CN103146617A - 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JUWEI001已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7034，保藏时间为2012年12月24日。本发明还涉及该枯草芽孢杆菌的培养方法与应用。本发明筛选的枯草芽孢杆菌JUWEI001抗逆性强，在生长过程中可产生丰富的具有高活力和植物病害防治功能的生理活性物质，具有促进土壤有机质分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性，改善土壤中微生物菌群结构，促进植物根系生长，抑制有害真菌、细菌、病毒和菌原体等作用。
Description
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种，单个细胞，0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
目前对枯草芽孢杆菌的研究报道非常多。如中国专利文献CN1554744A(申请号200310104195.6)公开了一种枯草芽孢杆菌菌株,将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B9601-Y2,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日:2003年6月18日，保藏号:CGMCC No.0954。该枯草芽孢杆菌B9601-Y2,可用于防治植物不同类型病害及食用菌污染,并能有效地促进植物生长和生根，对许多土传植物病原物具有较好的控制作用、兼顾月季切花保鲜作用,能耐贮藏、抗逆性好,重新施入环境中也不会导致环境污染。
中国专利文献CN102517235A（申请号201110443948.0）公开了枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CH-001，已于2011年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏编号为：CCTCCNO：M2011111。该菌株具有广谱降解角蛋白的特性，产酶活性高，稳定性好。不仅能产生高活性角蛋白酶，同时可降解胶原蛋白，对金黄色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，适用于动物蛋白饲料添加剂、角蛋白酶发酵生产等。
中国专利文献CN102515891A（申请号201210003711.5）公开了一种微生物肥料，包含下列比例的微生物发酵液：光合细菌、乳酸菌、放线菌、康宁木霉菌、枯草芽孢杆菌发酵液体积比为1∶0.8～1∶1.2～1.4：0.6～0.8:1～1.2。该发明制备的肥料，可以提高肥料的利用效率，并且还能够起到防治植物枯死、病害的作用。
因此研究枯草芽孢杆菌新菌株对于开发新的微生物肥料具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JUWEI001及培养方法与应用。
本发明技术方案如下：
一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JUWEI001已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7034，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JUWEI001为革兰氏阳性菌，细胞杆状，0.8～1.0×1.2～1.8μm，30～35℃培养24～48h可形成大量芽孢，无伴胞晶体，芽孢大小为0.7～0.9×1.0～1.5μm，不膨大，长圆形或圆柱形；在营养琼脂上30～35℃培养1～3d可大量形成菌落，呈污白色，粗糙有皱褶，不透明，不闪光，蔓延，边缘不规则；在肉汤培养基中30～35℃培养24～48h，可在液面形成菌膜，液体内部浑浊；营养琼脂穿刺培养时菌体在表面生长，底部不生长；接触酶反应、甲基红实验、VP实验均呈阳性，氧化酶反应与厌氧培养实验呈阴性，可发酵葡萄糖、***糖、木糖、甘露糖，可利用柠檬酸盐、液化明胶、水解淀粉与酪素，硝酸盐还原反应阳性。
上述枯草芽孢杆菌JUWEI001的培养方法，步骤如下：
①将枯草芽孢杆菌JUWEI001接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，在35℃～39℃条件下，培养45～50h；
②挑取菌体接种于玉米粉液体培养基，培养温度35℃～39℃，180～200rpm，培养时间22～26h，制得枯草芽孢杆菌培养液；
③以1～5%（w/w）的接种量将步骤②制得的枯草芽孢杆菌JUWEI培养液接种于玉米粉发酵培养基中，发酵条件为：35～38℃，罐压：0.05Mpa，通风0.8～1vvm，搅拌速度180～200rpm，培养时间为2～3天，即得。
根据本发明优选的，所述步骤①中的牛肉膏蛋白胨培养基每百毫升组分如下：牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂2g、pH7.0～7.2；
根据本发明优选的，所述步骤②中的玉米粉液体培养基每百毫升组分如下：玉米粉1.5g，豆粕粉0.9g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，MgSO40.1%，pH6.8～7.0；
根据本发明优选的，所述步骤③中的玉米粉发酵培养基，组分如下，均为重量百分比：玉米粉2.00%（w/w），豆粕粉7.00%（w/w），磷酸氢二钠0.40%（w/w），磷酸二氢钾0.03%（w/w），MgSO40.1%（w/w），消泡剂0.02～0.05%（w/w），pH6.8～7.0。
上述试剂如无特别说明，均为本领域常规市售产品。
上述枯草芽孢杆菌JUWEI001在制备微生物有机肥中的应用。
有益效果
本发明筛选的枯草芽孢杆菌JUWEI001抗逆性强，在生长过程中可产生丰富的具有高活力和植物病害防治功能的生理活性物质，具有促进土壤有机质分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性，改善土壤中微生物菌群结构，促进植物根系生长，抑制有害真菌、细菌、病毒和菌原体等作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JUWEI001已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7034，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JUWEI001已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7034，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
上述枯草芽孢杆菌JUWEI001由植株根际土壤中分离出的枯草芽孢杆菌原始菌株，经过紫外线诱变（1×107个/ml的菌悬液放于直径9cm的培养皿内，紫外灯预热20min，将培养皿至于磁力搅拌器上并使培养皿在20W紫外灯垂直距离30cm左右，照射150S）筛选出生长速度快、β-甘露聚糖酶、β葡聚糖酶、蛋白酶和抑菌活性较高的菌株经过平板试验、拮抗试验，筛选出生长速度快、产酶能力高、抑菌活性较强的菌株。
枯草芽孢杆菌JUWEI001为革兰氏阳性菌，细胞杆状，0.8～1.0×1.2～1.8μm，30～35℃培养24～48h可形成大量芽孢，无伴胞晶体，芽孢大小为0.7～0.9×1.0～1.5μm，不膨大，长圆形或圆柱形；在营养琼脂上30～35℃培养1～3d可大量形成菌落，呈污白色，粗糙有皱褶，不透明，不闪光，蔓延，边缘不规则；在肉汤培养基中30～35℃培养24～48h，可在液面形成菌膜，液体内部浑浊；营养琼脂穿刺培养时菌体在表面生长，底部不生长；接触酶反应、甲基红实验、VP实验均呈阳性，氧化酶反应与厌氧培养实验呈阴性，可发酵葡萄糖、***糖、木糖、甘露糖，可利用柠檬酸盐、液化明胶、水解淀粉与酪素，硝酸盐还原反应阳性。
将筛选出的该菌株连续转接10代，其优良性状遗传稳定。
原始菌株和突变菌株摇瓶培养24h后，发酵液（8000r/min，离心20min）中的β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶活性，结果如表1所示。由表1可知，突变株（枯草芽孢杆菌JUWEI001）在生长过程中比原始菌株具有更强的促进土壤有机质分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性的效果。
盆栽实验中枯草芽孢杆菌JUWEI001对黄瓜黄萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）的防治效果如表1所示。
表1枯草芽孢杆菌诱变结果
实施例2
枯草芽孢杆菌JUWEI001的培养方法，步骤如下：
①将枯草芽孢杆菌JUWEI001接种于牛肉膏蛋白胨培养基，在温度35℃℃条件下，培养50h；
②挑取菌体接种于玉米粉液体培养基，培养温度39℃，200rpm，培养时间22h，制得枯草芽孢杆菌培养液；
③以1～5wt%的接种量将步骤②制得的枯草芽孢杆菌培养液接种于玉米粉发酵培养基中，发酵条件为：温度40℃，罐压：0.05Mpa，通风1vvm，搅拌速度200rpm，培养时间为2天，即得。
所述步骤①中的牛肉膏蛋白胨培养基每百毫升组分如下：牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂2g、pH7.0；
所述步骤②中的玉米粉液体培养基每百毫升组分如下：玉米粉1.5g，豆粕粉0.9g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，MgSO40.1%，pH7.0；
所述步骤③中的玉米粉发酵培养基，组分如下，均为重量百分比：玉米粉2.00%（w/w），豆粕粉7.00%（w/w），磷酸氢二钠0.40%（w/w），磷酸二氢钾0.03%（w/w），MgSO40.1%（w/w），消泡剂0.05%（w/w）（商品名：th085泡敌，购自天津市冠前化工经销部），pH6.8。
经检测，有效菌体浓度为3×109个/ml。
Claims (6)
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JUWEI001已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7034，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JUWEI001的培养方法，其特征在于，步骤如下：
①将枯草芽孢杆菌JUWEI001接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，在35℃～39℃条件下，培养45～50h；
②挑取菌体接种于玉米粉液体培养基，培养温度35℃～39℃，180～200rpm，培养时间22～26h，制得枯草芽孢杆菌培养液；
③以1～5%（w/w）的接种量将步骤②制得的枯草芽孢杆菌JUWEI培养液接种于玉米粉发酵培养基中，发酵条件为：35～38℃，罐压：0.05Mpa，通风0.8～1vvm，搅拌速度180～200rpm，培养时间为2～3天，即得。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤①中的牛肉膏蛋白胨培养基每百毫升组分如下：牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂2g、pH7.0～7.2。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤②中的玉米粉液体培养基每百毫升组分如下：玉米粉1.5g，豆粕粉0.9g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，MgSO40.1%，pH6.8～7.0。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤③中的玉米粉发酵培养基，组分如下，均为重量百分比：玉米粉2.00%（w/w），豆粕粉7.00%（w/w），磷酸氢二钠0.40%（w/w），磷酸二氢钾0.03%（w/w），MgSO40.1%（w/w），消泡剂0.02～0.05%（w/w），pH6.8～7.0。
6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌JUWEI001在制备微生物有机肥中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130612 |