CN104288302B - 一种药/食用真菌发酵中草药的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药/食用真菌发酵中草药的方法及其应用，属于生物工程技术领域，所述方法包括：(1)药/食真菌固体种子的制备、(2)中草药的准备、(3)药/食真菌与中草药的双向发酵、(4)药/食真真菌与中草药的双向发酵终点的判断。用本发明发酵的中草药及其组方制剂(药性菌质)中，含有大量的真菌多糖、蛋白多肽、皂苷类、萜类、生物酶等活性物质，且中草药中的中草药味道明显减少或消失，毒副作用成分降低，有效功能物质成分增加，有效成分的提取率和防病治病的效果显著提高。

Description

一种药/食用真菌发酵中草药的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种药/食用真菌发酵中草药的方法及其应用。
背景技术
中国是中草药的发源地，中草药是我国的国宝，目前中国大约有12000种药用植物，种类多，功效齐全，在人畜疾病的防治中起到不可替代的作用，越来越受到学术界的重视和人民的青睐。
我国已知有药用价值的大型真菌约2000种，真菌富含萜类化合物(倍半萜、二萜类化合物和三萜类化合物、四萜类化合物)、多糖类化合物、蛋白多肽、生物碱、甾醇类化合物、核苷类化合物和其它活性物质等，大多具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、提高免疫力、降血压、降血糖、降胆固醇等功效。目前已有药(食)真菌类药物乌灵胶囊、乌灵菌粉、百令胶囊、金水宝、槐耳冲剂、槐耳滴丸等。药用真菌在兽药及饲料添加剂方面的应用寥寥无几，国内首个真菌类添加剂-虫草欣康(地顶孢霉培养物)，2006年批准为农业部国家级新产品新饲证字(2006)04号。药用真菌在兽药和饲料添加剂方面的应用开发有很大的前景。
“双向发酵”技术是庄毅1992年提出的菌质概念，将一定的药用真菌菌种接种到含有经筛选的中药基质上，在一定环境条件下，经过一定时间发酵，在特定的质量指标控制下达到发酵终点而产生的药性菌质。药用(食用)真菌发酵中草药有如下优点：1)在发酵中，药(食)真菌以中药为基础培养基，促进微生物生长，其中真菌生长中产生的纤维素酶、果胶酶、蛋白酶对中草药本身的纤维素、木质素、大分子蛋白等进行酶解，使中草药有效物质得到充分的释放，提高功能物质产量与药效。2)微生物转化中药活性成分，微生物在生长过程中可以分泌几十种胞外酶于培养基中，对特定底物进行结构修饰的化学反应，产生新的活性物质，开发新的药物。3)真菌在生长中自身产生的代谢产物积累，真菌代谢产物真菌多糖、生物碱、核苷类化合物等这些化合物具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等作用，由于中草药与真菌的代谢产物双重作用，提高了药效。关于中草药的双向发酵主要是提高药效、对中草药解毒、消除中草药的药味等，在人类的保健和治疗的应用较为广泛，在兽药、饲料添加剂领域需要加强应用。目前已有的双向发酵的专利如下：
专利CN 101507746A九州虫草镇咳口服液的制备方法，以九州虫草为菌种液体深层发酵药食两用的四叶参，产品治咳效果明显。专利CN 103316058利用灵芝-当归双向发酵以提高其药效技术，采用灵芝菌种发酵当归，发酵后的抗氧化活性提高了60-100倍。
专利CN 102614238 A，灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用，以灵芝为菌种人参为基质进行双向发酵，发酵后的菌质治疗肺癌的效果优于灵芝、人参和人参加灵芝。
专利CN 103355666 A，能改善心脑血管代谢功能植物酵素饮品的制备方法，以麦芽、谷芽、葛根、三七、杜仲、黄芪等中草药加水侵泡、煎煮后加糖、蛋白胨后灭菌接入复合益生菌。得到的产品能改善人体代谢紊乱，预防心、脑血管疾病。
专利CN 103565944 A，中药双向发酵技术，介绍了中药预处理，发酵菌种选择及活化，发酵方式的确定，通过二者的深层相互作用提高其抗氧化、抗自由基、增强免疫力等医疗保健功能。
专利CN 103098948 A，松针药用真菌发酵茶的制备方法及其制备的发酵茶，采用茯苓发酵松针，发酵产品同时有松针和茯苓菌种的双重性质，没有原来的苦涩味，有效成分容易释放，更容易被吸收。
专利CN1911262 A药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用。采用菌种灵芝、云芝、红栓等药用真菌发酵雷公藤，实现了雷公藤的解毒，提高了雷公藤的应用和开发前景。
专利CN 102688403 A，一种具有解酒保肝作用的玉米须发酵无的制备方法。采用灵芝发酵玉米须，发酵后的菌质解酒保肝效果增强
专利CN 101940611 A，蛹虫草发酵中药黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂。以药用真菌蛹虫草发酵中药黄芪，发酵后的药物免疫增强效果好。
专利CN 1831107A，中草药多菌混合固体发酵技术及其应用，应用益生菌发酵中药技术。
发明内容
本发明目的主要是针对中草药与药(食)真菌的双向发酵提供一种理论指导：即为中草药性味、功能与药(食)真菌性味、功能相同或相近，效果相增的原则，对不同性味、功能、作用的中草药组方选择相适应的药(食)用真菌进行组合发酵。
本发明目的主要是针对中草药组方与药(食)真菌组合双向发酵提供一种双向发酵工艺指导：中草药组方与药(食)真菌组合发酵，对方剂中的每一味中草药粉碎后与其药(食)真菌液体种子进行发酵，对适合其菌丝生长的中草药单独或混合与其药(食)真菌菌丝发酵；对于菌丝生长缓慢的中草药，按照10％—90％百分比加入麸皮、玉米等基础培养基和促生长因子后发酵，选择可以生长的基础培养基的最小百分比，对于加基础培养基后还不能生长的中草药，不进行发酵，在发酵完其他中草药后添加，保持组方的完整性。在整个发酵过程中采用固体静止发酵，在中草药上长满菌丝体以后适当翻动2-3次，以便充分发酵。
本发明的目的主要是提供一种中草药与药(食)真菌的双向发酵提供一种固体发酵终点判断的方法：在菌丝长满中草药后每隔1d取一次样，对样进行有效药物提取，提取后的药物做抑菌实验，以抑菌圈效果最佳的取样时间作为发酵终点。
本发明的主要目的是提供一种中草药组方与药(食)真菌组合双向发酵治疗湿热痢疾、急慢性胃肠炎疾病的方法。
本发明的主要目的是提供双向发酵后的药物在养殖中的应用效果。
本发明采用如下技术方案：
本发明的药/食用真菌发酵中草药的方法的具体步骤如下：
(1)药/食真菌固体种子的制备：
将药/食真菌在PDA平板上活化，活化后的药/食真菌接种到液体种子培养基中，培养2-4d，培养好的液体种子接入到灭菌后的固体培养基中，培养2-3d即为固体种子，备用；
(2)中草药的准备：
按照中药的组方来选取中草药，把选取好的中草药烘干，磨碎，过200目筛，把中草药调到含水量在40-60％，灭菌，备用；
(3)药/食真菌与中草药的双向发酵：
把固体种子接入到灭菌好的中草药中，先按照单一的纯中草药中接药/食真菌，对于菌丝生长缓慢的中草药，按照10％-90％重量百分比加入基础培养基和生长因子后发酵，选择可以生长的基础培养基的最小百分比，对于加基础培养基后还不能生长的中草药，不进行发酵，在发酵完其他中草药后添加，保持组方的完整性，发酵的全过程采用固体静止发酵，在菌丝长满中草药后，进行翻动1-2次，以便中草药得到充分的发酵；
(4)药/食真真菌与中草药的双向发酵终点的判断：
在灭菌的中草药上接种药/食真真菌后，每隔一天取一次样，对样进行有效药物提取，提取后的药物做抑菌实验，以抑菌效果最佳的取样时间作为发酵终点。
所述的药/食真菌为白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇中的一种或多种；所述的中草药为含黄连、黄芩、黄柏、苦参、秦皮、龙胆草、地锦草、马齿苋、连钱草、藿香、佩兰、苍术、五倍子、石榴皮、罂粟壳、乌梅一种或多种的方药或组方为止痢散、白头翁散，发酵结束后可用于制备治疗湿热痢疾、急慢性胃肠炎疾病的药物。
所述的基础培养基为：豆粕、玉米浆、麦麸、面粉、玉米粉或米康。
所述的生长促进剂为磷酸氢二钾、硫酸镁、氨基酸或维生素。
发酵的条件为：含水量40-60％，PH值4.5-8.5，发酵温度20-30℃，发酵时间1-5天。
本发明的积极效果如下：
用本发明发酵的中草药及其组方制剂(药性菌质)中，含有大量的真菌多糖、蛋白多肽、皂苷类、萜类、生物酶等活性物质，且中草药中的中草药味道明显减少或消失，毒副作用成分降低，有效功能物质成分增加，有效成分的提取率和防病治病的效果显著提高。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实例1:药(食)真菌对单味纯中草药的发酵
药(食)真菌菌种：白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇等
中草药：黄连、罂粟壳、乌梅、黄芩、黄柏、苦参、秦皮、龙胆草、地锦草、马齿苋、连钱草、石榴皮、藿香、佩兰、苍术、五倍子等。
表1：白灵菇在纯中草药中的菌丝生长情况
表2：茯苓在纯中草药中的菌丝生长情况
表3：竹荪在纯中草药中的菌丝生长情况
表4：松乳菇在纯中草药中的菌丝生长情况
由表1-4可知，四种药(食)真菌在乌梅、石榴皮和藿香上均不能生长，白灵菇、茯苓、松乳菇三种药(食)真菌对其余的13种中草药适应性比较好，竹荪对其余13种中草药的适应性较差。
实例2:药(食)真菌对中药组方止痢散的发酵
【处方】雄黄40g藿香110g滑石150g
1材料
药(食)菌种：白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇
药(食)真菌培养基：PDA
引起猪仔痢疾、腹泻的病原菌：大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌病原菌培养基：肉汤培养基
魏氏梭菌培养：37℃、10CO2％
中草药：购自张家界采芝堂大药房，将中草药洗净，干燥箱内60℃烘干，粉碎后放入匀浆机匀浆，过200目，备用。
2方法
将斜面培养基上的药(食)菌种接种于PDA平板进行活化，然后挑选2cm大小长势好的菌丝块接入装有PDA培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床上(转速80rpm)28℃培养3-5d得液体种子，再将液体种子按照接种量10％-20％的接种量接入固体培养基，按前述条件培养3-5d的固体药(食)菌种，将固体种子按重量10％-20％接种于含水40％-50％的单味中草药上，观察其生长状况，对于菌丝生长缓慢的中草药，按照10％—90％百分比加入麸皮、玉米等基础培养基和生长因子后发酵，选择可以生长的基础培养基的最小百分比，对于加基础培养基后还不能生长的中草药，不进行发酵，在发酵完其他中草药后添加，保持组方的完整性。
3药(食)真菌在组方中单味中草药发酵的适应性结果
根据表1-4可知四种药(食)真菌在雄黄上均能生长，但是在藿香上不能生长，在藿香中添加10％-90％的基础培养基后其生长状况如下：
表5：白灵菇在含有基础培养基中的菌丝生长情况
表6：茯苓在含有基础培养基中菌丝生长情况
表7：竹荪在含有基础培养基中菌丝生长情况
表8：松乳菇在含有基础培养基中菌丝生长情况
根据上表5-8可以看出，药(食)真菌白灵菇、茯苓、松乳菇在含90％基础培养基上能生长，竹荪在基础培养基10％-90％中，均不能生长。由于藿香在止痢散中所占比例超过10％，因此在药(食)真菌发酵止痢散的时候只发酵雄黄，藿香、滑石不发酵，只添加在发酵过的雄黄中，保证组方的完整性。
实例3:药(食)真菌对中药组方白头翁散的发酵
【处方】白头翁60g黄连30g黄柏45g秦皮60g
1材料
药(食)菌种：白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇
药(食)真菌培养基：PDA
引起猪仔痢疾、腹泻的病原菌：大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌病原菌培养基：37℃、肉汤培养基
魏氏梭菌培养：37℃、10CO2％
中草药：购自张家界采芝堂大药房，将中草药洗净，干燥箱内60℃烘干，粉碎后放入匀浆机匀浆，过200目，备用。
2方法
将斜面培养基上的药(食)菌种接种于PDA平板进行活化，然后挑选2cm大小长势好的菌丝块接入装有PDA培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床上(转速80rpm)28℃培养3-5d得液体种子，再将液体种子按照接种量10％-20％的接种量接入固体培养基，按前述条件培养3-5d的固体药(食)菌种，将固体种子按重量10％-20％接种于含水40％-50％的单味中草药上，观察其生长状况，对于菌丝生长缓慢的中草药，按照10％—90％百分比加入麸皮、玉米等基础培养基和生长因子后发酵，选择可以生长的基础培养基的最小百分比，对于加基础培养基后还不能生长的中草药，不进行发酵，在发酵完其他中草药后添加，保持组方的完整性。
3药(食)真菌在组方中单味中草药发酵的适应性结果
根据表1-4可知四种药(食)真菌在雄黄上均能生长，但是在藿香上不能生长，在藿香中添加10％-90％的基础培养基后其生长状况如下：
表9白灵菇在白头翁散单味纯中草药中的菌丝生长情况
表10茯苓在白头翁散单味纯中草药中的菌丝生长情况
表11竹荪在白头翁散单味纯中草药中的菌丝生长情况
表12松乳菇在白头翁散单味纯中草药中的菌丝生长情况
根据上表9-12可以看出，药(食)真菌白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇在白头翁散单味纯中草药中均能生长，白灵菇、茯苓、松乳菇三种药(食)真菌在白头翁散单味中药均能较好的生长，而竹荪相对差一点。因此在药(食)真菌发酵白头翁散的时候采用全发酵。
实例4:白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇体等药(食)真菌体外抑菌试验
1材料
药(食)真菌菌种：白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇
病原菌：大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌
病原菌培养基：37℃、肉汤培养基
魏氏梭菌培养：37℃、10CO2％
2方法
(1)菌液制备
药(食)真菌发酵液：将斜面培养基上的药(食)菌种接种于PDA平板进行活化，然后挑选2-4cm大小长势好的菌丝块接入装有PDA培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床上(转速80rpm)28℃培养3-5d得发酵液。
病原菌制备：经过肉汤平板活化过的病原菌，于37℃培养24h后，挑选典型菌落接种于肉汤中，再经37℃肉汤培养24h，将菌液稀释至104～105个/ml备用。
(2)药(食)真菌发酵液的处理：将发酵好的真菌菌丝温度100℃处理5min，磨碎后加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶于40-50℃处理2h-3h，离心取上清液备用。
(3)药(食)真菌抑制病原菌的测定
采用牛津杯法。吸取病原菌菌液0.1ml于肉汤培养基中，用涂布棒在平板上涂匀，然后在平板中放入牛津杯，在牛津杯中加入药(食)真菌发酵液的处理液1.5ml，于37℃恒温培养24h，记录结果。
3结果
表13药(食)真菌抑制病原菌测定结果
由上表13可以看出所选4药(食)真菌菌种对大肠杆菌与沙门氏菌都有抑菌作用，其中白灵菇与茯苓对魏氏梭菌有抑制作用，竹荪、松乳菇对魏氏梭菌没有抑制作用，对大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌抑菌圈最大的是白灵菇。
实例5:药(食)真菌发酵组方止痢散、白头翁散发酵终点的判断与体外抑菌试验
1材料
药(食)真菌菌种：白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇
病原菌：大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌
病原菌培养基：37℃、肉汤培养基魏氏梭菌培养：37℃、10CO2％
中草药组方止痢散、白头翁散
2方法
(1)发酵止痢散：只发酵雄黄，发酵雄黄烘干之后按比例加入藿香和滑石
发酵白头翁散：采用全发酵(组方中所有中草药都发酵)
病原菌制备：经过肉汤平板活化过的病原菌，于37℃培养24h后，挑选典型菌落接种于肉汤中，再经37℃肉汤培养24h，将菌液稀释至104～105个/ml备用
(2)药(食)真菌抑制病原菌的测定
采用牛津杯法。吸取病原菌菌液0.1ml于肉汤培养基中，用涂布棒在平板上涂匀，然后在平板中放入牛津杯，在牛津杯中加入药(食)真菌发酵液的处理液1.5ml，于37℃恒温培养24h，记录结果。
表14白灵菇发酵止痢散
表15茯苓菇发酵止痢散
表16竹荪发酵止痢散
表17松乳菇发酵止痢散
表18白灵菇发酵白头翁散
表19茯苓发酵白头翁散
表20竹荪发酵白头翁散
表21松乳菇发酵白头翁散
由表可知14-21，4种药(食)真菌发酵止痢散中，白灵菇发酵止痢散效果最好，且发酵后的药性得到一定的提升，其抑菌圈最大的发酵时间为第3d-4d，为了使中草药得到充分发酵选择发酵终点时间为4d；4种药(食)真菌发酵白头翁散中，白灵菇的效果最好，松乳菇其次，发酵后的药效得到大大提升，药物抑菌圈最大的时间为第3d-4d，第5天药效有点降低，因此选择4种药(食)真菌发酵白头翁散的发酵终点为第4d。
实例6:发酵白头翁散的养殖试验
1、试验药物：
发酵白头翁散：由白灵菇发酵白头翁散中草药，发酵时间4d，发酵后50-60℃烘干超微粉碎，自制。
2、试验地点：养猪场自然感染大肠杆菌病仔猪565头，体重相近，30-50日龄。
3、方法：对猪场自然发病的猪仔进行治疗，白头翁散(发酵与未发酵两种)分高、中、低剂量组口服给药治疗。结果详见表22。
表22自然感染大肠杆菌的患猪仔治疗实验统计结果
4、结果：发酵的白头翁散高剂量给药2次，基本痊愈，治愈率96.7％，发酵的白头翁散中、低剂量3次可基本痊愈，表现为排便次数减少，粪便变干，皮毛干净，精神明显好转，好动，食欲增强，体重增加。治愈率分别为95.7％，94.5％，而未发酵的白头翁散高剂量组口服给药3次后，下痢减轻，但效果不显著，6次用药后，效果明显，未发酵的白头翁散中、低剂量用药3次后无明显效果，给药6次后，猪仔泻痢严重，死亡率分别达8.2％、18.7％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种药/食用真菌发酵中草药的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)药/食真菌固体种子的制备：
将药/食真菌在PDA平板上活化，活化后的药/食真菌接种到液体种子培养基中，培养2-4d，培养好的液体种子接入到灭菌后的固体培养基中，培养2-3d即为固体种子，备用；
(2)中草药的准备：
按照中药的组方来选取中草药，把选取好的中草药烘干，磨碎，过200目筛，把中草药调到含水量在40-60％，灭菌，备用；
(3)药/食真菌与中草药的双向发酵：
把固体种子接入到灭菌好的中草药中，先按照单一的纯中草药中接药/食真菌，对于菌丝生长缓慢的中草药，按照10％-90％重量百分比加入基础培养基和生长因子后发酵，选择可以生长的基础培养基的最小百分比，对于加基础培养基后还不能生长的中草药，不进行发酵，在发酵完其他中草药后添加，保持组方的完整性，发酵的全过程采用固体静止发酵，在菌丝长满中草药后，进行翻动1-2次，以便中草药得到充分的发酵；
(4)药/食真真菌与中草药的双向发酵终点的判断：
在灭菌的中草药上接种药/食真真菌后，每隔一天取一次样，对样进行有效药物提取，提取后的药物做抑菌实验，以抑菌效果最佳的取样时间作为发酵终点；
其中，所述的药/食真菌为白灵菇、茯苓、竹荪、松乳菇中的一种或多种；所述的中草药为含黄连、黄芩、黄柏、苦参、秦皮、龙胆草、地锦草、马齿苋、连钱草、藿香、佩兰、苍术、五倍子、石榴皮、罂粟壳、乌梅一种或多种的方药或组方为止痢散、白头翁散。
2.如权利要求1所述的药/食用真菌发酵中草药的方法，其特征在于：所述的基础培养基为：豆粕、玉米浆、麦麸、面粉、玉米粉或米糠。
3.如权利要求1所述的药/食用真菌发酵中草药的方法，其特征在于：所述的生长促进剂为磷酸氢二钾、硫酸镁、氨基酸或维生素。
4.如权利要求1所述的药/食用真菌发酵中草药的方法，其特征在于：发酵的条件为：含水量40-60％，pH值4.5-8.5，发酵温度20-30℃，发酵时间1-5天。
5.一种如权利要求1所述的方法发酵的中草药用于制备治疗湿热痢疾、急慢性胃肠炎疾病的药物中的用途；其中，所述的中草药为止痢散、白头翁散。
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