CN104540524A - 包含抗cd22抗体的免疫缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含共价连接至吡咯并苯并二氮杂的抗CD22抗体的免疫缀合物以及其使用方法。

Description

包含抗CD22抗体的免疫缀合物
发明领域
本发明涉及包含抗CD22抗体的免疫缀合物及其使用方法。
背景
如CD19、CD22和CD52的B细胞抗原代表具有用于治疗淋巴瘤的治疗潜力的靶标(Grillo-Lopez A.J.等,Curr Pharm Biotechnol,2:301-11,(2001))。CD22是一种仅在成熟分化阶段在B细胞表面上表达的135-kDa B细胞限制性唾液酸糖蛋白(sialoglycoprotein)(Dorken,B.等,J.Immunol.136:4470-4479(1986))。CD22在人中的主要形式是CD22β，其在细胞外结构域中含有7个免疫球蛋白超家族结构域(Wilson,G.L.等,J.Exp.Med.173:137-146(1991))。一种变体形式CD22α缺乏免疫球蛋白超家族结构域3和4(Stamenkovic,I.和Seed,B.,Nature 345:74-77(1990))。已显示与人CD22的配体结合与免疫球蛋白超家族结构域1和2(还被称为表位1和2)相关(Engel,P.等,J.Exp.Med.181:1581-1586,1995)。
B细胞相关病症包括但不限于恶性淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphoma)，NHL)、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL，B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞))。为一组主要起因于B淋巴细胞的异质癌症的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)占所有新近诊断癌症的约4％(Jemal,A.等,CA-Cancer J Clin,52:23-47,(2002))。侵袭性NHL占成人NHL的约30％-40％(Harris,N.L.等,Hematol.J.1:53-66(2001))并且包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、外周T细胞淋巴瘤以及间变性大细胞淋巴瘤。一线组合化学疗法治愈少于半数的侵袭性NHL患者，并且大多数患者最终死于其疾病(Fisher,R.I.Semin.Oncol.27(增刊12):2-8(2000))。
在B细胞NHL中，在侵袭性群体和无痛群体中，CD22表达分别在91％至99％的范围内(Cesano,A.等,Blood 100:350a(2002))。CD22可充当B细胞活化复合物的组分(Sato,S.等,Semin.Immunol.10:287-296(1998))和粘附分子(Engel,Pl等,J.Immunol.150:4719-4732(1993))两者。CD22缺乏小鼠的B细胞具有较短寿命和增强的细胞凋亡，这表明这种抗原在B细胞存活中具有作用(Otipoby,K.L.等,Nature(Lond)384:634-637(1996))。在与其一种或多种天然配体或抗体结合之后，CD22快速内化，从而在原代B细胞中提供共刺激信号并且在赘生性B细胞中提供促细胞凋亡信号(Sato,S.等人,Immunity5:551-562(1996))。
本领域中对靶向CD22以供诊断和治疗CD22相关病状(如癌症)的药剂存在需要。本发明满足所述需要并且提供其它益处。
概述
本发明提供抗CD22抗体和免疫缀合物以及其使用方法。
在一些实施方案中，提供一种包含共价连接至细胞毒性剂的结合CD22的抗体的免疫缀合物，其中所述抗体结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位。在一些实施方案中，细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂
在一些实施方案中，抗体包含(i)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3，以及(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2。在一些实施方案中，抗体包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，以及(iii)包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，抗体包含：a)(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；或b)(i)包含SEQID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体包含：a)(i)包含选自SEQID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；或b)(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体包含：a)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或b)与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH序列。在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL序列或具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
在一些实施方案中，提供一种包含共价连接至细胞毒性剂的结合CD22的抗体的免疫缀合物，其中所述抗体包含(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL序列，并且其中所述细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂
在一些实施方案中，免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab为抗体；(b)L为接头；(c)D为细胞毒性剂；并且(d)p在1-8的范围内。在一些这类实施方案中，D为式A的吡咯并苯并二氮杂
其中虚线指示在C1与C2或C2与C3之间任选存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR，并且任选地进一步选自卤代或二卤代，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H以及卤代；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
Q独立地选自O、S和NH；
R11为H或R或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立地选自任选取代的C1-8烷基、C3-8杂环基以及C5-20芳基，并且任选地就基团NRR’而言，R和R’连同它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环；
R12、R16、R19和R17分别是如对于R2、R6、R9和R7所定义；
R″为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子和/或任选取代的芳香族环间断；以及
X和X’独立地选自O、S和N(H)。
在一些实施方案中，D具有结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，D具有选自以下的结构：
其中RE和RE”各自独立地选自H或RD，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H以及卤代；
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；以及
其中n为0或1。
在一些实施方案中，D为式B的吡咯并苯并二氮杂
其中水平波形线指示与接头的共价连接位点；
RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基、苯基、氟取代的苯基以及C5-6杂环基；以及
n为0或1。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含可由蛋白酶裂解的接头。在一些这类实施方案中，接头包含val-cit二肽或Phe-高Lys二肽。在一些实施方案中，免疫缀合物具有式：
在一些实施方案中，p在1-3的范围内。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含结构：
其中CBA表示抗体(Ab)。在一些实施方案中，RL1和RL2各自独立地选自H和甲基，或连同它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基。在一些实施方案中，Y选自单键、(a1)和(a2)；
其中N显示基团结合PBD部分的N10的位置。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含选自以下的结构：
在一些实施方案中，免疫缀合物包含结构：
其中RE和RE”各自独立地选自H和RD。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地选自任选取代的苯基、呋喃基、苯硫基以及吡啶基。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含结构：
其中RV1和RV2各自独立地选自H、甲基、乙基、任选取代的苯基、以及C5-6杂环基。在一些实施方案中，RV1和RV2各自独立地选自H、苯基以及4-氟苯基。
在一些实施方案中，提供一种具有选自以下的式的免疫缀合物：
其中Ab为抗体，其包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；并其中p在1至3的范围内。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有式：
其中Ab为抗体，其包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中p在1至3的范围内。在一些这类实施方案中，抗体包含SEQID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26的重链和SEQ ID NO:23的轻链。
在本文论述的任何实施方案中，抗体可为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体为结合CD22的抗体片段。在一些实施方案中，抗体结合人CD22。在一些这类实施方案中，人CD22具有SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的序列。
在一些实施方案中，提供药物制剂，其中所述制剂包含本文所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物制剂包含另一种治疗剂。
在一些实施方案中，提供治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法。在一些实施方案中，方法包括向个体施用有效量的本文所述的免疫缀合物。在一些实施方案中，CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)以及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用另一种治疗剂。在一些这类实施方案中，另一种治疗剂包含结合CD79b的抗体。在一些实施方案中，另一种治疗剂为包含共价连接至细胞毒性剂的结合CD79b的抗体的免疫缀合物。
在一些实施方案中，提供一种抑制CD22阳性细胞增殖的方法。在一些这类实施方案中，所述方法包括在允许免疫缀合物结合细胞表面上的CD22的条件下使细胞暴露于本文所述的免疫缀合物，从而抑制细胞的增殖。在一些实施方案中，细胞为赘生性B细胞。在一些实施方案中，细胞为淋巴瘤细胞。
附图简述
图1A-1B：图1A示出鼠类10F4抗CD22抗体(m10F4)的重链可变区的氨基酸序列与人源化10F4型式1(hu10F4v1)重链可变区和人源化10F4型式3(hu10F4v3)重链可变区的比对以及与人亚组III序列的比对。对HVR加框(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)。包围HVR的序列为构架序列(FR-H1至FR-H4)。序列是根据Kabat编号加以编号。Kabat、Chothia以及接触CDR在加框HVR附近加以指示。图1B示出鼠类10F4抗CD22抗体(m10F4)的轻链可变区的氨基酸序列与人源化10F4型式1(hu10F4v1)轻链可变区和人源化10F4型式3(hu10F4v3)轻链可变区的比对以及与人κI序列的比对。抗体hu10F4v3在HVR-L1的氨基酸28(N28V)处不同于hu10F4v1。对HVR加框。FR-L1、FR-L2、FR-L3以及FR-L4序列包围HVR(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。序列是根据Kabat编号加以编号。Kabat、Chothia以及接触CDR在加框HVR附近加以指示。
图2示出人源化抗CD22抗体10F4v3(IgG1同种型)的轻链和重链的全长氨基酸序列(可变区和恒定区)。加下划线部分为恒定结构域。
图3示出抗CD22半胱氨酸工程化抗体的氨基酸序列，其中改变轻链或重链或Fc区以将所选氨基酸位置处的氨基酸置换为半胱氨酸。所示的半胱氨酸工程化抗体包括抗CD22 10F4变体轻链，其中使Kabat位置205处的缬氨酸(序列位置缬氨酸210)改变成半胱氨酸(“抗CD22V205C h10Fv3半胱氨酸工程化轻链”)；抗CD22 10F4变体重链，其中使EU位置118处的丙氨酸(序列位置丙氨酸121)改变成半胱氨酸(“抗CD22A118C h10Fv3半胱氨酸工程化重链”)；以及抗CD22 10F4变体Fc区，其中使EU位置400处的丝氨酸(序列位置丝氨酸403)改变成半胱氨酸(“抗CD22S400C h10Fv3半胱氨酸工程化Fc区”)。在各图中，改变的氨基酸以加有双下划线的粗体文本显示。单下划线指示恒定区。可变区不加下划线。
图4示出实施例A中所述的(A)10F4v3-PBD、(B)10F4v3-SS-PBD以及(C)10F4v3-SSMe-PBD的接头和药物结构。
图5示出如实施例B中所述，各种抗体-药物缀合物在WSU-DLCL2小鼠异种移植物模型中的功效。
图6示出如实施例C中所述，各种抗体-药物缀合物在Granta-519小鼠异种移植物模型中的功效。
图7示出如实施例D中所述，各种抗体-药物缀合物在SuDHL4-luc小鼠异种移植物模型中的功效。
图8示出如实施例E中所述，在SuDHL4-luc小鼠异种移植物模型中10F4v3-PBD对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。
图9示出如实施例F中所述，在Bjab-luc小鼠异种移植物模型中10F4v3-PBD对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。
图10示出如实施例G中所述，各种抗体-药物缀合物在WSU-DLCL2小鼠异种移植物模型中的功效。
详述
I.定义
出于本文的目的，“受体人构架”为以下构架：其包含源于如以下定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“源于”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可包含其相同氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更少、9或更少、8或8更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或2更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列方面与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法(包括本文所述的那些)进行测量。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的”抗体是指相较于在一个或多个高变区(HVR)中不具有一个或多个改变的亲本抗体，具有这类改变的抗体，这类改变导致抗体对抗原的亲和力的改进。
术语“抗CD22抗体”和“结合CD22的抗体”是指能够以足以使得抗体在靶向CD22时适用作诊断剂和/或治疗剂的亲和力结合CD22的抗体。在一个实施方案中，抗CD22抗体结合不相关的非CD22蛋白质的程度小于抗体与CD22的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合CD22的抗体的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5Nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗CD22抗体结合CD22的在来自不同物种的CD22中保守的表位。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其表现出所需抗原结合活性。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
作为参考抗体的“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中使参考抗体与其抗原的结合被阻断50％或更多的抗体，并且相反，参考抗体在竞争测定中使所述抗体与其抗原的结合被阻断50％或更多。本文提供一种示例性竞争测定。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于黑色素瘤、癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。癌症的更具体的实例包括B细胞相关癌症，包括例如高级、中级以及低级淋巴瘤(包括B细胞淋巴瘤，例如像粘膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、以及霍奇金氏淋巴瘤和T细胞淋巴瘤)和白血病(包括继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞))、骨髓性白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病)、淋巴细胞性白血病(如急性淋巴母细胞性白血病(ALL))和骨髓发育不良)、以及其它血液***癌症和/或B细胞或T细胞相关癌症。还包括另外造血细胞的癌症，所述细胞包括多形核白细胞(如嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、嗜中性细胞)以及单核细胞、树突细胞、血小板、红细胞和天然杀伤细胞。还包括选自以下的癌性B细胞增生性病症：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)以及套细胞淋巴瘤。B细胞癌症的起源包括如下：边缘区B细胞淋巴瘤起源于边缘区中的记忆B细胞，滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤起源于生发中心的明区(light zone)中的中心细胞，慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性白血病起源于B1细胞(CD5+)，套细胞淋巴瘤起源于套膜区中的天然B细胞并且伯基特氏淋巴瘤起源于生发中心的暗区(darkzone)中的中心胚细胞。在本文中被称为“造血细胞组织”的包括造血细胞的组织包括胸腺和骨髓以及周围淋巴组织，如脾、***、与粘膜相关的淋巴组织(如肠管相关淋巴组织、扁桃腺、派亚氏淋巴丛(Peyer’spatches)和阑尾)以及与其它粘膜相关的淋巴组织，例如支气管内衬(bronchial lining)。这类癌症的其它特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病以及其它淋巴细胞增生性病症，以及各种类型的头颈部癌。
本文的“B细胞恶性肿瘤”包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞性NHL、高级淋巴母细胞性NHL、高级小非***细胞NHL、巨大肿块疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤以及瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’sMacroglobulinemia)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞优势型霍奇金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、无痛性NHL，包括复发性无痛性NHL以及利妥昔单抗(rituximab)难治性无痛性NHL；白血病，包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性骨髓母细胞性白血病；伯基特氏淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；以及其它血液学恶性肿瘤。这类恶性肿瘤可用针对B细胞表面标记物(如CD22)的抗体进行治疗。这类疾病在本文中预期通过施用针对B细胞表面标记物(如CD22)的抗体进行治疗，并且包括施用未缀合(“裸”)抗体或缀合于如本文所公开的细胞毒性剂的抗体。这类疾病在本文中还预期通过组合疗法进行治疗，所述组合疗法包括本发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体药物缀合物与同时或连续施用的另一种抗体或抗体药物缀合物、另一种细胞毒性剂、放射或其它治疗的组合。在一种示例性治疗方法中，抗CD22免疫缀合物与抗CD79b抗体、免疫球蛋白或其CD79b结合片段组合共同或顺序施用。抗CD79b抗体可为裸抗体或抗体药物缀合物。在另一种示例性治疗方法中，抗CD22免疫缀合物与抗CD20抗体、免疫球蛋白或其CD20结合片段组合共同或顺序施用。抗CD20抗体可为裸抗体或抗体药物缀合物。在组合疗法的一些实施方案中，抗CD22免疫缀合物与(利妥昔单抗)一起施用。
如本文所用的术语“非霍奇金氏淋巴瘤”或“NHL”是指除霍奇金氏淋巴瘤以外的淋巴***癌症。霍奇金氏淋巴瘤可通常根据在霍奇金氏淋巴瘤中存在里德-斯特恩伯格细胞(Reed-Sternberg cell)而在非霍奇金氏淋巴瘤中不存在所述细胞来与非霍奇金氏淋巴瘤进行区分。由如本文所用的所述术语涵盖的非霍奇金氏淋巴瘤的实例包括将由本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学家)根据本领域中已知的分类方案，像如Color Atlas of Clinical Hematology(第3版),A.VictorHoffbrand和John E.Pettit(编辑)(Harcourt Publishers有限公司,2000)中所述的修订欧洲-美国淋巴瘤(Revised European-AmericanLymphoma，REAL)方案鉴别为此淋巴瘤的任何淋巴瘤。特别参见图11.57、11.58及11.59中的清单。更特定实例包括但不限于复发性或难治性NHL、一线低级NHL、III/IV期NHL、化学疗法抗性NHL、前体B淋巴母细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结外边缘区-MALT淋巴瘤、结节性边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低级/滤泡性淋巴瘤、中级/滤泡性NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)、中级弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性一线NHL和侵袭性复发性NHL)、在自体干细胞移植之后复发或为自体干细胞移植所难治的NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高级免疫母细胞性NHL、高级淋巴母细胞性NHL、高级小非***细胞NHL、巨大肿块疾病NHL、伯基特氏淋巴瘤、前体(周围)大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样真菌病和/或塞扎莱综合征(Sezarysyndrome)、皮肤(皮肤性)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源于不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且若干这类类别可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如溶核酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下所公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“化学治疗剂”为适用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如本多帕(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多帕(meturedopa)以及优多帕(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)以及三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素(colchicine)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、莨菪素(scopolectin)以及9-氨基喜树碱(aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；凯利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)以及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足叶草酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(cryptophycin)(具体地说念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；潘卡他汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-(吡咯啉基)-阿霉素以及脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素(androgen)，如二***(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸(folic acid)补充剂，如弗罗林酸(frolinic acid)；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；洛尼代宁(lonidainine)；美登木素，如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹丹莫(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)以及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；格塞图辛(gacytosine)；***糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM无聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor-free)的白蛋白工程化紫杉醇纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)以及多西他赛(docetaxel)(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇(retinoid)，如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)任何上述各物的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各物的组合，如CHOP，即环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和***龙(prednisolone)的组合疗法的缩写；CVP，即环磷酰胺、长春新碱和***龙的组合疗法的缩写；以及FOLFOX，即使用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸组合的治疗方案的缩写。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必需剂量下且持续必需时期，有效实现所需治疗或预防结果的量。
术语“表位”是指抗原分子上抗体所结合的特定位点。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。所述术语包括天然序列Fc区以及变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***，还被称为EU指数，如Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3以及FR4。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”以及“全抗体”在本文中可互换使用来表示具有与天然抗体结构大体上类似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“CD22的糖基化形式”是指通过添加碳水化合物残基而经翻译后修饰的CD22的天然存在的形式。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”以及”宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源性核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源于其的子代而不考虑传代数目。子代在核酸内容物方面可能不完全与亲本细胞相同，而是可能含有突变。本文包括具有如在原始转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变子代。
“人抗体”为具有某一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或源于利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”为代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的构架。一般来说，人免疫球蛋白VL或VH序列选自可变结构域序列的亚组。一般来说，序列亚组为如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组为如Kabat等(同上)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组为如Kabat等(同上)中的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的大体上全部，其中全部或大体上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且全部或大体上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经受人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列方面高度可变和/或形成结构限定环(“高变环”)的各区。一般来说，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65以及H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“SDR”。SDR包含在CDR的被称为缩短CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2以及a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58以及H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示，否则HVR残基以及可变结构域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是根据Kabat等(同上)进行编号。
“免疫缀合物”为缀合至一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗以及马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，如猴)、兔以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者为人。
“分离的抗体”为已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)所测定。对于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的核酸”是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色***置的染色***置处。
“编码抗CD22抗体的分离的核酸”是指一个或多个编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括在单一载体或单独载体中的所述一个或多个核酸分子以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的所述一个或多个核酸分子。
除非另外指示，否则如本文所用的术语“CD22”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD22，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人、食蟹猴(cynomolgus monkey)(cyno))和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”未加工的CD22以及CD22的由在细胞中加工所产生的任何形式。所述术语还涵盖CD22的天然存在的变体，例如剪接变体、等位基因变体以及同工型。CD22的主要同工型物(CD22β)包含847个氨基酸并且在细胞外结构域中包含7个免疫球蛋白样区(参见Wilson,G.L.等,J.Exp.Med.173:137-146(1991))。次要同工型CD22α包含647个氨基酸并且在细胞外结构域中缺乏免疫球蛋白样结构域3和4(参见Stamenkovic,I.和Seed,B.,Nature 345:74-77(1990))以及Wilson等(1991),同上)。一种示例性人CD22β前体(具有信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO:28中示出。一种示例性人成熟CD22β(无信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO:29中示出。一种示例性人CD22α前体(具有信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO:30中示出。一种示例性人成熟CD22α(无信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO:31中示出。
术语“CD22阳性癌症”是指包含在其表面上表达CD22的细胞的癌症。
术语“CD22阳性细胞”是指在其表面上表达CD22的细胞。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指自大体上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中产生的突变，这类变体通常以少量存在)的外，构成所述群体的单独抗体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示如自大体上均质的抗体群体获得的抗体的特性，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例来说，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这类方法和制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文中描述。
“裸抗体”是指未缀合至异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。举例来说，天然IgG抗体为约150,000道尔顿(dalton)的异四聚糖蛋白，由二硫键键合的两个相同轻链和两个相同重链构成。自N末端至C末端，各重链具有可变区(VH)，还被称为可变重结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2及CH3)。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，还被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为称为κ(κ)和λ(λ)的两种类型之一。
术语“药品说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或涉及这类治疗产品的使用的警告的信息。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的多种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创造，并且源代码已与用户文件一起在美国版权办公室(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)备案，其中其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可公开自Genentech公司(South San Francisco,California)获得，或可自源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作***(包括数字UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置且不改变。
在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A对于、与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可替代地措词为给定氨基酸序列A具有或包含对于、与或相对于给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)是如下计算：
100×分数X/Y
其中X为通过序列比对程序ALIGN-2在所述程序进行A与B比对时计分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y为B中的氨基酸残基的总数目。应了解当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外明确陈述，否则本文使用的所有氨基酸序列同一性％值均是使用ALIGN-2计算机程序如前一段落中所述来获得。
术语“药物制剂”是指以下制剂：其呈允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用制剂的个体具有不可接受毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对个体无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(以及其语法变化形式，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然病程，并且可为实现防治或在临床病理学过程中进行的临床干预。合乎需要的治疗作用包括但不限于防止疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病病况及缓和或改进预后。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中各结构域包含四个保守构架区(FR)以及三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域来分离以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指核酸分子，其能够使其所连接的另一核酸繁殖。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体，以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这类载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所用的短语“任选取代的”涉及可为未取代的或可为取代的亲本基团。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“取代的”涉及携带一个或多个取代基的亲本基团。术语“取代基”在本文中以常规意义使用并且是指共价连接至亲本基团或在适当时与亲本基团融合的化学部分。已知广泛多种取代基，并且还已知其形成以及引入多种亲本基团中的方法。
在一些实施方案中，本文所述的取代基(其包括任选的取代基)限于不与抗体具有反应性的那些基团。在一些实施方案中，与抗体的连接是通过接头(L)由PBD化合物的N10位置形成。在一些情况下，位于PBD结构的其它部分处的反应性官能团可能能够与抗体形成另外的键(这可被称为交联)。在一些情况下，这类另外的键可能改变缀合物的转运和生物活性。因此，在一些实施方案中，另外的取代基限于缺乏反应性官能性的取代基。
在一些实施方案中，取代基选自R、OR、SR、NRR’、NO2、卤代、CO2R、COR、CONH2、CONHR以及CONRR’。在一些实施方案中，取代基选自R、OR、SR、NRR’、NO2、CO2R、COR、CONH2、CONHR以及CONRR’。在一些实施方案中，取代基选自R、OR、SR、NRR’、NO2以及卤代。在一些实施方案中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’及NO2组成的组。
以上论述的任何实施方案均可适用于本文所述的任何取代基。或者，取代基可选自以下论述的一个或多个组。
如本文所用的术语“C1-12烷基”涉及通过自具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子移除氢原子所获得的单价部分，所述烃化合物为脂肪族，并且可为环状或无环，并且可为饱和或不饱和的(例如部分不饱和、完全不饱和)。因此，术语“烷基”包括以下论述的亚类烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)以及庚基(C7)。
饱和直链烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)以及正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括但不限于异丙基(C3)、异丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异戊基(C5)以及新戊基(C5)。
烷基可任选地被一个或多个选自O、N(H)以及S的杂原子间断。这类基团可被称为“杂烷基”。
如本文所用的术语“C2-12杂烷基”涉及通过自具有2至12个碳原子以及一个或多个选自O、N(H)以及S(优选O和S)的杂原子的烃化合物的碳原子移除氢原子所获得的单价部分。
杂烷基的实例包括但不限于包含一个或多个-(OCH2CH2)-型乙二醇单元的杂烷基。杂烷基的末端可为杂原子的原形，例如-OH、-SH或-NH2。在一个优选实施方案中，末端为-CH3。
如本文所用的术语“C2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl/vinyl)(-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)以及己烯基(C6)。
如本文所用的术语“C2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。
如本文所用的术语“C3-12环烷基”涉及还为环基的烷基；即通过自环烃(碳环)化合物的脂环族环原子移除氢原子所获得的单价部分，所述部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括但不限于源于以下的环烷基：
(i)饱和单环烃化合物：
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)以及甲基环己烷(C7)；
(ii)不饱和单环烃化合物：
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)以及甲基环己烯(C7)；以及
(iii)饱和多环烃化合物：
降蒈烷(norcarane)(C7)、降蒎烷(norpinane)(C7)、降莰烷(norbornane)(C7)。
如本文所用的术语”C3-20杂环基”涉及通过自杂环化合物的环原子移除氢原子所获得的单价部分，所述部分具有3至20个环原子，其中1至10个环原子为环杂原子。在一些实施方案中，各环均具有3至7个环原子，其中1至4个环原子为环杂原子。
如本文所用，前缀(例如C3-20、C3-7、C5-6等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子或杂原子。举例来说，如本文所用的术语“C5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括但不限于源于以下的杂环基：
(i)N1：氮丙啶(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯、异唑)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、氮杂(C7)；
(ii)O1：环氧乙烷(C3)、氧杂环丁烷(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(二氢呋喃)(C5)、噁烷(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂环庚三烯(C7)；
(iii)S1：硫环丙烷(C3)、硫环丁烷(C4)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)(C5)、硫化环戊烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(C7)；
(iv)O2：二氧杂环戊烷(C5)、二噁烷(C6)以及二氧杂环庚烷(C7)；
(v)O3：三噁烷(C6)；
(vi)N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二唑烷)(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
(vii)N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
(viii)N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫吗啉(C6)；
(ix)N2O1：噁二嗪(C6)；
(x)O1S1：氧硫杂环戊二烯(C5)和氧硫杂环己烷(噻噁烷)(C6)；以及
(xi)N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括但不限于源于呈环状形式的糖类的杂环基，所述糖类例如呋喃糖(C5)，如***呋喃糖、来苏呋喃糖、核呋喃糖和木呋喃糖；以及吡喃糖(C6)，如阿洛吡喃糖、阿卓吡喃糖、葡萄吡喃糖、甘露吡喃糖、古洛吡喃糖、艾杜吡喃糖、半乳吡喃糖以及太洛吡喃糖。
如本文所用的术语“C5-20芳基”涉及通过自芳香族化合物的芳香族环原子移除氢原子所获得的单价部分，所述部分具有3至20个环原子。在一些实施方案中，各环具有5至7个环原子。
在一些实施方案中，环原子均为碳原子，如在“碳芳基”中。碳芳基的实例包括但不限于源于以下的碳芳基：苯(即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、并四苯(C18)以及芘(C16)。
包含其中至少一者为芳香族环的稠合环的芳基的实例包括但不限于源于以下的基团：茚烷(例如2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C10))、苊萘(C12)、茀(C13)、萉(C13)、醋菲(C15)以及醋蒽(C16)。
在一些实施方案中，环原子可包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于源于以下的杂芳基：
(i)N1：吡咯(唑)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
(ii)O1：呋喃(氧杂环戊二烯)(C5)；
(iii)S1：噻吩(thiophene/thiole)(C5)；
(iv)N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
(v)N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
(vi)N3O1：噁***(C5)；
(vii)N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
(viii)N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
(ix)N3：***(C5)、三嗪(C6)；以及
(x)N4：四唑(C5)。
包含稠合环的杂芳基的实例包括但不限于：
(i)源于以下的C9(具有2个稠合环)：苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、吲哚嗪(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并间二氧杂环戊烯(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并***(N3)、苯并硫呋喃(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
(ii)源于以下的C10(具有2个稠合环)：苯并吡喃(O1)、异苯并吡喃(O1)、苯并二氢吡喃(O1)、异苯并二氢吡喃(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(N2)、萘啶(N2)、蝶啶(N4)；
(iii)源于苯并二氮杂(N2)的C11(具有2个稠合环)；
(iv)源于以下的C13(具有3个稠合环)：咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、呸啶(N2)、吡啶并吲哚(N2)；以及
(v)源于以下的C14(具有3个稠合环)：吖啶(N1)、呫吨(O1)、噻吨(S1)、二苯并对二噁英(O2)、氧硫杂蒽(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、菲咯啉(N2)、吩嗪(N2)。
无论单独或为另一取代基的一部分的以上基团均可自身任选被一个或多个选自自身及以下列出的其它取代基的基团取代。
卤代：-F、-Cl、-Br以及-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R为醚取代基，例如C1-7烷基(还被称为以下论述的C1-7烷氧基)、C3-20杂环基(还被称为C3-20杂环基氧基)、或C5-20芳基(还被称为C5-20芳基氧基)。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R为烷基，例如C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(叔丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)以及-O(tBu)(仲丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地为缩醛取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R1和/或R2独立地为C1-7烷基。在一些实施方案中，在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2连同它们所连接的两个氧原子以及它们所连接的碳原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)2、-CH(OEt)2以及-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1为半缩醛取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R1为C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2是如对于缩醛所定义，并且R为除氢以外的缩酮取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2以及-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1是如对于半缩醛所定义，并且R为除氢以外的半缩酮取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。半缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)以及-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代(酮基、-酮)：＝O。
硫酮(Thione/thioketone):＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为氢或C1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝NEt及＝NPh。
甲酰基(甲醛(carbaldehyde/carboxaldehyde))：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R为酰基取代基，例如C1-7烷基(还被称为C1-7烷基酰基或C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(还被称为C3-20杂环基酰基)、或C5-20芳基(还被称为C5-20芳基酰基)。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)及-C(＝O)Ph(苯甲酰基、苯基酮)。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
硫醇羧基(硫醇羧酸)：-C(＝O)SH。
硫酮基羧基(硫酮基羧酸)：-C(＝S)OH。
亚氨酸：-C(＝NH)OH。
羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯(carboxylate/carboxylic acid ester)、氧基羰基)：-C(＝O)OR，其中R为酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。酯基团的实例包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3以及-C(＝O)OPh。
酰基氧基(反酯)：-OC(＝O)R，其中R为酰氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。酰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph以及-OC(＝O)CH2Ph。
氧基羰基氧基-OC(＝O)OR，其中R为酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。氧基羰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3以及-OC(＝O)OPh。
氨基：-NR1R2，其中R1及R2独立地为氨基取代基，例如氢、C1-7烷基(还被称为C1-7烷基氨基或二C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R1和R2独立地为H或C1-7烷基。在一些实施方案中，在“环状”氨基的情况下，R1和R2连同它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可为伯氨基(-NH2)、叔氨基(-NHR1)或仲氨基(-NHR1R2)，并且在呈阳离子形式时可为季氨基(-+NR1R2R3)。氨基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2以及-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于N-氮杂环丙烷基、N-氮杂环丁烷基、N-吡咯烷基、N-哌啶基、N-哌嗪基、N-吗啉代以及N-硫吗啉代。
酰胺基(氨甲酰基(carbamoyl/carbamyl)、氨基羰基、羧酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为如对于氨基所定义的氨基取代基。酰胺基的实例包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3以及-C(＝O)N(CH2CH3)2以及其中R1和R2连同它们所连接的氮原子一起形成杂环结构的酰胺基，如在例如N-哌啶基羰基、N-吗啉代羰基、N-硫吗啉代羰基及N-哌嗪基羰基中。
硫代酰胺基(硫氨甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地为如对于氨基所定义的氨基取代基。硫代酰胺基的实例包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2以及-C(＝S)NHCH2CH3。
酰基酰胺基(酰基氨基)：-NR1C(＝O)R2，其中R1为酰胺取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，并且R2为酰基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R1和/或R2为氢或C1-7烷基。酰基酰胺基团的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3以及-NHC(＝O)Ph。R1和R2可一起形成环状结构，如在例如琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基及邻苯二甲酰亚胺基中。
氨基羰基氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为如对于氨基所定义的氨基取代基。氨基羰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2以及-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地为如对于氨基所定义的氨基取代基，并且R1为脲基取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R1为氢或C1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2以及-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有4个氮原子及1个碳原子的5元芳香族环，
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中各R为脒取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，各R为H或C1-7烷基。脒基团的实例包括但不限于-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2以及-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈(nitrile/carbonitrile))：-CN。
异氰基：-NC。
氰酸酯基：-OCN。
异氰酸酯基：-NCO。
硫氰基(硫氰酸酯基)：-SCN。
异硫氰基(异硫氰酸酯基)：-NCS。
硫氢基(硫醇、巯基)：-SH。
硫醚(硫化物)：-SR，其中R为硫醚取代基，例如C1-7烷基(还被称为C1-7烷基硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。硫醚基团的实例包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R为二硫化物取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基(在本文中还被称为C1-7烷基二硫化物)。二硫化物基团的实例包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
锍化物(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R为锍化物取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。锍化物基团的实例包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R为砜取代基，例如C1-7烷基、C3- 20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基，包括例如氟化或全氟化C1-7烷基。砜基团的实例包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲烷磺酰基、甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙基磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(硫磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯基磺酰基、苯磺酰基)、4-甲基苯基磺酰基(对甲苯磺酰基)、4-氯苯基磺酰基(对氯苯磺酰基)、4-溴苯基磺酰基(对溴苯磺酰基)、4-硝基苯基(对硝基苯磺酰基)、2-萘磺酸酯基(萘磺酰基)以及5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯基(丹磺酰基)。
亚磺酸(亚磺酸基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺酸基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯基(亚磺酸酯)：-S(＝O)OR；其中R为亚磺酸酯基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)OCH3(甲氧基亚磺酰基；亚磺酸甲酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚磺酰基；亚磺酸乙酯)。
磺酸酯基(磺酸酯)：-S(＝O)2OR，其中R为磺酸酯基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；磺酸甲酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；磺酸乙酯)。
亚磺酰基氧基：-OS(＝O)R，其中R为亚磺酰基氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1- 7烷基。亚磺酰基氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰基氧基：-OS(＝O)2R，其中R为磺酰基氧基取代基，例如C1 -7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。磺酰基氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯基)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯基)。
硫酸酯基：-OS(＝O)2OR；其中R为硫酸酯基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。硫酸酯基团的实例包括但不限于-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰基(Sulfamyl)(氨磺酰基(sulfamoyl)；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为如对于氨基所定义的氨基取代基。氨磺酰基的实例包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2以及-S(＝O)NHPh。
磺酰胺基(胺亚磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地为如对于氨基所定义的氨基取代基。磺酰胺基的实例包括但不限于-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2以及-S(＝O)2NHPh。
磺酸氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1为如对于氨基所定义的氨基取代基。磺酸胺基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺酰氨基：-NR1S(＝O)2R，其中R1为如对于氨基所定义的氨基取代基，并且R为磺酰氨基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2CH3以及-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺酰氨基：-NR1S(＝O)R，其中R1为如对于氨基所定义的氨基取代基，并且R为亚磺酰氨基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基。亚磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH3以及-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(膦)：-PR2，其中R为膦基取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2以及-P(Ph)2。
二氧磷基：-P(＝O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R为氧膦基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为C1-7烷基或C5-20芳基。氧膦基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2以及-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯基(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R为膦酸酯基取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2以及-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰基氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯基(膦酰基氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R为磷酸酯基取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2以及-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2
亚磷酸酯基：-OP(OR)2，其中R为亚磷酸酯基取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为-H、C1 -7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2以及-OP(OPh)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为亚磷酰胺取代基，例如-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰氨基团的实例包括但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2以及-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷酰胺酯基：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为磷酰胺酯基取代基，例如-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基。在一些实施方案中，R1和R2为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰胺酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2以及-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
如本文所用的术语“C3-12亚烷基”涉及通过自具有3至12个碳原子(除非另外规定)的烃化合物的同一碳原子移除两个氢原子或自具有3至12个碳原子(除非另外规定)的烃化合物的两个不同碳原子的各者移除一个氢原子获得的双齿部分，所述烃化合物为脂肪族，并且可为环状或无环，并且可为饱和、部分不饱和或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括以下论述的亚类亚烯基、亚炔基、亚环烷基等。
直链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH2)n-，其中n为3至12的整数，例如-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)以及-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-以及-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直链部分不饱和C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-以及-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH3)＝CH-、-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-以及-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如亚环戊-1,3-基)和亚环己基(例如亚环己-1,4-基)。
脂环族部分不饱和C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如亚4-环戊烯-1,3-基)、亚环己烯基(例如亚2-环己烯-1,4-基；亚3-环己烯-1,2-基；亚2,5-环己二烯-1,4-基)。
“接头”是指包含共价键或原子链的使抗体共价连接至药物部分的化学部分。非限制性示例性接头在本文描述。
术语“手性”是指分子具有镜像配偶体的不可重叠性的性质，而术语“非手性”是指分子可重叠在其镜像配偶体上。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但关于原子或基团在空间中的排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或两个以上手性中心并且分子不为彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质以及反应性。非对映异构体的混合物可在如电泳和层析的高分辨率分析程序下分离。
“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种立体异构体。
本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker编,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book公司,New York；以及Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons公司,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，即其能够使平面偏振光的平面旋转。在描述光学活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和1或(+)和(-)用于表明化合物使平面偏振光旋转的记号，其中(-)或l意指化合物为左旋的。前缀为(+)或d的化合物为右旋的。对于给定化学结构，这些立体异构体为相同的，除其为彼此的镜像以外。特定立体异构体还可被称为对映异构体，并且这类异构体的混合物常被称为对映异构混合物。对映异构体的50:50混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，其可在化学反应或过程中不存在立体选择性或立体特异性时出现。术语“外消旋混合物”和”外消旋物”是指两种对映异构物质的缺乏光学活性的等摩尔混合物。
“离去基团”是指可被另一官能团取代的官能团。某些离去基团在本领域中为熟知的，并且实例包括但不限于卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲烷磺酰基(甲磺酰基)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(三氟甲磺酸酯基)以及三氟甲基磺酸酯基。
术语“保护基”是指通常用于阻断或保护特定官能团而使化合物上的其它官能团反应的取代基。举例来说，“氨基保护基”为连接至氨基的阻断或保护化合物中的氨基官能团的取代基。适合氨基保护基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)以及9-茀基亚甲基氧基羰基(Fmoc)。对于保护基及其使用的一般性描述，参见T.W.Greene,Protective Groups in OrganicSynthesis,John Wiley&Sons,New York,1991或后期版本。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分地基于结合CD22的抗体以及包含这类抗体的免疫缀合物。本发明的抗体和免疫缀合物例如适用于诊断或治疗CD22阳性癌症。
A.示例性抗CD22抗体
在一些实施方案中，提供结合CD22的分离抗体。CD22为一种在成熟分化阶段在B细胞表面上表达的135-kDa B细胞限制性唾液酸糖蛋白。CD22表达于各种B细胞相关病症和癌症，包括各种淋巴瘤，如非霍奇金氏淋巴瘤中。
具有信号序列(氨基酸1至19)的一种示例性天然存在的人CD22前体序列提供于SEQ ID NO:28中，并且相应成熟CD22序列显示于SEQ ID NO:29(对应于SEQ ID NO:28的氨基酸20至847)中。具有信号序列(氨基酸1至19)的另一示例性天然存在的人CD22前体序列提供于SEQ ID NO:30中，并且相应成熟CD22序列显示于SEQ IDNO:31(对应于SEQ ID NO:30的氨基酸20至670)中。
在某些实施方案中，抗CD22抗体结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位。非限制性示例性这类抗体包括10F4及其人源化型式。在一些实施方案中，抗CD22抗体结合人CD22。在一些实施方案中，抗CD22抗体结合人CD22和食蟹猴CD22。
在一些实施方案中，抗CD22抗体结合人CD22的亲和力为≤10nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。非限制性示例性这类抗体包括mu10F4、hu10F4v1以及hu10F4v3，其结合人CD22的亲和力分别为2.4nM、1.1-1.7nM和1.6nM。参见例如US 2008/0050310。
测定
为确定抗CD22抗体是否“结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位”，使具有N末端和C末端缺失的CD22多肽在CHO细胞中表达并且如先前所述，通过FACS测试抗体与截短多肽的结合。参见例如US 2008/0050310。相对于与在CHO细胞中表达的全长CD22的结合，抗体与截短多肽的结合实质性降低(≥70％降低)或消除指示抗体不结合所述截短多肽。
使用在表面上表达CD22的CHO细胞，在竞争测定中使用连续稀释的未标记抗CD22抗体来确定抗CD22抗体是否”以≤10nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM的亲和力进行结合”。参见例如US2008/0050310。抗体的结合亲和力KD可根据利用非线性曲线拟合程序进行的标准斯卡查德(Scatchard)分析来确定(参见例如Munson等,Anal Biochem,107:220-239,1980)。
抗体10F4和其它实施方案
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗CD22抗体或免疫缀合物：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗CD22抗体或免疫缀合物：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的抗体或免疫缀合物：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3。在另一实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在另一实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2。在另一实施方案中，抗体包含(a)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；以及(c)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3。
另一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体或免疫缀合物：(a)包含选自SEQ IDNO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。另一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体或免疫缀合物：(a)包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本发明的抗体或免疫缀合物包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，以及(iii)包含选自SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。另一方面，本发明的抗体或免疫缀合物包含(a)VH结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，以及(iii)包含选自SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)VL结构域，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本发明提供一种包含以下的抗体或免疫缀合物：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。另一方面，本发明提供一种包含以下的抗体或免疫缀合物：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何以上实施方案中，抗CD22抗体被人源化。在一个实施方案中，抗CD22抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且还包含人受体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在某些实施方案中，人受体构架为人VLκ1(VLKI)构架和/或VH构架VHIII。在一些实施方案中，人源化抗CD22抗体包含(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，人源化抗CD22抗体包含(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，抗CD22抗体包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含所述序列的抗CD22抗体保留结合CD22的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7中，总计1至10个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7中，总计1至5个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中，取代、***或缺失发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。
任选地，抗CD22抗体包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，以及(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供一种抗CD22抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列，与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含所述序列的抗CD22抗体保留结合CD22的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:8中，总计1至10个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:8中，总计1至5个氨基酸已被取代、***和/或缺失。在某些实施方案中，取代、***或缺失发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗CD22抗体包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，提供一种抗CD22抗体，其中所述抗体包含如任何以上提供的实施方案中的VH以及如任何以上提供的实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含分别SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:23中的重链序列和轻链序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别SEQID NO:26和SEQ ID NO:23中的重链序列和轻链序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:23中的重链序列和轻链序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:23中的重链序列和轻链序列，包括那些序列的翻译后修饰。
另一方面，本发明提供一种与本文提供的抗CD22抗体结合相同表位的抗体或免疫缀合物。举例来说，在某些实施方案中，提供一种与包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列的抗CD22抗体结合相同表位的抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:28的来自氨基酸20至240、在氨基酸20至240内或与氨基酸20至240重叠的表位的抗体。
在本发明的另一方面，根据任何以上实施方案的抗CD22抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗CD22抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，抗体大体上是全长抗体，例如IgG1抗体或如本文定义的其它抗体类别或同种型。
在任何上述免疫缀合物中，抗体可缀合至药物部分。在一些实施方案中，抗体缀合至细胞毒性剂。在一些这类实施方案中，细胞毒性剂是吡咯并苯并二氮杂(PBD)，如PBD二聚体。本文论述各种非限制性示例性PBD二聚体。
另一方面，根据任何以上实施方案的抗CD22抗体或免疫缀合物可并有单一或呈组合形式的如以下章节1-7中所述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM，并且任选地是≥10-13M。(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd是如以下测定所述，通过用目标抗体的Fab型式及其抗原进行放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量。Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过在一滴定系列的未标记抗原存在下，使Fab与最小浓度的(125I)标记抗原平衡，接着用抗Fab抗体涂布的盘捕获所结合抗原来测量(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH9.6)涂布过夜，并且随后在室温(约23℃)下用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS阻断2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的连续稀释液混合(例如与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。接着将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可持续较长时期(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板中以在室温下孵育(例如1小时)。接着移除溶液并且用含0.1％聚山梨醇酯20 的PBS将板洗涤八次。当板已干燥时，每孔添加150μl闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板持续10分钟计数。选择各Fab的实现小于或等于最大结合的20％的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一个实施方案，使用或(BIAcore公司,Piscataway,NJ)，用固定的抗原CM5芯片在约10反应单位(RU)下在25℃下使用表面等离子体共振测定来测量Kd。简言之，根据供应商的说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后在流速5μl/分钟下注射以实现约10反应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应基团。对于动力学测量，在25℃下在流速约25μl/分钟下注射Fab于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感器图，使用简单一对一朗缪尔结合模型(评估软件第3.2版)计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率k解离/k缔合。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果由以上表面等离子体共振测定获得的缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术来测定缔合速率，所述技术测量在如在分光计(如停流配备分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的递增浓度的抗原存在下，在25℃下于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段以及下述其它片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含结合表位残基的补救受体并且体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段的论述，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是可为二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis公司,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及如本文所述，通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如描述于美国专利号4,816,567中；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已自亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来说，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中例如CDR的HVR(或其部分)源于非人抗体，并且FR(或其部分)源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如综述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步例如描述于Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321以及7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)中。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的构架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的构架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人生殖系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及由筛选FR文库获得的构架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生。人抗体通常描述于van Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人抗体可通过向已经修改以响应于抗原激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。这类动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其置换内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在这类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。对于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870以及描述技术的美国专利申请公布号US 2007/0061900)。来自由这类动物产生的完整抗体的人可变区可例如通过与不同人恒定区组合而进一步修饰。
人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker公司,New York,1987)；以及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其它方法包括例如描述于美国专利号7,189,826(描述自杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)以及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中的方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可通过分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。这类可变结构域序列可接着与所需人恒定结构域组合。用于自抗体文库选择人抗体的技术在以下描述。
5.文库来源的抗体
抗体可通过筛选组合文库中具有一或多种所需活性的抗体来分离。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库和筛选这类文库中具有所需结合特征的抗体的方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且例如进一步描述于McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆VH和VL基因的谱系并且随机重组于噬菌体文库中，可接着筛选所述文库中的抗原结合噬菌体，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常呈现呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆(例如自人克隆)天然谱系以提供单一来源的针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的抗体而不进行任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，天然文库还可通过以下方式合成制备：自干细胞克隆未重排V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变CDR3区并且在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936以及2009/0002360。
自人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个结合特异性是针对CD22并且另一个是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合CD22的两个不同表位。双特异性抗体还可用于使细胞毒性剂定位于表达CD22的细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))；WO 93/08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))以及“孔中钮(knob-in-hole)”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体还可通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc异二聚分子的静电牵引效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980以及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用性FAb”或“DAF”，其包含结合CD22以及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。可对缺失、***以及取代进行任何组合以获得最终构建体，其条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合性。
a)取代、***和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代性诱变的目标位点包括HVR和FR。保守性取代展示于表1中的标题“优选取代”下。更实质性变化提供于表1中的标题“示例性取代”下，并且如以下关于氨基酸侧链类别进一步所描述。氨基酸取代可引入目标抗体中并且筛选具有所需活性(例如保留/改进的抗原结合性、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)的产物。
表1
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
可根据共同侧链特性对氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要将这些类别之一的成员更换成另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般来说，选择用于进一步研究的所得一种或多种变体相对于亲本抗体将在某些生物特性方面具有改变(例如改进)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将大体上保留亲本抗体的某些生物特性。一种示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变并且使变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在HVR中进行改变(例如取代)例如以改进抗体亲和力。可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间以高频率经受突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行这类改变，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并自其进行再选择来实现亲和力成熟已例如描述于Hoogenboom等Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编著,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一者将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。接着产生二级文库。接着筛选文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性地鉴别抗原结合中涉及的HVR残基。具体地说，通常以CDR-H3和CDR-L3为靶标。
在某些实施方案中，取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。这类改变可在HVR“热点”或SDR以外。在以上提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种适用于鉴别抗体的可作为诱变的靶标的残基或区域的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述。在此方法中，鉴别某一残基或一组靶残基(例如带电荷残基，如arg、asp、his、lys以及glu)并且置换为中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置上引入进一步取代。或者或另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴别抗体与抗原之间的接触点。这类接触残基和相邻残基可作为取代候选物而被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列***包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合、以及具有单一或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如用于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。对抗体添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得产生或移除一个或多个糖基化位点来方便地实现。
当抗体包含Fc区时，可改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含通常通过N-键联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297的支链双触角寡糖。参见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖以及唾液酸、以及连接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的海藻糖。在一些实施方案中，可对抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)连接至Fc区的海藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。举例来说，海藻糖在所述抗体中的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如通过MALDI-TOF质谱法所测量，通过相对于连接至Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合以及高甘露糖结构)的总和计算Asn297上的糖链内海藻糖的平均量来测定海藻糖的量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的Eu编号)上的天冬酰胺残基；然而，Asn297还可由于抗体中的微小序列变化而位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。这类海藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。与“去海藻糖基化”或“海藻糖缺乏”抗体变体相关的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质海藻糖基化作用的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；以及WO 2004/056312A1，Adams等,尤其在实例11中)以及敲除细胞系，如α-1,6-海藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
进一步提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖是由GlcNAc二等分。这类抗体变体可具有降低的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。这类抗体变体的实例例如描述于WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；以及US 2005/0123546(Umana等)中。还提供在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可具有改进的CDC功能。这类抗体变体例如描述于WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些而非所有效应功能的抗体变体，所述效应功能使所述抗体变体成为抗体的体内半衰期较为重要但某些效应功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用所需要的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII以及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3中。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法，(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司Mountain View,CA)；以及非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。适用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可例如在动物模型，如Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型中进行体内评估。还可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327以及329中的一个或多个被取代的抗体(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297以及327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
与FcR的结合改进或削弱的某些抗体变体已有描述。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312以及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改进ADCC的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中进行导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即改进或削弱)的改变，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
半衰期增加并且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合改进的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)中。那些抗体包含其中具有一个或多个改进Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。这类Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351，涉及Fc区变体的其它实例。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“硫代单抗(thioMAb)”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基从而定位在抗体的可及位点处并且可用于使抗体缀合至其它部分(如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，任一个或多个以下残基可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。抗CD22抗体的非限制性示例性半胱氨酸工程化重链和轻链在图3(SEQ ID NO:25至27)中示出。可如例如美国专利号7,521,541中所述来产生半胱氨酸工程化抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文提供的抗体可进行进一步修饰以含有本领域中已知且容易获得的另外非蛋白质部分。适于使抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可具有制造优势。所述聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化或未支化的。连接至抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接多于一个聚合物，则其可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于待改进的抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在限定条件下用于疗法中等考虑因素进行确定。
在另一个实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但会将非蛋白质部分加热至邻近于抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物来产生抗体。在一个实施方案中，提供编码本文所述的抗CD22抗体的分离核酸。所述核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一或多种包含所述核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供一种包含所述核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备抗CD22抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如以上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地自所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
对于重组产生抗CD22抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸并且将其***一种或多种载体中以用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。所述核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和测序。
适于克隆或表达抗体编码性载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。举例来说，抗体可在细菌中产生，具体地说当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199以及5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后，抗体可自细菌细胞糊状物分离于可溶性部分中并且可进一步纯化。
除原核生物的外，如丝状真菌或酵母的真核微生物还为适于抗体编码性载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已经“人源化”、从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴别众多可结合昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物还可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978以及6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞还可用作宿主。举例来说，适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为适用的。适用哺乳动物宿主细胞系的其它实例为通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠赛托利细胞(sertoli cell)(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其它适用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定
可通过本领域中已知的各种测定来鉴别、筛选或表征本文提供的抗CD22抗体的物理/化学特性和/或生物活性。
在一方面，例如通过已知方法，如ELISA、FACS或蛋白质印迹法(Western blot)来测试抗体的抗原结合活性。
另一方面，竞争测定可用于鉴别与本文所述的任何抗体竞争结合CD22的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合由本文所述的抗体所结合的同一表位(例如线性或构象表位)。对抗体所结合的表位作图的详述示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一个示例性竞争测定中，在包含结合CD22的第一标记抗体(例如本文所述的任何抗体)和要测试与所述第一抗体竞争结合CD22的能力的第二未标记抗体的溶液中孵育固定的CD22。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体而无第二未标记抗体的溶液中孵育固定的CD22。在允许第一抗体结合CD22的条件下孵育之后，移除过量未结合抗体，并且测量与固定的CD22缔合的标记的量。如果相对于对照样品，与固定的CD22缔合的标记的量在测试样品中实质上降低，则指示第二抗体与第一抗体竞争结合CD22。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含缀合至一种或多种细胞毒性剂的本文抗CD22抗体的免疫缀合物，所述细胞毒性剂为如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素；或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
免疫缀合物允许药物部分靶向递送至肿瘤，并且在一些实施方案中，允许在肿瘤中细胞内积聚，其中全身性施用未缀合药物可对正常细胞造成不可接受程度的毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion inPharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)通过使有效细胞毒性药物靶向抗原表达性肿瘤细胞(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004)，从而通过使功效最大化并且使脱靶毒性最小化来增强治疗指数(Carter,P.J.和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)而为组合抗体与细胞毒性药物两者的特性的靶向化学治疗分子。
本发明的ADC化合物包括具有抗癌活性的化合物。在一些实施方案中，ADC化合物包括缀合(即共价连接)至药物部分的抗体。在一些实施方案中，抗体通过接头共价连接至药物部分。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)将有效剂量的药物选择性递送至肿瘤组织，从而可实现较高选择性(即较低有效剂量)，同时增加治疗指数(“治疗窗”)。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物部分(D)可包括具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团。示例性药物部分包括但不限于吡咯并苯并二氮杂(PBD)及其具有细胞毒性活性的衍生物。以下进一步详细论述这类免疫缀合物的非限制性实例。
1.示例性抗体-药物缀合物
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的一个示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物部分(D)、以及使Ab连接至D的接头部分(L)。在一些实施方案中，抗体通过一个或多个氨基酸残基(如赖氨酸和/或半胱氨酸)连接至接头部分(L)。
一种示例性ADC具有式I：
Ab-(L-D)p    I
其中p为1至约20。在一些实施方案中，可缀合至抗体的药物部分的数目受限于游离半胱氨酸残基的数目。在一些实施方案中，通过本文所述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。示例性式I的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个工程化半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基在不使用工程化下已存在于抗体中，在所述情况下，现存游离半胱氨酸残基可用于使抗体缀合至药物。在一些实施方案中，使抗体暴露于还原条件，随后进行抗体缀合以产生一个或多个游离半胱氨酸残基。
a)示例性接头
“接头”(L)为可用于使一个或多个药物部分(D)连接至抗体(Ab)以形成式I抗体-药物缀合物(ADC)的双官能或多官能部分。在一些实施方案中，可使用具有可供共价连接至药物和抗体的反应性官能团的接头来制备抗体-药物缀合物(ADC)。举例来说，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。
一方面，接头具有能够与存在于抗体上的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。非限制性示例性这类反应性官能团包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、活化酯(如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酸氯化物、磺酰氯、异氰酸酯以及异硫氰酸酯。参见例如Klussman等(2004),Bioconjugate Chemistry15(4):765-773的第766页的缀合方法和本文中的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与存在于抗体上的亲电子基团反应的官能团。示例性这类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单元形成共价键。非限制性示例性这类反应性官能团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、硫代缩氨基脲、肼羧酸酯以及芳基酰肼。
接头可包含一种或多种接头组分。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苯甲基氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)以及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(“MCC”)。各种接头组分在本领域中为已知的，其中一些在以下描述。
接头可为有助于释放药物的“可裂解接头”。非限制性示例性可裂解接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定接头或含有二硫化物的接头(Chari等,CancerResearch 52:127-131(1992)；US 5208020)。
在某些实施方案中，接头具有下式II：
-Aa-Ww-Wy-      II
其中A为“延伸子单元”，并且a为整数0至1；W为“氨基酸单元”，并且w为整数0至12；Y为“间隔区单元”，并且y为0、1或2。包含式II接头的ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab、D以及p是如上对于式I所定义。这类接头的示例性实施方案描述于美国专利号7,498,298中，所述专利以引用的方式明确并入本文中。
在一些实施方案中，接头组分包含使抗体连接至另一接头组分或药物部分的“延伸子单元”(A)。以下示出非限制性示例性延伸子单元(其中波形线指示与抗体、药物或其它接头组分共价连接的位点)：
在一些实施方案中，接头组分包含“氨基酸单元”(W)。在一些这类实施方案中，氨基酸单元允许接头由蛋白酶裂解，从而有助于在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)时自免疫缀合物释放药物(Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；以及N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。氨基酸单元可针对由特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶(plasmin)蛋白酶)酶促裂解进行设计和优化。
通常，肽型接头可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这类肽键可例如根据液相合成方法制备(例如E.和K.Lübke(1965)“The Peptides”,第1卷,第76-136页,Academic Press)。
在一些实施方案中，接头组分包含使抗体直接或通过延伸子单元和/或氨基酸单元连接至药物部分的“间隔区”单元。间隔区单元可为“自我牺牲型”或“非自我牺牲型”。“非自我牺牲型”间隔区单元为间隔区单元的一部分或全部在ADC裂解后仍然保持结合于药物部分的间隔区单元。非自我牺牲型间隔区单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔区单元和甘氨酸-甘氨酸间隔区单元。在一些实施方案中，肿瘤细胞相关蛋白酶酶促裂解含有甘氨酸-甘氨酸间隔区单元的ADC会导致甘氨酸-甘氨酸-药物部分自ADC的其余部分释放。在一些这类实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物部分在肿瘤细胞中经受水解步骤，由此自药物部***解甘氨酸-甘氨酸间隔区单元。
“自我牺牲型”间隔区单元允许释放药物部分。在某些实施方案中，接头的间隔区单元包含对氨基苯甲基单元。在一些这类实施方案中，对氨基苯甲醇通过酰胺键连接至氨基酸单元，并且在苯甲醇与药物之间形成氨基甲酸酯、氨基甲酸甲酯或碳酸酯(Hamann等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中，间隔区单元包含对氨基苯甲基氧基羰基(PAB)。在一些实施方案中，包含自我牺牲型接头的ADC具有结构：
其中Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为在0至4的范围内的整数；X可为一个或多个其它间隔区单元或可不存在；并且p在1至约20的范围内。在一些实施方案中，p在1至10、1至7、1至5、或1至4的范围内。非限制性示例性X间隔区单元包括：
及其中R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1和R2各自为-CH3。
自我牺牲型间隔区的其它实例包括但不限于在电子方面与PAB基团类似的芳香族化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利号7,375,078；Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻氨基苯甲基缩醛或对氨基苯甲基缩醛。在一些实施方案中，可使用在酰胺键水解时经受环化的间隔区，如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等(1995)Chemistry Biology 2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环***(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)以及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基的α-碳的键联为可适用于ADC中的自我牺牲型间隔区的另一实例(Kingsbury等(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在一些实施方案中，接头L可为用于通过支链多官能接头部分使多于一个药物部分共价连接至抗体的树枝型接头(Sun等(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。树枝状接头可增加药物与抗体的摩尔比，即载量，其与ADC的效力相关。因此，当抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基时，众多药物部分可通过树枝状接头连接。
非限制性示例性接头在下文在式I的ADC的上下文中示出：
其中R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1和R2各自为-CH3。
其中n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。
其它非限制性示例性ADC包括结构：
其中X为：
Y为：
各R独立地为H或C1-C6烷基；并且n为1至12。
在一些实施方案中，接头被调节溶解性和/或反应性的基团取代。作为一个非限制性实例，如磺酸酯基(-SO3 -)或铵的带电荷取代基可增加接头试剂的水溶性并且有助于接头试剂与抗体和/或药物部分的偶联反应，或有助于Ab-L(抗体-接头中间体)与D、或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，取决于制备ADC的合成途径。在一些实施方案中，接头的一部分偶联至抗体并且接头的一部分偶联至药物，并且接着使Ab-(接头部分)a偶联至药物-(接头部分)b以形成式I的ADC。
本发明化合物明确涵盖但不限于用以下接头试剂制备的ADC：双-马来酰亚胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、3-(溴乙酰胺基)丙酸琥珀酰亚胺基酯(SBAP)、碘乙酸琥珀酰亚胺基酯(SIA)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸]琥珀酰亚胺基酯(SMPH)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，并且包括双-马来酰亚胺试剂：二硫代双马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(以下示出)以及BM(PEG)3(以下示出)；亚氨酸脂的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施方案中，双-马来酰亚胺试剂允许抗体中的半胱氨酸的硫醇基连接至含硫醇药物部分、接头或接头-药物中间体。可与硫醇基反应的其它官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯以及异硫氰酸酯。
某些适用接头试剂可自各种商业来源，如Pierce Biotechnology公司(Rockford,IL)、Molecular Biosciences公司(Boulder,CO)获得，或可根据本领域中(例如Toki等(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchik等(1997)Tetrahedron Letters,38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frisch等(1996)Bioconjugate Chem.7:180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；以及WO 04/032828)中所述的工序合成。
碳-14-标记的1-异硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种用于使放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)示例性药物部分
在一些实施方案中，ADC包含吡咯并苯并二氮杂(PBD)。在一些实施方案中，PBD二聚体识别并且结合特定DNA序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种PBD)最初在1965年报道(Leimgruber等,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795；Leimgruber等,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。自此，报道了许多PBD(天然存在的PBD与类似物两者)(Thurston等,(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三环PBD骨架的二聚体(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。在不意图受任何特定理论束缚下，据信二聚体结构会赋予适当三维形状以与B型DNA的小沟实现等螺旋性，从而在结合位点处产生适贴配合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。携带C2芳基取代基的二聚PBD化合物已显示适用作细胞毒性剂(Hartley等(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard等(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters19(22):6463-6466)。
已使PBD二聚体缀合至抗体并且所得ADC显示具有抗癌特性。PBD二聚体上的非限制性示例性键联位点包括五元吡咯并环、PBD单元之间的系链、以及N10-C11亚胺基团(WO 2009/016516；US2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC的非限制性示例性PBD二聚体组分具有式A：
及其盐和溶剂化物，其中：
波形线指示与接头的共价连接位点；
虚线指示任选在C1与C2或C2与C3之间存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR，并且任选地进一步选自卤代或二卤代，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H以及卤代；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
Q独立地选自O、S以及NH；
R11为H或R或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基，并且任选地就基团NRR’而言，R和R’连同它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环；
R12、R16、R19以及R17为分别如对于R2、R6、R9以及R7所定义；
R″为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子(例如O、S、N(H)、NMe)和/或芳香族环(例如苯或吡啶)间断，所述环是任选取代的；以及
X和X’独立地选自O、S以及N(H)。
在一些实施方案中，R9和R19为H。
在一些实施方案中，R6和R16为H。
在一些实施方案中，R7和R17均为OR7A，其中R7A为任选取代的C1-4烷基。在一些实施方案中，R7A为Me。在一些实施方案中，R7A为CH2Ph，其中Ph为苯基。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，R11为H。
在一些实施方案中，在各单体单元中的C2与C3之间存在双键。
在一些实施方案中，R2和R12独立地选自H和R。在一些实施方案中，R2和R12独立地为R。在一些实施方案中，R2和R12独立地为任选取代的C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些实施方案中，R2和R12独立地为任选取代的苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。在一些实施方案中，R2和R12独立地选自＝O、＝CH2、＝CH-RD以及＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CH2。在一些实施方案中，R2和R12各自为H。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝O。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CF2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立地为＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立地为＝CH-RD。
在一些实施方案中，当R2和/或R12为＝CH-RD时，各基团可独立地具有以下所示的任一构型：
在一些实施方案中，a＝CH-RD是呈构型(I)。
在一些实施方案中，R″为C3亚烷基或C5亚烷基。
在一些实施方案中，ADC的一种示例性PBD二聚体组分具有式A(I)结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种示例性PBD二聚体组分具有式A(II)结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种示例性PBD二聚体组分具有式A(III)结构：
其中RE和RE”各自独立地选自H或RD，其中RD是如上所定义；并且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，RE和/或RE”为H。在一些实施方案中，RE和RE”为H。在一些实施方案中，RE和/或RE”为RD，其中RD为任选取代的C1-12烷基。在一些实施方案中，RE和/或RE”为RD，其中RD为甲基。
在一些实施方案中，ADC的一种示例性PBD二聚体组分具有式A(IV)结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1和Ar2可相同或不同；并且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的一种示例性PBD二聚体组分具有式A(V)结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1和Ar2可相同或不同；并且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地选自任选取代的苯基、呋喃基、苯硫基以及吡啶基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的苯基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可通过任何可用环位置结合于PBD核心。举例来说，喹啉基可为喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基以及喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基以及异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。
ADC的其它非限制性示例性PBD二聚体组分具有式B：
及其盐和溶剂化物，其中：
波形线指示与接头的共价连接位点；
连接至OH的波形线指示S或R构型；
RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基(所述苯基可任选被氟取代，具体地说在4位中被取代)以及C5-6杂环基；其中RV1和RV2可相同或不同；并且
n为0或1。
在一些实施方案中，RV1和RV2独立地选自H、苯基以及4-氟苯基。
在一些实施方案中，接头可连接在PBD二聚体药物部分的各位点中的一处，包括B环的N10亚胺、C环的C-2内/外位置、或连接A环的系链单元(参见以下结构C(I)和C(II))。
ADC的非限制性示例性PBD二聚体组分包括式C(I)和C(II)：
式C(I)和C(II)以其N10-C11亚胺形式示出。示例性PBD药物部分还包括甲醇胺和受保护的甲醇胺形式，如下表中所示：
其中：
X为CH2(n＝1至5)、N或O；
Z和Z’独立地选自OR和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烷基链；
R1、R’1、R2和R’2各自独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括取代的芳基)、C5-20杂芳基、-NH2、-NHMe、-OH以及-SH，其中，在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含至多5个碳原子；
R3和R’3独立地选自H、OR、NHR以及NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烷基链；
R4和R’4独立地选自H、Me以及OMe；
R5选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括被卤代、硝基、氰基、烷氧基、烷基、杂环基取代的芳基)以及C5-20杂芳基，其中，在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含至多5个碳原子；
R11为H、C1-C8烷基或保护基(如乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)、9-茀基亚甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自我牺牲型单元的部分，如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；
R12为H、C1-C8烷基或保护基；
其中R1、R’1、R2、R’2、R5或R12中之一的氢或A环之间的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-间隔区的氢被连接至ADC的接头的键置换。
ADC的示例性PBD二聚体部分包括但不限于(波形线指示与接头共价连接的位点)：
在一些实施方案中，包含PBD二聚体的抗体-药物缀合物具有式(D)结构：
及其盐和溶剂化物，其中：
虚线指示任选在C1与C2或C2与C3之间存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR，并且任选地进一步选自卤代或二卤代；其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H以及卤代；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
Y选自单键和式a1或a2基团：
其中N显示基团结合PBD部分的N10的位置；
RL1和RL2独立地选自H和甲基，或连同它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基；
CBA表示抗体；
Q独立地选自O、S和NH；
R11为H或R或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基，并且任选地就基团NRR’而言，R和R’连同它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环；
其中R12、R16、R19以及R17是分别如对于R2、R6、R9及R7所定义；
其中R″为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个例如O、S、N(H)、NMe的杂原子和/或例如苯或吡啶的芳香族环间断，所述环是任选取代的；
X和X’独立地选自O、S以及N(H)。
在一些实施方案中，抗体通过半胱氨酸连接至PBD二聚体以形成二硫键联，此例如在图4B和4C中示出。
在一些实施方案中，取决于Y，式D选自下式D-I、D-II以及D-III：
在式A化合物中：
为硫连接基团。
在一些实施方案中，ADC包含结构：
并且在一些实施方案中，ADC包含结构：
其中CBA为抗体，并且n为0或1。Y、RL1和RL2是如先前所定义，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在任何上述实施方案中，适当时可如下定义某些取代基：
n为0；
n为1；
RE为H；
RE为RD，其中RD为任选取代的烷基；
RE为RD，其中RD为甲基；
RL1及RL2为H；
RL1和RL2为Me。
在一些实施方案中，ADC包含结构：
并且在一些实施方案中，ADC包含结构：
其中CBA为抗体，并且n为0或1。Y、RL1和RL2是如先前所定义，并且Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基。Ar1和Ar2可相同或不同。
在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地选自任选取代的苯基、呋喃基、苯硫基以及吡啶基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自为任选取代的苯基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自为任选取代的喹啉基或异喹啉基。
在各种实施方案中，喹啉基或异喹啉基可通过任何可用环位置结合至PBD核心。举例来说，喹啉基可为喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基以及喹啉-8-基。在这类喹啉基中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可为优选的。异喹啉基可为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基以及异喹啉-8-基。在这类异喹啉基中，异喹啉-3-基和异喹啉-6-基可为优选的。
在一些实施方案中，ADC包含结构：
并且在一些实施方案中，ADC包含结构：
其中CBA为抗体，并且n为0或1。Y、RL1和RL2是如先前所定义，并且RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基(所述苯基可任选被氟取代，在一些实施方案中，在4位中被取代)以及C5-6杂环基。RV1和RV2可相同或不同。在一些实施方案中，RV1和RV2可独立地选自H、苯基以及4-氟苯基。
包含PBD二聚体的ADC的非限制性示例性实施方案具有以下结构：
n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。在一些实施方案中，n选自4、5、6、7和8。
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab和PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab的接头可被蛋白酶裂解。
包含PBD二聚体的ADC的非限制性示例性实施方案具有以下结构：
PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC可根据本领域中已知的方法和本文所述的方法制备。参见例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598。
c)药物负载量
药物负载量由p，即式I分子中每个抗体所对应的药物部分的平均数表示。药物负载量可在每个抗体1至20个药物部分(D)的范围内。式I ADC包括缀合有一定范围(1至20个)的药物部分的抗体的集合。由缀合反应获得的ADC制剂中每个抗体所对应的药物部分的平均数可通过如质谱法、ELISA测定和HPLC的常规手段表征。还可测定用p表示的ADC的定量分布。在一些情况下，自具有其它药物负载量的ADC分离、纯化和表征p为某一数值的均质ADC可通过如反相HPLC或电泳的手段来实现。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受限于抗体上连接位点的数目。举例来说，当连接为如以上某些示例性实施方案中的半胱氨酸硫醇时，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有可供连接接头的一个或若干个具有足够反应性的硫醇基。在某些实施方案中，较高药物负载量(例如p>5)可导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶、毒性或细胞渗透性降低。在某些实施方案中，ADC的平均药物负载量在1至约8；约2至约6；或约3至约5的范围内。实际上，已显示对于某些ADC，每个抗体所对应的药物部分的最佳比率可小于8，并且可为约2至约5(US 7498298)。
在某些实施方案中，少于理论最大值的药物部分在缀合反应过程中缀合至抗体。抗体可含有例如不与如下论述的药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基。一般来说，抗体不含许多可连接至药物部分的游离和反应性半胱氨酸硫醇基；实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，抗体可用如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原性条件下还原以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，使抗体经受变性条件以显现反应性亲核基团，如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载量(药物/抗体比率)可以不同方式并且例如通过以下进行控制：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)部分或限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原性条件。
应了解当多于一个亲核基团与药物-接头中间体或接头试剂反应时，则所得产物为具有一定分布的一个或多个连接至抗体的药物部分的ADC化合物的混合物。每个抗体所对应的药物的平均数可通过对抗体具有特异性且对药物具有特异性的双重ELISA抗体测定自混合物计算。可通过质谱法鉴别混合物中的单独ADC分子并且通过HPLC(例如疏水性相互作用层析)进行分离(参见例如McDonagh等(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等“Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30antibody-drug conjugate,”摘要编号624,American Association for Cancer Research,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月；Alley,S.C.等“Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,”摘要编号627,American Association for Cancer Research,2004年年会,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月)。在某些实施方案中，具有单一负载量值的均质ADC可通过电泳或层析自缀合混合物分离。
d)某些制备免疫缀合物的方法
式I ADC可采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，通过若干途径制备，包括：(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成Ab-L，随后与药物部分D反应；以及(2)药物部分的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。通过后述途径制备式I ADC的示例性方法描述于US 7498298中，所述专利以引用的方式明确并入本文中。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，以及(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。胺基、硫醇基和羟基具有亲核性并且能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯以及酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，如卤代乙酰胺；以及(iii)醛、酮、羧基以及马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂处理以使抗体完全或部分还原来使抗体具有反应性以供与接头试剂缀合。各半胱氨酸桥因此将在理论上形成两个反应性硫醇亲核体。其它亲核基团可通过修饰赖氨酸残基，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特氏试剂(Traut’s reagent))反应，从而使胺转化成硫醇，而引入抗体中。反应性硫醇基还可通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基而引入抗体中(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)。
本发明的抗体-药物缀合物还可通过抗体上的亲电子基团(如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来产生。接头试剂上的适用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、硫代缩氨基脲、肼羧酸酯以及芳基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。在另一个实施方案中，糖基化抗体的糖可例如用高碘酸盐氧化试剂氧化以形成可与接头试剂或药物部分的胺基反应的醛或酮基团。所得亚胺希夫碱(Schiff base)基团可形成稳定键联，或可例如由硼氢化物试剂还原以形成稳定胺键联。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在抗体中产生可与药物上的适当基团反应的羰基(醛和酮)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可与偏高碘酸钠反应，从而产生醛替代第一氨基酸(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。可使这种醛与药物部分或接头亲核体反应。
药物部分上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、硫代缩氨基脲、肼羧酸酯以及芳基酰肼基团，其能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯以及酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基以及马来酰亚胺基团。
可用于制备ADC的非限制性示例***联试剂在本文中描述于标题为“示例性接头”的章节中。使用这类交联试剂来连接两个部分(包括蛋白质部分和化学部分)的方法在本领域中为已知的。在一些实施方案中，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。重组DNA分子可包含编码缀合物的抗体和细胞毒性部分的区域，所述区域彼此相邻或由编码不会破坏缀合物的所需特性的接头肽的区域分开。
在另一个实施方案中，抗体可缀合至“受体”(如抗生物素蛋白链菌素(streptavidin))以用于肿瘤预靶向中，其中向患者施用抗体-受体缀合物，随后使用清除剂自循环移除未结合缀合物并且接着施用缀合至细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生物素蛋白(avidin))。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗CD22抗体均适用于检测生物样品中CD22的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物样品”包括例如细胞或组织，(例如活组织检查材料，包括癌性或潜在癌性淋巴组织，包括来自患有或怀疑患有B细胞病症和/或B细胞增生性病症的受试者的组织，所述B细胞病症和/或B细胞增生性病症包括但不限于淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，提供一种用于诊断或检测方法中的抗CD22抗体。另一方面，提供一种检测生物样品中CD22的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使生物样品与如本文所述的抗CD22抗体在允许所述抗CD22抗体结合CD22的条件下接触，以及检测在所述抗CD22抗体与所述生物样品中的CD22之间是否形成复合物。这种方法可为体外或体内方法。在一个实施方案中，抗CD22抗体用于选择适于用抗CD22抗体治疗的受试者，例如当CD22为用于选择患者的生物标记物时。在另一个实施方案中，生物样品为细胞或组织，(例如癌性或潜在癌性淋巴组织，包括患有或怀疑患有B细胞病症和/或B细胞增生性病症的受试者的组织，所述B细胞病症和/或B细胞增生性病症包括但不限于淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。
在另一个实施方案中，例如出于诊断、预测或分级癌症；确定适当疗程；或监测癌症对疗法的反应的目的，体内使用抗CD22抗体以例如通过体内成像来检测受试者的CD22阳性癌症。本领域中已知的一种用于体内检测的方法为免疫正电子发射断层摄影术(免疫PET)，如例如van Dongen等,The Oncologist 12:1379-1389(2007)和Verel等,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所述。在这类实施方案中，提供一种用于检测受试者的CD22阳性癌症的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有CD22阳性癌症的受试者施用标记的抗CD22抗体，以及检测所述受试者中的所述标记的抗CD22抗体，其中检测到所述标记的抗CD22抗体指示在所述受试者中存在CD22阳性癌症。在某些这类实施方案中，标记的抗CD22抗体包含缀合至如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr以及124I的正电子发射体的抗CD22抗体。在一个具体实施方案中，正电子发射体为89Zr。
在其它实施方案中，诊断或检测方法包括使固定至基质的第一抗CD22抗体与待测试CD22的存在的生物样品相接触，使所述基质暴露于第二抗CD22抗体，以及检测所述第二抗CD22是否结合至所述第一抗CD22抗体与所述生物样品中的CD22之间的复合物。基质可为任何支撑性介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合珠粒、载片、芯片以及其它基质。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，(例如活组织检查材料，包括癌性或潜在癌性淋巴组织，包括来自患有或怀疑患有B细胞病症和/或B细胞增生性病症的受试者的组织，所述B细胞病症和/或B细胞增生性病症包括但不限于淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤)。在某些实施方案中，第一或第二抗CD22抗体为本文所述的任何抗体。
可根据任何以上实施方案诊断或检测的示例性病症包括CD22阳性癌症，如CD22阳性淋巴瘤、CD22阳性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL；包括但不限于CD22阳性侵袭性NHL、CD22阳性复发性侵袭性NHL、CD22阳性复发性无痛性NHL、CD22阳性难治性NHL以及CD22阳性难治性无痛性NHL)、CD22阳性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、CD22阳性小淋巴细胞性淋巴瘤、CD22阳性白血病、CD22阳性毛细胞白血病(HCL)、CD22阳性急性淋巴细胞性白血病(ALL)、CD22阳性伯基特氏淋巴瘤以及CD22阳性套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，CD22阳性癌症为得到大于“0”的抗CD22免疫组织化学(IHC)得分的癌症，得分“0”对应于在>90％的肿瘤细胞中染色极弱或无染色。在一些实施方案中，CD22阳性癌症以1+、2+或3+水平表达CD22，其中1+对应于在>50％赘生性细胞中实现弱染色，2+对应于在>50％赘生性细胞中实现中度染色，并且3+对应于在>50％赘生性细胞中实现强染色。在一些实施方案中，CD22阳性癌症为根据原位杂交(ISH)测定，表达CD22的癌症。在一些这类实施方案中，使用与用于IHC的计分***类似的计分***。在一些实施方案中，CD22阳性癌症为根据检测CD22mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定，表达CD22的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供标记的抗CD22抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光以及放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H以及131I、荧光团(如稀土螯合物或荧光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰基、伞形酮(umbelliferone)、荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456))、荧光素(luciferin)、2,3-二氢呔嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸去氢酶)、与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)或微过氧化物酶(microperoxidase))偶联的杂环氧化酶(如尿酸酶(uricase)和黄嘌呤氧化酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基等。在另一个实施方案中，标记为正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr以及124I。在一个具体实施方案中，正电子发射体为89Zr。
F.药物制剂
如本文所述的抗CD22抗体或免疫缀合物的药物制剂是通过混合具有所需纯度的这种抗体或免疫缀合物与一或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))制备成冻干制剂或水溶液形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性玻尿酸酶(hyaluronidase)糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International公司)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，sHASEGP与一或多种其它糖胺聚糖酶，如软骨素酶(chondroitinase)组合。
示例性冻干抗体或免疫缀合物制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体或免疫缀合物制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后述制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文制剂还可含有多于一种如为所治疗的特定适应症所必需的活性成分，优选为具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。
活性成分可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中，例如分别于胶状药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子以及纳米囊)中或于***液中的羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。这类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
待用于体内施用的制剂通常无菌。无菌性可易于例如通过经无菌过滤膜过滤来实现。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物均可用于例如治疗方法的方法中。
一方面，本文提供的抗CD22抗体或免疫缀合物用于抑制CD22阳性细胞增殖的方法中，所述方法包括在允许所述抗CD22抗体或免疫缀合物结合至所述细胞表面上的CD22的条件下使所述细胞暴露于所述抗CD22抗体或免疫缀合物，从而抑制所述细胞的增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外或体内方法。在一些实施方案中，细胞为B细胞。在一些实施方案中，细胞为赘生性B细胞，如淋巴瘤细胞或白血病细胞。
可使用可自Promega(Madison,WI)商购的CellTiter-GloTM发光细胞活力测定来测定体外细胞增殖抑制。所述测定基于对所存在ATP的定量来测定培养物中的活细胞数，ATP为具有代谢活性的细胞的指标。参见Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利号6602677。分析可以96或384孔格式进行，从而使得测定适用于自动高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。测定工序涉及向培养细胞中直接添加单一试剂(试剂)。这导致细胞溶解和产生由荧光素酶反应所产生的发光信号。发光信号与所存在ATP的量成比例，所存在ATP的量与培养物中存在的活细胞数成正比。数据可由光度计或CCD摄影机成像装置记录。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
另一方面，提供一种用作药剂的抗CD22抗体或免疫缀合物。在其它方面，提供一种用于治疗方法中的抗CD22抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供一种用于治疗CD22阳性癌症的抗CD22抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法中的抗CD22抗体或免疫缀合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述抗CD22抗体或免疫缀合物。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
另一方面，本发明提供抗CD22抗体或免疫缀合物用于制造或制备药剂的用途。在一个实施方案中，药剂是用于治疗CD22阳性癌症。在另一实施方案中，药剂是用于治疗CD22阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有CD22阳性癌症的个体施用有效量的所述药剂。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
另一方面，本发明提供一种用于治疗CD22阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述CD22阳性癌症的个体施用有效量的抗CD22抗体或免疫缀合物。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种如下所述的其它治疗剂。
根据任何以上实施方案的CD22阳性癌症可为例如淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，CD22阳性癌症为得到大于“0”的抗CD22免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，得分“0”对应于在>90％的肿瘤细胞中染色极弱或无染色。在另一个实施方案中，CD22阳性癌症以1+、2+或3+水平表达CD22，其中1+对应于在>50％赘生性细胞中实现弱染色，2+对应于在>50％赘生性细胞中实现中度染色，并且3+对应于在>50％赘生性细胞中实现强染色。在一些实施方案中，CD22阳性癌症为根据检测CD22mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定，表达CD22的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
在一些实施方案中，包含吡咯并苯并二氮杂细胞毒性部分的免疫缀合物适用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤，如例如通过实施例B和D中所示的异种移植物模型所证实。在一些实施方案中，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的免疫缀合物可包含具有以下结构的PBD二聚体：
其中n为0或1。在一些实施方案中，PBD二聚体通过蛋白酶可裂解接头共价连接至抗体，如图4A中所示的免疫缀合物。在一些实施方案中，PBD二聚体通过二硫化物接头共价连接至抗体，例如像图4B和4C中所示的免疫缀合物。在一些实施方案中，包含吡咯并苯并二氮杂细胞毒性部分的免疫缀合物适用于治疗套细胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤。
根据任何以上实施方案的“个体”可为人。
另一方面，本发明提供包含本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物的药物制剂，其例如用于任何以上治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物以及药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗CD22抗体或免疫缀合物以及至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
本发明的抗体或免疫缀合物可单独或与其它药剂组合用于疗法中。举例来说，本发明的抗体或免疫缀合物可与至少一种其它治疗剂共施用。
在一些实施方案中，抗CD22免疫缀合物与抗CD79b抗体或免疫缀合物组合施用。一种非限制性示例性抗CD79b抗体或免疫缀合物包含huMA79bv28的高变区，以使得所述抗CD79b抗体或免疫缀合物包含(i)具有SEQ ID NO:32的序列的HVR H1，(ii)具有SEQ IDNO:33的序列的HVR H2，(iii)具有SEQ ID NO:34的序列的HVRH3，(iv)具有SEQ ID NO:35的序列的HVR L1，(v)具有SEQ ID NO:36的序列的HVR L2，以及(vi)具有SEQ ID NO:37的序列的HVR L3。在一些实施方案中，抗CD79b抗体或免疫缀合物包含huMA79bv28的重链可变区和轻链可变区。在一些这类实施方案中，抗CD79b抗体或免疫缀合物包含具有SEQ ID NO:38的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:39的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CD79b免疫缀合物包含选自奥利斯他汀(auristatin)、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物以及吡咯并苯并二氮杂的细胞毒性剂。在一些实施方案中，抗CD79b免疫缀合物包含选自MMAE、PNU-159682以及具有以下结构的PBD二聚体的细胞毒性剂：
其中n为0或1。在一些实施方案中，抗CD79b免疫缀合物选自例如US 8,088,378B2中所述的硫代huMA79bv28HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE免疫缀合物；硫代huMA79bv28HC S400C-MC-val-cit-PAB-MMAE免疫缀合物；硫代huMA79bv28LC V205C-MC-val-cit-PAB-MMAE免疫缀合物；硫代huMA79bv28HC A118C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682；硫代huMA79bv28HC A118C-MC-缩醛-PNU-159682；硫代huMA79bv28HC A118C-MC-val-cit-PAB-PBD；硫代huMA79bv28HC S400C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682；硫代huMA79bv28HC S400C-MC-缩醛-PNU-159682；硫代huMA79bv28HCS400C-MC-val-cit-PAB-PBD；硫代huMA79bv28LC V205C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682；硫代huMA79bv28LC V205C-MC-缩醛-PNU-159682以及硫代huMA79bv28LC V205C-MC-val-cit-PAB-PBD。硫代huMA79bv28HC A118C的重链序列和轻链序列分别在SEQ IDNO:40和41中示出。硫代huMA79bv28HC S400C的重链序列和轻链序列分别在SEQ ID NO:43和41中示出。硫代huMA79bv28LC V205C的重链序列和轻链序列分别在SEQ ID NO:42和44中示出。除特定抗体序列的外，抗CD79b免疫缀合物的结构类似于本文和US 2008/0050310中所述的抗CD22免疫缀合物的结构。包含PNU-159682的非限制性示例性免疫缀合物具有结构：
Ab-MC-缩醛-PNU-159682
在一些实施方案中，抗CD22免疫缀合物与抗CD20抗体(裸抗体或ADC)组合施用。在一些实施方案中，抗CD20抗体为利妥昔单抗 或2H7(Genentech公司,South San Francisco,CA)。在一些实施方案中，抗CD22免疫缀合物与抗VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevicizumab)，商品名)组合施用。
其它治疗方案可与施用抗CD22免疫缀合物组合，包括但不限于放射疗法和/或骨髓和外周血液移植和/或细胞毒性剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂为一种药剂或药剂的组合，例如像环磷酰胺(cyclophosphamide)、羟基柔红霉素(hydroxyldaunorubicin)、阿霉素(adriamycin)、阿霉素(doxorubincin)、长春新碱(vincristine)(OncovinTM)、***龙(prednisolone)、CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱以及***龙的组合)、CVP(环磷酰胺、长春新碱以及***龙的组合)、或免疫治疗剂，如抗CD20剂(例如利妥昔单抗，商品名)、抗VEGF剂(例如贝伐单抗，商品名)、紫杉烷(taxane)(如紫杉醇和多西他赛)以及蒽环霉素(anthracycline)抗生素。
以上指示的这类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一或单独制剂中)和分开施用，在所述情况下，施用本发明的抗体或免疫缀合物可在施用其它治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体或免疫缀合物还可与放射疗法组合使用。
本发明的抗体或免疫缀合物(以及任何其它治疗剂)可通过任何适合手段施用，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且必要时，对于局部治疗而言，包括病变内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何适合途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，部分地取决于施用为短暂的还是长期的。本文涵盖各种给药方案，包括但不限于单次施用或历经各种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
本发明的抗体或免疫缀合物将以符合优良医学实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单独患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用方案以及医学从业者已知的其它因素。抗体或免疫缀合物无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。这类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型、以及以上论述的其它因素。这类药剂通常以如本文所述的相同剂量和用如本文所述的施用途径，或以本文所述的剂量的约1％至99％，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量并且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径来使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的抗体或免疫缀合物(当单独或与一种或多种其它额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体或免疫缀合物是出于预防目的还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体或免疫缀合物的反应、以及主治医师的判断。抗体或免疫缀合物适合一次或历经一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或免疫缀合物可为用于向患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次分开施用还是通过连续输注。取决于以上提及的因素，一种典型每日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于历经若干天或更长时间的重复施用，取决于病状，治疗将通常持续直至出现所需疾病症状抑制。抗体或免疫缀合物的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用一个或多个剂量的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。这类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如以使得患者接受约二至约二十、或例如约六个剂量的抗体)。可依次施用初始较高负载剂量和一次或多次较低剂量。然而，其它给药方案可能适用。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定进行监测。
在一些实施方案中，较低剂量的包含吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体的10F4v3 ADC可用于实现与较高剂量的包含MMAE部分的10F4v3 ADC相同的功效。
应了解任何以上制剂或治疗方法均可使用本发明的免疫缀合物与抗CD22抗体两者进行。
H.制品
在本发明的另一方面，提供一种含有适用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关联的标签或药品说明书。适合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉内溶液袋等。容器可由如玻璃或塑料的多种材料形成。容器容纳单独或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物组合的组合物并且可具有无菌进入端口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体或免疫缀合物。标签或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体或免疫缀合物；以及(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或另外的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品还可包括指示组合物可用于治疗特定病状的药品说明书。或者或另外，制品可还包含第二(或第三)容器，其包括药学上可接受的缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其还可包括自商业和使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
III.实例
以下为本发明的方法和组合物的实例。应了解鉴于以上提供的一般性描述，可实施各种其它实施方案。
A.抗CD22抗体药物缀合物的产生
抗CD22抗体10F4和包括人源化变体hu10F4v1和hu10F4v3的某些变体例如描述于US 2008/0050310中。抗体10F4、hu10F4v1和hu10F4v3包含SEQ ID NO:9、10和11的重链HVR(分别为HVR H1、HVR H2和HVR H3)。抗体10F4和hu10F4v1包含SEQ ID NO:12、13和14的轻链HVR(分别为HVR L1、HVF L2和HVR L3)。Hu10F4v3包含SEQ ID NO:15、13和14的轻链HVR(分别为HVR L1、HVF L2和HVR L3)，其中hu10F4v3的HVR L1相对于10F4和10F4v1的HVR L1包含单一氨基酸变化(N28V)。发现三种抗体对人CD22的结合亲和力类似(在1.4nM至2.3nM的范围内)。在hu10F4v1的HVR L1中进行某些其它氨基酸取代，并且所述取代在SEQ ID NO:16至22中示出。包含那些HVR L1序列中的每一个的抗体对人CD22的结合亲和力自hu10F4v1的结合亲和力变化小于2倍。参见例如US2008/0050310。
对于较大规模的抗体产生，在CHO细胞中产生抗体。将编码VL和VH的载体转染至CHO细胞中并且通过蛋白质A亲和层析自细胞培养基纯化IgG。
通过使硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C抗体缀合至某些药物部分来产生抗CD22抗体-药物缀合物(ADC)。硫代Hu抗CD22 10F4v3HC A118C为一种在重链中具有添加可缀合硫醇基团的A118C突变的人源化抗CD22 10F4v3抗体。参见例如US 2008/0050310。硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C的重链的氨基酸序列在SEQ ID NO:26中示出(参见图3)，并且硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C的轻链的氨基酸序列在SEQ ID NO:23中示出(参见图2)。如下制备免疫缀合物。
硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-PBD(“10F4v3-PBD”)
在缀合之前，用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以自硫代抗体的工程化半胱氨酸移除封闭基团(例如半胱氨酸)。这一过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以移除释放的封闭基团并且使用脱氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。接着将完整抗体与药物-接头部分MC-val-cit-PAB-PBD(“val-cit”在本文中还可称为“vc”)组合以使药物-接头部分缀合至抗体的工程化半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应，并且纯化ADC。ADC的药物负载量(每个抗体所对应的药物部分的平均数目)在约1.7至约1.9的范围内，如以下实施例中所指示。10F4v3-PBD具有图4A中所示的结构(p＝药物负载量)。
硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE(“10F4v3-MMAE”)
在缀合之前，用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以自硫代抗体的工程化半胱氨酸移除封闭基团(例如半胱氨酸)。这一过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以移除释放的封闭基团并且使用脱氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。接着将完整抗体与药物-接头部分MC-val-cit-PAB-MMAE(“val-cit”在本文中还可称为“vc”)组合以使药物-接头部分缀合至抗体的工程化半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应，并且纯化ADC。ADC的药物负载量(每个抗体所对应的药物部分的平均数目)测定为约2，如以下实施例中所指示。硫代Hu抗CD22 10F4v3HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE例如描述于US 2008/0050310中。
硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-二硫化物-PBD(“10F4v3-SS-PBD”)以及
硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-二硫化物甲基-PBD(“10F4v3-SSMe-PBD”)
在缀合之前，用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以自硫代抗体的工程化半胱氨酸移除封闭基团(例如半胱氨酸)。这一过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以移除释放的封闭基团并且使用脱氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。
接着将完整抗体与6-8倍摩尔过量的药物-接头部分(分别来自实施例H或I的14或22)组合于50mM Tris(pH 8)中，持续16至24小时。接着通过阳离子交换管柱纯化ADC。ADC的药物负载量(每个抗体所对应的药物部分的平均数目)在约1.7至约1.9的范围内，如以下实施例中所指示。10F4v3-SS-PBD具有图4B中所示的结构(p＝药物负载量)。10F4v3-SSMe-PBD具有图4C中所示的结构(p＝药物负载量)。
B.人源化抗CD22抗体药物缀合物在WSU-DLCL2异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PBD的缀合物的功效，检查缀合抗体在WSU-DLCL2肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17ICR SCID小鼠(12-13周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister,CA)各自用2×107个WSU-DLCL2细胞(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures),Braunschweig,Germany)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(被称为第0天)，施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用测径器测量的两个尺寸，根据式：V＝0.5a×b2计算肿瘤体积，并且用mm3表示，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积的重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro J,等nlme:linear and nonlinear mixed effects models.2009；R套件,第3.1-96版)。这种方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度漏失率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量下log2肿瘤体积的时程的非线性概况。接着使这些非线性概况与混合模型内的剂量相关联。
各组9只小鼠用0.5或2或8mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在WSU-DLCL2细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案均由机构动物照护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准。
所述实验的结果在表2和图5中示出。表2显示各治疗组、在研究结束时具有可观察肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50％以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量以及所施用的各ADC的药物负载量。
表2：向具有WSU-DLCL2异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物＝20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS20；n/a＝不适用。
在使用如表2中所示的药物缀合物和剂量的35天时程中，相较于媒介物和对照ADC(“对照-PBD”)，通过蛋白酶可裂解接头与PBD缀合的10F4v3ADC(“10F4v3-PBD”)显示抑制具有WSU-DLCL2肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。参见图5。
此外，2mg/kg的10F4v3-PBD与8mg/kg的缀合有奥利斯他汀药物MMAE的人源化抗CD22硫代单抗(“10F4v3-MMAE”)显示类似抗肿瘤活性。参见图5。如表2中所示，接受2mg/kg 10F4v3-PBD的小鼠具有9个完全反应，而接受8mg/kg 10F4v3-MMAE的小鼠具有6个部分反应和3个完全反应。
在这一研究中，测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3ADC不会导致体重在研究期间显著降低。
C.人源化抗CD22抗体药物缀合物在Granta-519异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PBD的缀合物(“10F4v3-PBD”)的功效，检查缀合抗体在Granta-519肿瘤(人套细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(10-11周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister,CA)各自用2×107个Granta-519细胞(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(被称为第0天)，施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用测径器测量的两个尺寸，根据式：V＝0.5a×b2计算肿瘤体积，并且用mm3表示，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等2009)。这种方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度漏失率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量下log2肿瘤体积的时程的非线性概况。接着使这类非线性概况与混合模型内的剂量相关联。
各组9只小鼠用1mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在Grant-519细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案均由机构动物照护和使用委员会(IACUC)批准。
所述实验的结果在表3和图6中示出。表3显示各治疗组、在研究结束时具有可观察肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50％以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量以及所施用的各ADC的药物负载量。
表3：向具有Grant-519异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物＝20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS20；n/a＝不适用。
在使用如表3中所示的1mg ADC/kg剂量的药物缀合物的29天时程中，相较于媒介物，通过蛋白酶可裂解接头与PBD缀合的硫代Hu抗CD22 ADC(“10F4v3-PBD”)显示抑制具有Granta-519肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。然而，缀合至PBD的对照ADC(“对照-PBD”)还显示抗肿瘤活性，从而指示这种肿瘤模型对PBD极敏感。最后，当在1mg/kg下给与时，10F4v3-PBD比缀合有奥利斯他汀药物MMAE的人源化抗CD22硫代单抗(“10F4v3-MMAE”)更好地抑制肿瘤生长。
接受10F4v3-PBD的小鼠均显示肿瘤消退，而大多数用10F4v3-MMAE治疗的小鼠不显示肿瘤消退。单次剂量的10F4v3-PBD产生1个部分反应和8个完全反应。
在这一研究中，测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3ADC不会导致体重在研究期间显著降低。
D.人源化抗CD22抗体药物缀合物在SuDHL4-luc异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PBD的缀合物(“10F4v3-PBD”)的功效，检查缀合抗体在SuDHL4-luc肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17 ICR SCID小鼠(11-12周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister,CA)各自用2×107个SuDHL4-luc细胞(自DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany获得，并且在Genentech进行工程化以稳定表达荧光素酶(luciferase)基因)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(被称为第0天)，施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用测径器测量的两个尺寸，根据式：V＝0.5a×b2计算肿瘤体积，并且用mm3表示，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等2008)。这种方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度漏失率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量下log2肿瘤体积的时程的非线性概况。接着使这类非线性概况与混合模型内的剂量相关联。
各组8只小鼠用2或8mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在SuDHL4-luc细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案均由机构动物照护和使用委员会(IACUC)批准。
所述实验的结果在表4和图7中示出。表4显示各治疗组、在研究结束时具有可观察肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50％以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量以及所施用的各ADC的药物负载量。
表4：向具有SuDHL4-luc异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物＝20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS20；n/a＝不适用。
在使用如表4中所示的药物缀合物和剂量的35天时程中，相较于媒介物和对照ADC(“对照-PBD”)，通过蛋白酶可裂解接头与PBD缀合的硫代Hu抗CD22 ADC(“10F4v3-PBD”)显示抑制具有SuDHL4-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。参见图7。
此外，2mg/kg的10F4v3-PBD与8mg/kg的缀合有奥利斯他汀药物MMAE的人源化抗CD22硫代单抗(“10F4v3-MMAE”)显示类似抗肿瘤活性；两者均显示在所有治疗动物中产生完全反应。参见图7和表4。
在这一研究中，测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3ADC不会导致体重在研究期间显著降低。
E.10F4v3-PBD在SuDHL4-luc异种移植物模型中的剂量递增研究
检查10F4v3-PBD在各种剂量下于SuDHL4-luc肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的功效。
雌性CB17ICR SCID小鼠(9-10周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister,CA)各自用2×107个SuDHL4-luc细胞(自DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany获得，并且在Genentech进行工程化以稳定表达荧光素酶基因)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(被称为第0天)，施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用测径器测量的两个尺寸，根据式：V＝0.5a×b2计算肿瘤体积，并且用mm3表示，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等2008)。这种方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度漏失率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量下log2肿瘤体积的时程的非线性概况。接着使这类非线性概况与混合模型内的剂量相关联。
各组8只小鼠用0.2、0.5、1或2mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3-PBD或对照-PBD治疗，所述对照-PBD结合不在SuDHL4-luc细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案均由机构动物照护及使用委员会(IACUC)批准。
所述实验的结果在表5和图8中示出。表5显示各治疗组、在研究结束时具有可观察肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50％以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量以及所施用的各ADC的药物负载量。
表5：向具有SuDHL4-luc异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物＝20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS20；n/a＝不适用。
在使用如表5中所示的药物缀合物和剂量的31天时程中，10F4v3-PBD显示以剂量依赖性方式抑制具有SuDHL4-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。当在0.5mg/kg或更高剂量下施用时，相较于媒介物或对照ADC，10F4v3-PBD显示明确抑制活性。参见图8。此外，2mg/kg的单次剂量的10F4v3-PBD在所有治疗动物中均导致完全肿瘤消退。
在这一研究中，测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3-PBD不会导致体重在研究期间显著降低。
F.10F4v3-PBD在Bjab-luc异种移植物模型中的剂量递增研究
检查10F4v3-PBD在各种剂量下于Bjab-luc肿瘤(伯基特氏淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的功效。
雌性CB17ICR SCID小鼠(11-12周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister,CA)各自用2×107个Bjab-luc细胞(可例如自Lonza,Basel,Switzerland获得，并且在Genentech进行工程化以稳定表达荧光素酶基因)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(被称为第0天)，施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用测径器测量的两个尺寸，根据式：V＝0.5a×b2计算肿瘤体积，并且用mm3表示，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro等2008)。这种方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度漏失率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量下log2肿瘤体积的时程的非线性概况。接着使这类非线性概况与混合模型内的剂量相关联。
各组9只小鼠用0.05、0.2、0.5或1mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的10F4v3-PBD或对照-PBD治疗，所述对照-PBD结合不在Bjab-luc细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案均由机构动物照护和使用委员会(IACUC)批准。
所述实验的结果在表6和图9中示出。表6显示各治疗组、在研究结束时具有可观察肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50％以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量以及所施用的各ADC的药物负载量。
表6：向具有Bjab-luc异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物＝20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS20；n/a＝不适用。
在使用如表6中所示的药物缀合物和剂量的35天时程中，10F4v3-PBD显示以剂量依赖性方式抑制具有Bjab-luc肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。当在0.2mg/kg或更高剂量下施用时，相较于媒介物或对照ADC，10F4v3-PBD显示明确抑制活性。参见图9。此外，0.5或1mg/kg的单次剂量的10F4v3-PBD在所有治疗动物中均导致完全肿瘤消退。对照-PBD在1mg/kg下还显示实质性抗肿瘤活性，从而指示这一模型对PBD极敏感。
在这一研究中，测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3-PBD不会导致体重在研究期间显著降低。
G.人源化抗CD22抗体药物缀合物在WSU-DLCL2异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
为测试硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C与PBD的缀合物的功效，检查缀合抗体在WSU-DLCL2肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植物模型中的作用。
雌性CB17ICR SCID小鼠(9-10周龄，来自Charles RiversLaboratories；Hollister,CA)各自用2×107个WSU-DLCL2细胞(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心,Braunschweig,Germany)于侧腹皮下接种。当异种移植物肿瘤达到平均肿瘤体积150-300mm3时(被称为第0天)，施用第一且唯一剂量的治疗剂。基于使用测径器测量的两个尺寸，根据式：V＝0.5a×b2计算肿瘤体积，并且用mm3表示，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。为分析同一动物随时间的肿瘤体积重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro J,等nlme:linear and nonlinear mixed effects models.2009；R套件,第3.1-96版)。这种方法可阐明重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度漏失率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量下log2肿瘤体积的时程的非线性概况。接着使这类非线性概况与混合模型内的剂量相关联。
各组9只小鼠用0.5或2或10mg ADC/kg的单次静脉内(i.v.)剂量的硫代Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C免疫缀合物或对照抗体-药物缀合物(对照ADC)治疗。对照ADC结合不在WSU-DLCL2细胞的表面上表达的蛋白质。在整个实验期间一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在肿瘤体积达到3000mm3的前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。所有动物方案均由机构动物照护和使用委员会(IACUC)批准。
所述实验的结果在表7和图10中示出。表2显示各治疗组、在研究结束时具有可观察肿瘤(“TI”)的小鼠的数目、显示部分反应(“PR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至第0天测量的肿瘤体积的50％以下)的小鼠的数目、显示完全反应(“CR”；其中在施用之后任何时间的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠的数目、各组的药物剂量、各组的抗体剂量以及所施用的各ADC的药物负载量。
表7：向具有WSU-DLCL2异种移植物的小鼠施用抗CD22 ADC
*媒介物＝20mM组氨酸乙酸盐(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS20；n/a＝不适用。
在使用如表7中所示的药物缀合物和剂量的28天时程中，相较于媒介物和对照ADC，10F4v3-PBD和10F4v3-SSMe-PBD显示在0.5mg/kg下抑制具有WSU-DLCL2肿瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长。参见图7。
此外，2mg/kg 10F4v3-SSMe-PBD显示几乎完全肿瘤生长抑制。参见图7。如表2中所示，2只接受2μg/kg 10F4v3-SSMe-PBD的小鼠和1只接受0.5μg/kg 10F4v3-SSMe-PBD的小鼠对疗法显示部分反应。
在这一研究中，测定各剂量组中的体重变化百分比。结果指示施用10F4v3ADC不会导致体重在研究期间显著降低。
H.合成二硫化物PBD试剂
(a)氯化(S)-2-(甲氧基羰基)-4-亚甲基吡咯烷鎓(3)
(i)(S)-4-亚甲基吡咯烷-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-甲酯(2)
添加碳酸钾(19.92g，14mmol，3当量)至羧酸(1)(10.92g，48mmol，1当量)于DMF(270mL)中的搅拌溶液中。在室温下搅拌所得白色悬浮液30分钟，此时添加碘甲烷(21.48g，9.5mL，151mmol，3.15当量)。使反应混合物在室温下搅拌3天。通过在减压下进行旋转蒸发来移除DMF，以得到黄色残余物，将其分配于乙酸乙酯与水之间。分离有机层并且用乙酸乙酯萃取水相。将合并的有机层用水、盐水洗涤并且经硫酸镁干燥。通过在减压下进行旋转蒸发来移除乙酸乙酯，以得到呈黄色油状的粗产物。将粗产物通过快速层析[85％正己烷/15％乙酸乙酯]纯化以得到呈无色油状的产物。(已知化合物FManfré等,J.Org.Chem.1992,57,2060-2065)
(ii)氯化(S)-2-(甲氧基羰基)-4-亚甲基吡咯烷鎓(3)
在室温下添加4M盐酸于二噁烷中的溶液(63mL，254.4mmol，4.5当量)至Boc保护的C-环片段(2)(13.67g，56.6mmol，1当量)中。观察到起泡，指示CO2释放和Boc基团移除。产物沉淀为白色固体并且再添加二噁烷以促进搅拌。使反应混合物搅拌1小时并且接着用***稀释。通过真空过滤收集沉淀的产物并且再用***洗涤。风干得到呈白色粉末状的所需产物(9.42g，94％)(P Herdwijn等,CanadianJournal of Chemistry.1982,60,2903-7)
(b)(5-((5-(5-氨基-4-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯(9)
(i)(S)-(4,4'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(5-甲氧基-2-硝基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(甲氧基羰基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮)(5)
在室温下添加催化量的无水DMF(0.5mL)至乙二酰氯(9.1g，6.25mL，71.7mmol，3当量)和二聚体核心(4)(11.82g，23.9mmol，1当量)于无水DCM(180mL)中的搅拌悬浮液中。在添加DMF之后观察到剧烈起泡并且使反应混合物于配备有氯化钙干燥管的圆底烧瓶中搅拌18小时。在减压下蒸发所得澄清溶液并且将固体用***湿磨。通过真空过滤收集固体产物，再用***洗涤并且在真空中在40℃下干燥1.5小时。接着逐份添加所述固体至C-环(3)(9.35g，52.6mmol，2.2当量)于TEA(12.08g，119.6mmol，5当量)和无水DCM(110mL)中的悬浮液中，同时借助于干冰/乙腈浴将温度维持在-40℃与-50℃之间。使反应混合物在-40℃下搅拌1小时并且接着使反应混合物温至室温，此时LCMS指示起始物质完全耗尽。反应混合物再用DCM稀释并且依序用盐酸水溶液(1M，2×200mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×250mL)、水(250mL)、盐水(250mL)洗涤，干燥(MgSO4)。通过在减压下进行旋转蒸发来移除DCM，得到呈黄色泡沫状的产物(13.94g，79％)。分析数据：RT 3.95分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)741([M+1]+.,100)。
(ii)(S)-(4,4'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(5-甲氧基-2-硝基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮)(6)
在0℃(冰浴)下在氮气氛下一次性添加固体硼氢化锂(0.093g，4.3mmol，3当量)至酯(5)(1.05g，142mmol，1当量)于无水THF(10mL)中的溶液中。使反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并且接着使反应混合物温至室温，此时观察到橙色胶状物沉淀。使反应混合物在室温下再搅拌2小时，并且接着于冰浴中冷却且用水(20mL)处理以得到黄色悬浮液。小心添加盐酸(1M)(剧烈起泡！)直至起泡停止。用乙酸乙酯(4×50mL)萃取反应混合物并且将合并的有机层用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤且干燥(MgSO4)。通过在减压下进行旋转蒸发来移除乙酸乙酯，以得到呈黄色泡沫状的产物(0.96g，99％)。以12.4g规模重复反应得到11.06g产物(96％)。分析数据：RT 3.37分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)685([M+H]+.,100)。
(iii)(S)-((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(5-甲氧基-2-硝基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮)(7)
在室温下在氩气氛下搅拌双硝基醇(6)(7.94g，11.6mmol，1当量)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(4.54g，30.15mmol，2.6当量)以及咪唑(4.1g，60.3mmol，5.2当量)于无水DMF(100mL)中的溶液3小时。反应混合物用水(250mL)稀释并且用DCM(4×100mL)萃取。合并的萃取物用水(200mL)、饱和盐水(200mL)洗涤，干燥(MgSO4)并且在减压下蒸发。残余物通过快速管柱层析[50％乙酸乙酯/50％正己烷以10％增量直至100％乙酸乙酯]纯化得到呈黄色泡沫状的产物(10.0g，94％)。分析数据：RT 4.57分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)913([M+H]+.,100)。
(iv)(S)-((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-氨基-5-甲氧基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮)(8)
一次性添加甲酸溶液(5％v/v，15mL)至锌粉(29.56g，0.45mol，40当量)和化合物(7)(10.34g，11.32mmol，1当量)于乙酸乙酯/乙醇(80mL/150mL)中的混合物中。观察到温升12℃。在15分钟之后，反应混合物经硅藻土过滤，用乙酸乙酯(过量)洗涤。滤液用饱和碳酸氢钠(3×150mL)、水(200mL)、饱和盐水(200mL)洗涤，干燥(MgSO4)并且在减压下蒸发。通过快速管柱层析[乙酸乙酯]纯化得到呈白色泡沫状的产物(8.09g，84％)。分析数据：RT 4.43分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)853([M+H]+.,100)。
(v)(5-((5-(5-氨基-4-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯(9)
在回流下加热双苯胺(8)(6.02g，7.1mmol，1当量)和二碳酸二-叔丁酯(1.54g，7.1mmol，1当量)于无水THF(50mL)中的溶液16小时。在减压下蒸发溶剂并且通过快速管柱层析[40％乙酸乙酯/60％正己烷至60％乙酸乙酯/40％正己烷至100％乙酸乙酯]纯化残余物得到呈白色泡沫状的产物(3.22g，48％)。分析数据：RT 4.27分钟MS(ES+)m/z(相对强度)953([M+H]+.,100),MS(ES-)m/z(相对强度)951([M-H])-.,100)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-甲酸2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙酯(14)
化合物10是根据Jones等,J.Am.Chem.Soc.,2006,128,6526-6527制备。
(i)((S)-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-亚苯基))二氨基甲酸叔丁酯(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)酯(11)
在室温下在氩气氛下添加三乙胺(0.25g，0.34mL，2.42mmol，2.2当量)至单Boc保护的双苯胺(9)(1.05g，1.1mmol，1.0当量)和三光气(0.117g，0.4mmol，0.36当量)于无水THF(10mL)中的搅拌溶液中。加热反应混合物至40℃并且在5分钟之后，样品用甲醇处理并且通过LCMS分析为氨基甲酸甲酯。分析数据：RT 4.37分钟MS(ES+)m/z(相对强度)1011([M+H]+.,100)。
逐滴添加2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙醇(10)(0.31g，1.65mmol，1.5当量)和三乙胺(0.17g，0.23mL，1.65mmol，1.5当量)于无水THF(10mL)中的溶液至新鲜制备的异氰酸酯中。在40℃下加热反应混合物1.5小时，在所述时间之后，添加另一份三光气(0.058g，0.2mmol，0.18当量)。在又30分钟之后，使反应混合物冷却，过滤以移除三乙胺盐酸盐并且蒸发滤液至干燥，得到呈黄色油状的粗产物，其通过快速管柱层析[60％正己烷/40％乙酸乙酯变化至55％正己烷/45％乙酸乙酯]纯化得到呈无色油状的所需产物(0.63g，49％)。分析数据：RT 4.50分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)1166([M+H]+.,100),MS(ES-)m/z(相对强度)1164([M-H])-.,70)。
(ii)((S)-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-((S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-亚苯基))二氨基甲酸叔丁酯(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)酯(12)
添加AcOH/H2O(3/1/)(8mL)至化合物(11)(0.37g，0.32mmol，1当量)于THF(2mL)中的溶液中并且在室温下搅拌所得溶液18小时。用饱和NaHCO3溶液调整反应混合物的pH至pH 8。混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取并且合并的萃取物用饱和NaHCO3溶液(100mL)、水(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发。通过快速管柱层析[梯度洗脱氯仿/甲醇0％至5％，增量1％]纯化残余物得到呈白色泡沫状的产物(0.24g，81％)。分析数据：RT 3.08分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)938([M+H]+ .,100),MS(ES-)m/z(相对强度)936([M-H])-.,100)。
(iii)(11S,11aS)-11-羟基-8-((5-(((11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-10-((2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙氧基)羰基)-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯(13)
在-78℃(干冰/丙酮)下在氩气氛下逐滴添加DMSO(79mg，72μL，1.0mmol，4.4当量)于DCM(5mL)中的溶液至乙二酰氯(62mg，42μL，0.49mmol，2.15当量)于DCM(5mL)中的溶液中。在-78℃下搅拌溶液15分钟。逐滴添加化合物(12)(0.214g，0.23mmol，1.0当量)于DCM(6mL)中的溶液并且在-78℃下搅拌混合物45分钟。添加三乙胺(0.23g，0.32mL，2.28mmol，10当量)并且在5分钟之后使反应混合物达到室温。反应混合物用饱和NH4Cl溶液(15mL)处理，分离有机部分并且用1M柠檬酸溶液(3×50mL)、饱和NaHCO3溶液(100mL)、水(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发得到浅黄色油状物。通过快速管柱层析纯化得到呈白色泡沫状的产物(68mg，32％)。分析数据：RT 2.90分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)933([M+H]+.,50),MS(ES-)m/z(相对强度)935([M-H])-.,55)。
(iv)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-甲酸2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙酯(14)
添加95％三氟乙酸的冷(冰浴)溶液(1mL)至已在冰浴中冷却的化合物13中。在0℃下搅拌溶液15分钟，此时LCMS显示反应完全。逐滴添加反应混合物至冰和饱和NaHCO3溶液的混合物中以中和三氟乙酸溶液。混合物用DCM(4×50mL)萃取并且合并的萃取物用饱和盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发得到呈白色泡沫状的产物(26mg，96％)。分析数据：RT 2.72分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)816([M+H]+.,70),MS(ES-)m/z(相对强度)814([M-H])-.,40)。
I.合成二硫化物甲基PBD试剂
(a)(R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙-1-醇(18)
(i)(R)-2-(乙酰基硫代)丙酸甲酯(16)
添加硫乙酸(1.99g，1.86mL，26.1mmol，1.1当量)至碳酸铯(7.73g，23.72mmol，1.0当量)于无水DMF(40mL)中的悬浮液中。在30分钟之后，添加(S)-2-氯丙酸甲酯(15)并且使混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物分配于***(150mL)与水(150mL)之间；分离水并且用另一份***(150mL)洗涤。合并的有机部分用水(6×100mL)、盐水(200mL)洗涤，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发。通过快速管柱层析[10％乙酸乙酯/90％正己烷]纯化得到呈无色油状的产物(3.01g，82％)。分析数据：RT 2.25分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)163([M+H]+.,10),185([M+Na]+.,65)；[α]t d＝[+141]17.8℃ d(c,2.26CHCl3)。
(ii)(R)-2-巯基丙-1-醇(17)
在回流下在氩气氛下逐滴添加硫乙酸酯(16)(0.57g，3.54mmol，1.0当量)于无水THF(10mL)中的溶液至氢化锂铝(0.54g，14.15mmol，4.0当量)于无水THF(20mL)中的悬浮液中。在1小时之后，冷却反应混合物至0℃并且逐滴添加2M HCl，同时维持温度在30℃以下直至起泡停止。使所得混合物在室温下搅拌1小时，接着在用THF(40mL)洗涤下经硅藻土过滤。蒸发溶剂；将残余物再溶解于DCM中并且干燥(MgSO4)。在减压下蒸发DCM，随后对残余物进行管柱层析[60％正己烷/40％乙酸乙酯]得到呈浅黄色油状的产物(0.193g，58％)。分析数据：[α]t d＝[-22]17.2℃ d(c,0.972CHCl3)。
(iii)(R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙-1-醇(18)
在0℃下在氩气氛下逐滴添加磺酰氯(1M于DCM中，2.0mL，2.0mmol，1.1当量)至2-巯基吡啶(0.2g，1.81mmol，1.0当量)于无水DCM(5mL)中的溶液中。在室温下搅拌所得溶液2小时并且在减压下蒸发DCM得到黄色固体。将固体悬浮于无水DCM(10mL)中并且逐滴添加(R)-2-巯基丙-1-醇(17)(0.18g，1.95mmol，1.08当量)于无水DCM(5mL)中的溶液。在室温下在氩气氛下搅拌混合物18小时。过滤反应混合物并且在减压下蒸发滤液得到黄色胶状物。将胶状物再溶解于水中并且用氢氧化铵溶液碱化溶液，用DCM(3×50mL)萃取并且合并的萃取物用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发得到黄色油状物。通过快速管柱层析[80％正己烷/20％乙酸乙酯以5％增量直至60％正己烷/40％乙酸乙酯]纯化得到呈无色油状的产物(0.213g，59％)。分析数据：RT 2.43分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)202([M+H]+.,50)；[α]t d＝[+273]26.2℃ d(c,0.28CHCl3)。
(b)(11S,11aS)-(R)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-甲酸2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酯(22)
(i)((S)-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-亚苯基))二氨基甲酸叔丁酯((R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙基)酯(19)
在室温下在氩气氛下添加三乙胺(0.28g，0.39mL，2.8mmol，2.2当量)至单boc保护的双苯胺(9)(1.21g，1.27mmol，1.0当量)和三光气(0.136g，0.46mmol，0.36当量)于无水THF(15mL)中的搅拌溶液中。加热反应混合物至40℃并且在5分钟之后，样品用甲醇处理且通过LCMS分析为氨基甲酸甲酯。分析数据：RT 4.30分钟MS(ES+)m/z(相对强度)1011([M+H]+.,100)。
逐滴添加(R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙-1-醇(18)(0.38g，1.91mmol，1.5当量)和三乙胺(0.19g，0.27mL，1.91mmol，1.5当量)于无水THF(10mL)中的溶液至新鲜制备的异氰酸酯中。在40℃下加热反应混合物4小时，并且接着在室温下搅拌18小时。过滤反应混合物以移除三乙胺盐酸盐并且蒸发滤液至干燥得到呈黄色油状的粗产物，其通过快速管柱层析[60％正己烷/40％乙酸乙酯以5％增量直至40％正己烷/60％乙酸乙酯]纯化得到呈白色泡沫状的所需产物(0.75g，50％)。分析数据：RT 4.50分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)1180([M+H]+.,60)；[α]t d＝[-18]21℃ d(c,0.28CHCl3)。
(ii)((S)-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-((S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-亚苯基))二氨基甲酸叔丁酯((R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙基)酯(20)
添加乙酸/H2O(3/1，16mL)至双甲硅烷基醚(19)(0.72g，0.61mmol，1当量)于THF(4mL)中的溶液中。在室温下搅拌所得溶液16小时。用饱和碳酸氢钠溶液调整反应混合物的pH至pH 8。混合物用乙酸乙酯(4×150mL)萃取并且合并的萃取物用饱和碳酸氢钠溶液(2×150mL)、水(150mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发。通过快速管柱层析纯化得到呈白色泡沫状的产物(0.56g，96％)。分析数据：RT 3.15分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)953([M+H]+.,100)；[α]t d＝[-13.5]26℃ d(c,0.22CHCl3)。
(iii)(11S,11aS)-11-羟基-8-((5-(((11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-10-(((R)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙氧基)羰基)-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯(21)
在-40℃下在氩气氛下逐滴添加DMSO(91mg，83μL，1.16mmol，4.4当量)于无水DCM(5mL)中的溶液至乙二酰氯(2.0M于DCM中，318μL，0.635mmol，2.4当量)于无水DCM(5mL).中的溶液中。在-40℃下搅拌溶液15分钟。逐滴添加双醇(20)(0.252g，0.26mmol，1当量)于无水DCM(10mL)中的溶液并且在-40℃下搅拌所得混合物45分钟。在此时间期间，使温度达到-25℃。使温度降低至-35℃并且逐滴添加三乙胺(0.27g，0.36mL，2.6mmol，10当量)。在5分钟之后，使温度达到室温。反应混合物用DCM(50mL)稀释并且用1M柠檬酸溶液(3×150mL)、饱和碳酸氢钠溶液(150mL)、水(200mL)、盐水(200mL)萃取，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发得到黄色泡沫状物。通过快速管柱层析[氯仿/甲醇0％至2％，增量0.5％]纯化得到呈白色泡沫状的产物(0.137g，53％)。分析数据：RT 3.17分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)948([M+H]+ .,100)；[α]t d＝[+170]26℃ d(c,0.25CHCl3)。
(iv)(11S,11aS)-(R)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-甲酸2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酯(22)
添加95％三氟乙酸的冷(冰浴)溶液(8.5mL)至已在冰浴中冷却的化合物(21)(0.221g，0.23mmol，1当量)中。在0℃下搅拌溶液25分钟，此时LCMS显示反应完全。逐滴添加反应混合物至冰和饱和碳酸氢钠溶液(200mL)的混合物中以中和三氟乙酸溶液。混合物用DCM(4×75mL)萃取并且合并的萃取物用水(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)且在减压下蒸发得到粗产物。通过快速管柱层析[氯仿/甲醇0％至3％，增量1％]纯化得到呈白色泡沫状的产物(0.192g，99％)。分析数据：RT 3.00分钟；MS(ES+)m/z(相对强度)830([M+H]+.,75)；[α]t d＝[+444]22℃ d(c,0.26CHCl3)。
尽管上述本发明已出于清楚理解的目的通过说明和实施例方式详细描述，但描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均以引用的方式整体明确并入本文中。
序列表

Claims (45)

1.一种免疫缀合物，其包含共价连接至细胞毒性剂的结合CD22的抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO:28的氨基酸20至240内的表位，并且其中所述细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂。
2.如权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含(i)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3，以及(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2。
3.如权利要求1或权利要求2所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，以及(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3。
4.如权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：
a)(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；或
b)(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
5.如权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：
a)(i)包含选自SEQ ID NO:12和15至22的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；或
b)(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3。
6.如权利要求1至5中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：
a)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或
b)与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。
7.如权利要求6所述的免疫缀合物，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH序列。
8.如权利要求6所述的免疫缀合物，其包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL序列或具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL序列。
9.一种免疫缀合物，其包含共价连接至细胞毒性剂的结合CD22的抗体，其中所述抗体包含(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL序列，并且其中所述细胞毒性剂为吡咯并苯并二氮杂。
10.如权利要求1至9中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
11.如权利要求1至10中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p，其中：
(a)Ab为所述抗体；
(b)L为接头；
(c)D为所述细胞毒性剂；以及
(d)p在1-8的范围内。
12.如权利要求11所述的免疫缀合物，其中D为式A的吡咯并苯并二氮杂：
其中波形线指示与所述接头的共价连接位点；
虚线指示任选在C1与C2或C2与C3之间存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR，并且任选地进一步选自卤代或二卤代，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H以及卤代；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn以及卤代；
Q独立地选自O、S以及NH；
R11为H或R或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R’各自独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基，并且任选地就所述基团NRR’而言，R和R’连同它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4、5、6或7元杂环；
R12、R16、R19以及R17分别是如对于R2、R6、R9以及R7所定义；
R″为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子和/或任选取代的芳香族环间断；以及
X和X’独立地选自O、S以及N(H)。
13.如权利要求12所述的免疫缀合物，其中D具有结构：
其中n为0或1。
14.如权利要求12所述的免疫缀合物，其中D具有选自以下的结构：
其中RE和RE”各自独立地选自H或RD，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H以及卤代；
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；以及
其中n为0或1。
15.如权利要求11所述的免疫缀合物，其中D为式B的吡咯并苯并二氮杂：
其中水平波形线指示与所述接头的共价连接位点；
RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基、苯基、氟取代的苯基以及C5-6杂环基；以及
n为0或1。
16.如权利要求11至15中任一项所述的免疫缀合物，其中所述接头可由蛋白酶裂解。
17.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
18.如权利要求11所述的免疫缀合物，其具有式
19.如权利要求11至18中任一项所述的免疫缀合物，其中p在1-3的范围内。
20.如权利要求12所述的免疫缀合物，其包含结构：
其中CBA表示所述抗体(Ab)；RL1和RL2各自独立地选自H和甲基，或连同它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基；并且Y选自单键、(a1)以及(a2)：
其中N显示基团结合所述PBD部分的N10的位置。
21.如权利要求20所述的免疫缀合物，其包含选自以下的结构：
22.如权利要求20或权利要求21所述的免疫缀合物，其包含结构：
其中RE和RE”各自独立地选自H和RD。
23.如权利要求20或权利要求21所述的免疫缀合物，其包含结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基。
24.如权利要求23所述的免疫缀合物，其中Ar1和Ar2各自独立地选自任选取代的苯基、呋喃基、苯硫基以及吡啶基。
25.如权利要求20或权利要求21所述的免疫缀合物，其包含结构：
其中RV1和RV2各自独立地选自H、甲基、乙基、任选取代的苯基、以及C5-6杂环基。
26.如权利要求25所述的免疫缀合物，其中RV1和RV2各自独立地选自H、苯基以及4-氟苯基。
27.一种免疫缀合物，其具有选自以下的式：
其中Ab为抗体，其包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中p在1至3的范围内。
28.一种免疫缀合物，其具有式：
其中Ab为抗体，其包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2，以及(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L3；并且其中p在1至3的范围内。
29.如权利要求27或28所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列。
30.如权利要求29所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含SEQID NO:26的重链和SEQ ID NO:23的轻链。
31.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体为单克隆抗体。
32.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
33.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体为结合CD22的抗体片段。
34.如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体结合人CD22。
35.如权利要求34所述的免疫缀合物，其中人CD22具有SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:29的序列。
36.一种药物制剂，其包含如前述权利要求中任一项所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
37.如权利要求36所述的药物制剂，其还包含另一种治疗剂。
38.一种治疗患有CD22阳性癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至35中任一项所述的免疫缀合物。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述CD22阳性癌症选自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。
40.如权利要求39所述的方法，其还包含向所述个体施用另一种治疗剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述另一种治疗剂包含结合CD79b的抗体。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述另一种治疗剂为包含共价连接至细胞毒性剂的结合CD79b的抗体的免疫缀合物。
43.一种抑制CD22阳性细胞增殖的方法，所述方法包括在允许如权利要求1至35中任一项所述的免疫缀合物结合所述细胞的表面上的CD22的条件下使所述细胞暴露于所述免疫缀合物，从而抑制所述细胞的增殖。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述细胞为赘生性B细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述细胞为淋巴瘤细胞。
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