CN112251356B - 一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法 - Google Patents

一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法。本发明通过配制半固体发酵培养基，灭菌后将培养基分装入无菌的培养孔板中，待半固体发酵培养基凝结后将单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的孔中，盖好孔板盖，将孔板倒置培养，培养24‑96h后，观察孔板盖是否有液体状产物；如有，则接入该孔的菌株为聚谷氨酸高产菌株。本方法简化了传统筛选高产γ‑聚谷氨酸菌株的过程，大大减轻了筛选过程的工作量。

Description

一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)主要由芽孢杆菌属(Bacillus)分泌出的胞外多肽，是这些微生物的荚膜的主要成分，其由谷氨酸单体通过γ-谷氨酰胺键聚合而成。γ-PGA是无毒无害且对环境无污染的绿色生物产品，其具有高水溶性、吸水能力强、可降解、很好的生物相容性、成膜性强、粘度高和成纤维性等独特的物理化学性能和生物学特性，使其可在医药、食品、环境、日化、农业等行业都具有广阔的应用前景。
目前，依然不少研究者筛选高产的γ-PGA的菌株，来降低γ-PGA的生产成本。但是，目前依然采用的是将样品稀释涂布在分离培养基中，然后将在分离培养基上单菌落接入液体发酵培养基中，进行摇瓶发酵；发酵完，测发酵液中γ-PGA的产量；该方法工作量大，摇瓶发酵需要大量的空间进行，不能同时对大量的分离培养基上的单菌进行筛选。因此需要开发能批量筛选高产γ-PGA的菌株的方法。
发明内容
本发明针对现有技术方法不能同时对大量的高产γ-PGA的菌株进行筛选的不足，提供一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法，通过半固体发酵培养基在孔板中进行批量筛选，该方法简单易行，成本低廉。
本发明的快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法，包括以下步骤：
a.将待筛选样品梯度稀释后涂布于分离培养基上培养；
b.根据待筛选样品中菌种/菌群类型，配制相应的半固体发酵培养基，灭菌后将融化的培养基分装入无菌的培养孔板中，将分离培养基上单菌落转接到孔中的凝结后的半固体发酵培养基上，盖好孔板盖，将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中培养；观察孔板盖是否有液体状产物，如有，则接入该孔的菌株为高产聚谷氨酸菌株。
优选，所述的半固体发酵培养基中含有琼脂的量为质量分数0.2％-0.8％；所述的培养基分装，其分装量控制为培养基液面离盖好后的孔板盖的距离为2-15mm。
优选，所述的培养孔板为96孔、48孔、24孔或12孔培养板。
优选，所述的分离培养基为营养琼脂培养基。
优选，待筛选样品中菌种/菌群为地衣芽孢杆菌，其半固体发酵培养基为：含有柠檬酸12g/L、甘油80g/L、L-谷氨酸20g/L、氯化铵7g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、二水氯化钙0.15g/L、一水硫酸锰0.104g/L、六水氯化铁0.01g/L和琼脂2g/L，余量为水，pH6.5。
优选，待筛选样品为纳豆，其半固体发酵培养基为：含有大豆粉40g/L和琼脂8g/L，余量为水，pH6.5。
优选，待筛选样品中菌种/菌群为枯草芽孢菌，其半固体发酵培养基为：含有葡萄糖60g/L、蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.05g/L、二水氯化钙0.1g/L、一水硫酸锰0.104g/L、六水氯化铁0.01g/L和琼脂5g/L，余量为水，pH6.5。
优选，待筛选样品为盐碱地土样，其半固体发酵培养基为：含有葡萄糖100g/L、蛋白胨50g/L、谷氨酸钠100g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.05g/L和琼脂3g/L，余量为水，pH6.5。
优选，所述的步骤a的涂布于分离培养基上培养，是在37℃培养24h。
优选，所述的步骤b的将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中培养，是在37℃培养24-96h。
有益效果：
本发明方法提供了快速筛选出高产γ-PGA的菌株的方法，该方法简单快速，可以同时筛选过千株单菌。而传统的方法，需要将每个单菌接入液体发酵培养，然后振荡培养数天，最后，测每个摇瓶的γ-PGA的产量。与传统方法比较，本发明的方法简单，简化传统筛选的过程，直接由肉眼观察出高产的菌株，减轻筛选的工作量。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
经过太空诱变的地衣芽孢杆菌ATCC9945a的冻干粉末，溶于无菌的生理盐水中，梯度稀释取100μL涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。
将半固体发酵培养基融化，取100μL融化的培养基加入96孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为5mm。
所述的半固体发酵培养基的成分：含有柠檬酸12g/L、甘油80g/L、L-谷氨酸20g/L、氯化铵7g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、二水氯化钙0.15g/L、一水硫酸锰0.104g/L、六水氯化铁0.01g/L和琼脂2g/L，余量为水，调pH为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的96孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养96h。γ-PGA是分泌到细胞外的产物，并且γ-PGA具有较大的粘性。当孔板倒置培养时，如果γ-PGA产量大积累较多时，自身重力大于其粘力时，重力作用产物就会滴落到孔板盖上；如果γ-PGA产量少，自身重力小于其粘力时，产物只能粘在孔板中。因此，肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
共挑取了768个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出24株高产量γ-PGA的生产菌。诱变前，出发菌的γ-PGA产量为30.73g/L。对筛选出的24株菌进行摇瓶发酵，γ-PGA的平均产量为55.52g/L。
实施例2：
将市场上纳豆样品加入无菌的生理盐水，梯度稀释取100微升涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。
将半固体发酵培养基融化，取1mL融化的培养基加入12孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为10mm。
所述的半固体发酵培养基的成分：粉碎的大豆粉40g/L，琼脂8g/L，余量为水，调pH为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的12孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养24h。然后肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
共挑取了768个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出的26株高产量γ-PGA的生产菌。对筛选出的26株菌进行固体发酵，γ-PGA的平均产量为36.31g/L。
实施例3：
将微重力诱变的枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)PGA-7冻干粉，加入无菌的生理盐水，,梯度稀释取100μL涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)PGA-7保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO：M206102，该菌公开于专利号：ZL 200610122640.5，发明名称为：γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法的专利中。
将半固体发酵培养基融化，取0.5mL融化的培养基加入24孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为15mm。
所述的发酵培养基的成分：含有葡萄糖60g/L、蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.05g/L、二水氯化钙0.1g/L、一水硫酸锰0.104g/L、六水氯化铁0.01g/L和琼脂5g/L，余量为水，调pH为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的24孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养48h。然后肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
共挑取了768个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出15株高产量γ-PGA的生产菌。诱变前，出发菌的γ-PGA产量为2.8g/L。对筛选出的24株菌进行摇瓶发酵，γ-PGA的平均产量为4.08g/L。
实施例4：
盐碱地土样溶于无菌的生理盐水中，梯度稀释取100μL涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。
将半固体发酵培养基融化，取300μL融化的培养基加入48孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为2mm。
所述的半固体发酵培养基的成分：含有葡萄糖100g/L、蛋白胨50g/L、谷氨酸钠100g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.05g/L和琼脂3g/L，余量为水，调pH为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的48孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养72h。然后肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
共挑取了480个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出2株高产量γ-PGA的生产菌。进行摇瓶发酵，γ-PGA的产量分别为38.15g/L，35.55g/L。

Claims (4)

1.一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将待筛选样品梯度稀释后涂布于分离培养基上培养；
b.根据待筛选样品中菌种/菌群类型，配制相应的半固体发酵培养基，灭菌后将融化的培养基分装入无菌的培养孔板中，将分离培养基上单菌落转接到孔中的凝结后的半固体发酵培养基上，盖好孔板盖，将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中培养；观察孔板盖是否有液体状产物，如有，则接入该孔的菌株为高产聚谷氨酸菌株；
当待筛选样品中菌种/菌群为地衣芽孢杆菌，其半固体发酵培养基为：含有柠檬酸12g/L、甘油80g/L、L-谷氨酸20g/L、氯化铵7g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、二水氯化钙0.15g/L、一水硫酸锰0.104g/L、六水氯化铁0.01g/L和琼脂2g/L，余量为水，pH6.5；
当待筛选样品为纳豆，其半固体发酵培养基为：含有大豆粉40g/L和琼脂8g/L，余量为水，pH6.5；
当待筛选样品中菌种/菌群为枯草芽孢菌，其半固体发酵培养基为：含有葡萄糖60g/L、蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.05g/L、二水氯化钙0.1g/L、一水硫酸锰0.104g/L、六水氯化铁0.01g/L和琼脂5g/L，余量为水，pH6.5；
当待筛选样品为盐碱地土样，其半固体发酵培养基为：含有葡萄糖100g/L、蛋白胨50g/L、谷氨酸钠100g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.05g/L和琼脂3g/L，余量为水，pH6.5；
所述的步骤b的将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中培养，是在37℃培养24-96h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基分装，其分装量控制为培养基液面离盖好后的孔板盖的距离为2-15mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养孔板为96孔、48孔、24孔或12孔培养板，所述的分离培养基为营养琼脂培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的涂布于分离培养基上培养，是在37℃培养24h。
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