CN107759685B - 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法，属于水产品精深加工技术领域，本铁螯合肽是以鲟鱼鱼骨为原料，制备明胶，利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对明胶进行酶解，采用超滤、大孔树脂柱层析、亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化得到铁螯合肽Asp‑Gly‑Pro‑Lys‑Gly‑Pro‑His‑Gly‑Lys‑Asp‑Gly‑Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28 Da，本发明的铁螯合肽对铁螯合能力强，用于制备补铁药物和保健品。
Description
技术领域
本发明属于水产品精深加工技术领域，特别是涉及一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法。
背景技术
明胶与胶原具有同源性，是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，但因处理工艺的差异，分子量一般为15000～250000Da。目前，明胶以其在医药、保健品、食品和化妆品等应用上的独特功效被越来越多的消费者所青睐，成为食品行业和保健品行业、日化行业所竞相关注的焦点。
微量元素与人的生存和健康息息相关，对人的生命起至关重要的作用。微量元素的摄入过量、不足、不平衡或缺乏都会不同程度地引起人体生理的异常或发生疾病，研究表明约30%的疾病直接是微量元素缺乏或不平衡所致。如：缺铁导致贫血；缺锌使免疫力下降并影响发育和智力，缺碘发生甲状腺肿大等。目前，微量元素的补充有多种形式，金属盐类、金属螯合肽等。其中，金属螯合肽生物利用度高、稳定性强和易吸收等优点受到普遍关注。
鲟鱼（Sturgeon），就是指鲟形目的鱼类，鲟鱼隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、硬鳞总目、鲟形目。目前，我国已经成功解决了俄罗斯鲟、欧洲鳇等引进品种的人工养殖技术，养殖产品也出国国外多个国家。养殖鲟鱼在加工过程中会产生大量鲟鱼软骨（鲟鱼头骨、脊椎骨等），约占与体重的6%。鲟鱼软骨富含硫酸软骨素和胶原蛋白等活性物质。鲟鱼鱼肉出口过程中，剩余部分鱼骨副产物，合理利用鲟鱼鱼骨产生更多经济价值成为行业急需解决的技术难题。
经检索，以鲟鱼鱼骨为原料制备明胶和金属螯合肽的技术未见报道。基于此，本发明根据鲟鱼鱼骨的研究现状，提供一种铁螯合肽，并提供这种铁螯合肽的制备方法。
发明内容
本发明针对上述的技术现状提供一种的鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽，铁螯合肽的氨基酸序列为Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28 Da。
作为优选，铁螯合肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR）对铁离子的螯合能力为167.13 μg/mg。
作为优选，鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽用于制备补铁药片和保健品的用途。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
1）鲟鱼鱼骨的预处理：按照料液比1 g:10~15 mL向鲟鱼鱼骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤至pH 6.5~7.0、沥干，按照料液比1 g: 5~10 mL加入pH 7.4的0.5 mol/L EDTA溶液，于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼骨粉；
2）鲟鱼鱼骨明胶的制备：按照料液比1 g:8～10 mL将脱钙鱼骨粉加入到双蒸水中，于60～70℃动态提取6～8 h，然后于6 000g离心25～30 min，取上清液，冻干得鲟鱼鱼骨明胶；
3）鲟鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15~20 mL向鲟鱼鱼骨明胶中加入超纯水，用HCl调溶液pH到7.0~8.0，按照胶原蛋白质量的1.5~2.0%向胶原蛋白溶液中加入胰蛋白酶，酶活力≥2.5×104 U/g，酶解3~5 h后，将溶液升温至90~ 95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到9.0~10.0，按照胶原蛋白质量的1.2 ~1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶，酶活力≥2.5×105 U/g，于温度50~60℃下酶解3~4 h，酶解液冷却至室温，于12000g离心20～25 min，取上清液，得酶解产物；
4）鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10～15倍D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱RP-HPLC纯化，得到鲟鱼鱼骨铁螯合肽。
作为优选，鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备步骤中的亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱RP-HPLC纯化的具体过程为：
亲和层析：将IDA-Sepharose装柱，加入3～5倍柱体积的FeSO4 0.2 mol/L，反应12～24 h后，分别用纯净水和pH 4.5～5.5 NaAC-HAC缓冲液流洗3～5个床体积；将胶原肽混合物溶于NaAC-HAC缓冲液，10 mmol/L，pH 4.5～5.5制成浓度为20~25 mg/mL溶液，按照样品溶液:IDA-Sepharose体积比1: 6～8加入到制备的亲和层析柱，用NaAC-HAC缓冲液，10mmol/L，pH 4.5～5.5，流洗3～5个床体积除去未结合多肽，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，10 mmol/L，pH 7.5～8.5，洗脱，紫外214波长检测，富集洗出多肽。
RP-HPLC纯化：将上述亲和层析洗出多肽配成45~55 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对Fe的螯合活性得1个高Fe螯合活性肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR）。
作为优选， RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Eclipse XDB-C18(9.4mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：30min内乙腈浓度由0匀速升至40%；洗脱速度1.5~2.0 mL/min；紫外检测波长214 nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Fe螯合物的独特功效，如可同时补充多肽/氨基酸和Fe，以鲟鱼鱼骨为原材料，通过对胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高Fe螯合活性的胶原肽。本发明为补铁保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时提高了鲟鱼鱼骨的利用价值。
附图说明
图1是本发明的超滤分段组分（MW≦3000 Da）的IDA-Sepharose亲和层析图；
图2是本发明的亲和层析制备多肽混合物的RP-HPLC分析图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，制备工艺流程如下：鲟鱼鱼骨"明胶提取"双酶酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"亲和层析"RP-HPLC制备"铁螯合肽。
1）鲟鱼鱼骨的预处理：按照料液比1 g:10 mL向鲟鱼鱼骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤至pH 7.0、沥干，按照料液比1 g: 8 mL加入pH 7.4的0.5 mol/L EDTA溶液，于4℃下浸泡4天，每天更换1次EDTA溶液，脱钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼骨粉；
2）鲟鱼鱼骨明胶的制备：按照料液比1 g:10 mL将脱钙鱼骨粉加入到双蒸水中，于65℃动态提取8 h，然后于6000g离心30 min，取上清液，冻干得鲟鱼鱼骨明胶。
3）鲟鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15 mL向鲟鱼鱼骨明胶中加入超纯水，用HCl调溶液pH到7.5，按照胶原蛋白质量的2.0%向胶原蛋白溶液中加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g），酶解4 h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到9.5，按照胶原蛋白质量的1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶（酶活力≥2.5×105 U/g），于温度55℃下酶解4 h，酶解液冷却至室温，于12000g离心20 min，取上清液，得酶解产物；
4）鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15倍D101大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲟鱼鱼骨铁螯合肽。
利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：
a）亲和层析：将IDA-Sepharose装柱，加入4倍柱体积的FeSO4（0.2 mol/L），反应15h后，分别用纯净水和pH 5.0 NaAC-HAC缓冲液流洗5个床体积；将胶原肽混合物溶于NaAC-HAC缓冲液（10 mmol/L，pH 5.0）制成浓度为45 mg/mL溶液，按照样品溶液:IDA-Sepharose体积比1:8加入到制备的亲和层析柱，用NaAC-HAC缓冲液（10 mmol/L，pH 5.0）流洗4个床体积除去未结合多肽，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液（10 mmol/L，pH 7.5～8.5）洗脱，紫外214波长检测，富集洗出多肽Frac-II，如图1所示；
b）RP-HPLC纯化：将上述亲和层析酶解物Frac-II用双蒸水配成25~35 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样量15 μL；色谱柱为Eclipse XDB-C18(9.4mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：30min内乙腈浓度由0匀速升至40%；洗脱速度1.5 mL/min；紫外检测波长214 nm），根据对Fe的螯合活性得1个高Fe螯合活性胶原肽P3，如图2所示。
c）结构检测：Fe螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28 Da。
测定结果表明：纯化得到的Fe螯合胶原肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），对铁离子的螯合能力为167.13 μg/mg，与明胶酶解产物（55.68 μg/mg）相比其对Fe的螯合能力有很大提高。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细描述。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成(Acipenser sinensis)
<400> 1
Ala Gly Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Ala Gly Ala
1 5 10
Claims (1)
1.一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽，其特征在于：铁螯合肽的氨基酸序列为Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg(DGPKGPHGKDGR)。
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