抗体所结合的同一表位(例如线性或构象表位)。绘制抗体所结合的表位的详述示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols”,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一个示例性竞争测定中,在包含结合CD22的第一标记抗体(例如本文所述的任何抗体)及要测试与第一抗体竞争结合CD22的能力的第二未标记抗体的溶液中培育固定的CD22。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一标记抗体而无第二未标记抗体的溶液中培育固定的CD22。在容许第一抗体结合CD22的条件下培育之后,除去过量未结合抗体,且测量与固定的CD22缔合的标记的量。如果相对于对照样品,与固定的CD22缔合的标记的量在测试样品中实质上降低,那么指示第二抗体与第一抗体竞争结合CD22。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含缀合于一种或多种细胞毒性剂的本文抗CD22抗体的免疫缀合物,所述细胞毒性剂为如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素;细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素;或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
免疫缀合物允许药物部分靶向递送至肿瘤,并且在一些实施方案中,允许在肿瘤中细胞内累积,其中全身性施用未缀合的药物可对正常细胞造成不可接受程度的毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion inPharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)因使有效细胞毒性药物靶向抗原表达性肿瘤细胞(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004),由此通过使功效增至最大且使脱靶毒性降至最低来增强治疗指数(Carter,P.J.和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169;Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)而为组合抗体与细胞毒性药物两者的性质的靶向化学治疗分子。
本发明的ADC化合物包括具有抗癌活性的化合物。在一些实施方案中,ADC化合物包括缀合(即共价连接)于药物部分的抗体。在一些实施方案中,抗体经由接头共价连接于药物部分。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)将有效剂量的药物选择性递送至肿瘤组织,由此可实现更高的选择性(即更低的有效剂量),同时增加治疗指数(“治疗窗”)。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物部分(D)可包括具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团。示例性药物部分包括但不限于奈莫柔比星及其具有细胞毒性活性的衍生物,如PNU-159682。以下进一步详细论述这类免疫缀合物的非限制性实例。
1.示例性抗体-药物缀合物
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的一个示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物部分(D)、及使Ab连接于D的接头部分(L)。在一些实施方案中,抗体经由一个或多个氨基酸残基(如赖氨酸和/或半胱氨酸)连接于接头部分(L)。
示例性ADC具有式I:
Ab-(L-D)p I
其中p为1至约20。在一些实施方案中,可缀合于抗体的药物部分的数目受限于游离半胱氨酸残基的数目。在一些实施方案中,通过本文所述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。示例性式I的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个改造半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中,一个或多个游离半胱氨酸残基在不使用改造下已存在于抗体中,在所述情况下,现存游离半胱氨酸残基可用于使抗体缀合于药物。在一些实施方案中,使抗体暴露于还原条件,随后进行抗体的缀合以生成一个或多个游离半胱氨酸残基。
a)示例性接头
“接头”(L)为可用于使一个或多个药物部分(D)连接于抗体(Ab)以形成式I抗体-药物缀合物(ADC)的双官能或多官能部分。在一些实施方案中,可使用具有可供共价连接于药物及抗体的反应性官能团的接头来制备抗体-药物缀合物(ADC)。举例来说,在一些实施方案中,抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。
一方面,接头具有能够与存在于抗体上的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。非限制性示例性这类反应性官能团包括马来酰亚胺、卤基乙酰胺、α-卤基乙酰基、活化酯(如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酸氯化物、磺酰氯、异氰酸酯及异硫氰酸酯。参见例如Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry15(4):765-773的第766页的缀合方法及本文中的实施例。
在一些实施方案中,接头具有能够与存在于抗体上的亲电子基团反应的官能团。示例性这类亲电子基团包括但不限于醛及酮羰基。在一些实施方案中,接头的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应且与抗体单元形成共价键。非限制性示例性这类反应性官能团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯及芳基酰肼。
接头可包含一种或多种接头组分。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苯甲基氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(“MCC”)。各种接头组分在本领域中为已知的,其中一些在以下描述。
接头可为有助于释放药物的“可裂解接头”。非限制性示例性可裂解接头包括酸不稳定性接头(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定性接头或含有二硫化物的接头(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992);US 5208020)。
在某些实施方案中,接头具有下式II:
-Aa-Ww-Yy- II
其中A为“延伸子单元”,且a为整数0至1;W为“氨基酸单元”,且w为整数0至12;Y为“间隔子单元”,且y为0、1或2。包含式II接头的ADC具有式I(A):Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p,其中Ab、D及p如上对于式I所定义。这类接头的示例性实施方案描述于美国专利号7,498,298中,所述专利以引用的方式明确并入本文中。
在一些实施方案中,接头组分包含使抗体连接于另一接头组分或药物部分的“延伸子单元”(A)。以下展示非限制性示例性延伸子单元(其中波形线指示与抗体、药物或其它接头组分共价连接的位点):
在一些实施方案中,接头组分包含“氨基酸单元”(W)。在一些这些实施方案中,氨基酸单元允许接头由蛋白酶裂解,由此有助于在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)时从免疫缀合物释放药物(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽及五肽。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe);苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys);苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys);以及N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)及甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物,如瓜氨酸。氨基酸单元可针对由具体酶(例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C及D、或纤维蛋白溶酶(plasmin)蛋白酶)酶促裂解进行设计及优化。
通常,肽型接头可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这类肽键可例如根据液相合成方法制备(例如E.和K.Lübke(1965)“The Peptides”,第1卷,第76-136页,Academic Press)。
在一些实施方案中,接头组分包含使抗体直接或经由延伸子单元和/或氨基酸单元连接于药物部分的“间隔子单元(Y)”。间隔子单元可为“自我分解型”或“非自我分解型”。“非自我分解型”间隔子单元为间隔子单元的一部分或全部在ADC裂解后仍然保持结合于药物部分的间隔子单元。非自我分解型间隔子单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔子单元及甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。在一些实施方案中,肿瘤细胞相关蛋白酶酶促裂解含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元的ADC会导致甘氨酸-甘氨酸-药物部分从ADC的其余部分释放。在一些这类实施方案中,甘氨酸-甘氨酸-药物部分在肿瘤细胞中经受水解步骤,由此从药物部***解甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。
“自我分解型”间隔子单元允许释放药物部分。在某些实施方案中,接头的间隔子单元包含对氨基苯甲基单元。在一些这类实施方案中,对氨基苯甲醇经由酰胺键连接于氨基酸单元,且在苯甲醇与药物之间形成氨基甲酸酯、氨基甲酸甲酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)ExpertOpin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中,间隔子单元包含对氨基苯甲基氧基羰基(PAB)。在一些实施方案中,包含自我分解型接头的ADC具有结构:
其中Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基;m为在0至4的范围内的整数;X可为一个或多个其它间隔子单元或可不存在;且p在1至约20的范围内。在一些实施方案中,p在1至10、1至7、1至5、或1至4的范围内。非限制性示例性X间隔子单元包括:
及其中R1和R2独立地选自H及C1-C6烷基。在一些实施方案中,R1和R2各自为-CH3。
自我分解型间隔子的其它实例包括但不限于在电子方面与PAB基团类似的芳族化合物,如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利号7,375,078;Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)及邻氨基苯甲基缩醛或对氨基苯甲基缩醛。在一些实施方案中,可使用在酰胺键水解时经历环化的间隔子,如取代及未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2:223)、适当取代的双环[2.2.1]及双环[2.2.2]环***(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基的α-碳的键联为可适用于ADC中的自我分解型间隔子的另-实例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在一些实施方案中,接头L可为用于经由分支多官能接头部分使一个以上药物部分共价连接于抗体的树枝型接头(Sun等人(2002)Bioorganic&MedicinalChemistry Letters12:2213-2215;Sun等人(2003)Bioorganic&Medicina Chemistry11:1761-1768)。树枝状接头可增加药物与抗体的摩尔比,即负载量,这与ADC的效能相关。因此,当抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基时,众多药物部分可经由树枝状接头进行连接。
非限制性示例性接头在下文展示在式I的ADC的上下文中:
其中R1和R2独立地选自H及C1-C6烷基。在一些实施方案中,R1和R2各自为-CH3。
Phe-高Lys-PAB-Ab;其中n为0至12。在一些实施方案中,n为2至10。在一些实施方案中,n为4至8。
其它非限制性示例性ADC包括结构:
其中X为:
Y为:
各R独立地为H或C1-C6烷基;且n为1至12。
在一些实施方案中,接头被调节溶解性和/或反应性的基团取代。作为一个非限制性实施例,如磺酸酯基(-SO3 -)或铵的带电荷取代基可增加接头试剂的水溶性且有助于接头试剂与抗体和/或药物部分的偶联反应,或有助于Ab-L(抗体-接头中间体)与D、或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应,视用于制备ADC的合成途径而定。在一些实施方案中,接头的一部分偶联于抗体且接头的一部分偶联于药物,且接着使Ab-(接头部分)a偶联于药物-(接头部分)b以形成式I的ADC。
本发明化合物明确涵盖(但不限于)用以下接头试剂制备的ADC:双-马来酰亚胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、3-(溴乙酰胺基)丙酸琥珀酰亚胺基酯(SBAP)、碘乙酸琥珀酰亚胺基酯(SIA)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸]琥珀酰亚胺基酯(SMPH)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB),且包括双-马来酰亚胺试剂:二硫基双马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(以下展示)及BM(PEG)3(以下展示);亚氨基酯的双官能衍生物(如己二酰亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施方案中,双-马来酰亚胺试剂允许抗体中的半胱氨酸的硫醇基连接于含硫醇药物部分、接头或接头-药物中间体。可与硫醇基反应的其它官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯及异硫氰酸酯。
某些适用接头试剂可从各种商业来源,如Pierce Biotechnology公司(Rockford,IL)、Molecular Biosciences公司(Boulder,CO)获得,或可根据本领域中(例如Toki等人(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872;Dubowehik等人(1997)Tetrahedron Letters,38:5257-60;Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355;Frisch等人(1996)BioconjugateChem.7:180-186;US 6214345;WO 02/088172;US 2003130189;US2003096743;WO 03/026577;WO 03/043583;以及WO 04/032828)中所述的程序合成。
碳-14-标记的1-异硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种用于使放射性核苷酸缀合于抗体的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)示例性药物部分
在一些实施方案中,ADC包含蒽环霉素(anthracycline)。蒽环霉素为展现细胞毒性活性的抗生素化合物。尽管不意图受任何具体理论约束,但研究已指出蒽环霉素可通过许多不同机制发挥作用来杀死细胞,所述机制包括:1)药物分子***细胞的DNA中,由此抑制DNA依赖性核酸合成;2)药物产生自由基,其然后与细胞巨分子反应对细胞造成破坏,和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Peterson等人,“Transport And Storage OfAnthracycline In ExperimentalSystems And Human Leukemia”,Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy;N.R.Bachur,“Free Radical Damage”(同上),第97-102页)。由于蒽环霉素的细胞毒性潜力,其已用于治疗众多癌症,如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,Anthracycline: Current Status And New Developments第11页)。
非限制性示例性蒽环霉素包括阿霉素、表柔比星、伊达比星、道诺霉素、奈莫柔比星及其衍生物。已制备并研究道诺霉素及阿霉素的免疫缀合物和前药(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13:477-523;Jeffrey等人(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362;Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16:717-721;Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834;Dubowchik等人(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532;King等人(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343;EP 0328147;US 6630579)。抗体-药物缀合物BR96-阿霉素与肿瘤相关抗原Lewis-Y特异性反应且已在第I期及第II期研究中加以评估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292;Ajani等人(2000)Cancer Jour.6:78-81;Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology17:478-484)。
PNU-159682是奈莫柔比星的一种有效代谢物(或衍生物)(Quintieri等人(2005)ClinicalCancer Research11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是一种在阿霉素的糖苷氨基上具有2-甲氧基(N-吗啉基)的半合成阿霉素类似物且已处于临床评估中(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rev.17:133;Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65:703;),包括针对肝细胞癌的第II/III期试验(Sun等人(2003)Proceedings of theAmerican Society for Clinical Oncology 22,Abs1448;Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research,44:第1版,Abs 4649;Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology24:14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的一个非限制性示例性ADC展示于式Ia中:
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基且R2为C1-C5烷氧基;或其药学上可接受的盐;
L1和Z一起为如本文所述的接头(L);
T为如本文所述的抗体(Ab);且
m为1至约20。在一些实施方案中,m为1至10、1至7、1至5、或1至4。
在一些实施方案中,R1和R2均为甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的另一非限制性示例性ADC展示于式Ib中:
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基且R2为C1-C5烷氧基;或其药学上可接受的盐;
L2和Z一起为如本文所述的接头(L);
T为如本文所述的抗体(Ab);且
m为1至约20。在一些实施方案中,m为1至10、1至7、1至5、或1至4。
在一些实施方案中,R1和R2均为甲氧基(-OMe)。
在一些实施方案中,含奈莫柔比星的ADC的奈莫柔比星组分为PNU-159682。在一些这类实施方案中,ADC的药物部分可具有一种以下结构:
其中波形线指示与接头(L)的连接。
包括PNU-159682在内的蒽环霉素可经由若干键联位点及包括本文所述的接头在内的多种接头(US 2011/0076287;WO2009/099741;US 2010/0034837;WO 2010/009124)缀合于抗体。
包含奈莫柔比星及接头的示例性ADC包括但不限于:
PNU-159682马来酰亚胺缩醛-Ab;
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab;
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab;
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab,其中:
R1和R2独立地选自H及C1-C6烷基:以及
PNU-159682-马来酰亚胺-Ab。
PNU-159682马来酰亚胺缩醛-Ab的接头具有酸不稳定性,而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab、PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab以及PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab的接头可为蛋白酶所裂解。
c)药物负载量
药物负载量由p,即式I分子中每个抗体所对应的药物部分的平均数表示。药物负载量可在每个抗体1至20个药物部分(D)的范围内。式I的ADC包括缀合有一定范围(1至20个)的药物部分的抗体的集合。由缀合反应获得的ADC制剂中每个抗体所对应的药物部分的平均数可通过如质谱法、ELISA测定及HPLC的常规手段表征。还可测定用p表示的ADC的定量分布。在一些情况下,从具有其它药物负载量的ADC分离、纯化及表征p为某一数值的均质ADC可通过如逆相HPLC或电泳的手段来实现。
对于一些抗体-药物缀合物,p可受限于抗体上连接位点的数目。举例来说,当连接为如以上某些示例性实施方案中的半胱氨酸硫醇时,抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基,或可仅具有可供连接接头的一个或若干个具有足够反应性的硫醇基。在某些实施方案中,更高的药物负载量(例如p>5)可导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶、毒性或细胞渗透性降低。在某些实施方案中,ADC的平均药物负载量在1至约8;约2至约6;或约3至约5的范围内。实际上,已显示对于某些ADC,每个抗体所对应的药物部分的最佳比率可小于8,且可为约2至约5(US 7498298)。
在某些实施方案中,少于理论最大值的药物部分在缀合反应期间缀合于抗体。抗体可含有例如不与如下论述的药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基。一般说来,抗体不含许多可连接于药物部分的游离和反应性半胱氨酸硫醇基;实际上,抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中,抗体可用如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原性条件下还原以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中,使抗体经受变性条件以显露反应性亲核基团,如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载量(药物/抗体比率)可以不同方式且例如通过以下加以控制:(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量,(ii)限制缀合反应时间或温度,及(iii)部分或限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原性条件。
应了解当一个以上亲核基团与药物-接头中间体或接头试剂反应时,则所得产物为具有一定分布的一个或多个连接于抗体的药物部分的ADC化合物的混合物。每个抗体所对应的药物的平均数可通过对抗体具有特异性且对药物具有特异性的双重ELISA抗体测定从混合物计算。可通过质谱法鉴别混合物中的个别ADC分子且通过HPLC(例如疏水性相互作用色谱)进行分离(参见例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307;Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070;Hamblett,K.J.等人“Effect of drugloading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,”摘要编号624,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月;Alley,S.C.等人“Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,”摘要编号627,American Association for Cancer Research,2004Annual Meeting,,2004年3月27-31日,Proceedings ofthe AACR,第45卷,2004年3月)。在某些实施方案中,具有单一负载量值的均质ADC可通过电泳或色谱从缀合混合物中分离。
d)某些制备免疫缀合物的方法
式I的ADC可采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件及试剂,通过若干途径制备,包括:(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应以经由共价键形成Ab-L,随后与药物部分D反应;以及(2)药物部分的亲核基团与二价接头试剂反应以经由共价键形成D-L,随后与抗体的亲核基团反应。经由后述途径制备式I的ADC的示例性方法描述于US 7498298中,所述专利以引用的方式明确并入本文中。
抗体上的亲核基团包括但不限于:(i)N端氨基,(ii)侧链氨基,例如赖氨酸,(iii)侧链硫醇基,例如半胱氨酸,及(iv)糖羟基或氨基,其中抗体被糖基化。氨基、硫醇基及羟基具有亲核性且能够与包括以下的接头部分及接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键:(i)活性酯,如NHS酯、HOBt酯、卤基甲酸酯及酸卤化物;(ii)烷基及苯甲基卤化物,如卤基乙酰胺;以及(iii)醛、酮、羧基及马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物,即半胱氨酸桥。可通过用如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂处理以使抗体完全或部分还原来使抗体具有反应性以供与接头试剂缀合。各半胱氨酸桥因此将在理论上形成两个反应性硫醇亲核体。其它亲核基团可经由修饰赖氨酸残基,例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特氏试剂(Traut’s reagent))反应,从而使胺转化成硫醇,而引入抗体中。反应性硫醇基还可通过引入一个、两个、三个、四个或四个以上半胱氨酸残基而引入抗体中(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)。
本发明的抗体-药物缀合物还可通过抗体上的亲电子基团(如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来产生。接头试剂上的适用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯及芳基酰肼。在一个实施方案中,修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。在另一实施方案中,糖基化抗体的糖可例如用高碘酸盐氧化试剂氧化以形成可与接头试剂或药物部分的氨基反应的醛或酮基团。所得亚胺希夫碱(Schiffbase)基团可形成稳定键联,或可例如由硼氢化物试剂还原以形成稳定的胺键联。在一个实施方案中,糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在抗体中产生可与药物上的适当基团反应的羰基(醛及酮)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一实施方案中,含有N端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可与偏高碘酸钠反应,从而产生醛替代第一氨基酸(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146;US 5362852)。可使该种醛与药物部分或接头亲核体反应。
药物部分上的示例性亲核基团包括但不限于:胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯及芳基酰肼基团,其能够与包括以下的接头部分及接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键:(i)活性酯,如NHS酯、HOBt酯、卤基甲酸酯及酸卤化物;(ii)烷基及苯甲基卤化物,如卤基乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基及马来酰亚胺基团。
可用于制备ADC的非限制性示例***联试剂在本文中描述于标题为“示例性接头”的章节中。使用这类交联试剂来连接两个部分(包括蛋白质部分和化学部分)的方法在本领域中为已知的。在一些实施方案中,可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体及细胞毒性剂的融合蛋白。重组DNA分子可包含编码缀合物的抗体及细胞毒性部分的区域,所述区域彼此相邻或由编码不破坏缀合物的所要性质的接头肽的区域分开。
在另一实施方案中,抗体可缀合于“受体”(如抗生蛋白链菌素(streptavidin))以用于肿瘤预靶向中,其中向患者施用抗体-受体缀合物,随后使用清除剂从循环除去未结合的缀合物且接着施用缀合于细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生蛋白(avidin))。
E.用于诊断及检测的方法和组合物
在某些实施方案中,本文提供的任何抗CD22抗体皆适用于检测生物样品中CD22的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物样品”包含例如细胞或组织,(例如活检材料,包括癌性或潜在癌性淋巴组织,包括来自患有或怀疑患有B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的受试者的组织,所述B细胞病症和/或B细胞增殖性病症包括但不限于淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中,提供一种用于诊断或检测方法中的抗CD22抗体。另一方面,提供一种检测生物样品中CD22的存在的方法。在某些实施方案中,所述方法包括使生物样品与如本文所述的抗CD22抗体在容许所述抗CD22抗体结合CD22的条件下接触,及检测在所述抗CD22抗体与所述生物样品中的CD22之间是否形成复合物。这类方法可为体外或体内方法。在一个实施方案中,抗CD22抗体用于选择适于用抗CD22抗体治疗的受试者,例如当CD22为用于选择患者的生物标记时。在另一实施方案中,生物样品为细胞或组织,(例如癌性或潜在癌性淋巴组织,包括患有或怀疑患有B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的受试者的组织,所述B细胞病症和/或B细胞增殖性病症包括但不限于淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。
在另一实施方案中,例如出于诊断、预测或分级癌症;确定适当疗程;或监测癌症对疗法的反应的目的,体内使用抗CD22抗体例如通过体内成像来检测受试者的CD22阳性癌症。本领域中已知的一种用于体内检测的方法为免疫正电子发射断层摄像术(免疫PET),如例如van Dongen等人,The Oncologist 12:1379-1389(2007)及Verel等人,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所述。在这类实施方案中,提供一种用于检测受试者的CD22阳性癌症的方法,所述方法包括向患有或怀疑患有CD22阳性癌症的受试者施用标记的抗CD22抗体,及检测所述受试者中的所述标记的抗CD22抗体,其中检测到所述标记的抗CD22抗体指示在所述受试者中存在CD22阳性癌症。在某些这类实施方案中,标记的抗CD22抗体包含缀合于如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I的正电子发射体的抗CD22抗体。在一个具体实施方案中,正电子发射体为89Zr。
在其它实施方案中,诊断或检测方法包括使固定于基质的第一抗CD22抗体与有待测试CD22的存在的生物样品接触,使所述基质暴露于第二抗CD22抗体,及检测所述第二抗CD22是否结合于所述第一抗CD22抗体与所述生物样品中的CD22之间的复合物。基质可为任何支撑性介质,例如玻璃、金属、陶瓷、聚合珠粒、载片、芯片及其它基质。在某些实施方案中,生物样品包含细胞或组织,(例如活检材料,包括癌性或潜在癌性淋巴组织,包括来自患有或怀疑患有B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的受试者的组织,所述B细胞病症和/或B细胞增殖性病症包括但不限于淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤)。在某些实施方案中,第一或第二抗CD22抗体为本文所述的任何抗体。
可根据任何以上实施方案诊断或检测的示例性病症包括CD22阳性癌症,如CD22阳性淋巴瘤、CD22阳性非霍奇金淋巴瘤(NHL;包括但不限于CD22阳性侵袭性NHL、CD22阳性复发性侵袭性NHL、CD22阳性复发性无痛性NHL、CD22阳性难治性NHL及CD22阳性难治性无痛性NHL)、CD22阳性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、CD22阳性小淋巴细胞性淋巴瘤、CD22阳性白血病、CD22阳性毛细胞白血病(HCL)、CD22阳性急性淋巴细胞性白血病(ALL)、CD22阳性伯基特氏淋巴瘤以及CD22阳性套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,CD22阳性癌症为得到大于“0”的抗CD22免疫组织化学(IHC)计分的癌症,计分“0”对应于在>90%的肿瘤细胞中染色极弱或无染色。在一些实施方案中,CD22阳性癌症以1+、2+或3+程度表达CD22,其中1+对应于在>50%赘生性细胞中实现弱染色,2+对应于在>50%赘生性细胞中实现中度染色,且3+对应于在>50%赘生性细胞中实现强染色。在一些实施方案中,CD22阳性癌症为根据原位杂交(ISH)测定,表达CD22的癌症。在一些这类实施方案中,使用与用于IHC的计分***类似的计分***。在一些实施方案中,CD22阳性癌症为根据检测CD22mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定,表达CD22的癌症。在一些实施方案中,RT-PCR为定量RT-PCR。
在某些实施方案中,提供标记的抗CD22抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色团、电子致密、化学发光及放射性标记)以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的部分,如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、荧光团(如稀土螯合物或荧光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰基、伞形酮(umbelliferone)、荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456))、荧光素(luciferin)、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)或微过氧化物酶(microperoxidase))偶联的杂环氧化酶(如尿酸酶(uricase)及黄嘌呤氧化酶)、生物素/抗生蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基及其类似标记。在另一实施方案中,标记为正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在一个具体实施方案中,正电子发射体为89Zr。
F.药物制剂
如本文所述的抗CD22抗体或免疫缀合物的药物制剂是通过混合具有所要纯度的这类抗体或免疫缀合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))制备成冻干制剂或水溶液形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒,且包括但不限于:缓冲液,如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵;氯化六烃季铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷酯,如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚(catechol);间苯二酚(resorcinol);环己醇;3-戊醇;以及间甲酚);低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖及其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖,如蔗糖、甘露糖醇、岩藻糖或山梨糖醇;成盐抗衡离子,如钠;金属错合物(例如Zn-蛋白质错合物);和/或非离子表面活性剂,如聚乙二醇(PEG)。本文示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂,如可溶性中性-活性透明质酸酶(hyaluronidase)糖蛋白(sHASEGP),例如人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,如rHuPH20(Baxter International公司)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法描述于美国专利公布号2005/0260186及2006/0104968中。一方面,sHASEGP与一种或多种其它糖胺聚糖酶,如软骨素酶(chondroitinase)组合。
示例性冻干抗体或免疫缀合物制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体或免疫缀合物制剂包括美国专利号6,171,586及WO2006/044908中所述的,后述制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文制剂还可含有一种以上如为所治疗的具体适应症所必需的活性成分,优选为具有不会不利地影响彼此的互补活性者。
活性成分可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中,例如分别于胶态药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子及纳米囊)中或于***液中的羟甲基纤维素或明胶-微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。这类技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质呈成形物品,例如薄膜或微囊形式。
有待用于体内施用的制剂通常无菌。无菌性可易于例如通过经无菌过滤膜过滤来实现。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物皆可用于例如治疗方法的方法中。
一方面,本文提供的抗CD22抗体或免疫缀合物用于抑制CD22阳性细胞增殖的方法中,所述方法包括在容许所述抗CD22抗体或免疫缀合物结合于所述细胞表面上的CD22的条件下使所述细胞暴露于所述抗CD22抗体或免疫缀合物,由此抑制所述细胞的增殖。在某些实施方案中,所述方法为体外或体内方法。在一些实施方案中,细胞为B细胞。在一些实施方案中,细胞为赘生性B细胞,如淋巴瘤细胞或白血病细胞。
可使用可从Promega(Madison,WI)商购获得的CellTiter-GloTM发光细胞活力测定来测定体外细胞增殖抑制。那个测定基于对所存在ATP的定量来测定培养物中的活细胞数,ATP为具有代谢活性的细胞的指标。参见Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;美国专利号6602677。测定可以96或384孔格式进行,从而使得所述测定适用于自动高通量筛选(HTS)。参见Cree等人(1995)AntiCancerDrugs 6:398-404。测定程序涉及向培养细胞中直接添加单一试剂(试剂)。这导致细胞溶解及产生由荧光素酶反应所产生的发光信号。发光信号与所存在ATP的量成比例,所存在ATP的量与培养物中存在的活细胞数成正比。数据可由发光计或CCD摄像机成像装置记录。发光输出表示为相对光度单位(RLU)。
另一方面,提供一种用作药剂的抗CD22抗体或免疫缀合物。在其它方面中,提供一种用于治疗方法中的抗CD22抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中,提供一种用于治疗CD22阳性癌症的抗CD22抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中,本发明提供一种用于治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法中的抗CD22抗体或免疫缀合物,所述方法包括向所述个体施用有效量的所述抗CD22抗体或免疫缀合物。在一个这类实施方案中,所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
另一方面,本发明提供抗CD22抗体或免疫缀合物用于制造或制备药剂的用途。在一个实施方案中,药剂是用于治疗CD22阳性癌症。在另一实施方案中,药剂是用于治疗CD22阳性癌症的方法中,所述方法包括向患有CD22阳性癌症的个体施用有效量的所述药剂。在一个这类实施方案中,所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
另一方面,本发明提供一种用于治疗CD22阳性癌症的方法。在一个实施方案中,所述方法包括向患有此CD22阳性癌症的个体施用有效量的抗CD22抗体或免疫缀合物。在一个这类实施方案中,所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种如下所述的其它治疗剂。
根据任何以上实施方案的CD22阳性癌症可为例如淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,CD22阳性癌症为得到大于“0”的抗CD22免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)计分的癌症,计分“0”对应于在>90%的肿瘤细胞中染色极弱或无染色。在另一实施方案中,CD22阳性癌症以1+、2+或3+程度表达CD22,其中1+对应于在>50%赘生性细胞中实现弱染色,2+对应于在>50%赘生性细胞中实现中度染色,且3+对应于在>50%赘生性细胞中实现强染色。在一些实施方案中,CD22阳性癌症为根据检测CD22mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定,表达CD22的癌症。在一些实施方案中,RT-PCR为定量RT-PCR。
在一些实施方案中,包含经由蛋白酶可裂解接头共价连接于抗CD22抗体的奈莫柔比星衍生物的免疫缀合物适用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤及套细胞淋巴瘤,如例如通过实施例B、C及D中所示的异种移植物模型所证实。在一些实施方案中,用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤及套细胞淋巴瘤的免疫缀合物可包含PNU-159682及包含val-cit的接头,如图4C中所示的免疫缀合物。在一些实施方案中,包含经由蛋白酶可裂解接头共价连接于抗CD22抗体的奈莫柔比星衍生物的免疫缀合物适用于治疗伯基特氏淋巴瘤。
在一些实施方案中,提供治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法,其中所述CD22阳性癌症对第一治疗剂具有抗性。在一些实施方案中,对第一治疗剂具有抗性的CD22阳性癌症表达P-糖蛋白(P-gp)。在一些实施方案中,所述方法包括向个体施用有效量的包含结合CD22的抗体的免疫缀合物。在一些实施方案中,CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,第一治疗剂包含结合除CD22以外的抗原的第一抗体。在一些实施方案中,第一治疗剂为包含结合除CD22以外的抗原的第一抗体及第一细胞毒性剂的第一免疫缀合物。在一些实施方案中,第一抗体结合CD79b。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂与包含结合CD22的抗体的免疫缀合物的细胞毒性剂不同。在一些这类实施方案中,第一细胞毒性剂选自MMAE、卡奇霉素、美登木素生物碱及吡咯并苯并二氮杂。在一些这类实施方案中,第一细胞毒性剂为MMAE且包含结合CD22的抗体的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。在一些这类实施方案中,第一细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂且包含结合CD22的抗体的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。在一些这类实施方案中,第一细胞毒性剂为美登木素生物碱且包含结合CD22的抗体的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。
在一些实施方案中,第一抗体结合CD22。在一些这类实施方案中,第一细胞毒性剂选自MMAE、卡奇霉素及吡咯并苯并二氮杂且本文所述的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂为MMAE且本文所述的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂且本文所述的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。在一些实施方案中,第一细胞毒性剂为美登木素生物碱且本文所述的免疫缀合物的细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。
在一些实施方案中,提供一种治疗患有CD22阳性/P-gp阳性癌症的个体的方法。在一些实施方案中,所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的免疫缀合物。在一些实施方案中,CD22阳性/P-gp阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,当癌症比对照细胞或组织表达更高水平的P-gp mRNA和/或蛋白质时,所述癌症被视为P-gp阳性。在各种实施方案中,对照细胞或组织可为来自同一患者的非癌性细胞或组织;来自不同患者或健康个体或来自一组患者或健康个体的非癌性或癌性细胞或组织;来自同一患者的在较早时间点,如在初始治疗方案之前获取的非癌性或癌性细胞或组织;或来自健康个体的细胞或组织等。
在一些实施方案中,提供治疗患有癌症的个体的方法,其中所述癌症对第一治疗剂具有抗性。在一些实施方案中,第一治疗剂为包含经由第一接头连接于第一细胞毒性剂的第一抗体的第一免疫缀合物。在一些实施方案中,治疗患有对第一治疗剂(如第一免疫缀合物)具有抗性的癌症的个体的方法包括施用包含经由第二接头连接于第二细胞毒性剂的第二抗体的第二免疫缀合物。在一些实施方案中,第一抗体及第二抗体结合不同抗原且第一细胞毒性剂与第二细胞毒性剂为相同或不同的。在一些实施方案中,第一抗体及第二抗体结合存在于至少一些相同细胞上的不同抗原。在一些实施方案中,第一抗体及第二抗体结合不同抗原且第一细胞毒性剂与第二细胞毒性剂不同。在一些实施方案中,第一抗体及第二抗体结合相同抗原,且第一细胞毒性剂与第二细胞毒性剂不同。在任何上述实施方案中,第一接头与第二接头可为相同或不同的。在一些实施方案中,第一抗体及第二抗体结合不同抗原,第一接头与第二接头不同,且第一细胞毒性剂与第二细胞毒性剂不同。
根据任何以上实施方案的“个体”可为人类。
另一方面,本发明提供包含本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物的药物制剂,其是例如用于任何以上治疗方法中。在一个实施方案中,药物制剂包含本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物及药学上可接受的载体。在另一实施方案中,药物制剂包含本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物及至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
本发明的抗体或免疫缀合物可单独或与其它药剂组合用于疗法中。举例来说,本发明的抗体或免疫缀合物可与至少一种其它治疗剂共同施用。
在一些实施方案中,抗CD22免疫缀合物是与抗CD79b抗体或免疫缀合物组合施用。一个非限制性示例性抗CD79b抗体或免疫缀合物包含huMA79bv28的高变区,以致所述抗CD79b抗体或免疫缀合物包含(i)具有序列SEQ ID NO:32的HVR H1,(ii)具有序列SEQID NO:33的HVR H2,(iii)具有序列SEQ ID NO:34的HVRH3,(iv)具有序列SEQ ID NO:35的HVR L1,(v)具有序列SEQ ID NO:36的HVR L2,以及(vi)具有序列SEQ ID NO:37的HVR L3。在一些实施方案中,抗CD79b抗体或免疫缀合物包含huMA79bv28的重链可变区及轻链可变区。在一些这类实施方案中,抗CD79b抗体或免疫缀合物包含具有序列SEQ ID NO:38的重链可变区及具有序列SEQ IDNO:39的轻链可变区。在一些实施方案中,抗CD79b免疫缀合物包含选自奥莉斯汀(auristatin)、奈莫柔比星衍生物及吡咯并苯并二氮杂的细胞毒性剂。在一些实施方案中,抗CD79b免疫缀合物包含选自MMAE、PNU-159682及具有以下结构的PBD二聚体的细胞毒性剂:
其中波形线指示与连接于抗CD79b抗体的接头的连接,且其中n为0或1。可用于抗CD79b免疫缀合物中的非限制性示例性接头包括本文所述的那些接头。在一些实施方案中,抗CD79b免疫缀合物选自例如US 8,088,378B2中所述的硫基huMA79bv28HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE免疫缀合物;硫基huMA79bv28HC S400C-MC-val-cit-PAB-MMAE免疫缀合物;硫基huMA79bv28LC V205C-MC-val-cit-PAB-MMAE免疫缀合物;硫基huMA79bv28HC A118C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682;硫基huMA79bv28HC A118C-MC-缩醛-PNU-159682;硫基huMA79bv28HC A118C-MC-val-cit-PAB-PBD;硫基huMA79bv28HC S400C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682;硫基huMA79bv28HC S400C-MC-缩醛-PNU-159682;硫基huMA79bv28HC S400C-MC-val-cit-PAB-PBD;硫基huMA79bv28LC V205C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682;硫基huMA79bv28LC V205C-MC-缩醛-PNU-159682以及硫基huMA79bv28LC V205C-MC-val-cit-PAB-PBD。硫基huMA79bv28HC A118C的重链序列及轻链序列分别展示于SEQ ID NO:40及41中。硫基huMA79bv28HC S400C的重链序列及轻链序列分别展示于SEQ ID NO:43及41中。硫基huMA79bv28LCV205C的重链序列及轻链序列分别展示于SEQ ID NO:42及44中。除特定抗体序列之外,抗CD79b免疫缀合物的结构类似于本文及US 2008/0050310中所述的抗CD22免疫缀合物的结构。
在一些实施方案中,抗CD22免疫缀合物是与抗CD20抗体(裸抗体或ADC)组合施用。在一些实施方案中,抗CD20抗体为利妥昔单抗或2H7(Genentech公司,South San Francisco,CA)。在一些实施方案中,抗CD22免疫缀合物是与抗VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevicizumab),商标名)组合施用。
其它治疗方案可与施用抗CD22免疫缀合物组合,包括但不限于放射疗法和/或骨髓及外周血液移植和/或细胞毒性剂。在一些实施方案中,细胞毒性剂为一种药剂或药剂的组合,如环磷酰胺、羟基道诺霉素(hydroxyldaunorubicin)、阿德力霉素(adriamycin)、多柔比星(doxorubincin)、长春新碱(OncovinTM)、***龙、CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及***龙的组合)、CVP(环磷酰胺、长春新碱及***龙的组合)、或免疫治疗剂,如抗CD20剂(例如利妥昔单抗,商标名)、抗VEGF剂(例如贝伐单抗,商标名)、紫杉烷(taxane)(如太平洋紫杉醇及多西他赛)及蒽环霉素抗生素。
以上指示的这类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一或各别制剂中)、及分开施用,在所述情况下,施用本发明的抗体或免疫缀合物可在施用其它治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体或免疫缀合物还可与放射疗法组合使用。
本发明的抗体或免疫缀合物(及任何其它治疗剂)可通过任何适合的手段施用,包括胃肠外、肺内及鼻内施用,且必要时,对于局部治疗来说,包括病变内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何适合的途径进行,例如通过注射,如静脉内或皮下注射,部分地取决于施用为暂时的抑或长期的。本文涵盖各种给药时程,包括但不限于单次施用或历经各种时间点多次施用、一次性大剂量施用及脉冲输注。
本发明的抗体或免疫缀合物将以符合优良医学规范的方式配制、给药及施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时程及医学从业者已知的其它因素。抗体或免疫缀合物无需但任选地与一种或多种当前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。这类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型、及以上论述的其它因素。这些药剂通常以如本文所述的相同剂量及用如本文所述的施用途径,或以本文所述的剂量的约1%至99%,或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。
对于预防或治疗疾病,本发明的抗体或免疫缀合物(当单独或与一种或多种其它额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于有待治疗疾病的类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重性及病程、施用抗体或免疫缀合物是出于预防目的抑或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史及对抗体或免疫缀合物的反应、以及主治医师的判断。抗体或免疫缀合物适合一次性或历经一系列治疗施用于患者。视疾病的类型及严重性而定,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或免疫缀合物可为用于向患者施用的初始候选剂量,无论例如通过一或多次分开施用或通过连续输注。视以上提及的因素而定,一种典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上的范围内。对于历经若干天或更长时间的重复施用,视病状而定,治疗将通常持续直至出现所要疾病症状抑制。抗体或免疫缀合物的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此,可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)中的一个或多个剂量。这类剂量可间歇施用,例如每周或每三周(例如以使患者接受约两剂至约二十剂,或例如约六剂抗体)。可依次施用初始较高负荷剂量及一次或多次较低剂量。然而,其它给药方案可能适用。此疗法的进展易于通过常规技术及测定进行监测。
在一些实施方案中,更低剂量的包含如PNU-159682的奈莫柔比星衍生物的10F4v3 ADC可用于与更高剂量的包含MMAE部分的10F4v3 ADC实现相同功效。
应了解任何以上制剂或治疗方法皆可使用本发明的免疫缀合物与抗CD22抗体两者进行。
H.制品
本发明的另一方面,提供一种含有适用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。所述制品包含容器及在所述容器上或与所述容器相伴的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、静脉内溶液袋等。容器可由如玻璃或塑料的多种材料形成。容器容纳单独或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一组合物组合的组合物且可具有无菌进入端口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体或免疫缀合物。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选病状。此外,所述制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中所述组合物包含本发明的抗体或免疫缀合物;以及(b)其中含有组合物的第二容器,其中所述组合物包含另一细胞毒性剂或另外的治疗剂。本发明的此实施方案中的制品还可包含指示组合物可用于治疗具体病状的包装插页。或者或另外,所述制品还可包含第二(或第三)容器,其包含药学上可接受的缓冲液,如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)或右旋糖溶液。其还可包括自商业及使用者观点看来合乎需要的其它材料,包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头及注射器。
III.实施例
以下为本发明的方法和组合物的实施例。应了解鉴于以上提供的一般性描述,可实施各种其它实施方案。
A.抗CD22抗体药物缀合物的制造
抗CD22抗体10F4及包括人源化变体hu10F4v1及hu10F4v3的某些变体例如描述于US 2008/0050310中。抗体10F4、hu10F4v1及hu10F4v3包含SEQ ID NO:9、10及11的重链HVR(分别为HVR H1、HVR H2及HVR H3)。抗体10F4及hu10F4v1包含SEQ ID NO:12、13及14的轻链HVR(分别为HVRL1、HVF L2及HVRL3)。Hu10F4v3包含SEQ ID NO:15、13及14的轻链HVR(分别为HVR L1、HVFL2及HVR L3),其中hu10F4v3的HVR L1相对于10F4及10F4v1的HVR L1包含单一氨基酸变化(N28V)。发现三种抗体对人类CD22的结合亲和力类似(在1.4nM至2.3nM的范围内)。在hu10F4v1的HVRL1中进行某些进一步氨基酸取代,且所述取代展示于SEQ ID NO:16至22中。包含那些HVR L1序列中的各者的抗体对人类CD22的结合亲和力自hu10F4v1的结合亲和力变化小于2倍。参见例如US2008/0050310。
对于更大规模的抗体制造,在CHO细胞中产生抗体。将编码VL及VH的载体转染至CHO细胞中且通过蛋白质A亲和色谱从细胞培养基中纯化IgG。
通过使硫基Hu抗CD22 10F4v3HC A118C抗体缀合于某些药物部分来产生抗CD22抗体-药物缀合物(ADC)。硫基Hu抗CD22 10F4v3HC A118C为一种在重链中具有添加可缀合的硫醇基团的A118C突变的人源化抗CD22 10F4v3抗体。参见例如US 2008/0050310。硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C的重链的氨基酸序列展示于SEQ IDNO:26中(参见图3),且硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C的轻链的氨基酸序列展示于SEQ ID NO:23中(参见图2)。如下制备免疫缀合物。
硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-缩醛-PNU-159682(“10F4v3-PNU-2”)
在缀合之前,用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以从硫基抗体的改造半胱氨酸除去阻断基团(例如半胱氨酸)。此过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以除去释放的阻断基团且使用脱氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。接着将完整抗体与药物-接头部分MC-缩醛-PNU-159682组合以使药物-接头部分缀合于抗体的改造半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应,且纯化ADC。ADC的药物负载量(每个抗体所对应的药物部分的平均数目)为约1.8,如以下实施例中所指示。10F4v3-PNU-2具有图4B中所示的结构(p=药物负载量)。
硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-PNU-159 682(“10F4v3-PNU-1”)
在缀合之前,用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以从硫基抗体的改造半胱氨酸除去阻断基团(例如半胱氨酸)。此过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以除去释放的阻断基团且使用脱氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。接着将完整抗体与药物-接头部分MC-val-cit-PAB-PNU-159682(“val-cit”在本文中又可称为“vc”)组合以使药物-接头部分缀合于抗体的改造半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应,且纯化ADC。ADC的药物负载量(每个抗体所对应的药物部分的平均数目)在约1.8至1.9的范围内,如以下实施例中所指示。10F4v3-PNU-1具有图4C中所示的结构(p=药物负载量)。
硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A 118C-MC-val-cit-PAB-MMAE(“10F4v3-MMAE”)
在缀合之前,用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以从硫基抗体的改造半胱氨酸除去阻断基团(例如半胱氨酸)。此过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以除去释放的阻断基团且使用脱氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。接着将完整抗体与药物-接头部分MC-val-cit-PAB-MMAE(“val-cit”在本文中又可称为“vc”)组合以使药物-接头部分缀合于抗体的改造半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应,且纯化ADC。ADC的药物负载量(每个抗体所对应的药物部分的平均数目)测定为约2,如以下实施例中所指示。硫基Hu抗CD22 10F4v3 HCA118C-MC-val-cit-PAB-MMAE例如描述于US 2008/0050310中。
B.人源化抗CD22抗体药物缀合物在WSU-DLCL2异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PNU-159682的缀合物(“10F4v3-PNU-1”及“10F4v3-PNU-2”)的功效,检查缀合抗体在WSU-DLCL2肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(12-13周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个WSU-DLCL2细胞(DSMZ,德国微生物及细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures),Braunschweig,Germany)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积的重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro J,等人nlme:linearand nonlinear mixed effects models.2009;R包,第3.1-96版)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组9只小鼠用2或8mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的硫基Hu抗CD22 10F4v3HCA118C免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在WSU-DLCL2细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤及体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)批准。
那个实验的结果展示于表2和图5中。表2展示各治疗组、在研究结束时具有可观测肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50%以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量及所施用各ADC的药物负载量。
表2:向具有WSU-DLCL2异种移植物的小鼠施用抗CD22ADC
*媒介物=20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02%PS20;n/a=不适用。
在使用如表2中所示的药物缀合物和剂量的35天时程中,相较于媒介物和对照ADC(“对照-PNU-1”),经由蛋白酶可裂解接头与PNU-159682缀合的10F4v3 ADC(“10F4v3-PNU-1”)显示抑制具有WSU-DLCL2肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。参见图5。相较于媒介物和对照ADC(“对照-PNU-2”),经由酸不稳定性接头与PNU-159682缀合的硫基Hu抗CD22(“10F4v3-PNU-2”)也显示抑制具有WSU-DLCL2肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。
在此研究中,测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3 ADC不导致体重在研究期间显著降低。
C.人源化抗CD22抗体药物缀合物在Granta-519异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PNU-159682的缀合物(“10F4v3-PNU-1”及“10F4v3-PNU-2”)的功效,检查缀合抗体在Granta-519肿瘤(人类套细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(10-11周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个Granta-519细胞(DSMZ,德国微生物及细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等人2009)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组9只小鼠用1mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在Grant-519细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。
那个实验的结果展示于表3和图6中。表3展示各治疗组、在研究结束时具有可观测肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50%以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量及所施用各ADC的药物负载量。
表3:向具有Grant-519异种移植物的小鼠施用抗CD22ADC
*媒介物=20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02%PS20;n/a=不适用。
在使用如表3中所示的1mg ADC/kg剂量的药物缀合物的29天时程中,相较于媒介物和对照ADC(“对照-PNU-1”),经由蛋白酶可裂解接头与PNU-159682缀合的硫基Hu抗CD22ADC(“10F4v3-PNU-1”)显示抑制具有Granta-519肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。参见图6。相较于媒介物和对照ADC(“对照-PNU-2”),经由酸不稳定接头与PNU-159682缀合的硫基Hu抗CD22(“10F4v3-PNU-2”)也显示抑制具有Granta-519肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。最后,当在1mg/kg下给与时,10F4v3-PNU-1比与奥莉斯汀药物MMAE缀合的人源化抗CD22硫基单抗(“10F4v3-MMAE”)更好地抑制肿瘤生长。
接受10F4v3-PNU-1的小鼠皆显示肿瘤消退,而大多数用10F4v3-MMAE治疗的小鼠不显示肿瘤消退。单次剂量的10F4v3-PNU-1产生2个部分反应及7个完全反应。
在此研究中,测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3 ADC不导致体重在研究期间显著降低。
D.人源化抗CD22抗体药物缀合物在SuDHL4-luc异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PNU-159682的缀合物(“10F4v3-PNU-1”及“10F4v3-PNU-2”)的功效,检查缀合抗体在SuDHL4-1uc肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(11-12周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个SuDHL4-luc细胞(自DSMZ,德国微生物及细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany获得,且在Genentech进行改造以稳定表达荧光素酶(luciferase)基因)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等人2008)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。接着使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组8只小鼠用2或8mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在SuDHL4-luc细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。
那个实验的结果展示于表4和图7中。表4展示各治疗组、在研究结束时具有可观测肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50%以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量及所施用各ADC的药物负载量。
表4:向具有SuDHL4-luc异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物=20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02%PS20;n/a=不适用。
在使用如表4中所示的药物缀合物及剂量的35天时程中,相较于媒介物和对照ADC(“对照-PNU-1”),经由蛋白酶可裂解接头与PNU-159682缀合的硫基Hu抗CD22 ADC(“10F4v3-PNU-1”)显示抑制具有SuDHL4-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。参见图7。相较于媒介物和对照ADC(“对照-PNU-2”),经由酸不稳定性接头与PNU-159682缀合的硫基Hu抗CD22(“10F4v3-PNU-2”)也显示抑制具有SuDHL4-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。
在此研究中,测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3 ADC不导致体重在研究期间显著降低。
E.10F4v3-PNU-1在SuDHL4-luc异种移植物模型中的剂量递增研究
检查10F4v3-PNU-1在各种剂量水平下于SuDHL4-luc肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的功效。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(10-11周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个SuDHL4-luc细胞(自DSMZ,德国微生物及细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany获得,且在Genentech进行改造以稳定表达荧光素酶基因)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等人2008)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组7只小鼠用0.2、0.5、1或2mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3-PNU-1或对照-PNU-1治疗,所述对照-PNU-1结合不在SuDHL4-luc细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。
那个实验的结果展示于表5和图8中。表5展示各治疗组、在研究结束时具有可观测肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50%以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量及所施用各ADC的药物负载量。
表5:向具有SuDHL4-luc异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物=20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02%PS20;n/a=不适用。
在使用如表5中所示的药物缀合物和剂量的49天时程中,10F4v3-PNU-1显示以剂量依赖性方式抑制具有SuDHL4-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。当在0.5mg/kg或更高剂量下施用时,相较于媒介物或对照ADC,10F4v3-PNU-1显示明确抑制活性。参见图8。
在此研究中,测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3-PNU-1不导致体重在研究期间显著降低。
F.10F4v3-PNU-1在Biab-luc异种移植物模型中的剂量递增研究
检查10F4v3-PNU-1在各种剂量水平下于Bjab-luc肿瘤(伯基特氏淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的功效。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(12-13周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个Bjab-luc细胞(可例如自Lonza,Basel,Switzerland获得,且在Genentech进行改造以稳定表达荧光素酶基因)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等人2008)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组8只小鼠用0.2、0.5、1或2mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3-PNU-1或对照-PNU-1治疗,所述对照-PNU-1结合不在Bjab-luc细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。
那个实验的结果展示于表6和图9中。表7展示各治疗组、在研究结束时具有可观测肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50%以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”;其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量及所施用各ADC的药物负载量。
表6:向具有Bjab-luc异种移植物的小鼠施用抗CD22ADC
*媒介物=20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02%PS20;n/a=不适用。
在使用如表6中所示的药物缀合物和剂量的41天时程中,10F4v3-PNU-1显示以剂量依赖性方式抑制具有Bjab-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。当在1mg/kg或更高剂量下施用时,相较于媒介物或对照ADC,10F4v3-PNU-1显示明确抑制活性。参见图9。此外,2mg/kg的单次剂量的10F4v3-PNU-1在所有治疗动物中皆导致完全肿瘤消退。
在此研究中,测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3-PNU-1不导致体重在研究期间显著降低。
G.包含奈莫柔比星衍生物的抗CD22免疫缀合物在对抗CD22-vc-MMAE具有抗性的Bjab-luc细胞中的功效
为测定包含奈莫柔比星衍生物的抗CD22免疫缀合物在已对抗CD22-vc-MMAE发展出抗性的非霍奇金淋巴瘤中的功效,体内产生对抗CD22-vc-MMAE具有抗性的Bjab-luc细胞。
用于HBSS中的2000万个Bjab-luc细胞于CB17SCID小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)的背侧右侧腹皮下接种。20只用Bjab-luc细胞接种的小鼠在第0天静脉内给与1.5mg/kg hu抗CD2210F4v3-MC-vc-PAB-MMAE。为确定何时将再次及在什么剂量下对小鼠给药,考虑以下因素:肿瘤在初始治疗之后是否再生长(即肿瘤生长回在第0天时的初始肿瘤体积尺寸)及再生长速率。所施用剂量的频率随时间变化但不超过2剂/周。静脉内剂量不超过300μL。所施用剂量的范围为1.5、2、3、4、5、6、8、15及20mg/kg。一旦肿瘤不再对一系列递增剂量起反应(即其显示对一系列递增剂量具有抗性),即中断给药。
产生2个称为BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1和BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1的抗性细胞系。CD22在抗性细胞的表面上表达,且抗CD22抗体由抗性细胞内化。在BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1异种移植物模型中确认对hu抗CD2210F4v3-MC-vc-PAB-MMAE的体内抗性。
通过RT-PCR、FACS及表面等离子体共振测定P-糖蛋白(P-gp,又称为多药物抗性蛋白质1或MDR1)在抗性细胞及亲本Bjab-luc细胞中的表达。所有三种方法皆显示相较于亲本Bjab-luc细胞,P-gp在BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1和BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1细胞中上调。图10显示如通过FACS所测定的P-gp于抗性细胞中的表达。
为支持P-gp至少部分负责在BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1和BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1细胞中观测到的10F4v3-MMAE抗性的假设,产生稳定表达P-gp的Bjab-luc细胞。图10展示P-gp在两个稳定表达Bjab-luc细胞系(高表达细胞系及低表达细胞系)中的表达。还发现Bjab-luc_P-gp高表达及低表达细胞对10F4v3-MMAE具有抗性。
为确定包含奈莫柔比星衍生物的抗CD22免疫缀合物是否可有效对抗抗性细胞,在P-gp表达Bjab-luc细胞系中测试PNU-159682的功效。如图11中所示,尽管PNU-159682为一种蒽环霉素类似物,但其似乎不为P-gp的底物。P-gp高表达Bjab-luc细胞与P-gp低表达Bjab-luc细胞均对PNU-159682敏感。
在BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1异种移植物模型中测定硫基Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682(“10F4v3-PNU-1”)的功效。雌性CB17 ICR SCID小鼠(10周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1细胞于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积100-200mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等人2008)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组8只小鼠用1mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3-PNU-1或8mg ADC/kg的单次静脉内剂量的10F4v3-MMAE治疗。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。
那个实验的结果展示于图12中。那幅图中的未标记线条显示施用单独媒介物的小鼠中的肿瘤生长。BJAB.Luc_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1细胞对10F4v3-MMAE具有体内抗性,但对10F4v3-PNU-1敏感。
H.包含奈莫柔比星衍生物的抗CD22免疫缀合物在对抗CD22-vc-MMAE具有抗性的WSU-DLCL2细胞中的功效
为测定包含奈莫柔比星衍生物的抗CD22免疫缀合物在已对抗CD22-vc-MMAE发展出抗性的非霍奇金淋巴瘤中的功效,体内产生对抗CD22-vc-MMAE具有抗性的WSU-DLCL2细胞。
用于HBSS中的2000万个WSU-DLCL2细胞于CB17 SCID小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)的背侧右侧腹皮下接种。20只用WSU-DLCL2细胞接种的小鼠在第0天静脉内给与12mg/kghu抗CD22 10F4v3-MC-vc-PAB-MMAE。为确定何时将再次及在什么剂量下对小鼠给药,考虑以下因素:肿瘤在初始治疗之后是否再生长(即肿瘤生长回在第0天时的初始肿瘤体积尺寸)及再生长速率。所施用剂量的频率随时间变化但不超过2剂/周。静脉内剂量不超过300μL。所施用剂量的范围为12、15、18、20、25及30mg/kg。一旦肿瘤不再对一系列递增剂量起反应(即其显示对一系列递增剂量具有抗性),即中断给药。
产生2个称为WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1和WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1的抗性细胞系。CD22在抗性细胞的表面上表达,且抗CD22抗体由抗性细胞内化。在WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1异种移植物模型中确认对hu抗CD22 10F4v3-MC-vc-PAB-MMAE的体内抗性。
通过RT-PCR、FACS及表面等离子体共振测定P-糖蛋白(P-gp,又称为多药物抗性蛋白质1或MDR1)在抗性细胞和亲本WSU-DLCL2细胞中的表达。所有三种方法皆显示相较于亲本WSU-DLCL2细胞,P-gp在WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1和WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.2X1细胞中上调。图13展示如通过FACS所测定的P-gp于抗性细胞中的表达。
在WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1异种移植物模型中测定硫基Hu抗CD2210F4v3HC A118C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682(“10F4v3-PNU-1”)的功效。雌性CB17 ICR SCID小鼠(11周龄,来自Charles Rivers Laboratories;Hollister,CA)各自用2×107个WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1细胞于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积100-250mm3时(称为第0天),施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用卡尺测量的两个尺寸,根据式:V=0.5a×b2计算肿瘤体积,且用mm3表示,其中a和b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果,使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等人2008)。此方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模型内的剂量相关联。
各组8只小鼠用2mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3-PNU-1或12mg ADC/kg的单次静脉内剂量的10F4v3-MMAE治疗。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤及体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。
那个实验的结果展示于图14中。那幅图中的未标记线条为施用单独媒介物的小鼠中的肿瘤生长。WSU-DLCL2_10F4v3-vcE(CD22)_T1.1X1细胞对10F4v3-MMAE具有体内抗性,但对10F4v3-PNU-1敏感。
尽管上述本发明已出于清楚理解的目的通过说明及实例方式详细描述,但描述及实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利及科学文献的公开内容皆以全文引用的方式明确并入本文中。
序列表
Claims (49)
1.一种免疫缀合物,其包含共价连接于细胞毒性剂的结合CD22的抗体,其中所述抗体结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位,并且其中所述细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。
2.如权利要求1所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:14的HVR-L3,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:10的HVR-H2。
3.如权利要求1或2所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQID NO:10的HVR-H2,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3。
4.如权利要求1所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含:
a)(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(iv)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3;或
b)(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-H3,(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1,(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3。
5.如权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含:
a)(i)包含选自SEQ ID NO:12及15至22的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3;或
b)(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-L1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:14的HVR-L3。
6.如权利要求1至5中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含:
a)与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少95%序列同一性的VH序列;或
b)与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少95%序列同一性的VL序列;或
c)如(a)中的VH序列及如(b)中的VL序列。
7.如权利要求6所述的免疫缀合物,其包含具有氨基酸序列SEQID NO:7的VH序列。
8.如权利要求6所述的免疫缀合物,其包含具有氨基酸序列SEQID NO:6的VL序列或具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL序列。
9.一种免疫缀合物,其包含共价连接于细胞毒性剂的结合CD22的抗体,其中所述抗体包含(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VH序列及具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL序列,并且其中所述细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
11.如权利要求1至10中任一项所述的免疫缀合物,其中所述免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p,其中:
(a)Ab为所述抗体;
(b)L为接头;
(c)D为所述细胞毒性剂;并且
(d)p在1-8的范围内。
12.如权利要求11所述的免疫缀合物,其中D为奈莫柔比星衍生物。
13.如权利要求12所述的免疫缀合物,其中D具有选自以下的结构:
14.如权利要求11至13中任一项所述的免疫缀合物,其中所述接头可由蛋白酶裂解。
15.如权利要求14所述的免疫缀合物,其中所述接头包含val-cit二肽或Phe-高Lys二肽。
16.如权利要求11至13中任一项所述的免疫缀合物,其中所述接头具有酸不稳定性。
17.如权利要求16所述的免疫缀合物,其中所述接头包括腙。
18.如权利要求12所述的免疫缀合物,其具有选自以下的式:
其中R1和R2独立地选自H及C1-C6烷基。
19.如权利要求11至18中任一项所述的免疫缀合物,其中p在1-3的范围内。
20.一种免疫缀合物,其具有选自以下的式:
其中Ab为抗体,其包含(i)包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-H1,(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-H2,(iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:11的HVR-H3,(iv)包含氨基酸序列SEQ IDNO:15的HVR-L1,(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-L2,以及(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3;并且其中p在1至3的范围内。
21.如权利要求20所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含VH序列SEQ ID NO:7及VL序列SEQ ID NO:8。
22.如权利要求21所述的免疫缀合物,其中所述抗体包含重链SEQ ID NO:26及轻链SEQ ID NO:23。
23.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体为单克隆抗体。
24.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
25.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体为结合CD22的抗体片段。
26.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物,其中所述抗体结合人类CD22。
27.如权利要求26所述的免疫缀合物,其中人类CD22具有序列SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29。
28.一种药物制剂,其包含如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物及药学上可接受的载体。
29.如权利要求28所述的药物制剂,其还包含另一治疗剂。
30.一种治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法,所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至27中任一项所述的免疫缀合物。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。
32.如权利要求31所述的方法,其还包括向所述个体施用另一治疗剂。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述另一治疗剂包含结合CD79b的抗体。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述另一治疗剂为包含共价连接于细胞毒性剂的结合CD79b的抗体的免疫缀合物。
35.一种抑制CD22阳性细胞增殖的方法,所述方法包括在容许如权利要求1至27中任一项所述的免疫缀合物结合所述细胞的表面上的CD22的条件下使所述细胞暴露于所述免疫缀合物,由此抑制所述细胞的增殖。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述细胞为赘生性B细胞。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述细胞为淋巴瘤细胞。
38.一种治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法,其中所述CD22阳性癌症对第一治疗剂具有抗性,所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至27中任一项所述的免疫缀合物。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。
40.如权利要求38或39所述的方法,其中所述第一治疗剂包含结合除CD22以外的抗原的第一抗体。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述第一治疗剂为包含结合除CD22以外的抗原的第一抗体及第一细胞毒性剂的第一免疫缀合物。
42.如权利要求40或41所述的方法,其中所述第一抗体结合CD79b。
43.如权利要求38或39所述的方法,其中所述第一治疗剂包含结合CD22的第一抗体。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述第一治疗剂为包含结合CD22的第一抗体及第一细胞毒性剂的第一免疫缀合物。
45.如权利要求41至44中任一项所述的方法,其中所述第一细胞毒性剂与如权利要求1至27中任一项所述的免疫缀合物的细胞毒性剂不同。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述第一细胞毒性剂为MMAE。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述CD22阳性癌症表达P-糖蛋白(P-gp)。
48.一种治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法,其中所述CD22阳性癌症表达P-gp,所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至27中任一项所述的免疫缀合物。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。
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