CN102159248A - 蒽环类衍生物缀合物、它们的制备方法以及它们作为抗肿瘤化合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗有效的蒽环类抗生素与载体诸如多克隆抗体和单克隆抗体、天然源或合成源的蛋白质或肽的缀合物；本发明还涉及它们的制备方法、含有它们的药物组合物以及其在治疗某些哺乳动物肿瘤中的用途。
Description
对相关申请的交叉引用
此非临时申请，根据35USC§119(e)，要求2008年7月15日提交的美国临时申请61/080,944的权益，将其全部内容通过引用的方式并入本申请。
技术领域
本发明涉及治疗有效的蒽环类抗生素与载体(诸如多克隆抗体和单克隆抗体、天然源或合成源的蛋白质或肽)的缀合物；本发明还涉及制备它们的方法、含有它们的药物组合物以及其在治疗某些哺乳动物肿瘤中的用途。本发明还涉及新的蒽环类衍生物以及它们的制备。
背景技术
蒽环类抗生素为表现细胞毒素活性的抗生素化合物。研究已经显示蒽环类抗生素可用于通过多种不同机制杀死细胞，所述机制包括：1)将药物分子嵌入到细胞的DNA中，因此抑制DNA-依赖性核酸合成；2)通过自由基的药物产生，然后将自由基与细胞大分子反应以引起细胞损伤；或3)药物分子与细胞膜的相互作用[参见，例如C.Peterson等人.，“Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia”在Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy中；N.R.Bachur，“Free Radical Damage”id.在第97-102页]。由于它们的细胞毒性潜力，蒽环类抗生素已经用于治疗多种癌症诸如白细胞过多症、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤[参见，例如P.H-Wiernik，在Anthracycline：Current Status And New Developments中第11页]。通常使
用的蒽环类抗生素包括多柔比星、表柔比星、伊达比星和柔红霉素。
在最近几年，已经合成了许多新的高细胞毒性的蒽环类抗生素。例如奈莫柔比星，带有与糖部分(sugar moiety)的C-3’位连接的经取代的吗啉代环的蒽环类衍生物，已经显示了有前景的对实验性鼠类肿瘤的抗肿瘤活性[参见J.W.Lown，Bioactive Molecules(1988)vol 6：55-101]且目前在治疗肝细胞癌的临床试验期[参见C.Sessa，O.Valota，C.Geroni，Cardiovascular Toxicology(2007)7(2)：75-79]。尽管这些化合物可有效用于治疗新生物和其它疾病(其中发现所选的细胞群被去除)，但是它们的治疗效能通常被与它们的给药相关的剂量依赖性毒性所限制。
已经通过将蒽环类抗生素与抗体或不同载体进行连接做了改善这些化合物的治疗作用的尝试。报道了与抗体缀合的蒽环类抗生素的实例，例如在Bristol Myers的EP 0328147、Farmitalia Carlo Erba的WO 9202255或Pharmacia & Upjohn的US 5776458中报道。
其它有趣的具有高活性特征的三环类吗啉代蒽环类衍生物，在M.Caruso等人的国际专利申请WO 98/02446(1997)中被描述和要求。在这些衍生物中，特别有效的化合物为PNU-159682，其由Quintieri，L.，Geroni，C.等人在Clinical Cancer Research(2005)11(4)：1608-1617中描述。化合物PNU-159682具有在本申请如下定义的式(IIA)，以及下述化学命名：
(9CI)(8S，10S)-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-[[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-八氢-9-甲氧基-1-甲基-1H-吡喃并[4′，3’：4，5]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基]5，12-并四苯二酮；
7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-[(八氢-9-甲氧基-1-甲基-1H-吡喃并[4′，3’：4，5]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基)氧基]-5，12-并四苯二酮，[1S-[1α，3β(8R*，10R*)，4aβ，9α，9aα，10aβ]]或(8S，10S)-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮。
已经建立了用于癌症、免疫学和血管新生紊乱患者靶向治疗的抗体疗法(Carter，P.(2006)Nature Reviews Immunology 6：343-357)。使用抗体-药物缀合物(ADC)即免疫缀合物局部递送细胞毒性或细胞抑制剂，即癌症治疗中杀伤或抑制肿瘤细胞的药物，将药物部分靶向递送到肿瘤，并在肿瘤的细胞内累积，在此全身性施用这些非缀合药剂可能导致对正常细胞和所要去除的肿瘤细胞不可接受的毒性水平(Xie等人(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3)：281-291；Kovtun等人(2006)Cancer Res.66(6)：3214-3121；Law等人(2006)Cancer Res.66(4)：2328-2337；Wu等人(2005)Nature Biotech.23(9)：1137-1145；Lambert J.(2005)Current Opin.in Pharmacol.5：543-549；Hamann P.(2005)Expert Opin.Ther.Patents 15(9)：1087-1103；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Trail等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614)。因此所要寻求的是最大的功效同时毒性最小。设计和改进ADC的努力集中于单克隆抗体(mAbs)的选择性以及药物作用机制、药物-连接、药物/抗体比(负载)和药物-释放特性(McDonagh(2006)Protein Eng.Design & Sel.；Doronina等人(2006)Bioconj.Chem.17：114-124；Erickson等人(2006)Cancer Res.66(8)：1-8；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res.11：843-852；Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem.48：1344-1358；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070)。所述药物部分可能通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制机制影响其细胞毒性和细胞抑制效应。当与缀合大型抗体或蛋白质受体配体时，一些细胞毒性药物倾向于失活或活性减小。
蒽环类抗生素类似物，多柔比星(ADRIAMYCIN
)，认为其通过对拓扑异构酶II的进程的潜入和抑制来与DNA相互作用，其解开DNA以用于转录。多柔比星在其破坏DNA链复制之后稳定拓扑异构酶II络合物，防止DNA双螺旋重接且因此终止复制进程。多柔比星和柔红霉素(DAUNOMYCIN)为原型细胞毒性天然产物蒽环类抗生素化学治疗(Sessa等人(2007)Cardiovasc.Toxicol.7：75-79)。已经制备并研究了免疫缀合物以及柔红霉素和多柔比星的前药(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13：477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362；Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16：717-721；Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97：829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532；King等人(2002)J.Med.Chem.45：4336-4343；US 6630579)。抗体-药物缀合物BR96-多柔比星特别地与肿瘤相关抗原Lewis-Y反应且已经在I期和II期研究中被评估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18：2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour.6：78-81；Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology 17：478-484)。
通过在糖苷氨基上环化形成的多柔比星和柔红霉素的吗啉代类似物具有更大的效能(Acton等人(1984)J.Med.Chem.638-645；US 4464529；US4672057；US 5304687)。奈莫柔比星为多柔比星与在多柔比星的糖苷氨基上的2-甲氧基吗啉代基团的半合成类似物，且已经进行临床评价(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rew.17：133；Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65：703)，包括针对肝细胞癌的II/III期试验(Sun等人(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22，Abs 1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research，44：1st Ed，Abs4649；Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology 24：14116)。
奈莫柔比星命名为(8S，10S)-6，8，11-三羟基-10-((2R，4S，5S，6S)-5-羟基-4-((S)-2-甲氧基吗啉代)-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基氧基)-8-(2-羟基乙酰基)-1-甲氧基-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮，CAS登记号108852-90-0，且其具有下述结构：
已经表征了几种来自肝微体的奈莫柔比星代谢产物(MMDX)，包括PNU-159682(Quintieri等人(2005)Clinical Cancer Research，11(4)：1608-1617；Beulz-Riche等人(2001)Fundamental&Clinical Pharmacology，15(6)：373-378；EP 0889898；WO 2004/082689；WO 2004/082579)。PNU-159682在体外具有比奈莫柔比星和多柔比星更显著的细胞毒性，且在体内肿瘤模型中有效。PNU-159682(式(IIA))命名为3′-脱氨基-3″，4′-脱水-[2″(S)-甲氧基-3″(R)-氧基-4″-吗啉基]多柔比星，且具有下述结构：
已经描述了一些PNU-159682抗体-药物缀合物(″NEMORUBIClN METABOLITE AND ANALOG ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND METHODS″，PCT/US2009/031199，2009年1月16日提交)。
发明内容
本发明的一个方面提供了新的蒽环类衍生物缀合物，其具有与所选细胞群反应的载体诸如单克隆抗体或多克隆抗体、蛋白质、肽或与受体组织反应的其它合成源的载体。
本发明的另一个方面为制备所述缀合物以及有效中间体的方法。
本发明的缀合物的特征为式(I)
[Ant-L-Z-]m-T (I)
其中
Ant为蒽环类衍生物残基，
L为连接基团(linker)，
Z为间隔基团(spacer)，
m为1至30的整数，且
T为载体诸如蛋白质、肽、单克隆抗体或多克隆抗体或适于与一个或多个[Ant-L-Z-]部分连接的上述物质的化学修饰衍生物，或聚合物载体；
其特征在于Ant表示的蒽环类衍生物残基可被释放得到式(II)的蒽环类衍生物或其药用盐：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基且R2为C1-C5烷氧基。
蒽环类衍生物残基经连接基团-间隔基团[L-Z-]与载体连接，且在蒽环类衍生物和连接基团臂之间的化学键可在生理条件下断开而释放如上定义的式(II)的蒽环类衍生物，其为生物活性剂。
例如，缀合物可典型地在细胞内的条件下(例如在溶酶体媒介物中)释放蒽环类衍生物，其中在蒽环类衍生物和连接基团之间的化学键对酸性条件或还原条件敏感。
本发明的优选的方法为治疗具体类型的癌症，所述癌症包括但不限于：癌诸如膀胱癌(bladder)、乳腺癌(breast)、结肠癌(colon)、肾癌(kidney)、肝癌(liver)、肺癌(lung)包括小细胞肺癌(including small cell lung cancer)、食道癌(esophagus)、胆囊癌(gall-bladder)、卵巢癌(ovary)、胰腺癌(pancreas)、胃癌(stomach)、***(cervix)、甲状腺癌(thyroid)、***癌(prostate)和皮肤癌(skin)包括鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)；淋巴系的造血肿瘤(hematopoietic tumors of lymphoid lineage)，包括白细胞过多症(leukaemia)、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocitic leukaemia)、急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukaemia)、B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、T细胞淋巴瘤(T-cell-lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、毛细胞淋巴瘤(hairy cell lymphoma)和伯基特淋巴瘤(Burkett′s lymphoma)；骨髓系的造血肿瘤(hematopoietic tumors of myeloid lineage)，包括急性和慢性髓细胞性白血病(acute and chronic myelogenous leukemias)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)和前髓细胞白血病(promyelocytic leukaemia)；间质源的肿瘤(tumors of mesenchymal origin)，包括纤维肉瘤(fibrosarcoma和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)；中枢和周围神经***的肿瘤(tumors of the central and peripheral nervous system)，包括星形细胞瘤(astrocytoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、胶质瘤((glioma)和神经鞘瘤(schwannomas))；其它肿瘤，包括黑色素瘤(melanoma)、***瘤(seminoma)、畸胎癌(teratocarcinoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)、角质黄色瘤(keratoxanthoma)、甲状腺滤泡癌(thyroid follicular cancer)和卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)。本发明的另一个优选的方法为治疗具体细胞增殖障碍(cellular proliferation disorders)，例如良性***增生(benign prostate hyperplasia)、家族性腺瘤病(familial adenomatosis)、息肉病(polyposis)、神经纤维瘤病(neurofibromatosis)、银屑病(psoriasis)、与动脉粥样硬化相关的血管性平滑细胞增生(vascular smooth cell proliferation associated with atherosclerosis)、肺纤维化(pulmonary fibrosis)、关节炎(arthritis，)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)和术后狭窄(post-surgical stenosis)和再狭窄(restenosis)。
式(I)的蒽环类衍生物缀合物可经包括标准合成转移的方法制备；本发明也提供了所述方法以及在所述方法中使用的中间体。
本发明也提供了药物组合物，其包含式(I)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐以及药用赋形剂或稀释剂。
本发明的一个方面为式(IIc)的蒽环类衍生物
Ant-L-(Z)m-X (IIc)
其中Ant为选自下述结构的蒽环类衍生物：
其中波浪线表示与连接基团L的连接；Z为任选间隔基团；m为0或1；X为反应活性官能团(reactive functional group)；且n为1至6的整数。
本发明的一个方面为抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其包含通过连接基团L和任选间隔基团Z与一个或多个蒽环类衍生物药物部分D共价连接的抗体，所述化合物具有式(Ic)
Ab-(L-Zm-D)p (Ic)
或其药用盐，其中p为1至8的整数。
附图说明
图1显示了pH 5.2时的表1中所示的化合物2的稳定性，如在图1中显示，其中(Y)轴表示如下定义的式(IIA)的化合物的含量百分数，且(X)轴表示按小时计的时间。该图证实了本发明的缩醛键合(acetalic bound)的酸敏感性，其通过式(IIA)的游离化合物在酸性pH条件下由缀合物中增加的释放来说明。
图2显示了制备式Ia的化合物的示例性方法，其通过使式II的蒽环类衍生物与乙烯基醚化合物(X)或(IX)反应得到缩醛化合物(XI)，水解为羧基化合物(XII)，并活化形成N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(XIII)，其用于与载体化合物缀合。
图3a显示制备式Ia的化合物的示例性方法，其通过使活化的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(XIII)与氨基-硫醇试剂(XXI)反应得到XXII，可将其与吡啶基-二硫化物载体(T)中间体(VI)反应得到二硫化物连接的蒽环类衍生物缀合物(Ia)，或使式(V)与马来酰亚胺载体(T)中间体(XXII)反应得到马来酰亚胺连接的蒽环类衍生物缀合物(Ia)。
图3b显示制备式Ia的化合物的示例性方法，其通过使活化的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(XIII)与氨基-酯试剂(XVIII)反应，接着进行酯水解得到羧基蒽环类衍生物(XIX)，其可活化为NHS酯并与氨基载体T中间体例如抗体缀合，得到酰胺连接的蒽环类衍生物缀合物(Ia)。
图3c显示制备式Ia的化合物的示例性方法，其通过使活化的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯(XIII)与载体T(XIV)例如抗体的氨基或硫醇基反应得到酰胺或硫基酰胺连接的蒽环类衍生物缀合物(Ia)。
图4显示了示例性方法，其使蒽环类衍生物(II)与酰基酰肼衍生物(XXV)反应形成腙(XXVI)，接着与载体T试剂缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图5a显示了示例性方法：(2a)使蒽环类衍生物腙(XXVI)与硫醇基-或氨基-载体T化合物(XIV)反应得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)；(2b)使蒽环类衍生物腙(XXVI)与试剂(XXVII)反应，接着脱保护为(XXVIII)并与羧基-载体T化合物(XVII)缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)；以及(2d)使脱保护的(XXVIII)与醛-载体T化合物(XX)进行缩合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图5b显示了示例性方法：(2c)使蒽环类衍生物腙(XXVI)与试剂(XXIX)反应，接着进行脱保护并与氨基-载体T化合物缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图5c显示了示例性方法：(2e)使蒽环类衍生物腙(XXVI)与试剂(XXXI)反应得到(XXXII)，接着(2e″)与吡啶基二硫化物载体化合物(VI)缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)，以及(2e′)使(XXXII)与马来酰亚胺载体化合物(V)缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图6显示了示例性方法，其使蒽环类衍生物(II)与酰基酰肼，吡啶基二硫化物(XXXIII)反应形成吡啶基二硫化物腙(XXXIV)，接着与载体T试剂缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图7a显示了示例性方法：(3a)使蒽环类衍生物(XXXIV)与硫醇-载体(XIV)反应得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)；(3b)使蒽环类衍生物(XXXIV)与硫醇化合物(XXXV)反应得到胺二硫化物化合物(XXXVI)，将其与羧基-载体T试剂缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)；以及(3d)使脱保护的(XXXVI)与醛-载体T化合物(XX)进行缩合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图7b显示了示例性方法：(3c)使蒽环类衍生物(XXXIV)与硫醇酯(XXXVII)反应，接着脱保护为羧基二硫化物化合物(XXXVIII)，并与氨基-载体T(XIV)缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图7c显示了示例性方法：(3e)使蒽环类衍生物(XXXIV)与硫醇试剂(XXXIX)反应得到二硫化物硫醇(XL)，(3e′)使二硫化物硫醇(XL)与吡啶基二硫化物载体化合物(VI)缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)；以及使二硫化物硫醇(XL)与马来酰亚胺载体化合物(V)缀合得到蒽环类衍生物缀合物(Ib)。
图7d显示了药物-连接基团中间体N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰]-L-缬氨酰-N5-氨基甲酰-N-[4-({[(4-{[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]羰基}哌嗪-1-基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺55的合成途径。
图8显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度(单位为nM)的曲线：游离药物PNU-159682连续暴露、PNU-159682 1小时培养、NHS-缩酮-Ant 50、马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、马来酰亚胺-腙-Ant 52和硫吡啶(thiopyridine)-腙-Ant 53。
图9显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度(单位为nM)的曲线：游离药物PNU-159682连续暴露、PNU-159682 1小时培养、NHS-缩酮-Ant 50、马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、马来酰亚胺-腙-Ant 52和硫吡啶-腙-Ant 53。
图10显示MCF7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度(单位为nM)的曲线：游离药物PNU-159682连续暴露、PNU-159682 1小时培养、NHS-缩酮-Ant 50、马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、马来酰亚胺-腙-Ant 52和硫吡啶-腙-Ant 53。
图11显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度(单位为nM)的曲线：游离药物PNU-159682连续暴露、PNU-1596821小时培养、NHS-缩酮-Ant 50、马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、马来酰亚胺-腙-Ant52和硫吡啶-腙-Ant 53。DoxRes Her2细胞系也已知为″AdrRes Her2″。
图12显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。(经Kabat编号方案的重链抗体编号)
图13显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。
图14显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。
图15显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。
图16显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。
图17显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。
图18显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。
图19显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22 NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。
图20显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对一定浓度(μg/ml)的以下物质的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。
图21显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110、PNU-159682游离药物。
图22显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。
图23显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110、PNU-159682游离药物。
图24显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。
图25显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110、PNU-159682游离药物。
图26显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。
图27显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HCA114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110、PNU-159682游离药物。
图28显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。
图29显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HCA114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110、PNU-159682游离药物，所有组均加入维拉帕米。
图30显示在第0天单次静脉内(iv)给药以下物质后，接种于CB17 SCID小鼠中的伯基特淋巴瘤Bjab-luc异种移植物肿瘤的体内平均肿瘤体积随时间的变化曲线：(1)媒介物，(2)硫基-抗-CD22(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE111 1mg/kg，(3)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 1mg/kg，(4)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 5mg/kg，(5)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 1mg/kg，(6)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 5mg/kg，(7)硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103 1mg/kg，(8)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108 1mg/kg，(9)PNU-159682游离药物8.77ug/kg(26ug/m2暴露)，与1mg/kg药物剂量的抗体-药物缀合物相匹配。
图31显示在第0天单次iv给药以下物质后，接种于CRL nu/nu小鼠中的MMTV-HER2 Fo5***同种异体移植物肿瘤的体内平均肿瘤体积随时间的变化曲线：(1)媒介物，(2)曲妥单抗-MCC-DM1 101 5/mg/kg，(3)曲妥单抗-MCC-DM1 101 10mg/kg，(4)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 5mg/kg，(5)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 10210mg/kg，(6)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 5mg/kg，(7)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 10mg/kg，(8)曲妥单抗-MCC-DM1 101 5mg/kg+硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 5mg/kg。
图32显示在第0天单次iv给药以下物质后，接种于SCID-米色小鼠的LnCap-Ner异种移植物肿瘤的体内平均肿瘤体积随时间的变化曲线：(1)媒介物，(2)硫基-抗-steap1(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112 1mg/kg，(3)硫基-抗-steap1(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112 3mg/kg，(4)硫基-抗-steap1(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 113 1mg/kg，(5)硫基-抗-steap1(HCA114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 113 3mg/kg，(6)硫基-抗-steap1(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 113 6mg/kg，(7)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 1mg/kg，(8)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant1073mg/kg，(9)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 6mg/kg。
具体实施方式
现在详细参考本发明的具体实施方案，以附随的结构和通式阐述其实施例。虽然将结合所列举的实施方案描述本发明，但会理解它们并不意味着将本发明限于那些实施方案。相反，本发明将包括所有的替代方案、改造方案和等同方案，这些替代方案、改造方案和等同方案包括在权利要求所定义的本发明的范围内。本领域技术人员会认识到与本申请所述类似或等同的许多方法和材料能够用于实施本发明。本发明决不限于所述的方法和材料。除非另有定义，本申请所用技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义，且与Singleton等人.，(1994)Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，2nd Ed.，J.Wiley & Sons，New York，NY；and Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immuno Biology，5thEd.，Garland Publishing，New York一致。
定义
除非另有说明，本申请所用下述术语和短语将具有下述含义。
本申请使用商标名时，申请人意欲独立地包括所述商标名产品制剂、所述商标名产品的同类药物和活性药物成分。
″蒽环类衍生物″为奈莫柔比星代谢产物或类似化合物，包括但不限于PNU-159682。
″蒽环类衍生物缀合物″为包含经连接基团与载体部分(包括抗体、蛋白质或肽)共价连接的蒽环类衍生物的化合物。蒽环类衍生物缀合化合物(conjugate compound)包括抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate，ADC)化合物。
术语“氨基酸侧链”包括在如下发现的那些：(i)天然存在的氨基酸诸如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；(ii)次要氨基酸诸如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、合成类似物和天然存在的氨基酸的衍生物；以及(iv)所有对映异构体、非对映异构体、异构体富集形式、同位素标记(例如2H、3H、14C、15N)、受保护形式及其外消旋混合物。
本申请术语“抗体”以最广义使用，特别包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的生物学活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170：4854-4861)。抗体可以为鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源于其它物种的抗体。抗体是由能够识别和结合特定抗原的免疫***产生的蛋白(Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immuno Biology，5th Ed.，Garland Publishing，New York)。目标抗原一般具有由多种抗体的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。每种特异地结合不同表位的抗体都具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异地结合感兴趣目标的抗原的抗原结合位点或其一部分的分子，这种目标包括但不限于癌细胞或生产与自身免疫病相关的自身免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。所述免疫球蛋白可以源于任何物种，包括人、鼠或兔源的。
″抗体片段″包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；由Fab表达文库生产的片段、抗独特型(抗-Id)抗体、CDR(互补决定区)和上述任何免疫特异地结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位-结合片段、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本申请所用术语“单克隆抗体”指由基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能少量存在的天然存在的突变之外，组成所述群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。另外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体优势在于它们可以被合成但不被其它抗体所污染。所述修饰语“单克隆”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，不能理解为需要以任何特定方法生产所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，所述杂交瘤方法由Kohler等(1975)Nature 256：495首次描述，或可以通过重组DNA方法(参见，US 4816567)制备。例如，单克隆抗体也可以利用Clackson等(1991)Nature，352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597描述的技术由噬菌体抗体文库分离。
此处单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，以及这些抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特异性抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，而链的其余部分与源于其它物种或属于其它抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，只要它们显示所需的生物学活性(US4816567；和Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855)。嵌合抗体包括“灵长类化的”抗体，其包含源于非人灵长类(例如，旧世纪猴或猿(old world Monkey or Ape))的可变区抗原结合序列和人恒定区序列。
此处“完整抗体”为包含VL和VH结构域，以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(例如，人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应器功能”，即可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应器功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体如B细胞受体和BCR的负调节。
依据其重链恒定区的氨基酸序列，可以将完整抗体指定为不同的“类别”。有五种主要的完整抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分为亚类(同工型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA，以及IgA2。相应于不同抗体类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是熟知的。
“ErbB受体”是受体蛋白酪氨酸激酶，其属于ErbB受体家族，该家族是细胞生长、分化和存活的重要介导物。ErbB受体家族包括四种不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1，HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。ErbB受体通常会包括胞外结构域，其可以结合ErbB配体；亲脂性跨膜结构域；保守性胞内酪氨酸激酶结构域；和含有几个可以磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。ErbB受体可以为“天然序列”ErbB受体或其“氨基酸序列变体”。ErbB受体可以为天然序列人ErbB受体。因此，“ErbB受体家族成员”为EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、ErbB4或当前已知的或将来要鉴定的任何其它ErbB受体。序列鉴别筛选已经得到两种其它ErbB受体家族成员的鉴别；ErbB3(US 5183884；US 5480968；Kraus等人(1989)PNAS(USA)86：9193-9197)和ErbB4(EP 599274；Plowman等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1746-1750；和Plowman等人(1993)Nature 366：473-475)。这些受体均表现在至少一些乳腺癌细胞系中的增加的表达。抗-ErbB2抗体已经被表征(US 5677171；US 5821337；US 6054297；US 6165464；US 6407213；US 6719971；US 6800738；Fendly等人(1990)Cancer Research 50：1550-1558；Kotts等人.(1990)In Vitro 26(3)：59A；Sarup等人.(1991)Growth Regulation 1：72-82；Shepard等人.J.(1991)Clin.Immunol.11(3)：117-127；Kumar等人.(1991)Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986；Lewis等人.(1993)Cancer Immunol.Immunother.37：255-263；Pietras等人.(1994)Oncogene 9：1829-1838；Vitetta等人.(1994)Cancer Research 54：5301-5309；Sliwkowski等人.(1994)J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665；Scott等人.(1991)J.Biol.Chem.266：14300-5；D′souza等人.Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：7202-7206；Lewis等人.(1996)Cancer Research 56：1457-1465；和Schaefer等人.(1997)Oncogene 15：1385-1394)。
“人源化”形式的非人(例如，啮齿类的)抗体为包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体为其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)高变区的残基所置换的人免疫球蛋白(受体抗体)，所述非人物种为例如具有所需特异性、亲合力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人残基所置换。另外，人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。构建了这些修饰以进一步改善抗体性能。总的来说，人源化抗体基本上会包含所有的或至少一个和典型地两个可变区，其中所有的或基本上所有的高变环相应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有的或基本上所有的FRs均为人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白恒定区)的至少一部分(Jones等人(1986)Nature，321：522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-329；和Presta，(1992)Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596)。人源化抗-ErbB2抗体包括在US5821337(此处特别加入作为参考)的表3中描述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN
曲妥单抗)；人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗体。
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”均表示治疗学治疗和预防或阻止措施，其中目的是阻止或减慢(减轻)不希望的生理学改变或紊乱，诸如癌症的发展或蔓延。针对本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病状况的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状况的改善或缓和，以及症状缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗(Treatment)”还可以指与不接受治疗时所期望的存活相比较的延长的存活。需要治疗的患者包括那些已经患所述病症或紊乱的，以及容易患所述病症或紊乱的患者，或要预防其病症或紊乱的那些患者。
“紊乱(disorder)”指将受益于本发明的治疗的任何病症。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括那些使哺乳动物易感染所述紊乱的病理学病症。此处所要治疗的紊乱的非限制性实例包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴恶性疾病，特别是乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰腺、***或膀胱癌；神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞(macrophagal)、上皮、基质和囊胚(blastocoelic)紊乱；以及炎性、血管发生病症和免疫学病症。所要治疗的根据本发明的示例性紊乱为实体恶性肿瘤。
术语“治疗有效量”指有效治疗哺乳动物疾病或紊乱的药物的量。就癌症来说，药物的治疗有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)将癌细胞向***器官中的浸润抑制、阻滞、减缓至一定程度并优选终止；(iv)抑制(即减缓至一定程度且优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；和/或(vi)将一种或多种与癌症有关的症状减轻至一定程度。达到药物能够阻止生长和/或杀死存在的癌细胞的程度时，其可能是细胞抑制和/或细胞毒性的。在动物模型中，可以通过施用ADC后的病程期间物理测量肿瘤，并通过测定肿瘤的部分和完全消退来评估功效。对于癌症治疗，例如可以通过评估疾病进展时间(time to disease progression)(TTP)和/或测定反应率(response rate)(RR)来测定功效。
术语″生物利用度″指施用到患者的给定量药物的***可利用性(即，血液/血浆水平)。生物利用度为绝对性术语，指药物从施用的剂量型式到达体循环的时间(速率)和总量(程度)的测量值。
术语“癌症”和“癌症的”指或描述典型地以无限制的细胞生长为特征的哺乳动物生理学病症。“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病或淋巴恶性疾病。这种癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝细胞癌、胃(gastric)或胃部(stomach)癌症，包括胃肠癌、胃肠基质肿瘤(gastrointestinal stromal tumor)(GIST)、胰腺癌、恶性胶质瘤(glioblastoma)、***(cervical cancer)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾(kidney or renal)癌、***癌、***癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、***癌、***癌，以及头颈癌。
“表达ErbB的癌症”指包含在其细胞表面存在ErbB蛋白的细胞的癌症。“表达ErbB2的癌症”指在其细胞表面产生足够水平的ErbB2，因此抗ErbB2抗体能够与其结合并具有针对所述癌症的治疗学效果的癌症。
“过表达”受体例如ErbB受体的癌症指与相同组织类型的非癌细胞相比，在其细胞表面具有明显更高水平所述受体诸如ErbB2的癌症。这种过表达可以由基因增殖或增强的转录或翻译所致。受体过表达可以在诊断或预后测试中通过评估细胞表面上提高的受体蛋白水平来测定(例如，通过免疫组化测试；IHC)。可替换地，或除此之外，可以通过例如荧光原位杂交(FISH；参见WO 98/45479)、southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术诸如实时定量PCR(RT-PCR)测定细胞中编码受体的核酸的水平。受体配体的过表达可以在诊断学上通过评估患者中所述配体(或编码它的核酸)的水平来测定，例如，在肿瘤活组织检查中或通过上述的多种诊断测试诸如IHC、FISH、southern印迹、PCR或体内测试。也可以通过测定生物流体诸如血清中的脱落抗原(例如，ErbB胞外结构域)来研究受体过表达(参见，例如，US 4933294；WO91/05264；US 5401638；和Sias等人(1990)J.Immunol.Methods 132：73-80)。除了上述测试以外，本领域技术人员还可以采用多种其它体内测试。例如，可以将患者体内的细胞与抗体接触，所述抗体任选用可检测的标记，例如，放射性同位素标记过，可以评估抗体与患者细胞的结合，例如，通过放射性外部扫描，或通过分析活组织切片，该活组织切片取自之前接触过所述抗体的患者。
本申请所用术语“细胞毒性试剂”指抑制或阻止细胞机能和/或导致细胞破坏的物质。所述术语将包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、60C和Lu的放射性同位素)、化疗剂，以及毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶学活性毒素，包括其合成类似物和衍生物。
″化疗剂″是用于以任何作用机制治疗癌症的化合物。化疗剂种类的实例包括但不限于：烷化剂、抗代谢产物、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括在“靶标疗法”和常规化学疗法中使用的化合物。化疗剂包括：厄洛替尼(TARCEVA
Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(TAXOTERE
Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS No.51-21-8)、吉西他滨(GEMZAR
Lilly)、PD-0325901(CAS No.391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺二胺，二氯铂(II)，CAS No.15663-27-1)、卡铂(CAS No.41575-94-4)、紫杉醇(TAXOL
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、曲妥单抗(HERCEPTIN
Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2，3，4，6，8-吡咯烷二环[4.3.0]壬-2，7，9-三烯-9-甲酰胺，CAS No.85622-93-1，TEMODAR
TEMODAL
Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N，N-二甲基-乙胺，NOLVADEX
ISTUBALVALODEX
)和多柔比星(ADRIAMYCIN
)、Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化疗剂更多的实例包括：奥沙利铂(ELOXATIN
Sanofi)、硼替佐米(VELCADE
Millennium Pharm.)、sutent(SUNITINIBSU11248，Pfizer)、来曲唑(FEMARA
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC
Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(FASLODEX
AstraZeneca)、leucovorin(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，RAPAMUNE
Wyeth)、拉帕替尼(TYKERB
GSK572016，Glaxo Smith Kline)、lonafarnib(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(NEXAVAR
BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA
AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR
CPT-11，Pfizer)、tipifarnib(ZARNESTRATM，Johnson &Johnson)、ABRAXANETM(无克列莫佛)、白蛋白修饰的紫杉醇纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，II)、vandetanib(rINN，ZD6474，ZACTIMA
AstraZeneca)、chloranmbucil、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、temsirolimus(TORISEL
Wyeth)、pazopanib(GlaxoSmithKline)、canfosfamide(TELCYTA
Telik)、塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN
NEOSAR
)；磺酸烷基酯(alkyl sulfonate)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚胺嗪(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、磷雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、三芥环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33：183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA；二碳磷酸盐化合物(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素类(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、吗啉阿霉素、氰吗啉阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、曲麦克特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羟哔咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；环氧甘醚(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和美坦西醇类(ansamitocin)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达谋(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西作非兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替哌；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(XELODA
Roche)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇(retinoids)，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述药剂的药用盐、酸和衍生物。
该定义“化疗剂”还包括：(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素药，诸如抗***和选择性***受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX
枸橼酸他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮(onapristone)和FARESTON
枸橼酸托瑞米芬(toremifene citrate)；(ii)抑制在肾上腺中调节***生成的芳化酶的芳化酶(aromatase)抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN
依西美坦(exemestane；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR
伏罗唑(vorozole)、FEMARA
来曲唑(letrozole；Novartis)和ARIMIDEX
阿纳托唑(anastrozole；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂诸如MEK抑制剂(WO 2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras诸如oblimersen(GENASENSE
Genta Inc.)；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(如ANGIOZYME
核酶)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN
疫苗、LEUVECTIN
疫苗和VAXID
疫苗；PROLEUKIN
rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂诸如LURTOTECAN
ABARELIX
rmRH；(ix)抗血管新生剂诸如贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN
Genentech)；及任何上述药剂的药用盐、酸和衍生物。
该定义“化疗剂”还包括治疗抗体诸如阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(AVASTIN
Genentech)；西妥昔单抗(ERBITUX
Imclone)；帕木单抗(panitumumab)(VECTIBIX
Amgen)、利妥昔单抗(RITUXAN
Genentech/Biogen Idec)、培妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥单抗(HERCEPTIN
Genentech)、托西莫单抗(Bexxar，Corixia)和抗体药物缀合物吉姆单抗奥佐米星(MYLOTARG
Wyeth)。
作为与本发明的PI3K抑制剂联用的具有治疗潜力的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、atlizumab、bapineuzumab、贝伐单抗、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达克珠单抗、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、非维珠单抗、泛维珠单抗(fontolizumab)、吉姆单抗奥佐米星、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、易普利姆玛(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗、莫维珠单抗(motavizumab)、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奥马佐单抗(omalizumab)、帕利珠单抗、帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、培妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、ralivizumab、兰尼单抗(ranibizumab)、reslivizumab、瑞利珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗维珠单抗、鲁利单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、tacatuzumab四氢西泮、tadocizumab、他利珠单抗(talizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、tocilizumab、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥单抗、tucotuzumab西莫白介素、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“包装说明书”用于按照惯例包括在治疗产品商业包装中的说明书，其包含有关适应症、用法、用量、给药方法、禁忌的信息和/或涉及此治疗产品使用的警告。
″烷基″指C1-C8烃，包含正、仲、叔或环碳原子。烷基的实例包括但不限于：甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
本申请使用的“亚烷基”指1-12个碳原子(C1-C12)的饱和直链或支链的二价烃基，其中亚烷基可任选独立取代有一个或多个下述取代基。在另一个实施方案中，亚烷基含有1至8个碳原子(C1-C8)，或1至6个碳原子(C1-C6)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语″烯基″指含有2至8个碳原子(C2-C8)的直链或支链一价烃基，其具有至少一个不饱和位点，即碳-碳sp2双键，其中烯基可任选独立取代有一个或多个本申请所述取代基，且包括具有″顺″和″反″构型或可替换地″E″和″Z″构型的基团。实例包括但不限于乙烯基(ethylenyl或vinyl)(-CH＝CH2)、2-丙烯基(-CH2CH＝CH2)等。
术语″亚烯基″指含有2至8个碳原子(C2-C8)的直链或支链二价烃基，其具有至少一个不饱和位点，即碳-碳sp2双键，其中烯基可被任选取代，且包括具有″顺″和″反″构型或可替换地″E″和″Z″构型的基团。实例包括但不限于亚乙烯基(ethylenylene或vinylene)(-CH＝CH-)、烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。
术语″炔基″指含有2至8个碳原子(C2-C8)的直链或支链一价烃基，其具有至少一个不饱和位点，即碳-碳sp三键，其中炔基可任选独立取代有一个或多个本申请所述取代基。实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH2C≡CH)等。
术语″亚炔基″指含有2至8个碳原子(C2-C8)的直链或支链二价烃基，其具有至少一个不饱和位点，即碳-碳sp三键，其中炔基可任选被取代。实例包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(亚炔丙基，-CH2C≡C-)等。
术语″碳环的″、″碳环基″、″碳环″和″环烷基″指具有3至12个碳原子(C3-C12)作为单环或具有7至12个碳原子作为二环的一价非芳族、饱和或部分不饱和的环。具有7至12个原子的二环碳环可被排列为例如二环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]***，且具有9或10个环原子的二环碳环可被排列为例如二环[5，6]或[6，6]***，或为桥环***诸如二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷和二环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。
″芳基″指6-20个碳原子的一价芳烃基团，其通过从母体芳香环***的单个碳原子去除一个氢原子而衍生得到。一些芳基以“Ar”的示例性结构表示。芳基包括二环基团，其包含与饱和、部分不饱和环基稠合的芳环，或芳族碳环。典型的芳基包括但不限于源于苯(苯基)、取代苯基、萘基、蒽基、联苯基、茚基、茚满基、1，2-二氢萘、1，2，3，4-四氢萘基等的基团。芳基任选独立取代有一个或多个本申请所述的取代基。
“亚芳基”指6-20个碳原子的二价芳烃基团，其通过从母体芳香环***的两个碳原子去除两个氢原子而衍生得到。一些亚芳基以“Ar”的示例性结构表示。亚芳基包括二环基团，其包含与饱和、部分不饱和环基稠合的芳环，或芳族碳环。典型的亚芳基包括但不限于源于苯基(亚苯基)、取代苯基、萘基、蒽基、亚联苯基、亚茚基、亚茚满基、1，2-二氢萘基、1，2，3，4-四氢萘基等的基团。亚芳基任选被取代。
术语″杂环的″、″杂环基″和″杂环″在本申请交替使用且是指3至20个环原子的饱和或部分不饱和(即在环中具有一个或多个双键和/或三键)碳环基团，其中至少一个环原子为选自氮、氧、磷和硫的杂原子，剩余的环原子为C，其中一个或多个环原子任选独立取代有一个或多个下述取代基。杂环可为具有3至7个环原子(2至6个碳原子和选自N、O、P和S的1至4个杂原子)的单环或具有7至10个环原子(4至9个碳原子和选自N、O、P和S的1至6个杂原子)的二环，例如：二环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]***。杂环在如下有述：Paquette，Leo A.；″Principles of Modern Heterocyclic Chemistry″(W.A.Benjamin，New York，1968)，特别是第1，3，4，6，7和9章；″The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of Monographs″(John Wiley & Sons，New York，1950至今)，特别是第13，14，16，19和28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。″杂环基″也包括其中杂环基团与饱和、部分不饱和环基或芳族碳环或杂环稠合的基团。杂环的实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢硫吡喃基、哌啶子基、吗啉代、硫吗啉代、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂
基、二氮杂
基、硫氮杂
基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1，3-二氧杂环戊基、吡唑啉基、二硫杂环己基、二硫杂环戊基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、氮杂二环[2.2.2]己基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺部分也包括在该定义的范围内。其中2个环碳原子取代有氧代(＝O)部分的杂环基团的实例为嘧啶酮基和1，1-二氧代-硫吗啉基。本申请的杂环基团任选独立取代有一个或多个本申请所述的取代基。
术语″杂芳基″指5-、6-或7-元环的一价芳基，且包括含有一个或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-20个原子的稠合环***(其中至少一个为芳族的)。杂芳基的实例为吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、***基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、***基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮杂萘基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选独立取代有一个或多个本申请所述的取代基。
在可能的情况下，杂环基或杂芳基可为碳(碳联的)键合的或氮(氮联的)键合的。作为非限制性实例，碳键合的杂环基或杂芳基在以下位置进行键合：吡啶的2、3、4、5或6位、哒嗪的3、4、5或6位、嘧啶的2、4、5或6位、吡嗪的2、3、5或6位、呋喃、四氢呋喃、噻吩、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位、噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位、异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位、氮丙啶的2或3位、氮杂环丁烷的2、3或4位、喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
作为非限制性的实例，氮键合的杂环基或杂芳基在以下位置进行键合：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位、异吲哚或异二氢吲哚的2位、吗啉的4位以及咔唑或β-咔啉的9位。
“连接基团”或“连接”指包含将抗体共价连接于药物部分的共价键或原子链的二价化学部分。在许多式I的实施方案中，连接基团以L表示。
术语″手性″指具有镜像伴侣不重叠(non-superimposability)特性的分子，而术语″非手性″指镜像伴侣可重叠(superimposable)的分子。
术语″立体异构体″指具有相同化学组成，但在原子或基团空间排列上有所不同的化合物。
″非对映异构体″指具有两个或多个手性中心，并且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析方法诸如电泳和色谱法下分离。
″对映异构体″指彼此为不重叠镜像的化合物的两个立体异构体。
本申请所用立体化学定义和惯例一般按照S.P.Parker，Ed.，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；和Eliel，E.and Wilen，S.，Stereochemistry of Organic Compounds(1994)JohnWiley & Sons，Inc.，New York。许多有机化合物以旋光活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光平面的能力。在描述旋光活性化合物中，前缀D和L或R和S用于表示有关其手性中心的分子的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于指明由所述化合物引起的平面偏振光的旋转方向，(-)或l指化合物是左旋的。加前缀(+)或d的化合物是右旋的。对于给定化学结构，除了他们彼此为镜像之外，这些立体异构体是相同的。特定立体异构体也可称为对映体，这种异构体的混合物通常称为对映体混合物。50∶50的对映体混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或进程中发生。术语″外消旋混合物″和″外消旋物″指两类对映体的等摩尔混合物，其缺少旋光活性。
本申请所用短语“药用盐”指ADC的药用有机盐或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性枸橼酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1，1’-亚甲基-二-(2-羟-3-萘甲酸))。药用盐可以涉及包含另一种分子如乙酸离子、琥珀酸离子或其它抗衡离子。所述抗衡离子可以为稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。另外，药用盐在其结构中可以具有超过一个带电原子。其中多电荷原子为药用盐的一部分的实例可能具有多个抗衡离子。因此，药用盐可能具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
“药用溶剂化物”指一个或多个溶剂分子与ADC的结合。形成药用溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
蒽环类衍生物和蒽环类衍生物缀合物
如前所述，本发明的第一个方面涉及式(I)的蒽环类衍生物的缀合物或其药用盐：
[Ant-L-Z-]m-T (I)
其中Ant、L、Z、m和T如上定义。
在第二个方面，本发明提供了式(I’)的蒽环类衍生物或其药用盐
Ant-L-Z-Q (I’)
其中Ant、L和Z如上定义，且Q为氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、苯基或苄基。
优选地，Ant表示的蒽环类衍生物残基可被释放得到式(IIA)蒽环类衍生物：
在另一个优选的方面，本发明提供了式(Ia)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐：
其中：
R1、R2、Z、m和T如上定义且L1为式(III)或式(IV)的连接基团：
其中B为任选被杂原子间隔的C1-C6亚烷基部分，且v、j、k和y独立为0或1。
在该实例中清楚的是，Ant表示的蒽环类衍生物残基经缩醛键与连接基团L1结合，所述缩醛键(acetalic bond)涉及在蒽环类抗生素骨架的C-14位的伯醇。
如上所述，式(I)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐释放期望的游离蒽环类衍生物，如下优选的式(Ia)的缀合物所显示
其中R1、R2、L1、Z、m和T如上定义。
优选地，Z为间隔基团如
a)-NH-，
b)-S-，
c)还带有硫醇基或氨基基团或羧基残基的氨基亚烷基、硫基亚烷基、氨基亚环烷基或硫基亚环烷基，
d)能够将L1连接基团与T载体连接的肽残基，其通过形成新的化学键例如酰胺键、二硫键。
T优选地选自多克隆抗体或其片段，其包含能够与肿瘤相关抗原结合的抗原结合位点；单克隆抗体或其片段，其包含能够与优先或选择性地在肿瘤细胞群上表达的抗原结合的抗原结合位点；肽或蛋白质，其任选能够优先或选择性地与肿瘤细胞结合；或适于与一个或多个[Ant-L1-Z-]部分连接的上述物质的化学修饰衍生物，或聚合物载体。
特别优选的式(Ia)的化合物为其中Z表示的间隔基团为如下的那些：
i)-NH-，从而[-Z-]m-T由式T-[NH2]m的载体得到，其中m如上定义；
ii)-S-，从而[-Z-]m-T由式T-[SH]m的载体得到，其中m如上定义；
iii)-NH-D-NH-CO-，从而[-Z-]m-T由式T-[COOH]m的载体得到，其中m如上定义，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-NH-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
iv)-NH-D-CO-NH-，从而[-Z-]m-T由式T-[NH2]m的载体得到，其中m如上定义，其中-D-如上定义，或-D-CO-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离羧基；
v)-NH-D-N＝CH-，从而[-Z-]m-T由式T-[CHO]m的载体得到，其中m如上定义，其中-D-如上定义，且-D-N-如上-D-NH所定义；
vi)-NH-D-S-CH-，从而[-Z-]m-T由式(V)的载体衍生物得到，其中-D-如上定义，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基；
其中m如上定义；
vii)-NH-D-S-S-，从而[-Z-]m-T由式(VI)的载体衍生物得到，其中-D-和-D-S-如上定义：
其中m如上定义。
在另一个优选的方面，本发明提供了式(Ib)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐：
其中R1和R2、Z和T如上定义且L2为式(VII)或(VIII)的连接基团：
其中n为1至9的整数。
在此情况下，期望的游离蒽环类衍生物的释放可如下由优选的式(Ib)的缀合物进行图式说明：
特别优选的式(Ib)的化合物为这样的化合物，其中：
a)L2为如上定义的式(VII)的连接基团且Z为如下的间隔基团：
如上按照i)所定义的viii)；
如上按照ii)所定义的ix)；
如上按照iii)所定义的x)；
如上按照iv)所定义的xi)；
如上按照v)所定义的xii)；
如上按照vi)所定义的xiii)；
如上按照vii)所定义的xiv)；
xv)-S-D-NH-CO-，其中-D-NH-CO-为如上按照iii)所定义；
xvi)-S-D-CO-NH-，其中-D-CO-NH为如上按照iv)所定义；
xvii)-S-D-N＝C-，其中D和D-N-为如上按照v)所定义；
xviii)S-D-S-CH-，其中D和-D-S-为如上按照vi)所定义；
xix)-S-D-S-S-，其中D和-D-S-为如上按照vii)所定义。
其它特别优选的式(Ib)的化合物为这样的化合物，其中：
b)L2为如上定义的式(VIII)的连接基团且Z为如下的间隔基团：
如上按照ii)所定义的xx)；
如上按照xv)所定义的xxi)；
如上按照xvi)所定义的xxii)；
如上按照xvii)所定义的xxiii)；
如上按照xviii)所定义的xxiv)；
如上按照xix)所定义的xxv)。
本发明的另一个特别优选的目标为式(I’a)和(I’b)的化合物：
其中L1、L2、R1和R2如上定义，Z为-NH--或由1至3个氨基酸构成的肽残基且Q为氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、苯基或苄基。
在此情况下，所述式(I’a)和(I’b)的化合物可在适当的条件下断开得到如上定义的式(II)的化合物。
另一类特别优选的化合物为式(I)或(I’)的化合物，其中L为：
-式(IIIa)或(IVa)的残基，
其中v和k如上定义；
或如上定义的式(VII)或(VIII)的残基，其特征在于n为2至5的整数。连接基团和间隔基团
连接基团L和间隔基团Z单元将载体例如抗体经共价键与蒽环类衍生物药物部分D连接。连接基团为双官能或多官能部分，其可用于将一个或多个药物部分(D)与抗体单位(Ab)连接以形成式Ic的抗体-药物缀合物(ADC)。连接基团(L)可在细胞外部(即细胞外)稳定，或其可通过酶活性、水解或其它代谢作用条件断裂。抗体-药物缀合物(ADC)可方便地使用具有与药物部分结合和与抗体结合的具有反应活性功能团的连接基团来制备。抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇或胺，例如N-端或氨基酸侧链诸如赖氨酸可与连接基团或间隔基团试剂的官能团、药物部分(D)或药物-连接基团试剂(D-L)形成化学键。
按照连接类型，在蒽环类衍生物化合物上的许多位置可用作键合位置。例如，酯、酰胺、硫代酰胺、硫代氨基甲酸酯或氨基甲酸酯键可由在C14的羟基甲基酮的羟基形成；缩酮和腙键可由在药物部分的C13羰基形成；酰胺、氨基甲酸酯和脲键可由在药物部分D的氨基形成；且各种烷基、醚、硫醚、二硫化物和酰基键可由在药物部分的苯环和芳环过Friedel-Crafts型烷基化和酰化反应形成。
连接基团和间隔基团优选在细胞外是稳定的。在转运或递送到细胞中前，抗体-药物缀合物(ADC)优选是稳定且完整的，即抗体仍然连接到药物部分。连接基团在靶细胞外是稳定的，并且在细胞内可以以一定的功效速率(efficacious rate)裂解。有效的连接基团将：(i)保持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即直到缀合物已被递送或转运到其目标位置才裂解；和(iv)保持蒽环类衍生物药物部分的细胞毒性、细胞杀伤效应或细胞抑制效应。ADC的稳定性可以通过标准分析技术诸如质谱学、HPLC和分离/分析技术LC/MS测定。
抗体与药物部分的共价连接要求连接基团和任选间隔基团具有两个反应活性官能团，即在反应性意义上是二价的。可用于连接两个或多个功能或生物学活性部分的二价连接基团试剂诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原，以及报道分子基团是已知的，已经描述了所述方法以及由其获得的缀合物(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press：New York，p 234-242)。
在另一实施方案中，连接基团或间隔基团可以被调节溶解性或反应性的基团所取代。例如，磺酸酯(sulfonate)取代基可以增强试剂的水溶性并促进连接基团试剂与抗体或药物部分的缀合反应，或促进Ab-L与D或D-L与Ab的缀合反应，这取决于制备ADC所使用的合成路线。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。胺、硫醇基和羟基为亲核的且能够与连接基团部分和连接基团试剂的亲电子基团反应以形成共价键，所述基团包括：(i)活性酯诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。抗体可以通过用还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理而使之对于与连接基团试剂的结合为反应性的。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核物。可以通过赖氨酸与2-亚氨基噻吩(Traut′s试剂)反应将其它的亲核基团引入抗体中，所述反应将胺转化为硫醇。反应性硫醇可通过引入一、二、三、四或多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变体抗体)而引入至抗体(或其片段)中。US 2007/0092940教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来修饰抗体。
在一些实施方案中，连接基团具有反应性亲核基团，其对抗体上存在的亲电子基团是反应性的。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮的羰基。连接基团亲核基团的杂原子能够与抗体上的亲电子基团反应，与抗体单位形成共价键。连接基团上可用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼(arylhydrazide)。抗体上的亲电子基团提供与连接基团连接的便利的位点。抗体上的亲电子基团提供用于连接连接基团的适当位点。
药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼(arylhydrazide)基团，这些基团能够与连接基团部分和连接基团试剂上的亲电子基团反应形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
间隔基团(Z)可以是包含一个或多个氨基酸单位的肽。肽连接基团试剂可以通过固相或液相合成法在自动合成仪诸如Rainin Symphony Peptide Synthesizer(Protein Technologies，Inc.，Tucson，AZ)或Model 433(Applied Biosystems，Foster City，CA)上制备(E.
and K.Lübke，The Peptides，volume 1，pp 76-136(1965)Academic Press)，这是肽化学领域熟知的，包括t-BOC化学(Geiser等人″Automation of solid-phase peptide synthesis″in Macromolecular Sequencing and Synthesis，Alan R.Liss，Inc.，1988，pp.199-218)和Fmoc/HBTU化学(Fields，G.and Noble，R.(1990)″Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids″，Int.J.Peptide Protein Res.35：161-214)。
示例性氨基酸连接基团包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯基丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸连接基团成分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物诸如瓜氨酸。氨基酸连接基团成分可以它们对酶裂解的选择性通过特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶)进行设计和优化。
氨基酸侧链包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物诸如瓜氨酸。氨基酸侧链包括氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、吡啶-2-基甲基-、吡啶-3-基甲基-、吡啶-4-基甲基-、苯基、环己基以及如下结构：
当氨基酸侧链除了包括氢(甘氨酸)时，氨基酸侧链所连接的碳原子为手性的。氨基酸侧链所连接的每个碳原子独立为(S)或(R)构型，或为外消旋混合物。因此药物-连接基团试剂可为对映体纯的、外消旋的或非对映异构的。
在示例性实施方案中，氨基酸侧链选自天然和非天然氨基酸的那些，所述氨基酸包括丙氨酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、α，α-二甲基γ-氨基丁酸、β，β-二甲基γ-氨基丁酸、鸟氨酸和瓜氨酸(Cit)。
药物-连接基团中间体
本发明包括用于与蛋白质、肽和抗体缀合的药物-连接基团中间体。所述药物-连接基团中间体包括式(IIc)的蒽环类衍生物：
Ant-L-(Z)m-X (IIc)
其中Ant选自下述结构：
其中波浪线表示与L的连接；
L为选自下述的连接基团：-N(R)-、-N(R)m(C1-C12亚烷基)-、-N(R)m(C2-C8亚烯基)-、-N(R)m(C2-C8亚炔基)-、-N(R)m(CH2CH2O)n-和下述结构：
其中波浪线表示与Ant和Z的连接；且
Z为选自下述的任选间隔基团：-CH2C(O)-、-CH2C(O)NR(C1-C12亚烷基)-和下述结构：
X为选自下述的反应活性官能团：马来酰亚胺基、硫醇基、氨基、溴、对甲苯磺酸酯基、碘、羟基、羧基、吡啶基二硫基和N-羟基琥珀酰亚胺基；
R为H、C1-C12烷基或C6-C20芳基；
R1和R2独立选自氨基酸侧链；
Z1选自-(C1-C12亚烷基)-、-(C2-C8亚烯基)-、-(C2-C8亚炔基)-和-(CH2CH2O)n-，
m为0或1；且n为1至6。
式IIc的蒽环类衍生物包括下述结构：
其中Z-X选自：
包含蒽环类抗生素药物部分和连接基团-间隔基团单元的示例性的式IIc的药物-连接基团中间体实施方案包括化合物50-53：
式IIc的蒽环类衍生物包括下述结构：
其中Z为C1-C12亚烷基。
包含蒽环类抗生素药物部分和连接基团-间隔基团单元的示例性的式IIc的药物-连接基团中间体实施方案包括化合物54(实施例3a)：
式IIc的蒽环类衍生物包括下述结构：
且其中X为马来酰亚胺：
包含蒽环类抗生素药物部分和连接基团-间隔基团单元的示例性的式IIc的药物-连接基团中间体实施方案包括化合物55(实施例3b)。由PNU-159682C-14羧基衍生物56和连接基团-间隔基团中间体60，药物-连接基团中间体55的合成途径在图7d中显示。
式IIc的蒽环类衍生物包括下述结构：
且其中Z1为-(C1-C12亚烷基)-。
包含蒽环类抗生素药物部分和连接基团-间隔基团单元的示例性的式IIc的药物-连接基团中间体实施方案包括下述化合物：
连接基团和间隔基团试剂
在抗体和药物部分之间的B-葡糖苷酸连接基团为通过β-葡糖醛酸糖苷酶裂解的底物(Jeffrey等人(2006)Bioconjugate Chem.17：831-840；WO2007/011968)。β-葡糖苷酸的缩醛键合释放在芳环上的酚羟基，使其可以“***(self-immolation)”并进行苄基氧基羰基的1，6-消除。
具有马来酰亚胺延伸链(stretcher)和对氨基苄基氨基甲酰(PAB)***性间隔基团的示例性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽连接基团试剂具有下述结构：
其中Q为C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；且m为0-4的整数。
具有马来酰亚胺延伸链和对氨基苄基***性间隔基团单元的示例性phe-lys(Mtr)二肽连接基团试剂可根据Dubowchik，等人.(1997)Tetrahedron Letters，38：5257-60制备，且其具有下述结构：
其中Mtr为单-4-甲氧基三苯甲基，Q为C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；且m为0-4的整数。
所述“***性连接基团”PABC或PAB(对氨基苄基氧基羰基)在缀合物中将药物部分与抗体连接(Carl等人(1981)J.Med.Chem.24：479-480；Chakravarty等人(1983)J.Med.Chem.26：638-644；US 6214345；US20030130189；US20030096743；US6759509；US20040052793；US6218519；US6835807；US6268488；US20040018194；WO98/13059；US20040052793；US6677435；US5621002；US20040121940；WO2004/032828)。除了PAB之外的***性间隔基团的其它实例包括但不限于：(i)与PAB基团诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物电学上相似的芳族化合物(Hay等人.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)、噻唑(US 2005/0256030)、多重延长的PAB单元(de Groot等人(2001)J.Org.Chem.66：8815-8830)；和邻或对氨基苄基缩醛；和(ii)获批的苯乙烯基PAB类似物(US 7223837)。可使用在酰胺键水解后进行环化的间隔基团，诸如取代的或未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2：223)、适当取代的二环[2.2.1]和二环[2.2.2]环***(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry，等人(1990)J.Org.Chem.55：5867)。在甘氨酸取代的含有胺的药物的消除(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27：1447)也为***性间隔基团用于ADC的实例。
用于本发明的抗体药物缀合物的连接基团试剂包括但不限于：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，且包括二-马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1，8-二-马来酰亚氨基二甘醇(BM(PEO)2)和1，11-二-马来酰亚氨基三甘醇(BM(PEO)3)，其可由Pierce Biotechnology，Inc.，ThemoScientific，Rockford，IL和其它试剂供应商商购得到。二-马来酰亚胺试剂允许抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基与含有硫醇的药物部分、标记物或连接基团中间体以连续或同时的方式结合。除了马来酰亚胺之外的与抗体、蒽环类衍生物药物部分或连接基团中间体的硫醇基反应的其它官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
其它连接基团试剂为：N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP，Carlsson等人(1978)Biochem.J.173：723-737)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮化合物(诸如二(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、二-重氮衍生物(诸如二-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯-2，6-二异氰酸酯)和二-活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。有用的连接基团试剂也可经其它商业资源得到，诸如Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO)或根据在Toki等人(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO 04/032828中所述的方法合成。
连接基团可以为通过支化的多官能连接基团部分将不止一个药物部分与抗体共价连接的树枝状类型连接基团(US 2006/116422；US 2005/271615；de Groot等人(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4490-4494；Amir等人(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4494-4499；Shamis等人(2004)J.Am.Chem.Soc.126：1726-1731；Sun等人(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768；King等人(2002)Tetrahedron Letters 43：1987-1990)。树枝状连接基团能够提高药物与抗体的摩尔浓度比，即负载的比例，这与ADC的效力有关。因此，在抗体只具有一个反应性半胱氨酸硫醇基时，可以通过树枝状连接基团连接许多药物部分。
载体
蒽环类衍生物缀合物的载体部分由多克隆抗体和单克隆抗体、天然源或合成源的蛋白质或肽得到。载体化合物T-NH2、T-COOH、T-CHO、T-SH、(V)或(VI)适合与蒽环类衍生物化合物缀合。载体部分可由对肿瘤相关抗原的多克隆抗体得到；或由与优先或选择性地在肿瘤细胞群上表达的抗原结合的单克隆抗体得到；或由优先或选择性地与肿瘤细胞结合的天然或重组体肽或蛋白质或生长因子得到；或由天然或合成的聚合物载体得到，所述聚合物载体诸如多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸及它们的类似物和衍生物，或诸如葡聚糖或其它多聚糖(polymeric carbohydrate)类似物以及它们的衍生物；或由合成共聚物得到，所述共聚物诸如由N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺(HPMA)得到的那些，参见：J.Kopecek，Macromolecules.H.Benoit & P.Rempp，Ed.：505-520(1982)Pergamon Press.Oxford，England；或由多(氨基酸)共聚物得到，所述共聚物诸如多(GluNa、Ala、Tyr)共聚物，其用作针对肺组织的靶标药物-载体，参见R.Duncan等人.，Journal of Bioactive and Compatible Polymers，Vol4，July 1989。载体部分也可由上面提及的经重组体DNA技术得到的肽或蛋白质得到。
抗体
上面提及的抗体和各自可能的治疗应用的代表性实例为：抗-T细胞抗体T101(Royston，I.等人.，J.Immunol.1980，125：725)；抗-CD5抗体OKT1(Ortho)ATCC CRL 8000，用于慢性淋巴细胞性白血病)；抗-CD20抗体IgG1替伊莫单抗(ibritumomab)(Theuer，C.P.等人.Biotechnology Annual Review 2004，用于非霍奇金淋巴瘤)；抗-CD33抗体huCD33(Drug of the future 200025(7)：686，用于急性髓细胞样白血病)；抗-转铁蛋白受体抗体OKT9(Ortho)ATCC CRL8021，用于卵巢瘤及其它肿瘤；抗-黑色素瘤抗体MAb 9.2.27(Bumol，T.F.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1982，79：1245，用于黑色素瘤)；抗-癌标记物抗体诸如：抗-CEA 1116 NS-3d ATCC CRL 8019)、抗-甲胎蛋白OM 3-1.1 ATCCHB 134，也用于肝癌)、791T/36(Embleton，M.J.等人.，Br.J.Cancer 1981，43，582，也用于骨肉瘤)、B 72.3(US 4522918，用于结肠直肠癌和其它肿瘤)、抗-卵巢癌抗体OVB 3 ATCC HB 9147、抗-乳腺癌抗体HMGF抗原(Aboud-Pirak，E.等人.，Cancer Res.1988，48：3188)、抗-膀胱癌1G3.10(Yu，D.S.等人.，Eur.J.Urol.1987，13：198)、抗-CanAg抗体huC242抗体(Olcher，Anthony W.等人.，Journal of Clinical Oncology 2003，21(2)：211-222，用于结肠癌、胰腺癌、胃癌)、抗-***抗体MLN591(Henry，Michael D.et al.，Cancer Research 2004，用于晚期激素-顽固性***癌)。
上面提及的生长因子和天然或重组体源的蛋白质的代表性实例为FGF、EGF、PDGF、TGF-ALPHA、ALPHA-MS、白细胞介素、干扰素、TNF、促黑激素(MSH)、Mcm2等。载体T-CHO优选地由具有糖部分的多克隆抗体或单克隆抗体得到，所述糖部分优选(preferentially)位于Fc区，通过化学或酶方法选择性地氧化成醛基，如在US 4671958中所述。
式IIc的抗体单位(Ab)包括与受体、抗原或其它接受性部分结合或反应性相关或复合的任何抗体单位、类型或类，所述受体、抗原或其它接受性部分与给定目标细胞群相关。抗体可以是任何的蛋白或蛋白样分子，其与所要治疗学或生物学修饰的细胞群体部分结合、复合或反应。一个方面，抗体单位发挥作用将蒽环类衍生物药物部分递送到抗体单位与其反应的特定目标细胞群。这样的抗体包括但不限于大分子量蛋白诸如全长抗体和抗体片段。式I的抗体允许在癌细胞中获得高浓度的活性代谢物分子。可以通过允许生物活性试剂在细胞内累积或保持的方法和化合物实现细胞内靶向。这种有效的靶向适用于多种治疗学制剂和方法。
在一个实施方案中，ADC特异地结合由ErbB基因编码的受体，如EGFR、HER2、HER3和HER4。ADC可以特异地结合HER2受体的胞外结构域。ADC可以抑制过表达HER2受体的肿瘤细胞的生长。
在另一实施方案中，式IIc的抗体(Ab)为人源化抗体如huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥单抗)。
本发明的抗体包括半胱氨酸-工程化的抗体，其中任意野生型或母体抗体的一个或多个被半胱氨酸氨基酸取代。所述修饰的半胱氨酸氨基酸为游离的半胱氨酸，且不是链内或链间二硫化物单元的一部分。任意形式、类或变体的抗体可被修饰，即突变。例如，母体Fab抗体片段可被修饰以形成半胱氨酸修饰的Fab，本申请是指“硫基Fab”。类似地，母体单克隆抗体可被修饰以形成“ThioMab”。应该注意的是单一位点突变在硫基Fab中产生单一修饰的半胱氨酸残基，而单一位点突变在ThioMab中产生两个修饰的半胱氨酸残基，这是由于IgG抗体的二聚物性质。本发明的半胱氨酸修饰的抗体包括单克隆抗体、人源化或嵌合单克隆抗体、抗体的抗原结合片段、优先结合细胞相关多肽的稠合多肽和类似物。
半胱氨酸工程的抗体已经设计为Fab抗体片段(硫基Fab)并表达为全长、IgG单克隆(ThioMab)抗体(US 7521541，将其内容通过参考并入本申请)。硫基Fab和ThioMab抗体已经通过连接基团在新引入的半胱氨酸硫醇处与硫醇-反应连接基团试剂和药物-连接基团试剂缀合以制备抗体-药物缀合物(硫基ADC)，包括抗-HER2(US 7521541)、抗-CD22(US 2008/0050310)和抗-steap1(WO 2008/052187)，以及其它半胱氨酸修饰的抗体和抗体-药物缀合物。
包含式IIc的抗体-药物缀合物的抗体优选保留其天然、野生型相应物的抗原结合能力。因此，本发明的抗体能够结合抗原，优选特异性地结合。这样的抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如，已知或怀疑在功能上有助于组织发育或分化)的或分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子和与血管新生相关的(例如，已知或怀疑在功能上有助于血管发生的)分子。肿瘤相关抗原可以是分化簇因子(即，CD蛋白)。本发明的抗体能够与其结合的抗原可以是上述类别之一的亚组的成员，其中所述类别的其它亚组包含具有区别特征(相对于感兴趣的抗原而言)的其它分子/抗原。
在一个实施方案中，式IIc的抗体-药物缀合物(ADC)的抗体特异地结合由ErbB基因编码的受体。所述抗体可以特异地结合选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体。ADC可以特异地结合HER2的胞外结构域(ECD)并抑制过表达HER2受体的肿瘤细胞的生长。ADC的抗体可以为单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体可以是huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥单抗)。所述抗体可以是抗体片段，例如Fab片段。
式IIc的抗体-药物缀合物(ADC)中的并且能够用于癌症治疗的抗体包括但不限于抗细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。这样的肿瘤相关抗原是本领域已知的，可以用本领域熟知的方法和信息制备以用于生产抗体。在寻找用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶物的努力中，研究者已设法鉴定了跨膜或肿瘤相关多肽，与一种或多种正常非癌细胞相比，这些多肽特异地表达于一种或多种特定类型癌细胞的表面上。通常，与非癌细胞的表面上相比，这些肿瘤相关多肽更多地表达在癌细胞表面上。鉴定这些肿瘤相关细胞表面抗原多肽已产生了通过基于抗体治疗的特异地靶向癌细胞进行破坏的能力。
TAA的实例包括但不限于以下所列肿瘤相关抗原(1)-(36)。为方便起见，以下列出有关这些抗原的所有本领域已知的信息，包括名称、替代名称、Genbank登录号和原始参考，遵循国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴别惯例。对应于TAA(1)-(36)的核酸和蛋白质序列可以在公共数据库如GenBank中获得。抗体靶向的肿瘤相关抗原包括相对于引证参考文献中鉴定的序列，具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的所有氨基酸序列变体和同工型，或基本上显示与TAA相同的生物学特性或特征的所有氨基酸序列变体和同工型，其中所述TAA具有所引用参考文献中发现的序列。例如，具有通常能够特异地结合抗体的变体序列的TAA，所述抗体特异地结合具有所列相应序列的TAA。本申请具体引用的参考文献中的序列和内容明确引入，作为参考。
肿瘤相关抗原(1)-(36)：
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，Genbank登录号NM_001203)；ten Dijke，P.，等人Science 264(5155)：101-104(1994)，Oncogene14(11)：1377-1382(1997))；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)；NP_001194骨形态发生蛋白受体，IB/pid型＝NP_001194.1；交叉参考：MIM：603248；NP_001194.1；AY065994
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(3)STEAP1(***的六跨膜上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)；Cancer Res.61(15)，5857-5860(2001)，Hubert，R.S.，等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25)：14523-14528)；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A)；NP_036581***的六跨膜上皮抗原；交叉参考：MIM：604415；NP_036581.1；NM_012449_1
(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登录号AF361486)；J.Biol.Chem.276(29)：27371-27375(2001))；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第页116-121)；US2003124140(实施例16)；US2003091580(权利要求6)；WO200206317(权利要求6；第400-408页)；交叉参考：GI：34501467；AAK74120.3；AF361486_1
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR，巨核细胞强化因子，间皮素(mesothelin)，Genbank登录号NM_005823)；Yamaguchi，N.，等人Biol.Chem.269(2)，805-808(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20)：11531-11536(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1)：136-140(1996)，J.Biol.Chem.270(37)：21984-21990(1995))；WO2003101283(权利要求14)；(WO2002102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉参考：MIM：601051；NP_005814.2；NM_005823_1
(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2，溶解物载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b，Genbank登录号NM_006424)；J.Biol.Chem.277(22)：19665-19672(2002)，Genomics 62(2)：281-284(1999)，Feild，J.A.，等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3)：578-582)；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉参考：MIM：604217；NP_006415.1；NM_006424_1
(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、脑信号蛋白(semaphorin)5b Hlog，sema结构域，七血小板反应蛋白重复(1型和类1型的)，跨膜结构域(TM)和短细胞质结构域，(脑信号蛋白)5B，Genbank登录号AB040878)；Nagase T.，等人(2000)DNA Res.7(2)：143-150)；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43，48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；登录号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC：10737
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；Ross等人(2002)Cancer Res.62：2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；交叉参考：GI：37182378；AAQ88991.1；AY358628_1
(9)ETBR(内皮素B型受体，Genbank登录号AY275463)；Nakamuta M.，等人Biochem.Biophys.Res.Commun.177，34-39，1991；Ogawa Y.，等人Biochem.Biophys.Res.Commun.178，248-255，1991；Arai H.，等人Jpn.Circ.J.56，1303-1307，1992；Arai H.，等人J.Biol.Chem.268，3463-3470，1993；Sakamoto A.，Yanagisawa M.，等人Biochem.Biophys.Res.Commun.178，656-663，1991；Elshourbagy N.A.，等人J.Biol.Chem.268，3873-3879，1993；Haendler B.，等人J.Cardiovasc.Pharmacol.20，s1-S4，1992；Tsutsumi M.，等人Gene 228，43-49，1999；Strausberg R.L.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，16899-16903，2002；Bourgeois C.，等人J.Clin.Endocrinol.Metab.82，3116-3123，1997；Okamoto Y.，等人Biol.Chem.272，21589-21596，1997；Verheij J.B.，等人Am.J.Med.Genet.108，223-225，2002；Hofstra R.M.W.，等人Eur.J.Hum.Genet.5，180-185，1997；Puffenberger E.G.，等人Cell 79，1257-1266，1994；Attie T.，等人，Hum.Mol.Genet.4，2407-2409，1995；Auricchio A.，等人Hum.Mol.Genet.5：351-354，1996；Amiel J.，等人Hum.Mol.Genet.5，355-357，1996；Hofstra R.M.W.，等人Nat.Genet.12，445-447，1996；Svensson P.J.，等人Hum.Genet.103，145-148，1998；Fuchs S.，等人Mol.Med.7，115-124，2001；Pingault V.，等人(2002)Hum.Genet.111，198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；第31-34栏)；WO2004001004
(10)MSG783(RNF124，假想蛋白(hypothetical protein)FLJ20315，Genbank登录号NM_017763)；WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第页61)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；交叉参考：LocusID：54894；NP_060233.2；NM_017763_1
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六跨膜上皮抗原2，六跨膜***蛋白，Genbank登录号AF455138)；Lab.Invest.82(11)：1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；交叉参考：GI：22655488；AAN04080.1；AF455138_1
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B，瞬时受体潜在阳离子通道，亚家族M，成员4，Genbank登录号NM_017636)；Xu，X.Z.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19)：10692-10697(2001)，Cell109(3)：397-407(2002)，J.Biol.Chem.278(33)：30813-30820(2003))；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第391页)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；交叉参考：MIM：606936；NP_060106.2；NM_017636_1
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1，畸胎癌衍生的生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola，A.，等人EMBOJ.8(7)：1987-1991(1989)，Am.J.Hum.Genet.49(3)：555-565(1991))；US2003224411(权利要求1)；WO2003083041(实施例1)；WO2003034984(权利要求12)；WO200288170(权利要求2；第52-53页)；WO2003024392(权利要求2；图58)；WO200216413(权利要求1；第94-95，105页)；WO200222808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；第17-18栏)；US5792616(图2)；交叉参考：MIM：187395；NP_003203.1；NM_003212_1
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃巴病毒受体)或Hs.73792Genbank登录号M26004)；Fujisaku 等人(1989)J.Biol.Chem.264(4)：2118-2125)Weis J.J.，等人J.Exp.Med.167，1047-1066，1988；Moore M.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，9194-9198，1987；Barel M.，等人Mol.Immunol.35，1025-1031，1998；Weis J.J.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，5639-5643，1986；Sinha S.K.，等人(1993)J.Immunol.150，5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；登录号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关beta)、B29，Genbank登录号NM_000626或11038674)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7)：4126-4131，Blood(2002)100(9)：3068-3076，Muller等人(1992)Eur.J.Immunol.22(6)：1621-1625)；WO2004016225(权利要求2，图140)；WO2003087768，US2004101874(权利要求1，第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5，第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1，第306和309页)；WO 99/558658，US6534482(权利要求13，图17A/B)；WO200055351(权利要求11，第1145-1146页)；交叉参考：MIM：147245；NP_000617.1；NM_000626_1
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登录号NM_030764、AY358130)；GenomeRes.13(10)：2265-2270(2003)，Immunogenetics 54(2)：87-95(2002)，Blood99(8)：2662-2669(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17)：9772-9777(2001)，Xu，M.J.，等人(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3)：768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；交叉参考：MIM：606509；NP_110391.2；NM_030764_1
(17)HER2(ErbB2，Genbank登录号M11730)；Coussens L.，等人Science(1985)230(4730)：1132-1139)；Yamamoto T.，等人Nature 319，230-234，1986；Semba K.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82，6497-6501，1985；SwierczJ.M.，等人J.Cell Biol.165，869-880，2004；Kuhns J.J.，等人J.Biol.Chem.274，36422-36427，1999；Cho H.-S.，等人Nature 421，756-760，2003；Ehsani A.，等人(1993)Genomics 15，426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO200400962；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第页71-74)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；第1-38栏)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；登录号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1
(18)NCA(CEACAM6，Genbank登录号M18728)；Barnett T.，等人Genomics3，59-66，1988；Tawaragi Y.，等人Biochem.Biophys.Res.Commun.150，89-96，1988；Strausberg R.L.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：16899-16903，2002；WO2004063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004044178(实施例4)；WO2004031238；WO2003042661(权利要求12)；WO200278524(实施例2)；WO200286443(权利要求27；第427页)；WO200260317(权利要求2)；登录号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728
(19)MDP(DPEP1，Genbank登录号BC017023)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)：16899-16903(2002))；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第页85-87)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；交叉参考：MIM：179780；AAH17023.1；BC017023_1
(20)IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7，Genbank登录号AF 184971)；Clark H.F.，等人Genome Res.13，2265-2270，2003；Mungall A.J.，等人Nature 425，805-811，2003；Blumberg H.，等人Cell 104，9-19，2001；Dumoutier L.，等人J.Immunol.167，3545-3549，2001；Parrish-Novak J.，等人J.Biol.Chem.277，47517-47523，2002；Pletnev S.，等人(2003)Biochemistry 42：12617-12624；Sheikh F.，等人(2004)J.Immunol.172，2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；登录号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1
(21)Brevican(BCAN、BEHAB，Genbank登录号AF229053)；Gary S.C.，等人Gene 256，139-147，2000；Clark H.F.，等人Genome Res.13，2265-2270，2003；Strausberg R.L.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，16899-16903，2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)
(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5，Genbank登录号NM_004442)；Chan，J.and Watt，V.M.，Oncogene 6(6)，1057-1061(1991)Oncogene 10(5)：897-905(1995)，Annu.Rev.Neurosci.21：309-345(1998)，Int.Rev.Cytol.196：177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；交叉参考：MIM：600997；NP_004433.2；NM_004442_1
(23)ASLG659(B7h，Genbank登录号AX092328)；US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第页205-207)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234，452-453页)；WO 0116318
(24)PSCA(***干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)；ReiterR.E.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，1735-1740，1998；Gu Z.，等人Oncogene 19，1288-1296，2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3)：783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO9851805(权利要求17；第97页)；WO9851824(权利要求10；第94页)；WO9840403(权利要求2；图1B)；登录号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1
(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤(lipoma)HMGIC融合伴侣样蛋白/pid＝AAP14954.1智人(人)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3，权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；交叉参考：GI：30102449；AAP14954.1；AY260763_1
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体、BlyS受体3、BR3，Genbank登录号：AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-智人；Thompson，J.S.，等人Science293(5537)，2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(第136-137栏)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；交叉参考：MIM：606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同工型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814，Genbank登录号：AK026467)；Wilson等人(1991)J.Exp.Med.173：137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；交叉参考：MIM：107266；NP_001762.1；NM_001771_1
(28)CD79a(CD79A、CD79α，免疫球蛋白相关的alpha，与Ig beta(CD79B)共价相互作用，与IgM分子在表面上形成复合体，转导涉及B细胞分化的信号的B细胞特异性蛋白)；226aa)，pI：4.84，MW：25028TM：2[P]Gene Chromosome：19q13.2，Genbank登录号：NP_001774.10)；WO2003088808，US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4，第13-14页)；WO9958658(权利要求13，图16)；WO9207574(图1)；US5644033；Ha等人(1992)J.Immunol.148(5)：1526-1531；Mueller等人(1992)Eur.J.Biochem.22：1621-1625；Hashimoto等人(1994)Immunogenetics40(4)：287-295；Preud’homme等人(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1)：141-146；Yu等人(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi等人(1988)EMBO J.7(11)：3457-3464
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1、由CXCL13趋化因子活化的G蛋白缀合受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥作用，在HIV-2感染以及或许在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病发生中起作用)；372aa)，pI：8.54 MW：41959TM：7[P]Gene Chromosome：11q23.3，Genbank登录号：NP_001707.1)；WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20，第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；WO9928468(权利要求1，第38页)；US5440021(实施例2，第49-52栏)；WO9428931(第56-58页)；WO9217497(权利要求7，图5)；Dobner等人(1992)Eur.J.Immunol.22：2795-2799；Barella等人(1995)Biochem.J.309：773-779
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的Beta亚基(Ia抗原)，其结合肽并将其呈递到CD4+T淋巴细胞)；273aa，pI：6.56MW：30820TM：1[P]Gene Chromosome：6p21.3，Genbank登录号：NP_002111.1)；Tonnelle等人(1985)EMBO J.4(11)：2839-2847；Jonsson等人(1989)Immunogenetics 29(6)：411-413；Beck等人(1992)J.Mol.Biol.228：433-441；Strausberg等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：16899-16903；Servenius等人(1987)J.Biol.Chem.262：8759-8766；Beck等人(1996)J.Mol.Biol.255：1-13；Naruse等人(2002)Tissue Antigens 59：512-519；WO9958658(权利要求13，图15)；US6153408(第35-38栏)；US5976551(第168-170栏)；US6011146(第145-146栏)；Kasahara等人(1989)Immunogenetics 30(1)：66-68；Larhammar等人(1985)J.Biol.Chem.260(26)：14111-14119
(31)P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，其缺陷可能导致特发性逼尿肌不稳定病理生理状况)；422aa)，pI：7.63，MW：47206TM：1[P]Gene Chromosome：17p13.3，Genbank登录号：NP_002552.2)；Le等人(1997)FEBS Lett.418(1-2)：195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman等人(2000)Genome Res.10：165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；359aa)，pI：8.66，MW：40225TM：1[P]Gene Chromosome：9p13.3，Genbank登录号：NP_001773.1)；WO2004042346(权利要求65)；WO2003026493(第51-52，57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen等人(1990)J.Immunol.144(12)：4870-4877；Strausberg等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA99：16899-16903
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复(LRR)的I型膜蛋白家族，调节B细胞活化和凋亡，功能的丧失与***性红斑狼疮患者疾病活动增强有关)；661 aa)，pI：6.20，MW：74147 TM：1[P]Gene Chromosome：5q12，Genbank登录号：NP_005573.1)；US2002193567；WO9707198(权利要求11，第页39-42)；Miura等人(1996)Genomics 38(3)：299-304；Miura等人(1998)Blood92：2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8，第57-61页)；WO200012130(第24-26页)
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，Fc结构域推定的免疫球蛋白受体，其包含C2型Ig样和ITAM结构域，可能在B淋巴细胞分化中有作用)；429aa)，pI：5.28，MW：46925TM：1[P]Gene Chromosome：1q21-1q22，Genbank登录号：NP_443170.1)；WO2003077836；WO200138490(权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davis等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17)：9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)
(35)IRTA2(易位相关的免疫球蛋白超家族受体2，在B细胞发育和淋巴瘤发生中可能有作用的推定的免疫受体；与发生在一些B细胞恶性疾病中的由易位引起的基因失调有关)；977aa)，pI：6.88MW：106468TM：1[P]GeneChromosome：1q21，(Genbank登录号：Human：AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；Mouse：AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1)；WO2003024392(权利要求2，图97)；Nakayama等人(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1)：124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3，图18B-1-18B-2)
(36)TENB2(TMEFF2、tomoregulin、TPEF、HPP1、TR、推定的跨膜蛋白聚糖，涉及生长因子和卵泡抑素(follistatin)的EGF/调蛋白家族)；374aa，NCBI登录号：AAD55776、AAF91397、AAG49451、NCBI RefSeq：NP_057276；NCBI Gene：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；(Genbank登录号：AF179274、AY358907、CAF85723、CQ782436)；WO2004074320(SEQID NO 810)；JP2004113151(SEQ ID NOS 2，4，8)；WO2003042661(SEQ ID NO580)；WO2003009814(SEQ ID NO 411)；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304(SEQ ID NO 2706)；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；US 6410506；US 6642006l；Horie等人(2000)Genomics 67：146-152；Uchida等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266：593-602；Liang等人(2000)Cancer Res.60：4907-12；Glynne-Jones等人(2001)Int J Cancer.Oct 15；94(2)：178-84。
此外，优选的化合物为在下表1中报道为化合物1-14的式(Ia)、(Ib)、(I’a)和(I’b)的化合物：
表1[Ant-L-Z-]m-T (I) Ant-L-Z-Q (I’)
其中[Ant]残基由如下式(IIa)或(IIb)的化合物表示，即[Ant]为如上定义的式IIA的蒽环类抗生素残基，
如果一种手性中心或另一种形式的异构中心出现在本发明的化合物中，则所有形式的所述一种或多种异构体(包括对映异构体和非对映异构体)意在包括于本申请中。含有手性中心的化合物用作外消旋混合物，即对映异构体富集的混合物，或可使用已知技术分离所述外消旋混合物并且单一的对映异构体可单独使用。在化合物具有不饱和碳-碳双键的情况下，顺(Z)和反(E)式异构体均在本发明的范围内。
在化合物可以互变异构形式诸如酮烯醇互变异构体存在的情况下，认为每个互变异构形式包括在本发明中，无论是以平衡的形式存在还是以主要一种形式存在。
式(I’)的蒽环类衍生物的药用盐或式(I)的蒽环类衍生物缀合物的药用盐包括与无机酸或有机酸的酸加成盐，所述酸例如硝酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、高氯酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、草酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、枸橼酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、羟乙磺酸和水杨酸。优选地，本发明化合物的酸加成盐为盐酸盐或甲磺酸盐。
式(I’)的蒽环类衍生物的药用盐或式(I)的蒽环类衍生物缀合物的药用盐也包括与无机碱或有机碱的盐，所述碱例如碱金属或碱土金属，所述碱特别是钠、钾、钙、铵或镁的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，非环状或环状胺，优选地甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、哌啶等。
如本申请使用，除非另作说明，术语C1-C6烷基表示这样的基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、异己基等。
术语C3-C6环烷基表示，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环戊烯基、环己烯基等。
术语C1-C6亚烷基表示二价残基，例如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚叔丁基、亚正戊基、亚新戊基、亚正己基、亚异己基等。
术语C3-C6亚环烷基表示二价残基，例如亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环戊烯基、亚环己烯基等。
对技术人员清楚的是本申请定义的任意基团或取代基可由它们起始的基团的名称理解。
作为实例，除非另作特别说明，在C1-C5烷氧基中的烷基部分包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基等。示例性的C1-C5烷氧基为甲氧基(-OCH3)、乙氧基(-OCH2CH3)、丙基氧基、异丙基氧基、正丁基氧基、异丁基氧基、仲丁基氧基、叔丁基氧基、正戊基氧基、新戊基氧基等。
“由1至4个氨基酸构成的肽残基”表示包含1至4个天然或合成的氨基酸序列的肽。
本发明也提供了用于制备如上定义的式(I)的化合物的方法。
如上定义的式(Ia)的化合物及其药用盐可如在图2中所述制备。
式(Ia)的蒽环类衍生物缀合物的制备方法
因此，本发明提供了用于制备如上定义的式(Ia)的化合物及其药用盐的第一种方法，所述方法包括下述步骤：
步骤1使如上定义的式(II)的化合物与式(IX)或(X)的化合物反应：
其中v、j、k、y和B如上定义且R3为C1-C3烷基；
步骤2对所得的酯中间体(XI)进行水解：
其中R1、R2、R3如上定义且L1为如上定义的式(III)或式(IV)的基团；
步骤3使所得式(XII)的酸活化：
其中R1、R2和L1如上定义且
步骤4将所得的活化的式(XIII)的化合物与期望的载体连接，生成式(Ia)的化合物，以及任选地将所得的化合物转化为药用盐，所述式(XIII)的化合物为：
其中R1、R2和L1如上定义且W为酸基团的活化基团，诸如N-氧基琥珀酰亚胺基、N-氧基硫代琥珀酰亚胺基或2，4-二硝基苯氧基或2，3，4，5，6-五氟苯氧基或叔丁氧基羰基氧基。
如上定义的式(XI)、(XII)和(XIII)的化合物也为本发明的目的。
步骤1的反应在有机溶剂(例如二甲氧基乙烷或优选地N，N-二甲基甲酰胺(DMF))中且在对甲苯磺酸的存在下在0℃至80℃的温度进行，且历时1小时至24小时的时间。
步骤2的反应在碱性水解条件优选地为强碱如NaOH在0℃至室温的温度进行，且历时1至48小时的时间。
步骤3的反应按照已知方法进行，例如N-氧基琥珀酰亚胺基衍生物可如下制备：使酸(XII)与N-羟基琥珀酰亚胺或其水可溶的3-取代的磺酸钠在N，N′-二环己基-碳二亚胺的存在下在溶剂(诸如二氯乙烷或N，N-二甲基甲酰胺)中在0℃至50℃的温度反应，历时1至24小时的时间。
步骤4的反应可按照在图3a、3b、3c中概述的方法中的一种进行，取决于期望的所得的如上定义的式(Ia)的化合物：
特别地，制备如上定义的式(Ia)的化合物的最终缩合反应包括使如上定义的式(XIII)的化合物与
1a)式T-[X]m(XIV)的化合物(其中X为-NH2或-SH且m如上定义)反应以得到按照如上i)或ii)所定义的式(Ia)的化合物。
所述缩合反应在能够产生酰胺型或硫酯型的共价键且与载体的结构符合的条件下进行。优选的条件包括在4℃至37℃的温度使用pH 7-9.5的缓冲水溶液，历时几小时至几天的时间。
例如，用于式(XIII)的化合物和抗体T-NH2之间的缩合反应的条件为：pH 8的含有1mg/ml单克隆抗体的0.1M磷酸钠水溶液和0.1M氯化钠水溶液，用30倍摩尔浓度过量的10％w/v 6在N，N-二甲基甲酰胺中的溶液在20℃处理24小时。将缀合物在SEPHADEX G-25柱(Pharmacia Fine Chemical，Piscataway，N.J.)上经凝胶过滤纯化(用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗脱)。
用于制备如上定义的式(Ia)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XIII)的化合物与
1b)式(XV)的化合物NH2-D-NH-P(其中-D-或-D-NH-如上定义且P为氢原子或优选地保护基团)反应，
1b’)如果必要，将所得的式(XVI)的化合物的NH官能团脱保护：
其中R1、R2、L1和D如上报道且P为保护基团，然后
1”b)使所得的式(XVI)的化合物与式(XVII)的载体残基T-[COOH]m缀合以得到如上(iii)所定义的式(Ia)的化合物，其中[T-Z]-为-NH-D-NHCO-T，R1、R2、L1和T如上定义，所述式(XVI)的化合物为：
其中R1、R2、L1和D如上报道且P为氢原子，所述式(XVII)中T和m如上定义。
步骤1b的反应在能够产生酰胺型的共价键且在文献中已知并与间隔基团的结构符合的条件下进行。优选地条件包括在4℃至50℃的温度使用pH7-9.5的缓冲水溶液或有机溶剂(例如N，N-二甲基甲酰胺、二氯乙烷、四氢呋喃或乙酸乙酯)，且历时几小时至几天的时间。
步骤1’b的任选的脱保护使用在文献中报道的已知方法进行[参见，例如Green T.W.，Wuts P.G.M in Protective Groups in Organic Chemistry]。步骤1”b的缀合反应在有机溶剂(优选地N，N-二甲基甲酰胺)中在缩合剂(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1，3-二-叔丁基碳二亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或优选地N，N′-二环己基-碳二亚胺)的存在下进行。所述反应在5℃至50℃的温度进行，且历时1小时至24小时的时间。
在替代途径中，式(XVII)的化合物可用如上在步骤3中所述的适当的活化酸基团W活化，然后使用如上报道的相同条件与脱保护的胺缀合。
用于制备如上定义的式(Ia)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XIII)的化合物与
1c)式(XVIII)的化合物NH2-D-COO-P1(其中D或D-CO-如上定义且P1为适当地保护酸基团，例如烷基酯，其在缀合反应后被除去)反应以得到式(XIX)的酸化合物：
其中R1、R2、L1和D如上所述。
所得的式(XIX)的化合物可这样使用，或优选地经如上在步骤3中所述的适当的活化酸基团活化，然后与式(XIV)的载体残基T-[X]m缀合以制备在(iv)中定义的式(Ia)的化合物，所述式(XIV)中X为NH2且m和T如上定义，所述式(Ia)中[T-Z]-为-NH-D-CONH-T，R1、R2、L1和T如上定义。
对于如上定义的式(XIII)的化合物与式(XVIII)的化合物缀合的优选的反应条件与上述步骤1b报道的相同。除去酸保护基团使用很好综述的方法进行[参见，例如Green T.W.，Wuts P.G.M in Protective Groups in Organic Chemistry]，例如，当酸官能团被保护为乙基酯衍生物时，脱保护可在碱性水解条件优选地使用NaOH并在0℃至室温的温度进行，历时1小时至48小时的时间。式(XIX)的化合物与式(XIV)的化合物的反应在有机溶剂(优选地N，N-二甲基甲酰胺)中在缩合剂(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1，3-二-叔丁基碳二亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，或优选地N，N′-二环己基-碳二亚胺)的存在下进行。反应在5℃至50℃的温度进行且历时1小时至24小时的时间，或在替代的合成途径中，将酸(XIX)用如在步骤3的方法中报道的适当的活化基团活化然后将活化的酸与式(XIV)的化合物在如上在步骤1中报道的合成条件下缀合。
用于制备如上定义的式(Ia)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XIII)的化合物与
1d)如上所述的式(XV)的化合物反应，然后将所得的如上定义的式(XVI)的中间体(其中P为氢原子)与式(XX)的载体残基T-[CHO]m(其中m和T如上定义)缀合以得到如上按照(v)所述的式(Ia)的化合物，其中[T-Z]-残基表示-NH-D-N＝CH-T。
式(XVI)的脱保护的氨基衍生物与式(XX)的载体的结合可在能够产生腙型的共价键且与载体的结构符合的条件下进行。优选的条件包括在4℃至37℃的温度使用pH 4-7.5的缓冲水溶液、醇或它们的混合物，历时几小时至几天的时间。对于式(XVI)的脱保护衍生物的化合物和抗体T-CHO之间的缀合的条件为：pH 6的含有1mg/ml单克隆抗体的0.1M乙酸钠水溶液和0.1M氯化钠水溶液，用30倍摩尔浓度过量的5％w/v 8在相同缓冲液中的溶液在20℃处理24小时。将缀合物如上所述经凝胶过滤纯化。
用于制备如上定义的式(Ia)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XIII)的化合物与
1e)式(XXI)的化合物NH2-D-SH(其中D如上定义)在与步骤1的方法中报道的相同反应条件下反应，然后将所得的式(XXII)的化合物
(其中R1、R2、L1和D如下报道)与
1e’)式(V)的载体残基
(其中T和m如上定义)缀合以在Michael加成后得到如在(vi)中所述的式(Ia)的化合物，其中[T-Z]-为式(XXIII)的残基：
其中D和T如上定义；或
将所得的式(XXII)的化合物与
1e”)式(VI)的载体残基
(其中T和m如上定义)缀合以在吡啶-2-硫醇基的置换后得到如上按照(vii)所定义的式(Ia)的化合物，其中[T-Z]-为式(XXIV)的残基
其中D和T如上定义。
如上定义的式(XXII)的化合物与如上定义的式(V)的化合物的反应在pH7-9.5的缓冲水溶液、醇或它们的混合物中在4℃至室温的温度进行，历时1至6小时的时间[参见，例如Willner D.等人，Bioconjugate Chem.(1993)4：521-527]。化合物(XXII)与化合物(VI)的缀合优选地在pH 7.2的甲醇和磷酸盐缓冲溶液的混合物中进行，其中1至1.5当量的如上定义的式(XXII)的化合物与如上定义的化合物(VI)的每个反应基团缀合。反应混合物优选地在4℃至室温的温度培养[参见例如EP328147]。
如上定义的式(Ib)的化合物及其药用盐可如在图4中所述制备。
式(Ib)的蒽环类衍生物缀合物的制备方法
因此，本发明提供了制备如上定义的式(Ib)的化合物及其药用盐的方法，所述方法包括下述步骤：
步骤1使如上定义的式(II)的化合物与式(XXV)的酰基酰肼衍生物在能够产生酰基腙型的共价键且与载体的结构符合的条件下反应：
步骤2将所得的式(XXVI)的化合物
通过适当的方法转化为作中的如上定义的式(Ib)的化合物。
如上定义的式(XXVI)的化合物也为本发明的目标。
上述步骤1的优选条件包括在4℃至50℃的温度使用pH 4-7.5的缓冲水溶液或优选地有机溶剂诸如例如乙醇、四氢呋喃或优选地甲醇，历时1小时至几天的时间。
最终转化可按照在图5a、5b、5c中概述的方法中的一种进行：
特别地，用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的最终缩合反应包括使如上定义的式(XXVI)的化合物与
2a)式T-[X]m(XIV)的载体化合物(其中X为NH2或SH且m如上定义)反应以得到如上按照(viii)和(ix)所定义的式(Ib)的化合物，其中L2为如上定义的式(VII)的连接基团，R1、R2如上定义且[T-Z]-为T-NH-或T-S-，其中T如上定义。缀合反应使用与上述步骤1e报道的相同条件进行。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XXVI)的化合物与
2b)式(XXVII)的化合物H-R4-D-NH-P(其中D如上定义，R4为-NH-或-S-且P为氢原子，或优选地氨基保护基团，其在缀合反应后被除去)反应，然后
2’b)使所得的式(XXVIII)的酰基腙衍生物
(其中R1、R2、R4和D如上定义)与式(XVII)的载体衍生物T-[COOH]m(其中T和m如上定义)缀合以得到如在(x)和(xv)中定义的式(Ib)的化合物，其中[T-Z]-残基为-NH-D-NHCO-T或-S-D-NHCO-T且R1、R2、L2、T如上定义。缀合反应使用与上述步骤1b报道的相同条件进行。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XXVI)的化合物与
2c)式(XXIX)的化合物H-R4-D-CO-P1(其中R4、D、D-CO-和P1如上定义)反应，并且除去保护基团(如果存在)；且
2’c)使所得的式(XXX)的酰基腙衍生物
(其中R1、R2、R4和D如上定义)优选地在用适当的活化酸基团W(其中W如上报道)活化后与式(XIV)的载体T-[X]m(其中X为NH2，且T和m如上定义)缀合以得到如上在(xi)和(xvi)中定义的式(Ib)的化合物，其中[T-Z]-残基为-NH-D-CONH-T或-S-D-CONH-T且L2、R1、R2、T如上定义。缀合反应使用与在(1c)的方法中报道的相同条件进行。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括：
2d)使如上所述得到的式(XXVIII)的化合物与式(XX)的载体T-[CHO]m缀合以得到如上在(xii)和(xvii)中定义的式(Ib)的化合物，其中[T-Z]-残基为-NH-D-N＝C-T或-S-D-N＝C-T且L2、R1、R2、T如上定义，使用如上1d报道的相同反应条件；
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XXVI)的化合物与
2e)式(XXXI)的化合物H-R4-D-S-P2(其中R4和D如上定义且P2为氢原子或任选地硫醇保护基团)反应，然后使所得的式(XXXII)的化合物
(其中n、R1、R2、R4和D如上定义)在除去硫醇保护基团(如果存在)后，与
2e’)如上定义的式(V)的载体衍生物缀合以得到如上在(xiii)和(xviii)中定义的式(Ib)的化合物，其中L2、R1、R2、D如上定义且[T-Z]-为如上定义的式(XXIII)的残基或(XXIIIa)
或使所得的式(XXXII)的化合物与
2e”)如上定义的式(VI)的载体衍生物缀合以得到如上在(xiv)和(xix)中定义的式(Ib)的化合物，其中L2、R1、R2、D如上定义且[T-Z]-为如上定义的式(XXIV)的残基或(XXIVa)
缀合反应使用与在(1e)的方法中报道的相同条件进行，而除去所选的硫醇保护基团可在文献报道的条件下进行[参见，例如Green T.W.，Wuts P.G.M in Protective Groups in Organic Chemistry]。
式(Ib)的化合物(其中L2为式(VIII)的间隔基团)以及药用盐可通过在图6中所述的方法得到，其中G为碳或氮原子，优选地氮原子，R5为卤素或氢原子，优选地氢原子，且n、R1和R2如上定义。
因此，本发明提供了用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的方法，其中L2为式(VIII)的间隔基团及其药用盐，所述方法包括下述步骤：
步骤1使如上定义的式(II)的化合物与式(XXXIII)的酰基酰肼衍生物反应
其中G和R5如上定义，使用在制备式(Ib)的化合物的方法中如上所述的步骤1中报道的相同条件，且
步骤2将所得的式(XXXIV)的酰基腙衍生物
(其中n、R1、R2和G如上定义)通过适当方法转化为最终的式(Ib)的化合物。
如上定义的式(XXXIV)的化合物也为本发明的目标。
最终的转化可按照在图7a、7b、7c中概述的方法中的一种进行，其中n、m、T、D、P、P1、P2和R4如上定义。特别地，用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的最终的缩合反应包括使如上定义的式(XXXIV)的化合物与
(3a)式(XIV)的载体衍生物T-[X]m(其中X为-SH且m为如上定义)反应以得到如上在(xx)中定义的式(Ib)的化合物，其中L2为如上定义的式(VIII)的连接基团，R1和R2如上定义且[T-Z]为-S-T，其中T如上定义。对于将载体与式(XXXIV)的化合物连接的反应条件与如上在(1e”’)中所述的条件相同。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XXXIV)的化合物与
(3b)式(XXXV)的化合物SH-D-NH-P(其中D和P如上定义)在与如上在1e”中定义的相同条件下反应，且
(3’b)使所得的式(XXXVI)的酰基腙衍生物
(其中n、R1、R2和D如上定义)在除去氨基保护基团(如果存在)后与式(XVII)的载体衍生物T-[COOH]m(其中T和m如上定义)缀合以得到如上在(xxi)中定义的式(Ib)的化合物，其中L2如上定义且[T-Z]-残基为-S-D-NHCO-T。反应使用在上述(1b)中用于产生最终的化合物的相同条件进行。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XXXIV)的化合物与
(3c)式(XXXVII)的化合物HS-D-CO-OP1(其中D和P1如上定义)在与如上在1e”中定义的相同条件下反应；且在除去氨基保护基团(如果存在)后，
(3’c)使所得的式(XXXVIII)的酰基腙衍生物(优选地通过适当的活化酸基团W的反应活化，其中W为如上定义的基团)
(其中n、R1、R2和D如上定义)与式(XIV)的载体T-[X]m(其中X为NH2且T和m如上定义)缀合以得到如上在(xxii)中定义的式(Ib)的化合物，其中[T-Z]-残基为-S-D-CONH-T且L2、R1、R2、T如上定义，使用如上在1c中报道的相同条件。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括：
(3d)使如上所述得到的式(XXXVI)的化合物与式(XX)的载体衍生物T-[CHO]m(其中T和m如上定义)缀合以得到如上在(xxiii)中定义的式(Ib)的化合物，其中[T-Z]-残基为-S-D-N＝C-T且D、L2、R1、R2、T如上定义。反应条件与如上在1d中报道的相同。
用于制备如上定义的式(Ib)的化合物的另一种缩合反应包括使如上定义的式(XXXIV)的化合物与
(3e)式(XXXIX)的化合物HS-D-S-P2(其中D和P2如上定义，且P2优选为硫醇保护基团)在与如上在1e”中定义的相同条件下反应，且在使用文献中已知的条件除去保护基团(如果存在)后，使所得的式(XL)的酰基腙衍生物
(其中n、R1、R2和D如上定义)与
(3’e)如上定义的式(V)的载体缀合以得到如上在(xiv)中定义的式(Ib)的化合物，其中L2、R1、R2、D如上定义且[T-Z]-为如上定义的式(XXIIIa)的残基，
或使所得的式(XL)的酰基腙衍生物与
(3”e)如上定义的式(VI)的载体缀合以得到如上在(xxv)中定义的式(Ib)的化合物，其中L2、R1、R2和D如上定义且[T-Z]-为如上定义的式(XXIVa)的残基。
如上定义的化合物(XL)与如上定义的式(VII)或(VIII)的化合物之间的反应在与在1e’和1e”中报道的相同条件下进行。
如上定义的式(I’)的本发明化合物(其中L为L1)及其药用盐可通过如下在方案7-10中所述的方法得到，其中所有标志具有如上定义的相同含义。
方案7
通过使式(XIII)的化合物与式Q-NH2或Q-SH的化合物(其中Q如上定义)反应得到式(I’)的化合物，其中L为L1且R1、R2、Q和L1如上定义。缀合反应条件与如上1a所述的相同。
方案8
通过使式(XIX)的化合物与如上定义的式Q-NH2的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L1且R1、R2、Q和D如上定义。缀合反应条件与如上1c所述的相同。
方案9
通过使式(XVI)的化合物(其中P为氢原子)与式Q-CHO的化合物(其中Q如上定义)反应得到式(I’)的化合物，其中L为L1且R1、R2、Q、L1和D如上定义。缀合反应条件与如上1d所述的相同。
方案10
通过使式(XVI)的化合物(其中P为氢原子且L1和D如上定义)与式Q-COOH的化合物(其中Q如上定义)反应得到式(I’)的化合物，其中L为L1且L1、R1、R2、Q和D如上定义。
缀合反应条件与如上1b所述的相同。如上定义的式(I’)的本发明化合物(其中L为L2)及其药用盐可通过如下在方案11-15中所述的方法得到，其中所有标志具有如上定义的相同含义。
方案11
通过使式(XXVI)的化合物与如上定义的式Q-NH2或Q-SH的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2，且L2为如上定义的式(VII)且R1、R2、Q如上定义。
方案12
通过使式(XXX)的酸化合物与如上定义的式Q-NH2的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2且L2为如上定义的式(VII)的连接基团且R1、R2、R4、D、Q如上定义。
方案13
通过使式(XXVIII)的酸化合物与如上定义的式Q-CHO的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L2为如上定义的式(VII)的连接基团且R1、R2、R4、D、Q如上定义。
方案14
通过使式(XXVIII)的酸化合物与如上定义的式Q-COOH的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2，L2为如上定义的式(VII)的连接基团且R1、R2、R4、D、Q如上定义。缀合反应条件与如上1e’所述的相同。
方案15
通过使式(XXXIV)的化合物与如上定义的式Q-SH的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2，L2为如上定义的式(VIII)的连接基团且R1、R2、Q如上定义。
方案16
通过使式(XXXVIII)的化合物与如上定义的式Q-NH2的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2，L2为式(VIII)的连接基团且R1、R2、Q和D如上定义。
方案17
通过使式(XXXVI)的化合物与如上定义的式Q-CHO的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2，L2为式(VIII)的连接基团且R1、R2、Q和D如上定义。
方案18
通过使式(XXXVI)的化合物与如上定义的式Q-COOH的化合物反应得到式(I’)的化合物，其中L为L2，L2为式(VIII)的连接基团且R1、R2、Q和D如上定义。缀合反应条件与如上1e”所述的相同。
起始化合物和试剂可商购得到或可按照文献中报道的已知方法制备。例如，式(II)的化合物在WO 98/02446中所述，式(IX)和(X)的化合物在WO9202255中所述。
抗体-药物缀合物
本发明的蒽环类衍生物缀合化合物包括具有抗癌活性效用的那些化合物。在一个实施方案中，所述蒽环类衍生物缀合化合物包括缀合的即通过连接基团共价连接于蒽环类衍生物药物部分的抗体，其中所述药物不缀合于抗体时具有细胞毒性或细胞抑制效应。因此，通过缀合于抗体所述药物部分的生物学活性得到调节。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)可以选择性地将有效量的细胞毒性试剂递送到肿瘤组织，由此可以获得更强的选择性，即以较低剂量即可达到期望的功效。
在一个实施方案中，与仅有相应的PNU-159682蒽环类衍生物化合物相比，哺乳动物中ADC或ADC的胞内代谢物的生物利用度提高。同时，与仅有相应的抗体(ADC的抗体，无药物部分或连接基团)相比，哺乳动物中ADC或ADC的胞内代谢物的生物利用度提高。
在一个实施方案中，ADC的蒽环类衍生物药物部分直到抗体-药物缀合物结合到细胞表面受体或进入细胞时才从抗体裂解，其中所述细胞具有抗体-药物缀合物的抗体特异的细胞表面受体。在抗体-药物缀合物进入所述细胞后，药物部分可以从所述抗体裂解。在哺乳动物体内，蒽环类衍生物药物部分可以通过酶学作用、水解、氧化或其它机制，在细胞内从所述化合物或所述化合物的胞内代谢物的抗体裂解。
也可以通过修饰抗体以引入亲电子部分来生产抗体-药物缀合物，亲电子部分能够与连接基团试剂或药物上的亲核取代基反应。例如可以用高碘酸氧化剂氧化糖基化抗体的糖，形成醛或酮基，醛或酮基可以与连接基团试剂或药物部分(drug moieties)的胺基反应。所得亚胺席夫碱基团可以形成稳定的键，或可以例如通过氢硼化物试剂还原形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或高碘酸钠(sodium meta-periodate)反应可以在蛋白质中产生羰基(醛和酮)，羰基能够与药物上的适当基团反应(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press：New York，p 234-242)。在另一实施方案中，包含N端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能够与高碘酸钠反应，导致醛取代第一个氨基酸(Geogegan & Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。这样的醛能够与药物部分或连接基团亲核试剂反应。
在一个实施方案中，抗体-药物缀合物(ADC)化合物包含通过连接基团L和任选间隔基团Z共价连接至一个或多个蒽环类衍生物药物部分D的抗体，所述化合物具有式(Ic)
Ab-(L-Zm-D)p Ic
或其药用盐，其中：
Ab为抗体；
D为选自下述结构的蒽环类衍生物：
其中波浪线表示与L的连接；
L为选自下述的连接基团：-N(R)-、-N(R)m(C1-C12亚烷基)-、-N(R)m(C2-C8亚烯基)-、-N(R)m(C2-C8亚炔基)-、-N(R)m(CH2CH2O)n-和下述结构：
其中波浪线表示与D和Z的连接；且
Z为选自下述的任选间隔基团：-CH2C(O)-、-CH2C(O)NR(C1-C12亚烷基)-和下述结构：
R为H、C1-C12烷基或C6-C20芳基；
R1和R2独立选自氨基酸侧链；
Z1选自-(C1-C12亚烷基)-、-(C2-C8亚烯基)-、-(C2-C8亚炔基)-和-(CH2CH2O)n-，
m为0或1；
n为1至6；且
p为1至8的整数。
式I的化合物包括各种负载和连接的抗体-药物缀合物的所有混合物，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接至抗体。
抗体-药物缀合物的示例性实施方案包括：
其中Aa为二价单元，诸如能够将抗体(Ab)连接至氨基酸单元诸如缬氨酸-瓜氨酸的MC(马来酰亚氨基己酰基)、MP(马来酰亚氨基丙酰基)或MPEG(2-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)且Yy为二价单元，诸如PAB(对氨基苄基氧基羰基)，当存在氨基酸单元时，其将氨基酸单元连接至药物部分(D)。在另一个实施方案中，当不存在氨基酸单元时，Aa直接将Yy连接至药物部分。在另一个实施方案中，当氨基酸单元和Aa单元均不存在时，Yy单元直接将药物部分连接至抗体单位。
示例性抗体-二硫化物连接基团药物缀合物经下述结构表示：
二硫化物连接基团SPP可由连接基团试剂N-4-(2-吡啶基硫基)戊酸琥珀酰亚氨酯构成。
式(I)的抗体-药物缀合物和式(I’)的化合物包括所有的对映异构体、非对映异构体、异构体富集的、外消旋混合物、同位素标记和同位素富集的形式(例如2H、3H、14C、15N)和它们的保护形式。
不受任意具体的作用机制所限制，本发明的式(I)的抗体-药物缀合物和式(I’)的化合可为有效的治疗剂，这是由于它们含有缩醛键或腙键，其在水合氢离子催化的水解或″体内″酶裂解后释放母体药物(II)。已知的是相对于正常组织，在恶性肿瘤中有高水平的糖酵解，其引起乳酸盐产生的增加且因此减小肿瘤内的pH，参见：H.M.Rauen等人.，Z.Naturforsch，Teil B，23(1968)1461。本发明提供了两种水平的化合物作用的特异性，第一种在于肿瘤组织中缀合物通过抗原识别的方式的优选局限化，且第二种在于肿瘤组织中激活型的药物通过优选酸性裂解的方式的优选释放。尽管不限制本发明组合物或方法的范围或实用性，本申请所述的酸敏感的缩醛连接基团可在局部或***的酸性条件下进行体内裂解，因此将靶标抗体从药物部分分离。
根据所述方法产生的缀合物按照不同的化学-物理方法表征。初始分子量的保留和聚集体形成的缺失可用不同波长的蒽环类抗生素和抗体的同时和独立检测通过色谱凝胶过滤法进行评估(Yu，D.S.等人.，J.Urol.140，415，1988)，且可通过凝胶电泳法评估。得到的化合物的总体电荷分布可通过色谱离子交换法进行评估。蒽环类抗生素浓度可通过分光光度滴定对照由母体蒽环类抗生素得到的标准校正曲线进行评估。蛋白浓度可通过比色测定诸如二金鸡纳酸测定(Smith，P.K.等人.，Anal.Biochem.150，76，1985)或Bradford染色测定(Bradford，M.M.，(1976)Anal.Biochem.72：248)进行评估。在结合方法后，抗体的抗原结合活性保留可通过ELISA方法(Yu，D.S.等人.，J.Urol.140，415，1988)和细胞荧光测定法(Gallego，J.等人.，Int.J.Cancer 33，737，1984)进行评估。在化合物在适当缓冲溶液中培养后，缀合物的酸敏感性可通过色谱法进行评价。
药物负载
在式I的抗体-药物缀合物分子中，以p表示药物负载，表示每抗体负载的蒽环类衍生物药物的平均数目。药物负载可以为每抗体(Ab)1至8个药物(D)，即其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接于抗体。式I的ADC的组成包括与1至8个药物结合的抗体的集合。来自缀合反应的ADC制品中，每抗体的药物平均数目可以通过传统方法如质谱学方法、ELISA测试、电泳和HPLC鉴定。也可以测定ADC依据p的定量分布。通过ELISA可以测定特定ADC制品中的p平均值(Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res.11：843-852)。然而，p(药物)值分布不能通过抗体-抗原结合和ELISA的检测限制来辨别。同时，检测抗体-药物缀合物的ELISA测试不测定药物部分于何处连接于抗体，如重链或轻链片段或特定氨基酸残基。在一些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳等手段实现同质ADC的分离、纯化和鉴定，其中p为来自ADC与其它药物负载的特定值。
对于一些抗体-药物缀合物，p可能受限于抗体上的连接位点数目。例如，抗体可能仅有一个或几个半胱氨酸硫醇基，或可能仅有一个或几个充分反应性的硫醇基，连接基团可以通过此硫醇基连接。更高的药物负载，例如p＞5，可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不可溶性、毒性或细胞通透性的丧失。
典型地，缀合反应期间，结合于抗体的药物部分小于理论最大值。抗体可以包含例如许多不与药物-连接基团中间体(D-L)或连接基团试剂反应的赖氨酸残基。只有反应性最强的赖氨酸基团能够与胺反应性连接基团试剂反应。同样，只有反应性最强的半胱氨酸硫醇基能够与硫醇反应性连接基团试剂反应。通常，即便有，抗体也不会包含许多能够连接到药物部分的游离的反应性半胱氨酸硫醇基。抗体化合物中的大多数半胱氨酸硫醇残基都以二硫键形式存在，必须用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP在不完全或完全还原条件下还原。此外，抗体必须置于变性条件下以暴露反应性亲核基团如赖氨酸或半胱氨酸。ADC的负载(药物/抗体比)可以以几种不同的方式得到控制，包括：(i)限制相对于抗体的药物-连接基团中间体(D-L)或连接基团试剂的过量摩尔浓度数，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)针对半胱氨酸硫醇修饰的不完全的或限制的还原条件。
半胱氨酸氨基酸可在抗体的反应位点进行修饰，且其不形成链内或分子间的二硫键(US 7521541)。经修饰的半胱氨酸硫醇基可与本发明的连接基团试剂或药物-连接基团试剂反应以形成具有半胱氨酸修饰的抗体和蒽环类衍生物药物部分的ADC，所述试剂具有硫醇基-反应亲电子基团诸如马来酰亚胺或α-卤代酰胺。因此药物部分的定位可被设计、控制且已知。药物负载可被控制，这是由于经修饰的半胱氨酸硫醇基典型地与硫醇基-反应连接基团试剂或药物-连接基团试剂以高收率反应。通过在重链或轻链的单一位点的取代来修饰IgG抗体以引入半胱氨酸氨基酸得到在对称抗体上的两个新的半胱氨酸。可实现2附近的药物负载且结合产物ADC的接近同质性也可实现。
抗体中超过一个亲核或亲电子基团与药物-连接基团中间体或连接基团试剂反应，之后与药物部分试剂反应，然后所得产物为ADC化合物的混合物，其具有例如1、2、3等连接于抗体的药物部分的分布。液相色谱方法如聚合物反相(PLRP)和疏水性相互作用(HIC)能够通过药物负载值分离混合物中的化合物。可以分离具有单一药物负载值(p)的ADC制品，然而，这些单一负载值ADCs可能仍然是异源混合物，因为药物部分可以经由连接基团连接于抗体上的不同位点。
因此，本发明的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合化合物的混合物，其中所述抗体具有一个或多个蒽环类衍生物药物部分，且其中所述药物部分可在各种氨基酸残基上与抗体连接。
抗体-药物缀合物的制备
式I的ADC可以通过几个路线，使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂制备，包括：(1)抗体亲核基团或亲电子基团与二价连接基团试剂反应，形成由共价键连接的抗体-连接基团中间体Ab-L，之后与活化的药物部分试剂反应；和(2)药物部分试剂的亲核基团或亲电子基团与连接基团试剂反应，形成由共价键连接的药物-连接基团中间体D-L，之后与抗体的亲核基团或亲电子基团反应。可以利用多种抗体、药物部分和连接基团来应用结合方法(1)和(2)，以制备式I的抗体-药物缀合物。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N端氨基，(ii)侧链氨基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体是糖基化的。氨、硫醇和羟基是亲核的，能够与连接基团部分和连接基团试剂上的亲电子基团反应形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯(haloformates)和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。抗体可以通过用还原剂如DTT(Cleland′s reagent，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)；Getz等人(1999)Anal.Biochem.Vol 273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)处理而使之对于与连接基团试剂的缀合为反应性的。因此，每个半胱氨酸二硫桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核物。可以通过赖氨酸与2-亚氨基噻吩(Traut′s试剂)反应将其它的亲核基团引入抗体中，所述反应将胺转化为硫醇。
也可以通过修饰抗体以引入亲电子部分来生产抗体-药物缀合物，亲电子部分能够与连接基团试剂或药物上的亲核取代基反应。例如可以用高碘酸氧化剂氧化糖基化抗体的糖，形成醛或酮基，醛或酮基可以与连接基团试剂或药物部分的胺基反应。所得亚胺席夫碱基团可以形成稳定的键，或可以例如通过氢硼化物试剂还原形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或高碘酸钠反应可以在蛋白质中产生羰基(醛和酮)，羰基能够与药物上的适当基团反应(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press：New York，p 234-242)。在另一实施方案中，含有N端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能够与高碘酸钠反应，导致醛取代第一个氨基酸(Geoghegan & Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。这样的醛能够与药物部分或连接基团亲核试剂反应。
同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼(arylhydrazide)基团，这些基团能够与连接基团部分和连接基团试剂上的亲电子基团反应形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。反应亲核基团可通过标准官能团互变引入至蒽环类衍生物化合物中。例如，羟基可通过Mitsunobu型反应转化为硫醇基，形成硫醇基修饰的药物化合物。
表2中的抗体-药物缀合物根据在实施例中所述的方法制备且通过体外细胞增殖测定和体内肿瘤异种移植物生长抑制测试其效能。
表2抗体-药物缀合物
*DAR＝药物/抗体比平均值
针对肿瘤相关抗原和细胞表面受体的抗体-药物缀合物(ADC)的筛选
用于检测癌细胞的测定方法包括将细胞暴露于抗体-药物缀合化合物，并确定抗体-药物缀合化合物与细胞的结合程度。在动物模型和基于细胞的测定中鉴定的式I的ADC化合物可进一步在荷瘤高等灵长类动物和人临床试验中测试。
转基因动物和细胞系尤其可用于筛选具有预防性或治疗性治疗疾病或紊乱潜力的抗体-药物缀合物(ADC)，所述疾病或紊乱涉及肿瘤相关抗原和细胞表面受体例如HER2的过表达(US 6632979)。筛选可用的ADC可能涉及为转基因动物施用一定剂量范围的候选ADC，并在不同时间点测试ADC对所评估的疾病或紊乱的影响。可替换地，或除此之外，可以在暴露于疾病诱导因素之前或与之同时施用所述药物，如果适用的话。候选ADC可以在培养基或高通量筛选阵列下连续并分别地，或同时筛选。筛选ADC的速率仅受合成速率或包括检测/测定/数据分析的筛选方法学速率的限制，ADC的筛选用于疾病或紊乱的预防性或治疗性治疗的应用。
筛选方法的一个实施方案包括(a)将细胞从稳定的乳腺癌细胞系移植到非人动物中，(b)为所述非人动物施用ADC候选药物以及(c)确定候选药物抑制肿瘤自移植细胞系形成的能力。本发明还涉及筛选用于治疗疾病或紊乱的候选ADC的方法，所述疾病或紊乱的特征为受体蛋白的过表达，所述方法包括(a)将来自稳定的乳腺癌细胞系的细胞与候选药物接触，和(b)评估候选ADC抑制稳定细胞系生长的能力。
筛选方法的一个实施方案包括(a)将来自稳定的乳腺癌细胞系的细胞与ADC候选药物接触，和(b)评估候选ADC诱导细胞死亡、诱导细胞凋亡、阻断调蛋白(heregulin)结合、阻断配体刺激的酪氨酸磷酸化或阻断HER2的配体活化的能力。另一实施方案评估了候选ADC的能力。在另一实施方案中，评估了候选ADC的能力。
筛选方法的另一实施方案包括为例如在其乳腺细胞中过表达天然人蛋白质，例如HER2或其片段的转基因非人哺乳动物施用ADC候选药物，其中这种转基因哺乳动物已将编码天然人蛋白质或其具有天然人蛋白质的生物学活性的片段的核酸序列稳定地整合到其基因组中，所述核酸序列可操作地连接到引导其表达的转录调控序列，并且发育出肿瘤。通过为转基因动物施用一定剂量范围的候选ADC，并随着时间推移评估所述动物对所述化合物的生理反应来筛选候选ADC。施用可以是口服，或通过合适的注射，这取决于要评估的化合物的化学性质。有时，与会增强化合物功效的辅助因子(co-factor)一起施用所述化合物可能是合适的。如果源于受试转基因动物的细胞系用于筛选可用于治疗不同病症的化合物，其中所述病症与某些肿瘤相关抗原蛋白或细胞表面受体的过表达，例如HER2-过表达相关。为鉴定特异地靶向HER2的生长抑制性ADC化合物，可以筛选抑制源于转基因动物的HER2-过表达癌细胞生长的ADC(US 5677171)。
体外细胞增殖测定
通常，通过如下所述测定抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制活性：在细胞培养基中，将具有肿瘤相关抗原或受体蛋白的哺乳动物细胞与ADC的抗体接触；培养细胞约6小时至约5天的时间；测定细胞存活力(viability)。基于细胞的体外测定可用于测定存活力，即ADC的增殖(IC50)、细胞毒性(EC50)和凋亡诱导(胱天蛋白酶活化)。
Luminescent Cell Viability Assay是可在商业上利用的(Promega Corp.，Madison，WI)均相测试(homogeneous assay)方法，其以鞘翅目(Coleoptera)荧光素酶的重组表达为基础(US 5583024；US 5674713；US 5700670)。该细胞增殖测定以所存在的ATP的定量为基础确定培养物中的活细胞数目，ATP为代谢活性细胞的指示剂(Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；US 6602677)。
测定在96孔板中实施，使之易于进行自动化高通量筛选(HTS)(Cree(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404)。均相测定方法涉及直接将单一试剂
Reagent)添加到培养在补充有血清的培养基中的细胞。不需要细胞冲洗、去除培养基和多个移液步骤。在添加试剂并混合后10分钟，所述***在384-孔阵列中探测15个细胞/孔。
对与母体药物比较的缀合物的细胞毒性保留的评价可通过基于ATP定量的测试进行评估。将A2780人卵巢癌细胞和MCF7人乳腺癌细胞(1250个细胞/孔)在完全培养基(RPMI1640或EMEM加10％胎牛血清)中接种于白色384孔板中并在接种24小时后用在0.1％DMSO中溶解的化合物处理。将细胞在37℃和5％CO2孵育并在72小时后按照厂商说明书使用CellTiter-Glo测定(Promega)对板进行处理。
CellTiter-Glo为基于存在的ATP定量的均相方法，是一种代谢活性细胞的指示剂。使用导致光产生的基于萤光素酶和D-萤光素的***定量ATP。发光信号与在培养基中存在的细胞数目呈比例。简言之，将25μL/孔的试剂溶液加入至每孔并在5分钟后通过发光计读取小室微量培养板(shacking microplate)。发光信号与在培养基中存在的细胞数目呈比例。
式Ic的抗体-药物缀合物的抗增殖作用(表6)通过针对表达在图8-29中在3天连续暴露研究中的肿瘤细胞系的HER2的
测定(实施例9)进行测量。
图8显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：游离药物PNU-159682连续暴露、PNU-1596821小时培养、连接基团药物：NHS-缩酮-Ant 50、连接基团药物：马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、连接基团药物：马来酰亚胺-腙-Ant 52和连接基团药物：硫吡啶-腙-Ant 53。SK-BR-3细胞的HER2表达水平为3+。通过连续暴露至PNU-159682，SK-BR-3细胞增殖得到最有效的抑制。简单的(1小时)暴露也有效地抑制SK-BR-3细胞的生长。腙连接的Ant 52和53相对于游离Ant作用较弱，而缩酮连接的Ant 50和51连接基团药物中间体显示最小的抗增殖活性。
图9显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：游离药物：PNU-159682连续暴露、游离药物：PNU-1596821小时培养、连接基团药物：NHS-缩酮-Ant 50、连接基团药物：马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、连接基团药物：马来酰亚胺-腙-Ant 52和连接基团药物：硫吡啶-腙-Ant 53。BT-474细胞的HER2表达水平为3+。通过连续暴露至PNU-159682，BT-474细胞增殖得到最有效的抑制。简单的(1小时)暴露也有效地抑制BT-474细胞的生长。腙连接的Ant 52和53显示最小的抗增殖活性，而缩酮连接的Ant 50和51无活性。
图10显示MCF7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：游离药物：PNU-159682连续暴露、游离药物：PNU-159682 1小时培养、连接基团药物：NHS-缩酮-Ant 50、连接基团药物：马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、连接基团药物：马来酰亚胺-腙-Ant 52和连接基团药物：硫吡啶-腙-Ant 53。通过连续暴露至PNU-159682，MCF7细胞增殖得到最有效的抑制。简单的(1小时)暴露也有效地抑制MCF7细胞的生长。腙连接的Ant 52和53显示最小的抗增殖活性，而缩酮连接的Ant 50和51无活性。
图11显示多柔比星-耐药(DoxRes)HER2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：游离药物：PNU-159682连续暴露、游离药物：PNU-1596821小时培养、连接基团药物：NHS-缩酮-Ant 50、连接基团药物：马来酰亚胺-缩酮-Ant 51、连接基团药物：马来酰亚胺-腙-Ant 52和连接基团药物：硫吡啶-腙-Ant 53。DoxRes HER2细胞的HER2表达水平为3+，具有高PgP/MDR1。通过连续暴露至PNU-159682，DoxRes/HER2细胞增殖得到最有效的抑制。简单的(1小时)暴露也有效地抑制AdrRes/HER2细胞的生长。腙连接的Ant 52和53相对于游离Ant作用较弱，而缩酮连接的Ant 50和51显示最小的抗增殖活性。DoxRes Her2细胞系也称为″AdrRes Her2″。
图12显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 103显示对SK-BR-3细胞的最有效的抗增殖活性。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102和Tr-MCC-DM1 101按照IC50计算为等效的，但相比于101用102处理SK-BR-3细胞导致更强的细胞杀伤作用。所有测试的缀合物均比曲妥单抗更有效。
图13显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 103显示对BT-474细胞的最有效的抗增殖活性。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102和Tr-MCC-DM1 101等效地抑制BT-474细胞的生长。所有测试的缀合物均比曲妥单抗更有效。
图14显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。MCF7细胞的HER2表达水平为正常。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 103显示对Her2-正常MCF7细胞系的有效的抗增殖活性。曲妥单抗、Tr-MCC-DM1 101和硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102对MCF7细胞无活性。
图15显示多柔比星-耐药(DoxRes)HER的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 103显示对DoxRes/HER2细胞的有效的抗增殖活性，所述细胞表达高水平的HER2和多药耐药运载体MDR1/PgP。硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-缩酮-Ant 103仅在两个最高测试浓度(3.3和10ug/ml)由活性，而Tr-MCC-DM1 101和曲妥单抗显示对该细胞系最小的活性。
图16显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。硫基-Tr-HC-NHS-缩酮-Ant 105和Tr-MCC-DM1 101按照IC50计算显示对SK-BR-3细胞增殖相同的效能；用105处理导致更强的细胞杀伤作用。非靶标的对照抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110也显示对SK-BR-3细胞的有效的抗增殖活性。所有测试的缀合物均比曲妥单抗更有效。
图17显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。硫基-Tr-HC-NHS-缩酮-Ant 105显示对BT-474细胞最有效的抗增殖活性。用Tr-MCC-DM1处理也导致对BT-474细胞的生长抑制。非靶标的对照抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110显示对BT-474细胞的有效的抗增殖作用。所有测试的缀合物均比曲妥单抗更有效。
图18显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。硫基-Tr-HC-NHS-缩酮-Ant 105和抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110显示对低HER2-表达的MCF7细胞相同的活性。曲妥单抗和Tr-MCC-DM1 101对MCF7无活性。
图19显示多柔比星-耐药(DoxRes)Her2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：抗-CD22NHS-缩酮-Ant 110、曲妥单抗、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105。硫基-Tr-HC-NHS-缩酮-Ant 105和抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110显示对DoxRes/HER2细胞相同的活性。Tr-MCC-DM1 101显示适中的活性，且曲妥单抗对DoxRes/HER2无作用。
图20显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。
图21显示SK-BR-3的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110和PNU-159682游离药物。如前报道，曲妥单抗通过细胞生长抑制机制适当地抑制SK-BR-3细胞的生长。非靶标的对照ADCs硫基-抗-CD22-HC-缩酮-Ant 107和抗-CD22-NHS-缩酮-Ant110仅在最高测试剂量显示抗增殖活性。非靶标的对照ADCs硫基-抗-CD22-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 108和硫基-抗-CD22-H-硫吡啶-腙-Ant 109显示与HER2-靶标ADC相同的抑制SK-BR-3细胞生长的效能(图20)，说明腙连接的ADC的不稳定性。以μM浓度给药的游离药物PNU-159682在所有测试的剂量引起细胞毒性。
图22显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。所有测试的ADC显示对BT-474细胞增殖的相似活性。硫基-Tr-HC-vc-MMAE 106具有最低的IC50(0.01μg/ml)，而用硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 103和硫基-Tr-HC-硫吡啶-腙-Ant 104处理导致最大量的总体生长抑制。
图23显示BT-474的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110和PNU-159682游离药物。如前报道，曲妥单抗通过细胞生长抑制机制适当地抑制BT-474细胞的生长。非靶标的对照ADC硫基-抗-CD22-HC-缩酮-Ant 107和抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110对BT-474细胞不具有抗增殖作用。非靶标的对照ADC硫基-抗-CD22-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 108和硫基-抗-CD22-H-硫吡啶-腙-Ant 109显示与HER2-靶标ADC相同的抑制BT-474细胞生长的效能(图22)，说明腙连接的ADC的不稳定性。以μM浓度给药的游离药物PNU-159682在所有测试的剂量引起细胞毒性。
图24显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106。仅硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-腙-Ant 103和硫基-Tr-HC-硫吡啶-Ant 104对HER2-低的MCF7细胞具有抗增殖作用，说明腙连接的ADC的不稳定性。所有其它测试的ADC(硫基-Tr-HC-vc-MMAE 106、Tr-MCC-DM1 101、硫基-Tr-HC-马来酰亚胺-缩酮-Ant102和硫基-Tr-NHS-缩酮-Ant 105)对MCF7细胞生长无作用。
图25显示MCF-7的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110和PNU-159682游离药物。与之前报道一致，曲妥单抗对低HER2-表达的MCF7细胞完全无活性。非靶标的对照ADC硫基-抗-CD22-HC-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107和硫基-抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110也不抑制MCF7细胞的生长，说明缺乏药物从稳定的缩酮连接基团释放。腙连接的非靶标的对照ADC108和109显示对MCF7细胞的抗增殖作用，说明药物从不稳定的腙连接的ADC释放。以μM剂量给药的游离药物PNU-159682在所有测试的浓度引起细胞毒性。
图26显示多柔比星-耐药(DoxRes)/HER2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-硫吡啶-腙-Ant 104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE106。当106对DoxRes/HER2细胞生长无作用且Tr-MCC-DM1 101对DoxRes/HER2细胞生长具有最小的作用时，缩酮连接的ADC102和105仅在最高测试浓度有效，而腙连接的ADC 103和104有效地抑制DoxRes/HER2细胞生长。
图27显示多柔比星-耐药(DoxRes)/HER2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110和PNU-159682游离药物。单独使用曲妥单抗对DoxRes/HER2细胞的生长无作用。缩酮连接的非靶标的对照ADC 107和110仅在最高测试浓度抑制DoxRes/HER2细胞的生长，而腙连接的非靶标的对照ADC 108和109显示对DoxRes/HER2细胞的有效的抗增殖活性。所有四个非靶标抗-CD22-Ant对照ADC的活性与HER2-靶标的硫基-Ant ADC类似(图26)。以μM剂量给药的游离药物PNU-159682在所有测试的浓度抑制生长。
图28显示多柔比星-耐药(DoxRes)/HER2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103、硫基-曲妥单抗(HCA114C)-硫吡啶-腙-Ant 104、硫基-曲妥单抗(HC A114C)-NHS-缩酮-Ant 105、曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE106，所有给药在维拉帕米(10μg/m)的存在下进行。维拉帕米抑制已知为多药耐药运载体MDR1/P-糖蛋白(PgP)的底物的不同药物的外排，其在DoxRes/HER2细胞上高表达。加入维拉帕米使得DoxRes/HER2细胞对Tr-MCC-DM1 101的细胞毒性作用敏感，说明DM1为MDR1/PgP的底物。维拉帕米在对其它测试的ADC(102-106)的应答中无作用，说明这些ADC的药物作用不被NDR1/PgP抑制。
图29显示多柔比星-耐药(DoxRes)/HER2的3天体外细胞存活力对以下物质的浓度的曲线：曲妥单抗、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107、硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108、硫基-抗-CD22(HC A114C)-硫吡啶-腙-Ant 109、抗-CD22-NHS-缩酮-Ant 110和PNU-159682游离药物，所有给药在维拉帕米的存在下进行。所有测试的ADC(107-110)在维拉帕米的存在下等效(相比于图27)，说明Ant药物不是MDR1/PgP的底物。
表3概述了图20-29的测试化合物对SK-BR-3、BT-474、MCF7、多柔比星-耐药(DoxRes)和多柔比星-耐药(DoxRes)(维拉帕米存在下)细胞增殖的抑制的IC50值(ug/ml)。将SK-BR-3和BT-474与MCF7比较，马来酰亚胺-缩酮-Ant和NHS-缩酮-AntADC显示靶标依赖性杀伤作用，而腙连接的AntADC显示无靶标依赖性非选择性杀伤作用。
表3SK-BR-3、BT-474、MCF7、多柔比星-耐药(DoxRes)和多柔比星-耐药(DoxRes)(维拉帕米存在下)细胞增殖的体外抑制
式Ic的抗体-药物缀合物的抗增殖作用(表6)通过针对在3天连续暴露研究中的CD22阳性B-淋巴瘤细胞系：BJAB、GRANTA、DoHH2和SuDHL4的
测定(实施例9)进行测量。Jurkat细胞(CD22阴性)用抗体-药物缀合物处理作用阴性对照。
表4概述了在3天连续暴露研究中测试抗体-药物缀合化合物对BJAB、GRANTA、DoHH2、SuDHL4和Jurkat细胞系的抑制的IC50值(ug/ml)。抗-CD22抗体-药物缀合物107-110显示高效的细胞杀伤作用。显著的细胞杀伤作用通过阴性对照抗-HER2抗体药物缀合物102-105观察到。显著的细胞杀伤作用通过CD22阴性Jurkat细胞上的抗-CD22抗体-药物缀合物107-110观察到。
表4BJAB、GRANTA、DoHH2、SuDHL4和Jurkat细胞系的体外抑制
小鼠体内血清清除率和稳定性
ADC的血清清除率和稳定性可在裸露的幼稚的(无通过外源性移植物接受的肿瘤)小鼠中根据在实施例10中的方法进行研究。总体抗体和ADC的量的差异说明连接基团从其药物部分断裂且抗体从其药物部分分离。
缀合物的稳定性使用HPLC分析进行研究。将缀合物在pH 4和5.2的乙酸铵缓冲液中在37℃培养。然后周期性取出每份溶液并使用如上报道的方法应用到HPLC柱。从缀合物释放的物质的量被确定且以释放物质百分数表示。
体内效能
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的治疗作用以及与母体药物比较的它们的治疗效能的改善在人移植瘤的动物模型中进行评估。荷人肿瘤的异种移植物的小鼠用适当剂量的抗体-药物缀合物、PNU-159682游离药物和无修饰的抗体在某些剂量处理，并记录肿瘤生长且在不同处理组中比较。图30-32通过在小鼠中异种移植物肿瘤抑制显示式Ic的抗体-药物缀合物的效能。
可以根据实施例12的方法通过在啮齿类动物中植入癌细胞或原发性肿瘤的同种异体移植物或异种移植物并用ADC处理肿瘤而测量本发明的抗体-药物缀合物的功效。取决于细胞系、ADC与癌细胞上存在的受体的抗体结合特异性、给药方案和其它因素，预期结果是不同的。例如，抗HER2ADC的体内功效用高表达HER2转基因外植体(explant)小鼠模型测量。从Fo5 mmtv转基因小鼠繁殖同种异体移植物，所述Fo5 mmtv转基因小鼠对HERCEPTIN
治疗无反应或反应很弱。受试者用ADC处理一次，并监测3-6周，以测定肿瘤加倍时间、细胞杀伤对数和肿瘤缩小的时间。跟踪剂量-反应并进行多个剂量试验。
图30显示在第0天单次给药以下物质后，接种于CB17 SCID小鼠中的伯基特淋巴瘤Bjab-luc异种移植物肿瘤的体内平均肿瘤体积随时间的变化曲线：(1)媒介物，(2)硫基-抗-CD22(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 111 1mg/kg，(3)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 1mg/kg，(4)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 5mg/kg，(5)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 1mg/kg，(6)硫基-抗-CD22(HCA114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 5mg/kg，(7)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 103 1mg/kg，(8)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-腙-Ant 108 1mg/kg，(9)PNU-159682游离药物8.77ug/kg。所有抗-CD22缀合物(107，108和111)显示靶标特异性肿瘤生长抑制并且缩酮连接的抗-CD22ADC 107的抑制活性为剂量依赖性。游离药物PNU-159682和非靶标对照ADC(102和103)在等效剂量对肿瘤生长无作用。
表5显示在体内Bjab-luc异种移植物肿瘤效能研究中在第48天对于图30的每个测试化合物处理组的药物暴露水平、平均药物负载、肿瘤发生率和应答。Bjab-luc(EBV-阴性伯基特淋巴瘤，萤光素酶表达Bjab细胞)中硫表达CD22受体蛋白(Polson等人(2009)Cancer Res.69(6)：2358-2364；US2008/0050310；US 2005/0276812)。CD22仅在B细胞区室和大多数NHL细胞表面上表达(D’Arena等人(2000)Am J Hematol.64：275-81；Olejniczak等人(2006)Immunol Invest.35：93-114)。抑制作为模型***的小鼠Bjab-luc异种移植物肿瘤的效能可预测在治疗患有造血恶性肿瘤诸如非霍奇金淋巴瘤的患者中的临床应答。所有抗-CD22 ADC(107、108、111)相比于不与Bjab-luc细胞结合的媒介物和对照ADC(102和103)在肿瘤抑制中有效。对照ADC的活性的缺失说明观察的靶标ADC的活性是特异性的，例如，其不归因于游离药物的***性释放。在一些实例中，肿瘤不仅被抑制，而且被抗-CD22缀合物(107、108、111)部分且完全退化。这些数据说明抗-CD22表面抗原为针对本发明的蒽环类抗生素-衍生物ADC的潜在有效的靶标。
表5体内Bjab-luc异种移植物肿瘤效能研究(图30)
图31显示在第0天单次给药以下物质后，接种于CRL nu/nu小鼠中的MMTV-HER2 Fo5***同种异体移植物肿瘤的体内平均肿瘤体积随时间的变化曲线：(1)媒介物，(2)曲妥单抗-MCC-DM1 101 5mg/kg，(3)曲妥单抗-MCC-DM1 101 10mg/kg，(4)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 5mg/kg，(5)硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 10210mg/kg，(6)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 5mg/kg，(7)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 10mg/kg，(8)曲妥单抗-MCC-DM1 101 5mg/kg+硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102 5mg/kg。所有抗-Her2缀合物(101和102)显示靶标特异性肿瘤生长抑制且抑制活性为剂量依赖性。等效剂量的非靶标对照ADC 107对肿瘤生长无作用。
表6显示在体内MMTV-HER2 Fo5***同种异体移植物肿瘤效能研究中在第38天对于图31的每个测试化合物处理组的第7天肿瘤生长抑制、药物暴露水平、平均药物负载、肿瘤发生率和应答(Phillips等人(2008)Cancer Res.68(22)：9280-9290；US 2005/0276812)。MMTV-HER2 Fo5***同种异体移植物肿瘤为曲妥单抗-不敏感的，HER2-过表达乳腺癌细胞系。靶标的抗-HER2ADC(101、102以及101和102的组合)相比于不与MMTV-HER2 Fo5细胞结合的媒介物和对照ADC(107)在肿瘤抑制中为有效的。对照ADC的活性的缺失说明观察的靶标ADC的活性是特异性的，例如，其不归因于游离药物的***性释放。肿瘤不仅被抑制，而且被抗-HER2缀合物(101、102以及101和102的组合)部分且完全退化。曲妥单抗-MCC-DM1 101和硫基-曲妥单抗(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 102的组合显示除单一药物102之外无额外的应答。这些数据说明抗-HER2表面抗原为针对本发明的蒽环类抗生素-衍生物ADC的潜在有效的靶标。
表6体内MMTV-HER2Fo5***同种异体移植物肿瘤效能研究(图31)
图32显示在第0天单次给药以下物质后，接种于SCID-米色小鼠的LnCap-Ner异种移植物肿瘤的体内平均肿瘤体积随时间的变化曲线：(1)媒介物，(2)硫基-抗-steap 1(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112 1mg/kg，(3)硫基-抗-steap1(HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112 3mg/kg，(4)硫基-抗-steap1(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 113 1mg/kg，(5)硫基-抗-steap1(HCA114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 113 3mg/kg，(6)硫基-抗-steap1(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 113 6mg/kg，(7)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 1mg/kg，(8)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant107 3mg/kg，(9)硫基-抗-CD22(HC A114C)-马来酰亚胺-缩酮-Ant 107 6mg/kg。所有抗-steap1缀合物(112和113)显示靶标特异性肿瘤生长抑制且缩酮连接的抗-steap1 ADC 113的抑制活性为剂量依赖性。等效剂量的非靶标对照ADC 107对肿瘤生长无作用。
表7显示在体内LnCap-Ner异种移植物肿瘤效能研究中在第49天对于图32的每个测试化合物处理组的药物暴露水平、平均药物负载、肿瘤发生率和应答。Steap1(***的六-跨膜上皮细胞抗原)为在人***肿瘤高表达的***-特异性细胞表面抗原(Hubert等人(1999)PNAS 96(25)：14523-14528)。LnCap细胞系高表达steap1。小鼠中的LnCap-Ner异种移植物(Jin等人(2004)Cancer Res.64：5489-5495)肿瘤抑制研究可为针对治疗患者内***癌的有效的预测剂。靶标的抗-steap1 ADC(112和113)相比于不与LnCap细胞结合的媒介物和对照ADC(107)在肿瘤抑制中为有效的。对照ADC的活性的缺失说明观察的靶标ADC的活性是特异性的，例如，其不归因于游离药物的***性释放。肿瘤不仅被抑制，而且被抗-HER2缀合物(112和113)部分退化。这些数据说明抗-steap1表面抗原为针对本发明的蒽环类抗生素-衍生物ADC的潜在有效的靶标。
表7体内LnCap-Ner异种移植物肿瘤效能研究(图32)
啮齿类动物毒性
在急性毒性大鼠模型中(Brown等人(2002)Cancer Chemother.Pharmacol.50：333-340)且根据实施例11评估了抗体-药物缀合物和无ADC的对照“媒介物(vehicle)”。通过用ADC处理雌性Sprague-Dawley大鼠，随后观察和分析对多种器官的影响，如此研究了ADC的毒性。基于总的观察结果(体重)、临床病理学参数(血清化学和血液学)和组织病理学为基础，可以观察、鉴定和测定ADC的毒性。
在***雌性大鼠中的多天急性毒性研究可通过一种或多种剂量的候选ADC、对照ADC、游离蒽环类衍生物化合物(PNU-159682)和对照媒介物(第0天)实施。周期性测量体重。也周期性实施了临床化学、血清酶和血液学分析；由组织病理学评估的完全尸体解剖一起作结论。毒性信号包括体重损失的临床观察，认为关于给药ADC后仅给药媒介物的动物的体重损失或体重变化为***或局部毒性的总的一般指示剂。肝毒性可通过如下测量：(i)升高的肝酶诸如AST(天冬氨酸氨基转移酶)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、GGT(g-谷氨酰转移酶)；(ii)数目增加的有丝***和细胞凋亡征象；和(iii)肝细胞坏死。血液淋巴毒性通过如下观察：白细胞、主要粒细胞(嗜中性粒细胞)和/或血小板损耗，以及淋巴器官介入，即萎缩或凋亡活性。毒性也表现为胃肠道病变诸如有丝***和凋亡征象数的增加以及退化性肠炎(degenerative entercolitis)。
抗体-药物缀合物药物制剂的施用
治疗性抗体-药物缀合物(ADC)可以通过任何适合于所要治疗的病症的途径施用。典型地，肠胃外即输注、皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内、快速推注(bolus)、肿瘤内注射或硬膜外施用ADC(Shire等人(2004)J.Pharm.Sciences 93(6)：1390-1402)。治疗性抗体-药物缀合物(ADC)的药物制剂典型地随同药用肠胃外媒介物制备用于肠胃外施药，并且为可注射的单位剂量形式。具有所需纯度的抗体-药物缀合物(ADC)任选与药用稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合，可为冻干制剂或水溶液形式(Remington′s Pharmaceutical Sciences(1980)16th edition，Osol，A.Ed.)。
ADC可配制为具有药用载体或稀释剂的药物组合物。可使用任意适当的载体或稀释剂。适当的载体和稀释剂包括生理盐水溶液和Ringers葡萄糖溶液。
可接受的肠胃外媒介物、稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所用剂量和浓度对受试者来说是无毒的，其包括：(i)缓冲液诸如磷酸盐、枸橼酸盐、二碱式磷酸钙、硬脂酸镁和其它有机酸；(ii)抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；(iii)防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；(iv)烷基对羟基苯甲酸酯类如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；(v)低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；(vi)亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；(vii)氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；(viii)单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、淀粉羟乙酸钠、山梨醇甘露糖、羧甲基纤维素或糊精；(ix)螯合剂诸如EDTA；(x)形成盐的抗衡离子诸如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；(xi)非离子表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)；(xii)助流剂或制颗粒剂诸如硬脂酸镁、羧甲基纤维素、滑石、二氧化硅和氢化植物油；(xiii)崩解剂诸如交联聚维酮、淀粉羟乙酸钠或玉米淀粉；(xiv)增稠剂诸如明胶和聚乙二醇；(xv)肠溶包衣诸如枸橼酸三乙酯；和/或(xvi)味道或质地改性剂、消泡剂、色素和干燥剂。例如，WO 97/04801中描述了冻干的抗-ErbB2抗体制剂，此处特别加入作为参考。ADC的示例性制剂含有约100mg/ml的海藻糖(2-(羟基甲基)-6-[3，4，5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基-四氢吡喃-3，4，5-三醇；C12H22O11；CAS CAS第99-20-7号)和约0.1％TWEENTM 20(多山梨醇酯20；月桂酸2-[2-[3，4-二(2-羟基乙氧基)四氢呋喃-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙酯；C26H50O10；CAS第9005-64-5号)，pH约为6。
治疗性抗体-药物缀合物(ADC)的药物制剂可以含有一定量的不反应药物部分(D)、抗体-连接基团中间体(Ab-L)和/或药物-连接基团中间体(D-L)，其为ADC制备过程中过量试剂、杂质和副产品不完全纯化和分离；或为批量ADC存储过程中或制剂化ADC组合物存储过程中受时间/温度影响水解或降解的结果。例如，ADC制剂可以含有可检测量的游离药物。可替换地，或除此之外，其可以含有可检测量的药物-连接基团中间体。可替换地，或除此之外，其可以含有可检测量的抗体。例如，也可以通过凝聚技术或界面聚合将活性药物成分包装于所制备的微胶囊中，例如分别包装于羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，包装于胶状药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包装于宏乳液(macroemulsion)中。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980)。
可以制备缓释制品。适当的缓释制品的实例包括包含ADC的固态疏水性聚合物半透性基质，其中基质为成形颗粒产品形式的，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)或聚乙烯醇、聚交酯(US 3773919)、L-谷氨酸和gamma-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
所述制剂可以方便地以单位剂量形式提供，可以通过任何制药领域熟知的方法制备。技术和制剂通常可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)。这样的方法包括将活性成分与组成一种或多种辅助组分的载体结合的步骤。大体上，将活性成分与液态载体或细碎的固态载体或两者均一紧密地结合，然后，如有必要，将产品成形，由此制得所述制剂。
水混悬液包含与赋形剂混合的活性材料(ADC)，所述赋形剂适合于生产水混悬液。这样的赋形剂包括助悬剂，如羧甲基纤维素钠、交联羧甲纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和***树胶和分散或润湿剂如天然产生的磷脂(例如，卵磷脂)、环氧烷烃(ethylene oxide)与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七亚乙基氧基十六醇)、环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧化乙烯山梨醇单油酸酯)。水混悬液还可以包含一种或多种防腐剂如乙基或正丙基p-羟基-苯甲酸酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
ADC的药物组合物可以为无菌可注射制品形式的，如无菌可注射的水或油质混悬液。该混悬液可以按照已知技术，利用上面已经提到的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制。所述无菌可注射制品也可以为溶于无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂的无菌可注射溶液或混悬液，如溶于1，3-丁烷-二醇的溶液或制成冻干粉末。可用的可接受媒介物和溶剂为水、Ringer氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌非挥发油传统上可以用作溶剂或混悬介质。对于该目的，可以使用任何温和的非挥发油，包括合成的单或二脂酰甘油脂。此外，脂肪酸如油酸同样可用于可注射产品的制备。
可与载体材料组合以生产单一剂量形式的活性成分的量将根据所治疗的主体和特定施用方式而改变。例如，用于静脉内输注的水溶液可以包含每毫升溶液约3至500μg的活性成分，以便能够产生合适体积的约30mL/hr速率的输注。可以用约1.5ml或更小的总体积和约100mgADC每ml的浓度完成皮下(快速推注(bolus))施用。对于需要频繁并长期施用的ADC，可以使用皮下途径，如通过预填充的注射器或自动注射装置技术。
作为一般性建议，所施用的ADC每个剂量的药学上初始有效量将在约0.01-100mg/kg范围，即约0.1至20mg/kg患者体重每天，其中所用化合物的典型初始范围为约0.3至15mg/kg/天。例如，起初可以以约1.5mg ADC每kg患者体重为人类患者定量给药。所述剂量可以逐步升高到最大耐受剂量(MTD)。剂量给药方案可以为约每3周，但根据所诊断的病症或反应，所述方案可以更加频繁或更不频繁。在治疗过程中，所述剂量可以进一步调整到等于或低于MTD，其可以安全地多次循环施用，如约4次或更多次。
适合于肠胃外施药的制剂包括水和非水无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使所述制剂与欲受试者的血液等渗的溶质；和水和非水无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。
尽管通常不赞成口服蛋白质治疗剂，因为有限的肠道(gut)吸收、水解或变性导致低的生物利用度，但适合于口服的ADC制剂可以制备为分散的单位如均包含预先确定量的ADC的胶囊、扁囊剂或片剂。
所述制剂可以包装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和管形瓶中，可以保存在冷冻干燥的(冻干的)条件下，此条件只需要在马上要使用前添加无菌液态载体，例如水用于注射。即时注射液和混悬液从之前所述类型的无菌粉末、颗粒和药片制备。示例性单位剂量制剂包含活性成分的每日剂量或单位每日亚剂量(unit daily sub-dose)或其适当部分。
抗体-药物缀合物治疗方法
本发明的抗体-药物缀合物用作抗肿瘤剂。因此可通过如下方法治疗哺乳动物例如人或动物，所述方法包括对其给予药用有效量的如前定义的式1的缀合物。可按照此途径缓解或改善人或动物的病症。
式I的ADC可用于治疗多种疾病或紊乱，如癌症和自身免疫病症，其包括特征在于肿瘤相关抗原过表达的那些。示例性病症或紊乱包括良性或恶性肿瘤；白血病和淋巴恶性疾病；其它疾病如神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞(macrophagal)、上皮、基质、囊胚(blastocoelic)、炎性、血管新生和免疫学疾病。对ADC治疗敏感的癌症包括特征在于特定肿瘤相关抗原或细胞表面受体例如HER2过表达的那些癌症。
一种方法用于治疗哺乳动物癌症，其中所述癌症以ErbB受体的过表达为特征。所述哺乳动物任选对非缀合抗ErbB抗体治疗不反应，或反应微弱。所述方法包括为所述哺乳动物施用治疗有效量的抗体-药物缀合化合物。可抑制过表达生长因子受体的肿瘤细胞生长，所述生长因子受体诸如HER2受体或EGF受体，所述抑制包括为患者施用特异地结合所述生长因子受体的式I的ADC和化疗剂，其中所述抗体-药物缀合物和所述化疗剂分别以有效抑制患者肿瘤细胞生长的量施用。
可治疗对以ErbB2受体过表达为特征的病症敏感或被诊断为患有以ErbB2受体过表达为特征的病症的人类患者，其包括施用式I的ADC和化疗剂的组合。所述过度活化可能归因于ErbB受体或ErbB配体的过表达或生成增加。在一个实施方案中，将进行诊断或预后测试以测定患者的癌症是否以ErbB受体的过度活化为特征。例如，在癌症中可以确定ErbB受体的ErbB基因扩增和/或过表达。本领域有多种用于确定这种扩增/过表达的测定方法，包括上述的IHC、FISH和脱落抗原测定。
本申请待治疗的癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)和白血病或淋巴恶性疾病。这种癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症，包括胃肠癌、胃肠基质肿瘤(GIST)、胰腺癌、恶性胶质瘤、***、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾脏或肾癌、***癌、***癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、***癌、***癌，以及头颈癌。
为预防或治疗疾病，ADC的合适剂量将取决于如上定义的要治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用所述分子是否用于预防或治疗目的、以前的治疗、患者的病史和对所述抗体的反应，以及主治医师的判断。ADC制剂适于一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，无论是例如一次或多次单独施用、还是连续输注，施用于患者的初始候选剂量都是约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的ADC。根据上述因素，典型的每日剂量可为约1μg/kg至100mg/kg或更多。所要施用于患者的ADC的示例性剂量在约0.1至约10mg/kg患者体重范围内。对于几天或更长时间的重复施用，根据所述病症，所述治疗将一直持续到所需疾病症状得到所期望的抑制。示例性剂量给药方案包含施用约4mg/kg的初始加载剂量，之后每周约2mg/kg的ADC的维持剂量。也可以使用其它的给药方案。
联合治疗
抗体-药物缀合物(ADC)可以与第二种具有抗癌特性的化合物组合成药物组合制剂或组合为联合疗法的剂量给药方案。所述药物组合制剂或剂量给药方案的第二种化合物优选具有与组合中的ADC互补的活性，以免它们相互产生不利影响。
第二种化合物可以是化疗剂、细胞毒性试剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、芳化酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、脂质激酶抑制剂、抗雄激素、反义寡核苷酸、核酶、基因治疗疫苗、抗血管新生剂和/或心脏保护剂。这样的分子在组合药物中适合以对预定目标有效的量提供。含有ADC的药物组合物也可以具有治疗有效量的化疗剂如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合物。
可替换地，或除此之外，第二种化合物可以为结合或阻断肿瘤相关抗原或受体的配体活化的抗体。第二抗体可以与细胞毒性剂或化疗剂，例如大环的缩酚酸肽、auristatin、刺孢霉素或1，8二-萘酰亚胺部分缀合。例如，可能期望在一种制剂或剂量给药方案中进一步提供结合EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4或血管内皮因子(VEGF)的抗体。
组合治疗可以作为同时的或顺序的方案施用。当顺序施用时，所述组合可以在两次或多次施用中施用。联合施用包括同时施用，其利用分开的制剂或单个药物制剂，也包括以任何顺序顺序施用，其中优选有两种(或所有)活性试剂同时发挥其生物学活性的时期。
在一个实施方案中，用本发明的ADC治疗涉及组合施用本申请鉴定的抗癌剂和一种或多种化疗剂或生长抑制剂。这种化疗剂的制备和剂量给药方案可以依照厂商的说明使用，或依照熟练技术人员根据经验所确定的使用。Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，Md.(1992)中也描述了这种化疗剂的制备和剂量给药方案。
ADC可以与抗激素化合物组合；例如抗***化合物如他莫昔芬；抗***如奥那司酮(EP 616812)；或抗雄激素如氟他胺(flutamide)，其中以这些分子已知的剂量使用。在所要治疗的癌症为与激素无关的癌症中，所述患者可以事先已经接受抗激素治疗，并且，在癌症变得与激素无关之后，可以为患者施用抗ErbB2抗体(以及任选此处描述的其它试剂)。为患者共同施用心脏保护剂(以预防或减少与治疗相关的心肌机能障碍)或一种或多种细胞因子可能是有益的。除了上述治疗方法，可以对患者实施外科手术去除癌细胞，和/或实施放射疗法。
任何上述共同施用的试剂的合适剂量均为目前使用的那些剂量，并且，由于新鉴定的试剂和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同作用)，所述剂量可以有所降低。
所述组合治疗可以提供“协同作用”并证实有“协同作用的”，即当一同使用所述活性成分时所获得的效果大于分别用所述化合物获得的效果的总和。当所述活性成分：(1)共同配制并以组合的单位剂量制剂形式同时施用或递送；(2)作为不同的制剂交替或并行递送；或(3)通过其它一些方案施用时，可以获得协同效应。当以交替疗法递送时，顺序施用或递送化合物，例如通过在不同的注射器中分开注射时，可以获得协同效应。大体上，在交替治疗期间，顺序即连续施用有效剂量的各种活性成分，而在组合治疗中，有效剂量的两种或多种活性成分一起施用。
抗体-药物缀合物的代谢产物
本申请描述的ADC化合物的体内代谢产物也落入本发明的范围内，所述范围包括直至这样的产物是新的并且相对于现有技术是非显而易见的程度。这样的产物可以例如源于所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、酶学裂解等。相应地，本发明包括通过所述方法生产的新的和非显而易见的化合物，该方法包括将本发明的化合物与哺乳动物接触，所接触的时间足以产生其代谢产物。
可以通过制备放射性同位素标记的(例如14C或3H)ADC，以可检测剂量(例如大于约0.5mg/kg)将其肠胃外施用于动物如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子或施用于人，提供代谢足以发生的时间(典型地约30秒至30小时)并从尿、血液或其它生物样品分离其转化产物来鉴定代谢产物。这些产物很容易分离，因为它们是经标记的(其它的通过利用能够结合代谢物中存留的表位的抗体来分离)。以常规方式测定代谢物结构例如通过MS、LC/MS或NMR分析。大体上，代谢物的分析以与本领域技术人员熟知的传统药物代谢研究相同的方式完成。所述转化产物，只要它们未在体内发现，就可用于ADC化合物治疗给药的诊断测试中。
代谢物包括ADC体内裂解的产物，其中裂解发生在将药物部分连接到抗体的任何键。因此代谢性裂解能够产生裸抗体(naked antibody)或抗体片段。抗体代谢物可以连接到连接基团的一部分或整个连接基团。代谢性裂解也可能导致产生药物部分(drug moiety)或该药物部分的一部分。药物部分的代谢物可以连接到连接基团的一部分或整个连接基团。
制品
在另一实施方案中，提供了含有ADC和用于治疗上述紊乱的材料的制品或“试剂盒”。所述制品包含容器或和容器上的或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、管形瓶、注射器或薄膜包装。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料构成。所述容器装有治疗所选病症有效的抗体-药物缀合物(ADC)组合物，可以具有无菌存取口(例如，所述容器可以为静脉内溶液袋或管形瓶，所述管形瓶具有可用皮下注射针穿透的塞子)。组合物中至少一种活性试剂是ADC。标签或包装说明书指明所述组合物用于治疗所选病症如癌症。
在一个实施方案中，所述制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药用缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液，以及指明第一种和第二种化合物可用于治疗癌症的包装说明书。其可以进一步包括从商业和用户的观点来看所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
实施例
根据下述实施例制备的本发明化合物通过HPLC/MS分析数据表征；HPLC/MS数据按照方法1、2中的任意一种收集。
HPLC/MS分析方法1
Waters 2795 Alliance HT HPLC***配备有2996Waters PDA检测器和Micromass mod。ZQ单一四极质谱仪配备有电喷射(ESI)离子源。仪器控制、数据采集和数据处理由Empower和MassLynx 4.0软件提供。HPLC在30℃在1.0mL/min的流速使用C18，3微米Phenomenex(4.6x 50mm)柱进行。流动相A为乙酸铵5mM pH 5.2缓冲液与乙腈(95∶5)，且流动相B为H2O/乙腈(5∶95)；梯度为8分钟的10至90％B然后变为1.0分钟的100％B。注射体积为10μL。质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压设置在3.5KV(ES+)和28V(ES-)；源温度为120℃；锥电压为14V(ES+)和2.8KV(ES-)；全扫描、质量范围为100至1000m/z。
HPLC/MS分析方法2
Waters 2795HPLC***配备有996Waters PDA检测器和Micromass mod。ZQ单一四极质谱仪配备有电喷射(ESI)离子源。仪器控制、数据采集和数据处理由Empower和MassLynx 4.0软件提供。HPLC在30℃在1mL/min的流速使用RP18 Waters X Terra(4.6μM x 50mm)柱进行。流动相A为氢氧化铵0.05％pH＝10缓冲液与乙腈(95∶5)，且流动相B为H2O/乙腈(5∶95)；梯度为8分钟的10至90％B然后变为2分钟的100％B。注射体积为10μL。质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压设置在2.5KV；源温度为120℃；锥电压为10V；全扫描、质量范围为100至1000m/z。
实施例1N-甲基-2-[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰胺(化合物2)
步骤1中间体[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酸乙酯45的合成
在氮气下向(8S，10S)-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮(50mg，0.078mmo1)[PNU-159682，化合物IIA，如在WO 9802446中报道的制备]在2ml无水二甲基甲酰胺中的溶液中加入(环己-1-烯基氧基)-乙酸乙酯(0.5mL)[如在J.Org.Chem.(1978)43：1244-1245中报道的制备]和对甲苯磺酸一水合物(5mg，0.026mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，加入碳酸氢钠饱和溶液(20mL)并将产物用二氯乙烷(2x 20mL)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，将溶剂真空除去并将残留物经快速色谱法部分纯化(DCM/MeOH 97.5∶2.5)得到30mg(37％)酯中间体，其在步骤2中如原样使用。MS(ESI)：826[M+H]+。保留时间＝7.48分钟。方法2
步骤2中间体[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酸46的合成
向30mg 45中加入5mL 0.1N NaOH。将混悬液在5℃冷却并在氩气下搅拌3小时。用10％乙酸水溶液使水溶液变为
且用二氯乙烷(2x 10mL)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，将溶剂真空除去并将残留物经快速色谱法纯化(DCM/MeOH 90∶10)得到5mg(y＝8％，2步)酸中间体46，其为红色固体。MS(ESI)：798[M+H]+。保留时间＝3.94分钟。方法2
步骤3中间体1-({[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮47的合成
在+5℃向酸中间体46(4mg，0.005mmol)在无水二氯乙烷(2mL)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(2mg，0.017mmol)和N，N′-二环己基碳二亚胺(2mg，0.01mmol)。将溶液在室温搅拌6小时，将溶剂真空蒸发并将残留物用***(5mL)处理。将混悬液搅拌30分钟，将固体经过滤除去并将有机溶液真空浓缩。将粗物质经快速色谱法纯化(DCM/丙酮80∶20)得到1.5mg(y＝33％)47，其为红色固体。MS(ESI)：895[M+H]+。保留时间＝3.22分钟。方法1。
步骤4标题化合物2的合成
向由步骤3得到的47(1mg，0.001mmol)在无水四氢呋喃(2mL)中的溶液中加入1M甲胺在THF(3μL，0.003mmol)中的溶液。将溶液在室温搅拌30分钟，将溶剂真空蒸发并将残留物经快速色谱法纯化(二氯乙烷/甲醇90∶10)得到0.9mg(y＝99％)2，其为红色固体。MS(ESI)：811[M+H]+。保留时间＝6.10分钟，方法2。保留时间＝5.99分钟，方法1。
通过类似方法并使用适当的起始物质制备下述化合物化合物：
2-[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰胺(化合物1)MS(ESI)：887[M+H]+。保留时间＝5.86分钟。方法2
N-苄基-2-[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰胺(化合物3)MS(ESI)：797[M+H]+。保留时间＝7.16分钟。方法2
N2-(叔丁氧基羰基)-N6-{[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰基}-L-赖氨酸(化合物4)MS(ESI)：1026[M+H]+。保留时间＝5.26分钟，方法1；保留时间＝4.64分钟，方法2
实施例2N-甲基-2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺(化合物7)
步骤1中间体：(3，4-二氢-2H-吡喃-2-基甲氧基)乙酸乙酯的合成
在干燥的圆底烧瓶中在氩气气氛下将60％氢化钠(240mg，6.0mmol)用无水正戊烷淋洗三次。将2-羟基甲基-3，4-二氢-2H-吡喃(570.8mg，5mmol)在四氢呋喃(10ml)中的溶液在0℃冷却然后加入至NaH中。将反应混合物在0℃搅拌直到氢气释放结束。将溴乙酸乙酯(1253mg，7.5mmol)在四氢呋喃(6ml)中的溶液加入至反应混合物中并在室温继续搅拌直到起始醇消失(TLC分析)。冷却后，加入H2O，并将溶剂减压蒸发。将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(AcOEt∶己烷＝1∶12)得到626mg(收率为57％)的(3，4-二氢-2H-吡喃-2-基甲氧基)乙酸乙酯，其为无色油状物；1H NMR(401MHz，DMSO-d6)δppm 1.18-1.23(m，3H)3.55-3.59(m，2H)3.93(m，J＝10.08，5.11，5.11，2.38Hz，1H)4.13(q，J＝7.07Hz，2H)4.14(s，2H)4.67(dddd，J＝6.14，4.83，2.56，1.34Hz，1H)6.36(dt，J＝6.13，1.75Hz，1H)。
步骤2中间体：[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酸乙酯48的合成
在氩气气氛下向(8S，10S)-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮(50mg，0.078mmol)[PNU-159682，式IIA，如在WO 9802446中报道的制备]在4ml无水二氯乙烷中的溶液中加入由步骤1得到的(3，4-二氢-2H-吡喃-2-基甲氧基)乙酸乙酯(118.5mg，0.592mmol)和无水对甲苯磺酸(22.3mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时，直到检测不到起始物质(TLC分析，MeOH∶CH2Cl2＝0.3∶9.7)。然后将碳酸氢钠10％水溶液加入至反应混合物中并将水相用二氯乙烷(4x 20ml)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(MeOH∶CH2Cl2＝0.3∶9.7)得到41mg(红色蜡状物，收率为62％)的48，其为四个非对映异构体的混合物。MS(ESI)：842[M+H]+。保留时间＝7.47，7.83分钟(方法2)。
步骤3中间体：[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酸49的合成
将由步骤2得到的乙酯中间体48(40mg，0.0475mmol)在0℃冷却，在氩气下用0.1N氢氧化钠水溶液(1.5ml)处理。将反应混合物在0℃搅拌2小时。反应过程通过反相HPLC-MS监测。之后，用10％乙酸水溶液使反应混合物变为并用水饱和的正丁醇(8x 10mL)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并将溶剂真空除去。将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(MeOH∶CH2Cl2＝1∶9)得到4.5mg(红色固体，收率为12％)的49，其为非对映异构体混合物。MS(ESI)：814[M+H]+。保留时间＝2.99，3.50，3.66分钟(方法2)。保留时间＝4.24分钟(方法1)。
步骤4中间体：1-({[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮50的合成
向在0℃冷却的由步骤3的方法得到的酸中间体49(2mg，0.0024mmol)在无水二氯乙烷(1ml)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1mg，0.00792mmol)和N，N′-二环己基碳二亚胺(1mg，0.004556mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2.5小时，直到起始物质消失(HPLC-MS分析)。将溶剂真空蒸发并将残留物用***(2x 4ml)处理。将混悬液搅拌10分钟，将固体经过滤除去并将有机溶液真空浓缩，得到2mg的50(红色固体)，其为非对映异构体的混合物。MS(ESI)：911[M+H]+。保留时间＝6.12，6.30，6.42分钟(方法1)。
步骤5标题化合物7
向由步骤4的方法得到的50(1mg，0.0011mmol)在无水二氯乙烷(100μL)中的溶液中加入2.0M甲胺在THF(65μL，0.0033mmol)中的溶液。将溶液在室温搅拌4小时直到检测不到起始物质(HPLC-MS分析)，并将溶剂真空蒸发。将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(MeOH∶CH2Cl2＝0.3∶9.7)得到0.46mg(红色固体，收率为51％)的7，其为非对映异构体的混合物。MS(ESI)：827[M+H]+。保留时间＝5.34，5.54，5.66分钟(方法1)。
通过类似方法并使用适当的起始物质制备下述化合物：
2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺(化合物6)MS(ESI)：813[M+H]+。
保留时间＝5.42分钟(方法2)。
N-苄基-2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺(化合物8)MS(ESI)：903[M+H]+。
保留时间＝6.92分钟(方法1)。保留时间＝6.94分钟(方法2)。
实施例3N-乙酰基-3-({3-[(2E)-2-{2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}肼基]-3-氧代丙基}二硫基)-L-丙氨酸(化合物12)。
步骤1N′-{(1E)-2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}-3-(吡啶-2-基二硫基)丙烷酰肼53
将3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酰肼盐酸盐(41.5mg，0.156mmol)在无水甲醇(5ml)中的溶液加入至(8S，10S)-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮[PNU-159682，化合物IIA，如在WO 9802446中报道的制备](50mg，0.078mmol)中。将溶液避光在室温搅拌20小时。反应过程通过反相HPLC-MS监测。之后，将溶剂蒸发并将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(MeOH∶CH2Cl2＝0.2∶9.8)得到18mg(收率为27％)的53。MS(ESI)：853[M+H]+。保留时间＝5.52分钟(方法2)。
通过类似方法并使用适当的起始物质制备下述化合物：6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N′-{(1E)-2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}己烷酰肼52。MS(ESI)：849[M+H]+。保留时间＝5.15分钟(方法2)。
步骤2向由步骤1得到的53(8.5mg，0.01mmol.)中加入N-乙酰基半胱氨酸(0.32mg，0.02mmol)。将溶液在室温搅拌24小时，将溶剂蒸发并将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(MeOH∶CH2Cl2＝2∶8)得到7.2mg(收率为80％)的12，其为红色固体。MS(ESI)：905[M+H]+。保留时间＝3.62分钟(方法2)。
通过类似方法并使用适当的起始物质制备下述化合物：
N-乙酰基-S-(1-{6-[(2E)-2-{2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}肼基]-6-氧代己基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸(化合物9)。MS(ESI)：1012[M+H]+。
N2-(叔丁氧基羰基)-N6-(1-{6-[(2E)-2-{2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}肼基]-6-氧代己基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-赖氨酸(化合物10，表1)MS(ESI)：1095[M+H]+。
实施例3a(2S，4S)-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-甲酰胺54的制备
向如在WO 98/02446中报道的制备的PNU-159682(15.3mg，0.02038mmol)在3ml甲醇和2ml H2O中的溶液中加入NaIO4(5.1mg，0.0238mmol)在1ml H2O中的溶液。将反应混合物在室温搅拌3小时，直到检测不到起始物质(TLC和HPLC分析)。将溶剂减压除去并且粗红色固体(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-羧酸56无需进一步纯化即可在下一步中使用。MS(ESI)：628[M+H]+。保留时间＝2.1-3.2分钟(方法1，实施例3b)。
在氩气气氛下向粗中间体56(4.4mg)在无水二氯乙烷(1.5ml)中的溶液中加入无水三乙胺(2.2mg，0.0204mmol)、TBTU(4.4mg，0.01388mmol)和可商购得到的三氟乙酸N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐(3.6mg，0.00694mmol)。将反应混合物在室温搅拌30分钟，直到起始物质消失(HPLC-MS分析)。将溶剂真空蒸发然后将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(EtOH∶CH2Cl2＝0.2∶9.8)得到1.1mg(红色固体，对于PNU-159682计算的收率＝21％)的54。MS(ESI)：750[M+H]+。保留时间＝5.18分钟(方法1，实施例3b)。
实施例3bN-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰]-L-缬氨酰-N5-氨基甲酰-N-[4-({[(4-{[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]羰基}哌嗪-1-基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺55的制备
步骤1在氩气气氛下在室温将碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯·4-硝基苯基酯58(30mg，0.041mmol)与哌嗪-1-羧酸叔丁酯(5.3mg，0.0287mmol)在无水DMSO中的溶液反应(图7d)。将反应混合物搅拌1小时，直到起始物质消失(HPLC-MS分析)。然后将***(80ml)加入至反应混合物中并因此将得到的沉淀物经过滤收集得到N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰]-L-缬氨酰-N-{4-[({[4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨基甲酰-L-鸟氨酰胺59，其为黄色固体(22.0mg)，将其分离并且其无需进一步纯化即可在下一步中使用。MS(ESI)：785[M+H]+。保留时间＝4.87分钟(方法1)。
步骤2将中间体59(22.0mg)用三氟乙酸(327mg，2.87mmol)在无水二氯乙烷(0.12ml)中的溶液处理。反应混合物在室温搅拌15分钟，直到起始物质消失(HPLC-MS分析)。之后，将反应混合物用***(20ml)处理并因此将得到的残留物用***(2x 10ml)淋洗：产物N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰]-L-缬氨酰-N5-氨基甲酰-N-(4-{[(哌嗪-1-基羰基)氧基]甲基}苯基)-L-鸟氨酰胺60(白色蜡状物，20.0mg)，因此将其分离并且其无需进一步纯化即可在下一步中使用。MS(ESI)：685[M+H]+。保留时间＝2.97分钟(方法1)。
步骤3向中间体60(13.2mg)中加入粗物质(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-羧酸56(9.3mg)在无水二氯乙烷(2.6ml)中的溶液、TBTU(5.3mg，0.0165mmol)和无水三乙胺(2.8mg，0.0275mg)。将反应混合物在氩气气氛下在室温搅拌15分钟，直到起始物质消失(HPLC-MS分析)。然后将溶剂真空蒸发并将粗物质在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(EtOH∶AcOEt＝1.5∶8.5)得到4.8mg(红色固体，对于PNU-159682计算的收率＝34％)的55。MS(ESI)：1295[M+H]+。保留时间＝5.51分钟(方法1)。
化合物通过HPLC/MS分析数据表征；HPLC/MS数据按照方法1或2中任意一种收集。
HPLC/MS分析方法1：HPLC仪器由配备有2996Waters PDA检测器和Micromass mod的Waters 2795Alliance HT***构成。ZQ单一四极质谱仪配备有电喷射(ESI)离子源。仪器控制、数据采集和数据处理由Empower和MassLynx 4.0软件提供。HPLC在30℃在1.0mL/min的流速使用Waters X Terra MS C18-3.5μM (4.6x 50mm)柱进行。流动相A为乙酸铵5mM pH＝5.2缓冲液与乙腈(95∶5)，且流动相B为H2O/乙腈(5∶95)；梯度为8分钟的10至90％B然后变为1.0分钟的100％B。质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压设置在3.5KV(ES+)和28V(ES-)；源温度为120℃；锥电压为14V(ES+)和2.8kV(ES-)；全扫描、质量范围设置为100至1000m/z。
HPLC/MS分析方法2：HPLC仪器由配备有996Waters PDA检测器和Micromass mod的Waters 2795HPLC***构成。ZQ单一四极质谱仪配备有电喷射(ESI)离子源。仪器控制、数据采集和数据处理由Empower和MassLynx 4.0软件提供。HPLC在30℃在1mL/min的流速使用RP18 Waters X Terra(4.6μM x 50mm)柱进行。流动相A为氢氧化铵0.05％pH＝10缓冲液与乙腈(95∶5)，且流动相B为H2O/乙腈(5∶95)；梯度为8分钟的10至90％B然后为2分钟的100％B。质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压设置在2.5kV；源温度为120℃；锥电压为10V；全扫描、质量范围设置为100至1000m/z。
实施例3c(8S，10S)-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-8-(哌嗪-1-基羰基)-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮57的制备
在氩气气氛下向56(9mg)在无水二氯乙烷(5ml)中的溶液中加入无水三乙胺(1.6mg，0.0158mmol)、哌嗪(3.6mg，0.0424mmol)、HOBt(2.1mg，0.0158mmol)和EDC(3.0mg，0.0158mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将溶剂真空蒸发然后将残留物在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(DCM/MeOH/AcOH/H2O 45/4/1/0.5)。将得到的产物在DCM中溶解并用饱和NaHCO3(x2)和水(x2)洗涤。将有机溶剂真空蒸发得到5.0mg的57。MS(ESI)：696[M+H]+。保留时间＝4.01分钟(方法1，实施例3b)。
实施例3dN-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6-亚甲基-11-氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺51的制备
在氩气气氛下向粗中间体50(103.8mg)在无水二氯乙烷(29.7ml)中的溶液中加入可商购得到的三氟乙酸N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐(57.9mg，0.228mmol)和无水三乙胺(23.1mg，0.228mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，直到起始物质消失(HPLC-MS分析)。将溶剂真空蒸发并将残留物用Et2O/n-己烷混合物(1ml/20ml)淋洗。然后将粗物质在硅胶(230-400目筛)上经快速柱色谱法纯化(EtOH∶CH2Cl2＝0.2∶9.8)得到12.2mg(红色固体，对于PNU-159682计算的收率＝20％)的51，其为非对映异构体混合物。MS(ESI)：936[M+H]+。保留时间＝5.86，根据下述方法：
Waters 2795 Alliance HT***配备有2996Waters PDA检测器和Micromass mod。ZQ单一四极质谱仪配备有电喷射(ESI)离子源。仪器控制、数据采集和数据处理由Empower和MassLynx 4.0软件提供。HPLC在30℃在1.0mL/min的流速使用Waters X Terra MS C18-3.5μM (4.6x 50mm)柱进行。流动相A为乙酸铵5mM pH＝5.2缓冲液与乙腈(95∶5)，且流动相B为H2O/乙腈(5∶95)；梯度为8分钟的10至90％B然后变为1.0分钟的100％B。质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压设置在3.5KV(ES+)和28V(ES-)；源温度为120℃；锥电压为14V(ES+)和2.8kV(ES-)；全扫描、质量范围设置为100至1000m/z。
实施例4如在表1中鉴定的MCM2缀合物化合物5的制备
将MCM2(10-294)蛋白[Ishimi等人(2001)Jour.Biol Chem.276(46)：42744-42752](1.5mg，0.045μmol)在0.5ml磷酸盐缓冲盐水溶液(pH 7.2)中溶解，通过加入55μl 1M NaHCO3(pH 8.5)将pH值调节为8.5，并由10mg/ml乙腈溶液加入0.5mg 1-({[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(0.55μmol)[如在实施例1步骤3中报道的制备]。将反应混合物在室温培养1小时然后将反应混合物在NAP-10柱上在磷酸盐缓冲盐水溶液中除去盐分并将含有蛋白的馏分收集并合并。
反应蛋白经SDS PAGE分析，与如上报道的不反应的MCM2和不同量的1-({[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮比较。
通过类似方法并使用适当的起始物质制备下述化合物(表1)：MCM2缀合物化合物11；MCM2缀合物化合物13；MCM2缀合物化合物14。
实施例5缀合物的稳定性：一般方法
向0.5mg缀合物中加入乙酸铵5mM pH＝5.2缓冲溶液(200mL)。将溶液在37℃温热并周期性取出样品且经HPLC分析(方法2)。结果表示为由缀合物释放的物质(8S，10S)-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮(化合物IIA)的百分数。
也通过类似方法，使用乙酸铵5mM pH＝4.5缓冲溶液确定pH 4.5时的稳定性。
通过类似方法，在四小时培养后，在化合物12(表1)上进行的稳定性结果显示(8S，10S)-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-10-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮(化合物IIA)在pH 5.2缓冲溶液中由缀合物的90％释放以及在pH 4.2缓冲溶液中的100％释放。
实施例6通过还原和再氧化制备用于缀合的半胱氨酸修饰的抗体
轻链和重链氨基酸根据Kabat编号(Kabat等人.，Sequences of proteins of immunological interest，(1991)5th Ed.，US Dept of Health and Human Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)。使用单字母氨基酸缩写。
CHO细胞表达的全长半胱氨酸修饰的单克隆抗体(ThioMabs)带有半胱氨酸加合物(胱氨酸)或在修饰的半胱氨酸上被谷胱甘肽化，这归因于细胞培养条件。为了释放修饰的半胱氨酸的硫醇基，将ThioMabs在约pH 8.0在500mM硼砂和500mM氯化钠中溶解并在37℃用约50-100倍过量的1mMTCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；Getz等人(1999)Anal.Biochem.273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)还原约1-2小时。可替换地，DTT可用作还原剂。链间二硫键的形成通过非还原SDS-PAGE或通过变性反相HPLC PLRP柱色谱法进行检测。将还原的半胱氨酸修饰的抗体稀释并载入至HiTrap S柱上10mM乙酸钠(pH 5)中，并用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。将洗脱出的半胱氨酸修饰的抗体(ThioMab)用pH 7的2mM脱氢抗坏血酸(dhAA)处理3小时，或用2mM硫酸铜水溶液(CuSO4)在室温处理过夜。环境空气氧化也可为有效的。通过在Sephadex G25树脂上洗脱交换缓冲液并用具有1mM DTPA的PBS洗脱。硫醇/Ab值如下检验：通过由溶液的280nm的吸光度确定还原的抗体浓度并且通过与DTNB的反应(Aldrich，Milwaukee，WI)且确定412nm的吸光度来确定硫醇浓度。
液相色谱法/质谱分析在具有扩大的质量范围的TSQ Quantum Triple四极质谱仪(Thermo Electron，San Jose California)上进行。样品在加热至75℃的PRLP-S，1000A微孔柱(50mm×2.1mm，Polymer Laboratories，Shropshire，UK)上进行色谱测定。使用30-40％B的线性梯度(溶剂A：0.05％TFA在水中，溶剂B：0.04％TFA在乙腈中)并使用电喷射源将洗脱剂直接离子化。通过Xcalibur数据***采集数据并使用ProMass(Novatia，LLC，New Jersey)进行重叠合法(deconvolution)。在LC/MS分析前，将抗体或抗体-药物缀合物(50μg)用PNGase F(2单位/ml；PROzyme，San Leandro，CA)在37℃处理2小时以除去N-连接的糖类。
将疏水作用色谱(HIC)样品注射到Butyl HIC NPR柱(2.5μm，4.6mm×3.5cm)(Tosoh Bioscience)上并用0至70％B的线性梯度以0.8ml/min的流速洗脱(A：1.5M硫酸铵在50mM磷酸钾中的溶液，pH 7，B：50mM磷酸钾pH 7，20％异丙醇)。Agilent 1100series HPLC***配备有多波长检测器且Chemstation软件用于解析和通过每抗体上不同比例的药物来定量抗体类别。
实施例7抗体和蒽环类衍生物药物-连接基团中间体的缀合
一般地，抗体和蒽环类衍生物药物-连接基团中间体根据以下的方法缀合：US 7521541；US 7498298；US 2005/0276812；US 2008/0311134；和提交于2009年1月16日的″NEMORUBICIN AND ANALOG ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND METHODS″，PCT/US2009/031199，将其各自通过引用的方式并入本申请。
通过凝胶荧光检测的缀合物量化分析使用ProXpress基于CCD的扫描仪(PerkinElmer)进行。仪器激发和发射滤光片分别设置在480/30nm和590/35nm。量化分析使用Profinder软件进行，所述软件由利用不同量的载入至硅胶上的起始物质作为标准的仪器提供。然后通过Coomassie Blue蛋白染色评价总体载入的蛋白。
实施例8半胱氨酸修饰的抗体和马来酰亚胺药物-连接基团中间体的缀合
在实施例6的还原和再氧化操作后，将半胱氨酸修饰的抗体在PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中溶解并在冰上冷却。将相对于具有硫醇-反应活性官能团(诸如：吡啶-二硫化物，例如药物-连接基团中间体53；或溴-乙酰氨基和马来酰亚胺，例如药物-连接基团中间体51和52)的蒽环类衍生物上的修饰半胱氨酸/抗体的约1.5摩尔浓度等价物在DMSO中溶解，在乙腈和水中稀释，并将其加入至冷却的还原的、再氧化的抗体在PBS中的溶液中。约1小时后，加入过量的马来酰亚胺以淬灭反应混合物并封闭任意未反应的抗体硫醇基。通过离心超滤将反应混合物浓缩并将半胱氨酸修饰的抗体-药物缀合物纯化并通过经G25树脂在PBS中洗脱除去盐分，在无菌条件下经0.2μm滤器过滤，并冷冻贮存。
通过上述操作，制备半胱氨酸修饰的抗体药物缀合物：102、103、104、105、106、107、108、109、111、112和113(表2)。每个包含抗体-药物缀合物的半胱氨酸修饰的抗体102、103、104、105、106、107、108、109、111、112和113为重链(HC)A114C(Kabat)半胱氨酸修饰的突变体(US 7521541)。对于曲妥单抗抗体，经Kabat编号方案的A114C突变体与经EU编号方案的A118C突变体和经Sequential编号方案的A121C突变体相同。
具有马来酰亚胺己酰基(MC)、缬氨酸-瓜氨酸(vc)、对氨基苄基氧基氨基甲酰基(PAB)和auristatin药物(MMAE)药物-连接基团部分(106、111和112)的半胱氨酸修饰的抗体药物缀合物通过如下的方法制备：US 2008/0311134的实施例3和US 7498298的实施例27和29，将其通过引用的方式并入本申请，其中药物-连接基团中间体MC-vc-PAB-MMAE为：
实施例9体外细胞增殖测定
肿瘤细胞系乳腺癌BT-474、SKBR-3和MCF7由American Type Culture Collection得到。
抗体-药物缀合物的体外效能通过细胞增殖测定测量(图8-29)。
Luminescent Cell Viability Assay是可商购得到的(Promega Corp.，Madison，WI)均相测定(homogeneous assay)方法，其以鞘翅目(Coleoptera)荧光素酶的重组表达为基础(US 5583024；US 5674713；US 5700670)。该细胞增殖测定以所存在的ATP的定量为基础测定培养物中的活细胞数目，ATP为代谢活性细胞的指示剂(Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；US6602677)。
测定在96孔板中实施，使之易于进行自动化高通量筛选(HTS)(Cree(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404)。同相测定方法涉及直接将单一试剂(
Reagent)添加到培养在补充有血清的培养基中的细胞。
均相″添加-混合-测量″的形式导致细胞裂解，并产生与所存在的ATP的量成正比的发光信号。底物Beetle荧光素由重组萤火虫荧光素酶氧化脱羧，同时伴随ATP转化为AMP并产生光子。以相对光单位(RLU)反射存活的细胞。可以用光度计或CCD照相机成像装置记录数据。以相对光单位(RLU)提供荧光输出，其随着时间的推移而测定。可替换地，来自荧光的光子可在闪烁计数器中在闪烁体的存在下进行计数。然后光单位可表示为每秒的CPS-计数。
ADC的效能通过细胞存活力测定使用下述操作进行测量，所述操作根据CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega Corp.Technical Bulletin TB288 and Mendoza等人(2002)Cancer Res.62：5485-5488修改：
1.将在培养基中的含有约1000或更多细胞(包括HER2-表达和CD22-表达细胞)的50μl细胞培养液的等分部分置于96孔、不透明壁、透明底部的板的每孔中。
2.将ADC(50μl)加入至三份实验孔中以得到10μg/mL的终浓度，其中″无ADC″对照孔只接受培养基，且培养3天或3天以上。
3.将板平衡至室温且保持约30分钟。
4.加入CellTiter-Glo试剂(100μl)。
5.将内容物在定轨摇床上混合2分钟以诱导细胞裂解。
6.将板在室温培养10分钟以使荧光信号稳定。
7.记录荧光并以图报道：RLU＝相对荧光单位。
实施例10药动学-血清清除率和稳定性
在单次静脉内推注给药至Sprague-Dawley大鼠后，抗体-药物缀合物的体内分布通过测量抗体和药物缀合物的血清浓度进行分析。带有至少一种细胞毒性药物的抗体-药物缀合物的浓度用ELISA测量，所述ELISA使用用于捕获的胞外域(ECD)和用于检测的抗-蒽环类抗生素和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-小鼠Fc抗体。血清中的总抗体浓度用ELISA测量，所述ELISA使用测量抗体的用于捕获的ECD和用于检测的抗-人-Fc HRP，所述两者均具有且不具有缀合的蒽环类衍生物。来自每个动物的血清浓度-时间数据使用具有IV推注输入、一级消除和大比例常数的二室模型(Model 8，WinNonlin Pro v.5.0.1，Pharsight Corporation，Mountain View，CA)进行分析。
实施例11动物毒性
在***雌性大鼠(100-125克)中的12天急性毒性研究通过在第一天单次注射约1-10mg/kg的抗体-药物缀合物和对照媒介物来实施。注射检品以静脉内推注典型地给药。每日测量体重。周期性实施临床化学、血清酶和血液学分析。毒性信号包括体重损失的临床观察。
实施例12肿瘤生长抑制，体内效能小鼠模型
实施所有动物研究符合NIH保护方针和实验动物使用且通过Institutional Animal Care和Use Committee at Genentech批准。
效能研究使用SCID小鼠(Charles River Laboratories)实施。针对在图30-32中示例说明的研究的效能模型如下所述的使用(Polson等人(2009)Cancer Res.69(6)：2358-2364；Phillips等人(2008)Cancer Res.68(22)：9280-9290；US 2008/0050310；US 2005/0276812)，在单次静脉内给药后评价肿瘤体积。移植物模型使用由荷腹膜内瘤的小鼠切除的肿瘤，然后连续传代至受试小鼠内。例如，将接种细胞洗涤并在HBSS(Hyclone)中混悬且经皮下以0.2mL/小鼠的体积接种于雌性CB17ICR重度联合免疫缺陷症小鼠(来自Charles Rivers Laboratories的7-16周龄小鼠)的侧腹中。为了测试抗体药物缀合物的体内效能，对每只SCID小鼠一次接种约几百万个细胞并在注射后允许生长约10至60天。当肿瘤体积达到150-200mm3(典型地在接种后第14至21天)时，将小鼠分开至样品组中，每组9-10只小鼠，并确定每只小鼠的肿瘤体积。当肿瘤体积达到预期体积时，将小鼠分组，每组8至10只小鼠，其具有相同平均肿瘤大小，且经尾静脉静脉内给予下述样品：ADC、抗体或媒介物。将ADC剂量测量为每单位小鼠体表面积的缀合的细胞毒性小分子药物的质量，或测量为每单位小鼠质量的ADC恒定质量(例如每千克小鼠5mg ADC)。一般地，在任意给定的实验中负载至抗体上的药物为相似的或标准化的，因此可认为这两种测量相同。使用测径器根据下式测量肿瘤体积：V(mm3)＝0.5AX B2，其中A和B分别为长径和短径。在肿瘤体积达到3000mm3时或当肿瘤显示即将溃疡的迹象时将小鼠实施安乐死。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。
Claims (55)
1.式(I)或式(I’)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐
[Ant-L-Z-]m-T (I)
Ant-L-Z-Q (I’)
其中
Ant为蒽环类衍生物残基，
L为连接基团，
Z为间隔基团，
m为1至30的整数，
T为选自下述的载体：蛋白质、肽、单克隆抗体或多克隆抗体或适于与一个或多个[Ant-L-Z-]部分连接的上述物质的化学修饰衍生物，或聚合物载体，且
Q为氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、苯基或苄基；
且所述Ant可被释放得到式(II)的蒽环类衍生物或其药用盐
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基且R2为C1-C5烷氧基。
2.根据权利要求1的式(I)或式(I’)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其中所述间隔基团Z选自
a)-NH-，
b)-S-，
c)还带有硫醇基或氨基或羧基残基的氨基亚烷基、硫基亚烷基、氨基亚环烷基或硫基亚环烷基，或
d)肽残基，其可通过形成酰胺键或二硫键将L1连接基团与T载体连接。
3.根据权利要求1的式(I)的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其中所述载体T选自多克隆抗体或其片段，其包含能够与肿瘤相关抗原结合的抗原结合位点；单克隆抗体或其片段，其包含能够与优先或选择性地在肿瘤细胞群上表达的抗原结合的抗原结合位点；天然的或重组体肽或蛋白质，其能够优先或选择性地与肿瘤细胞结合；或适于与一个或多个[Ant-L1-Z-]部分连接的上述物质的化学修饰衍生物，或天然或合成的聚合物载体。
4.根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其为式(Ia)：
其中：
R1、R2、Z、m和T如在权利要求1中定义，且L1为式(III)或式(IV)的连接基团：
其中B为任选被杂原子间隔的C1-C6亚烷基部分，且v、j、k和y独立为0或1；且所述Ant经连接到式(II)的C-14位的伯醇上的缩醛键与连接基团L1结合。
5.根据权利要求4的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其中所述间隔基团Z选自：
i)-NH-，从而[-Z-]m-T由式T-[NH2]m的载体得到；
ii)-S-，从而[-Z-]m-T由式T-[SH]m的载体得到；
iii)-NH-D-NH-CO-，从而[-Z-]m-T由式T-[COOH]m的载体得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-NH-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
iv)-NH-D-CO-NH-，从而[-Z-]m-T由式T-[NH2]m的载体得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-CO-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离羧基；
v)-NH-D-N＝CH-，从而[-Z-]m-T由式T-[CHO]m的载体得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，且-D-N-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
vi)-NH-D-S-CH-，从而[-Z-]m-T由式(V)的载体衍生物得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基，所述式(V)为：
vii)-NH-D-S-S-，从而[-Z-]m-T由式(VI)的载体衍生物得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基，所述式(VI)为：
6.根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其为式(Ib)：
其中R1和R2、Z、m和T如在权利要求1中定义，且L2为式(VII)或(VIII)的连接基团：
其中n为1至9的整数。
7.根据权利要求6的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其中
L2为式(VII)的连接基团，其如在权利要求6中定义，且Z选自：
i)-NH-，从而[-Z-]m-T由式T-[NH2]m的载体得到；
ii)-S-，从而[-Z-]m-T由式T-[SH]m的载体得到；
iii)-NH-D-NH-CO-，从而[-Z-]m-T由式T-[COOH]m的载体得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-NH-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
iv)-NH-D-CO-NH-，从而[-Z-]m-T由式T-[NH2]m的载体得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-CO-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离羧基；
v)-NH-D-N＝CH-，从而[-Z-]m-T由式T-[CHO]m的载体得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-N-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
vi)-NH-D-S-CH-，从而[-Z-]m-T由式(V)的载体衍生物得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基，所述式(V)为：
vii)-NH-D-S-S-，从而[-Z-]m-T由式(VI)的载体衍生物得到，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基，所述式(VI)为：
viii)-S-D-NH-CO-，其中-D-NH-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
ix)-S-D-CO-NH-，其中-D-CO-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离羧基；
x)-S-D-N＝C-，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-N-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
xi)S-D-S-CH-，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基；且
xii)-S-D-S-S-，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基。
8.根据权利要求6的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其中
L2为式(VIII)的连接基团，如在权利要求6中定义，且Z选自：
i)-S-，从而[-Z-]m-T由式T-[SH]m的载体得到；
ii)-S-D-NH-CO-，其中-D-NH-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
iii)-S-D-CO-NH-，其中-D-CO-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离羧基；
iv)-S-D-N＝C-，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-N-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离氨基；
v)S-D-S-CH-，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基；且
vi)-S-D-S-S-，其中-D-为C1-C6亚烷基、C3-C6亚环烷基，或-D-S-为由1至4个氨基酸构成的肽残基，具有至少一个游离硫醇基。
9.根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其式(I’a)或(I’b)：
其中L1、L2、R1和R2如在权利要求4或6中定义，Z为-NH--或由1至3个氨基酸构成的肽残基，且Q为氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、苯基或苄基。
10.根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐，其中L为式(IIIa)或(IVa)：
其中v和k独立为0或1；或L为式(VII)或(VIII)：
其中n为2至5的整数。
11.根据权利要求3的聚合物载体为多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸及其类似物或衍生物、葡聚糖、多聚糖及其类似物或衍生物；或由N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺(HPMA)得到的合成共聚物。
12.根据权利要求3的抗体为抗T细胞抗体T101 Royston、抗CD5抗体OKT1(Ortho)ATCC CRL 8000、抗CD20抗体IgG1 ibritumomab、抗CD33抗体huCD33、抗转移受体抗体OKT9(Ortho)ATCC CRL 8021、抗黑色素瘤抗体MAb 9.2.27、抗癌标记物抗体，其选自抗-CEA 1116NS-3d ATCC CRL8019、抗甲胎蛋白OM 3-1.1 ATCC HB 134，791T/36Embleton和B 72.3，抗卵巢癌抗体OVB 3 ATCC HB 9147、抗乳腺癌抗体、抗膀胱癌1G3.10、抗CanAg抗体huC242抗体或抗***抗体MLN591。
13.根据权利要求3的肽或蛋白质为FGF、EGF、PDGF、TGF-ALPHA、ALPHA-MS、白细胞介素、干扰素、TNF、促黑激素(MSH)或Mcm2。
14.根据权利要求5的载体T-[CHO]m，其由具有糖部分的多克隆抗体或单克隆抗体得到，所述糖部分优选位于Fc区，并且通过化学或酶方法选择性地氧化成醛基。
15.根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物，其选自以下化合物，其中
式I为[Ant-L-Z-]m-T，且式(I’)为Ant-L-Z-Q；
Ant为式(IIa)或(IIb)；
且L、Z、m、Q和T如下定义：
16.根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物，其选自：
2-[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰胺，
N-甲基-2-[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰胺，
N-苄基-2-[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰胺，
N2-(叔丁氧基羰基)-N6-{[(1-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}环己基)氧基]乙酰基}-L-赖氨酸，
N-甲基-2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺，
2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺，
N-苄基-2-[(6-{2-氧代-2-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]乙氧基}四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基]乙酰胺，
N-乙酰基-S-(1-{6-[(2E)-2-{2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}肼基]-6-氧代己基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸，
N2-(叔丁氧基羰基)-N6-(1-{6-[(2E)-2-{2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}肼基]-6-氧代己基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-赖氨酸，和
N-乙酰基-3-({3-[(2E)-2-{2-羟基-1-[(2S，4S)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S，3R，4aS，9S，9aR，10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-吡喃并[4′，3’：4，5][1，3]噁唑并[2，3-c][1，4]噁嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-基]亚乙基}肼基]-3-氧代丙基}二硫基)-L-丙氨酸。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐以及药用赋形剂、载体或稀释剂。
18.一种治疗癌症或细胞增殖障碍的方法，其包括对需要所述治疗的患者给予治疗有效量的根据权利要求1的蒽环类衍生物缀合物或其药用盐或根据权利要求17的药物组合物。
19.根据权利要求18的癌症，为选自下述的癌：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌、***癌和皮肤癌；鳞状细胞癌；淋巴系的造血肿瘤，其选自白细胞过多症、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓系的造血肿瘤，其选自急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；间质源的肿瘤，其选自纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经***的肿瘤，其选自星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；黑色素瘤、***瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、角质黄色瘤、甲状腺滤泡癌或卡波西肉瘤。
20.权利要求18的细胞增殖障碍，选自良性***增生、家族性腺瘤病、息肉病、神经纤维瘤病、银屑病、与动脉粥样硬化相关的血管性平滑细胞增生、肺纤维化、关节炎、肾小球肾炎和术后狭窄和再狭窄。
21.式(IIc)的蒽环类衍生物
Ant-L-(Z)m-X (IIc)
其中Ant选自下述结构：
其中波浪线表示与L的连接；
L为选自下述的连接基团：-N(R)-、-N(R)m(C1-C12亚烷基)-、-N(R)m(C2-C8亚烯基)-、-N(R)m(C2-C8亚炔基)-、-N(R)m(CH2CH2O)n-和下述结构：
其中波浪线表示与Ant和Z的连接；且
Z为选自下述的任选间隔基团：-CH2C(O)-、-CH2C(O)NR(C1-C12亚烷基)-和下述结构：
X为选自下述的反应活性官能团：马来酰亚胺基、硫醇基、氨基、溴、对甲苯磺酸酯基、碘、羟基、羧基、吡啶基二硫基和N-羟基琥珀酰亚胺基；
R为H、C1-C12烷基或C6-C20芳基；
R1和R2独立选自氨基酸侧链；
Z1选自-(C1-C12亚烷基)-、-(C2-C8亚烯基)-、-(C2-C8亚炔基)-和-(CH2CH2O)n-，
m为0或1；且n为1至6。
22.权利要求21的蒽环类衍生物，其选自下述结构：
其中Z-X选自：
23.权利要求22的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
24.权利要求22的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
25.权利要求21的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
26.权利要求21的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
27.权利要求21的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
其中Z为C1-C12亚烷基。
28.权利要求27的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
29.权利要求21的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
30.权利要求29的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
31.权利要求29的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
32.权利要求29的蒽环类衍生物，其选自下述结构：
33.权利要求32的蒽环类衍生物，其中Z1为-(C1-C12亚烷基)-。
34.权利要求32的蒽环类衍生物，其具有下述结构：
35.权利要求21的蒽环类衍生物，其中R1和R2独立选自氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、吡啶-2-基甲基-、吡啶-3-基甲基-、吡啶-4-基甲基-、苯基、环己基和下述结构：
36.一种抗体-药物缀合化合物或其药用盐，其包含通过连接基团L和任选间隔基团Z与一个或多个蒽环类衍生物药物部分D共价连接的抗体，所述缀合化合物具有式(Ic)
Ab-(L-Zm-D)p Ic
其中：
Ab为抗体；
D为选自下述结构的蒽环类衍生物：
其中波浪线表示与L的连接；
L为选自下述的连接基团：-N(R)-、-N(R)m(C1-C12亚烷基)-、-N(R)m(C2-C8亚烯基)-、-N(R)m(C2-C8亚炔基)-、-N(R)m(CH2CH2O)n-和下述结构：
其中波浪线表示与D和Z的连接；且
Z为选自下述的任选间隔基团：-CH2C(O)-、-CH2C(O)NR(C1-C12亚烷基)-和下述结构：
R为H、C1-C12烷基或C6-C20芳基；
R1和R2独立选自氨基酸侧链；
Z1选自-(C1-C12亚烷基)-、-(C2-C8亚烯基)-、-(C2-C8亚炔基)-和-(CH2CH2O)n-，
m为0或1；
n为1至6；且
p为1至8的整数。
37.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中R1和R2独立选自氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、吡啶-2-基甲基-、吡啶-3-基甲基-、吡啶-4-基甲基-、苯基、环己基和下述结构：
38.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中间隔基团Z包含对氨基苄基氧基羰基(PAB)基团。
39.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中连接基团-间隔基团单元L-Z包含马来酰亚氨基己酰基(MC)基团。
40.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中Z包含缬氨酸-瓜氨酸(vc)基团。
41.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中Ab为与一种或多种肿瘤相关抗原或选自(1)-(36)的细胞表面受体结合的抗体，所述(1)-(36)为：
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型)；
(2)E16(LAT1、SLC7A5)；
(3)STEAP1(***六跨膜上皮抗原)；
(4)0772P(CA125、MUC16)；
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞强化因子、间皮素)；
(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；
(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七血小板反应蛋白重复(1型和类1型的)，跨膜结构域(TM)和短细胞质结构域，(脑信号蛋白)5B)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；
(9)ETBR(内皮素B型受体)；
(10)MSG783(RNF124，假想蛋白FLJ20315)；
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、***癌相关基因1、***癌相关蛋白1、***的六跨膜上皮抗原2、六跨膜***蛋白)；
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体潜在阳离子通道，亚家族M，成员4)；
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1，畸胎癌衍生的生长因子)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃巴病毒受体)或Hs.73792)；
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关beta)、B29)；
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；
(17)HER2；
(18)NCA；
(19)MDP；
(20)IL20Rα；
(21)Brevican；
(22)EphB2R；
(23)ASLG659；
(24)PSCA；
(25)GEDA；
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BlyS受体3，BR3)；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同工型)；
(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关alpha)；
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的Beta亚基(Ia抗原))；
(31)P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复(LRR)的I型膜蛋白家族)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；
(35)IRTA2(易位相关免疫球蛋白超家族受体2)；以及
(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)。
42.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中Ab为半胱氨酸-工程化的抗体。
43.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中Ab为与ErbB受体结合的抗体。
44.权利要求43的抗体-药物缀合物，其中Ab为曲妥单抗。
45.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其中p为1、2、3或4.
46.权利要求36的抗体-药物缀合化合物，其包含所述抗体-药物缀合化合物的混合物，其中在抗体-药物缀合化合物的混合物中的每抗体的平均药物负载约为约2至约5。
47.权利要求46的抗体-药物缀合化合物，其中在抗体-药物缀合化合物的混合物中的每抗体的平均药物负载约为约3至约4。
48.一种药物组合物，其包含权利要求36的抗体-药物缀合化合物和药用稀释剂、载体或赋形剂。
49.权利要求48的药物组合物，还包含治疗有效量的化疗剂。
50.一种治疗癌症的方法，其包括对患者给予权利要求48的药物组合物。
51.权利要求50的方法，其中对患者给予化疗剂与所述抗体-药物缀合化合物的组合。
52.权利要求36的抗体-药物缀合化合物在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途。
53.权利要求52的用途，其中哺乳动物为人。
54.一种制品，其包含
权利要求36的抗体-药物缀合化合物；
容器；和
包装说明书或标签，其指明所述化合物可用于治疗癌症。
55.一种制备抗体-药物缀合化合物的方法，其包括
使蒽环类衍生物和抗体Ab反应，形成抗体-药物缀合化合物，其中蒽环类衍生物具有式(IIc)：
Ant-L-(Z)m-X (IIc)
其中Ant选自下述结构：
其中波浪线表示与L的连接；
L为选自下述的连接基团：-N(R)-、-N(R)m(C1-C12亚烷基)-、-N(R)m(C2-C8亚烯基)-、-N(R)m(C2-C8亚炔基)-、-N(R)m(CH2CH2O)n-和下述结构：
其中波浪线表示与Ant和Z的连接；且
Z为选自下述的任选间隔基团：-CH2C(O)-、-CH2C(O)NR(C1-C12亚烷基)-和下述结构：
X为选自下述的反应活性官能团：马来酰亚胺基、硫醇基、氨基、溴、对甲苯磺酸酯基、碘、羟基、羧基、吡啶基二硫基和N-羟基琥珀酰亚胺基；
R为H、C1-C12烷基或C6-C20芳基；
R1和R2独立选自氨基酸侧链；
Z1选自-(C1-C12亚烷基)-、-(C2-C8亚烯基)-、-(C2-C8亚炔基)-和-(CH2CH2O)n-，
m为0或1；且n为1至6；
所述抗体-药物缀合物具有式Ic：
Ab-(L-Zm-D)p Ic
其中Ab为抗体；且
p为1至8的整数。
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