CN103966105B - 一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉、生产方法及应用 - Google Patents
一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉、生产方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉、生产方法及应用，所述米曲霉保藏名称为米曲霉（Aspergillusoryzae）AS.mq01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M2013430，保藏日期：2013年9月17日。本发明筛选得到的米曲霉代谢产物中含有能强烈水解人参皂苷Rg3的人参皂苷糖苷酶，在24小时内转化人参皂苷Rg3形成Rh2的转化率最高可达56.6%，而且，转化形成的Rh2不会进一步分解转化。
Description
技术领域
本发明涉及一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉，同时还涉及该米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法及应用，属于中药技术领域。
背景技术
人参(Panax ginseng G.A.Meyer)是我国珍贵的传统中药，应用于中医临床已有两千多年的历史。人参的主要活性成分是人参皂苷(ginsenoside)，其中，原人参二醇类皂苷属于达玛烷型四环三萜皂苷，主要包括Rb1、Rc、Rd、Rg3以及Rh2等。其中，人参皂苷Rg3和Rh2均有十分重要的药用价值，相对于人参皂苷Rh2，实际应用中由于Rg3水溶解性较低，一定程度上限制了药效。此外，人参皂苷Rg3的获得也相对容易，而且它的结构仅比人参皂苷Rh2多了一个糖基，因此可通过水解Rg3中多出的糖基获得Rh2。张丹等(高产人参皂甙β-葡萄糖苷酶菌种的筛选，大连轻工业学院学报，2000)从8种菌种中筛选出一株高产人参皂苷葡萄糖苷酶的菌种黑曲霉(Aspergillus niger)，由该菌种发酵液中获取的粗酶液可以转化Rg3形成Rh2，转化率高达43％，而且形成的Rh2不会被进一步降解。
发明内容
本发明的目的是提供一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉。
本发明的目的还在于提供一种米曲霉在转化人参皂苷Rg3生产Rh2方面的应用。
本发明的目的还在于提供一种米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉，所述米曲霉保藏名称为米曲霉Aspergillus oryzae AS.mq01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M2013430，保藏日期：2013年9月17日。
米曲霉是一种好气性真菌，菌丝有多细胞组成，可产淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶等，是一类产复合酶的菌株，可用于生产各种酶制剂。利用米曲霉活性强大的酶系，降解人参皂苷Rg3分子上的糖基，使其转化为人参皂苷Rh2，可提高人参皂苷的生物利用度。
本发明筛选得到的米曲霉代谢产物中含有能强烈水解人参皂苷Rg3的人参皂苷糖苷酶，在24小时内转化人参皂苷Rg3形成Rh2的转化率最高可达56.6％，而且，转化形成的Rh2不会进一步分解转化。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种米曲霉在转化人参皂苷Rg3生产Rh2方面的应用。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，包括以下步骤：
(1)菌株的准备：将米曲霉活化并发酵培养；
(2)酶液的制备：将步骤(1)的发酵液过滤，滤液离心，去除菌体沉淀，收集上清液；在上清液中加硫酸铵至60-80％饱和度；4-8℃静置过夜，离心，弃上清液，收集蛋白质沉淀；蛋白质沉淀用0.02mol/L，pH4.5-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后装入透析袋，用相同的醋酸-醋酸钠缓冲液透析24-36h；透析后，离心，上清液即为粗酶液；
(3)酶液的转化反应：称取人参皂苷Rg3，用0.02mol/L，pH4.5-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rg3浓度为0.5～1mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在35-45℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，得到人参皂苷Rh2。
步骤(1)的具体方法如下：将米曲霉接种于PDA斜面培养基，于32-36℃培养36-48h，然后挑取菌株孢子或菌落转入麦芽汁培养基，在28-32℃、150-200rpm条件下发酵培养3天。
所述PDA斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水定容至1000ml，自然pH。
所述麦芽汁培养基：将干麦芽粉碎，1重量份麦芽加4重量份水，在65℃水浴锅中糖化3-4h，将糖化液用纱布过滤后稀释至5-6波美度，得到麦芽汁培养基。
所述离心条件为：离心温度15-20℃、转速10000-13000rpm、离心时间10-20min。
本发明利用米曲霉代谢产物中的人参皂苷糖苷酶转化人参皂苷Rg3生产Rh2，操作简单，成本低廉，转化周期短，促进了中药人参皂苷现代化和产业化的发展。
具体实施方式
培养基的配制
PDA斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水定容至1000ml，自然pH。
麦芽汁培养基：将干麦芽粉碎，1重量份麦芽加4重量份水，在65℃水浴锅中糖化3-4h，煮沸后将糖化液用纱布过滤后稀释至5-6波美度，pH值约为6.4，配成麦芽汁培养基。
上述培养基于121℃，0.1MPa，高压灭菌20min，冷却。
实施例1
1、米曲霉的筛选
取某酒厂大曲，用无菌生理盐水依次制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释浓度的悬液，分别吸取不同浓度悬液0.2mL滴入添加氯霉素的PDA培养基表面，均匀涂布，将平板倒置放入30℃的恒温培养箱中培养。待长出菌落后，挑取单菌落并进一步纯化。以菌落外观形态为主，配合镜检观察菌体形态，多次分离纯化后获得一系列纯培养的丝状真菌菌株，对菌株编号后分别接入斜面培养基置于冰箱4℃保存备用。
取分离纯化得到的3个菌株命名为DQ-MJ01、DQ-MJ02和DQ-MJ03，分别进行人参皂苷转化实验，结果显示，菌株DQ-MJ03具有较高转化人参皂苷Rg3形成Rh2的能力。
菌株DQ-MJ03菌落形态观察结果显示，其菌落质地疏松，起初为白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色；镜检形态结果显示，其分生孢子头放射状，直径约150μm-300μm，分生孢子梗2mm左右，无隔膜，顶囊近球形，分生孢子卵圆形或近球形。
18S rDNA片段扩增及测序：提取其基因组，采用EF3、EF4通用引物进行18S rDNA片段扩增及测序。
EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'(如SEQ ID NO.1所示)，
EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'(如SEQ ID NO.2所示)，
其中，R代表A或G。
18S rDNA扩增片段测序结果如SEQ ID NO.3所示。
测序结果在GenBank数据库中进行同源性序列比对分析，结果显示DQ-MJ03与米曲霉(Aspergillus oryzae)相关基因片段在序列上具有极高相似值。结合形态观察以及分子鉴定，鉴定DQ-MJ03为米曲霉(Aspergillus oryzae)，命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)AS.mq01。
实施例2
本实施例的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，包括以下步骤：
(1)菌株的准备：将米曲霉AS.mq01接种于PDA斜面培养基，于36℃培养40h，然后挑取菌株孢子或菌落转入麦芽汁培养基，在28℃、160rpm条件下发酵培养3天；
(2)酶液的制备：将步骤(1)的发酵液过滤，滤液在15℃条件下，10000rpm离心20min，去除菌体沉淀，收集上清液；在上清液加硫酸铵至70％饱和度；4℃静置过夜，在15℃条件下，10000rpm离心20min，弃上清液，收集蛋白质沉淀；蛋白质沉淀用0.02mol/L，pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后装入透析袋，用相同的醋酸-醋酸钠缓冲液透析24h；透 析后，在15℃条件下，10000rpm离心20min，上清液即为粗酶液；
(3)酶液的转化反应：称取人参皂苷Rg3，用0.02mol/L，pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rg3浓度为1mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在40℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，得到人参皂苷Rh2。
人参皂苷Rh2的分解检测：称取人参皂苷Rh2，用0.02mol/L，pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rh2浓度为1mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在40℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，检测Rh2的转化率。
实施例3
本实施例的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，包括以下步骤：
(1)菌株的准备：将米曲霉AS.mq01接种于PDA斜面培养基，于32℃培养48h，然后挑取菌株孢子或菌落转入麦芽汁培养基，在32℃、200rpm条件下发酵培养3天；
(2)酶液的制备：将步骤(1)的发酵液过滤，滤液在20℃条件下，13000rpm离心10min，去除菌体沉淀，收集上清液；在上清液加硫酸铵至60％饱和度；6℃静置过夜，在20℃条件下，13000rpm离心10min，弃上清液，收集蛋白质沉淀；蛋白质沉淀用0.02mol/L，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后装入透析袋，用相同的醋酸-醋酸钠缓冲液透析30h；透析后，在20℃条件下，13000rpm离心10min，上清液即为粗酶液；
(3)酶液的转化反应：称取人参皂苷Rg3，用0.02mol/L，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rg3浓度为0.5mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在35℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，得到人参皂苷Rh2。
人参皂苷Rh2的分解检测：称取人参皂苷Rh2，用0.02mol/L，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rh2浓度为0.5mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在35℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，检测Rh2的转化率。
实施例4
本实施例的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，包括以下步骤：
(1)菌株的准备：将米曲霉AS.mq01接种于PDA斜面培养基，于34℃培养36h，然后挑取菌株孢子或菌落转入麦芽汁培养基，在30℃、150rpm条件下发酵培养3天；
(2)酶液的制备：将步骤(1)的发酵液过滤，滤液在18℃条件下，12000rpm离心15min，去除菌体沉淀，收集上清液；在上清液加硫酸铵至80％饱和度；8℃静置过夜，在18℃条件下，12000rpm离心15min，弃上清液，收集蛋白质沉淀；蛋白质沉淀用0.02mol/L，pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后装入透析袋，用相同的醋酸-醋酸钠缓冲液透析24h；透 析后，在18℃条件下，12000rpm离心15min，上清液即为粗酶液；
(3)酶液的转化反应：称取人参皂苷Rg3，用0.02mol/L，pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rg3浓度为0.75mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在45℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，得到人参皂苷Rh2。
人参皂苷Rh2的分解检测：称取人参皂苷Rh2，用0.02mol/L，pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rh2浓度为0.75mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在45℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，检测Rh2的转化率。
实验例
酶反应液通过HPLC进行检测分析，HPLC色谱条件：检测器为UV/VIS，检测波长203nm；色谱柱：ODS C18(150mm×4.6mm，5μm)；进样量10μl，柱温35℃，流速1ml/min，流动相为乙腈(A)和0.05％磷酸水(B)；人参皂苷Rg3检测：0～58min，A:B＝39:61；59min～80min，A:B＝45:55；人参皂苷Rh2检测：0～45min，A:B＝47：53。根据标准曲线测得反应前后各种成分的含量，根据反应底物和产物摩尔比例关系计算人参皂苷转化率，结果如表1所示。
表1米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的转化分析
| 人参皂苷Rg3转化率(％) | 人参皂苷Rh2的转化率(％) | |
| 实施例2 | 56.6 | 0 |
| 实施例3 | 51.7 | 0 |
| 实施例4 | 53.2 | 0 |
Claims (7)
1.一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉，其特征在于，所述米曲霉为米曲霉（Aspergillus oryzae）AS.mq01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M2013430，保藏日期：2013年9月17日。
2.一种如权利要求1所述的米曲霉在转化人参皂苷Rg3生产Rh2方面的应用。
3.一种如权利要求1所述的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌株的准备：将米曲霉活化并发酵培养；
（2）酶液的制备：将步骤（1）的发酵液过滤，滤液离心，去除菌体沉淀，收集上清液；在上清液中加硫酸铵至60-80%饱和度；4-8℃静置过夜，离心，弃上清液，收集蛋白质沉淀；蛋白质沉淀用0.02mol/L，pH 4.5-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后装入透析袋，用相同的醋酸-醋酸钠缓冲液透析24-36h；透析后，离心，上清液即为粗酶液；
（3）酶液的转化反应：称取人参皂苷Rg3，用0.02mol/L，pH 4.5-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成人参皂苷Rg3浓度为0.5-1mg/mL的底物反应液，与等体积的粗酶液混合，在35-45℃条件下反应24h；然后在90℃放置15min，终止反应，得到人参皂苷Rh2。
4.根据权利要求3所述的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，其特征在于，步骤（1）的具体方法如下：将米曲霉接种于PDA斜面培养基，于32-36℃培养36-48h，然后挑取菌株孢子或菌落转入麦芽汁培养基，在28-32℃、150-200rpm条件下发酵培养3天。
5.根据权利要求4所述的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，其特征在于，所述PDA斜面培养基的制备方法：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水定容至1000ml，自然pH。
6.根据权利要求4所述的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，其特征在于，所述麦芽汁培养基的制备方法：将干麦芽粉碎，1重量份麦芽加4重量份水，在65℃水浴锅中糖化3-4h，将糖化液用纱布过滤后稀释至5-6波美度，得到麦芽汁培养基。
7.根据权利要求3所述的米曲霉转化人参皂苷Rg3生产Rh2的方法，其特征在于，所述离心条件为：离心温度15-20℃、转速10000-13000rpm、离心时间10-20min。
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Family Cites Families (9)
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| KR101015700B1 (ko) * | 2010-09-16 | 2011-02-22 | 홍진석 | 인삼의 발효방법 및 이로부터 제조된 발효 인삼 |
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