CN104164376B - 大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法 - Google Patents
大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种大量生产γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。所述枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC？No.7288。本发明所获得的诱变菌株SY-ND-SFX029与常规γ-PGA生产菌相比，其γ-PGA生产能力强，并由此能够有效提高γ-PGA的生产效率，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸[γ-poly(glutamicacid),γ-PGA]，是由L-谷氨酸[L-Glu]、D-谷氨酸[D-Glu]单体通过γ-谷氨酰胺键结合而成的一类均聚氨基酸。近年来对这种高分子材料的研究开发进展迅速，该种材料可以自然降解，而且降解产物无毒害，不会对环境产生二次污染。γ-PGA作为一种高分子聚合物，具有许多独特的物理、化学和生物学特性，例如可生物降解性、强吸水性、良好的生物相容性、可塑性、粘结性等特性。这些特性使其具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和黏结等有益功能。因此，在注重环保，强调可持续发展的今天，γ-PGA及其衍生物在农业、环保、医药、水处理及化妆品工业等领域有着广泛应用前景。
γ-PGA是迄今发现的少数几个可以利用生物聚合得到的聚合氨基酸之一。1937年Ivaovics等在病原菌炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）的荚膜中首次发现了γ-PGA，此后在一些非致病性的芽孢杆菌属（Bacillussp.）革兰氏阳性菌的荚膜中也发现了γ-PGA的存在，例如地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）。γ-PGA作为某些微生物荚膜的主要成分之一，很多环境下是作为微生物的一种适应性因子存在，如保护细胞不受蛋白酶的攻击或高盐环境下保持水分的吸收。γ-PGA对环境无污染，为绿色生物产品。目前日本、我国台湾和美国等对γ-PGA发酵的研究处于世界领先水平，很多相关的生产工艺和技术已经形成专利。其中我国台湾味丹企业已经实现了γ-PGA的商业化生产。
目前合成γ-PGA的主要方法是微生物发酵法、化学合成法、提取法等。化学合成法面临的主要问题是工艺路线较长，副产物多，收率低。γ-PGA作为一种高分子聚合物，其许多物理化学性质与分子量密切相关，采用化学合成法得到的γ-PGA分子量较低，而提高产物分子量必将大大降低产率，因此，该方法不具备实际应用价值。提取法由于γ-PGA固有的特性，使得提取工艺复杂，成本较高，无法大规模生产。γ-PGA的制备方法主要集中在微生物发酵合成，微生物发酵法工艺简单、培养条件温和、周期短且适合于大规模生产，因此，微生物发酵法是目前制备γ-PGA最具有工业化前景的生产方法。但该方法产量不高是制约其大规模工业生产的主要原因。
发明内容
本发明目的在于提供一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SY-ND-SFX029已于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为：CGMCCNo.7288。
所述菌株以纳豆中筛选出的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）菌株SY-ND为出发菌株经常压室温等离子体诱变后得到；其中枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）菌株SY-ND已于2011年9月6日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为：CGMCCNo.5224。
大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，将所述诱变菌株枯草芽孢杆菌于保藏培养基中，在30-37℃活化12-24h；活化后菌株于种子培养基中，于30-37℃，100-150rpm下培养1-2天，作为种子液；将所得种子液以4-8%（v/v）接种比例接种于发酵培养基中，在30-37℃下，100-150rpm振荡培养2-4天。
所述保藏培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1.0L，pH7.2；
所述种子培养基：蛋白胨6-15g/L，葡萄糖5-10g/L，酵母膏3-10g/L，NaCl5-8g/L，pH6.0-7.0，K2HPO40.5-1g/L，KH2PO40.5-1g/L,MgSO40.5-1g/L，水1.0L；
发酵培养基：L-谷氨酸钠25-35g/L，蔗糖25-40g/L，蛋白胨6-20g/L，K2HPO40.5-1g/L，MgSO40.5-1g/L，KH2PO40.5-1g/L，CaCl20.1-0.3g/L，MnSO4·H2O0.05-0.08g/L，蒸馏水1.0L，pH6.6-7.2。
本发明所具有的优点：本发明所获得的诱变菌株SY-ND-SFX029与常规γ-PGA生产菌相比，其γ-PGA生产能力强，并由此能够有效提高γ-PGA的生产效率，降低生产成本。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能一次限定本发明的保护范围。
实施例1
以枯草芽孢杆菌SY-ND为出发菌株采用常压室温等离子体诱变技术筛选菌株SY-ND-SFX029
1.诱变菌株SY-ND-SFX029的获得
（1）选择生长良好的γ-聚谷氨酸生产菌株SY-ND斜面菌种，接种至菌种保藏培养基活化12h，对活化后的菌液适当稀释至OD600值0.8-1.2，取微量上述稀释好的菌液于等离子体诱变育种机，在距离离子源2mm处，分别照射10s、30s、1min、2min、3min、4min、5min，对照射后菌液适当稀释涂平板，于30℃恒温培养，计算致死率。
所述菌株SY-ND已于2011年9月6日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.5224。保藏培养基：蛋白胨10g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏3g/L、NaCl5g/L，pH7.0。
（2）根据（1）的计算结果，致死率为80%时正突变率大于负突变率，当致死率高于90%时，负突变率较高，所以选择致死率为80%-90%的处理组，即上述对菌株SY-ND分别照射1min、2min、3min的三组等离子体照射处理组，对处理结果梯度稀释涂平板，恒温培养。
（3）把（2）中的诱变菌株接种到发酵培养基的固体平板上培养，选择培养基中菌落边缘较为整齐、粘稠、透明，用接种环触碰呈拉丝状，即得高产聚谷氨酸诱变菌株。所述发酵培养基的固体平板培养基为L-谷氨酸钠30g/L，蔗糖30g/L，蛋白胨15g/L，K2HPO41g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4·H2O0.05g/L,琼脂粉18g/L，蒸馏水1.0L，pH6.8，
（4）取（3）中得到的多株菌株接种到发酵培养基中，在30℃下，120rpm振荡培养3天，即得到聚谷氨酸高产菌株SY-ND-SFX029。
聚谷氨酸高产菌株SY-ND-SFX029已于2013年3月8日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.7288。
发酵培养基成分为L-谷氨酸钠30g/L，蔗糖30g/L，蛋白胨15g/L，K2HPO41g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4·H2O0.05g/L，pH6.8，蒸馏水1.0L，121℃灭菌20min。
培养条件：250mL摇瓶，装液量40mL，30℃，120rpm，振荡培养3天。
2.诱变菌株SY-ND-SFX029的特性
（1）菌体形态：菌体着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动，为革兰氏阳性菌。
（2）菌落形态：菌落大体呈圆形，面积较大，菌苔边缘整齐，菌落不透明且粘度大，接种环触碰有拉丝状。当发酵培养基中添加适量L-谷氨酸钠时，菌落拓展明显，菌落表面呈“木耳状”，倒置培养时，菌落悬挂呈滴落状。
（3）培养特征：37℃，120rpm震荡培养3天，成熟发酵液颜色为浅黄色。
（4）可以利用的碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、柠檬酸、甘油、糖蜜、L-谷氨酸钠，上述碳源可以选择性混合使用。
（5）可以分别以葡萄糖、蔗糖为唯一碳源进行生长，并且生长良好。
（6）可以利用的氮源：蛋白胨、鱼粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏，上述氮源可单一使用，也可选择性混合使用。
实施例2
枯草芽孢杆菌SY-ND-SFX029的培养
1.培养基的配制
（1）保藏培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂18g/L，蒸馏水1.0L，pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）种子培养基：蛋白胨6g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，pH6.5，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.5g/L，蒸馏水1.0L，121℃高压灭菌20min。
（3）发酵培养基：L-谷氨酸钠25g/L，蔗糖30g/L，蛋白胨6g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4·H2O0.05g/L，蒸馏水1.0L，pH6.8，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2.菌种活化
将枯草芽孢杆菌SY-ND-SFX029转接种子培养基中斜面培养，即于恒温培养箱中，37℃培养12h。
3.种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基三角瓶（250mL三角瓶内装40mL培养基）中，于37℃，120rpm振荡培养24h。
4.发酵培养
将3中制得的种子培养液按4%（v/v）接种量接种于发酵培养基中（250mL三角瓶内装40mL培养基），于37℃，120rpm培养3天。
检测结果：诱变枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SY-ND-SFX029在发酵培养基发酵生产γ-聚谷氨酸产量为25.5g/L。出发菌株SY-ND的聚谷氨酸发酵产量为7.1g/L，经诱变选育后菌株产量比出发菌株产量提高2.6倍。
Claims (3)
1.一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株SY-ND-SFX029已于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.7288。
2.一种权利要求1所述的大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将所述诱变菌株枯草芽孢杆菌于保藏培养基中，在30-37℃活化12-24h；活化后菌株于种子培养基中，于30-37℃，100-150rpm下培养1-2天，作为种子液；将所得种子液以4-8％(v/v)接种比例接种于发酵培养基中，在30-37℃下，100-150rpm振荡培养2-4天。
3.按权利要求2所述的大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：
所述保藏培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1.0L，pH7.2；
所述种子培养基：蛋白胨6-15g/L，葡萄糖5-10g/L，酵母膏3-10g/L，NaCl5-8g/L，pH6.0-7.0，K2HPO40.5-1g/L，KH2PO40.5-1g/L,MgSO40.5-1g/L，蒸馏水1.0L；
发酵培养基：L-谷氨酸钠25-35g/L，蔗糖25-40g/L，蛋白胨6-20g/L，K2HPO40.5-1g/L，MgSO40.5-1g/L，KH2PO40.5-1g/L，CaCl20.1-0.3g/L，MnSO4·H2O0.05-0.08g/L，蒸馏水1.0L，pH6.6-7.2。
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