CN1793320A - 一株镰刀霉菌及其用于制备人参皂苷Rh2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株镰刀霉菌及其用于制备人参皂苷Rh2的方法。用于制备人参皂苷Rh2的是一种属于镰刀霉菌属的菌种(Fusarium proliferatum)ECU2042 CGMCC No.1495。本发明为在温和条件下催化水解相对易得的人参皂苷制备极具应用潜力的稀有皂苷提供了一株制备方便、价格相对低廉的镰刀菌株，用该菌株制备人参皂苷Rh2，成本相对较低，转化率可达到60％以上，所得皂苷纯度≥95％。
Description
技术领域
本发明涉及一株镰刀霉菌及其用途，具体地说，涉及一株产特异性β-葡萄糖苷水解酶的镰刀霉菌及其在制备人参皂苷Rh2中的应用方法。
技术背景
人参是我国珍贵的传统中药，具有滋补、强壮、抗疲劳、抗肿瘤等多方面的药理和生物活性。研究表明，人参皂苷是其主要活性成分，目前已分离鉴定的人参皂苷达40多种。各种人参皂苷都有其独特的药物疗效，其中人参皂苷Rh2对多种癌细胞的增殖具有抑制作用，是很有发展潜力的抗癌药物。但人参皂苷Rh2在人参中的含量极少，所以直接提取十分困难。相对而言，人参皂苷Rg3的提取制备要容易得多，而人参皂苷Rg3与人参皂苷Rh2的区别仅在于前者在C3位上多连有一个糖基，因此选用合适的方法去掉Rg3分子中C3位上侧链O-Glc-Glc末端的β-葡萄糖基，使其转化为人参皂苷Rh2，是制备Rh2的一条有效途径。多年来许多学者对此都颇感兴趣，已有一些文献和专利涉及了这方面的技术，较为典型的有：
(1)中国专利CN 1293198A于2001年公开了一种化学法改变皂苷结构的方法。此方法将几种人参皂苷单体或其混合物溶于碱金属氢氧化物和高沸点脂肪醇类有机物组成的溶液中，在常压下加热进行水解，来制备稀有的人参皂苷。化学法的主要缺点是专一性差，转化率低。
(2)文献Biological & Pharmaceutical Bulletin，2002，25(1)，58-63报道了利用肠道菌将人参皂苷Rg3代谢生成人参皂苷Rh2和原人参二醇。该方法的主要缺点是肠道菌厌氧培养条件苛刻、效率很低，且需要专用设备，用于稀有皂苷制备很不经济。
(3)韩国专利2000年公开了用酶制备人参皂苷Rh2的方法。此方法利用β-半乳糖苷酶水解人参皂苷Rg3生成人参皂苷Rh2。使用商品酶制剂存在供应受限、成本较高等问题。
(4)文献大连轻工业学院学报，2000，19(3)，195-198报道了利用一株黑曲霉制备人参皂苷Rh2的方法，此黑曲霉所产生的β-葡萄糖苷酶可以特异性地水解人参皂苷Rg3生成Rh2。该方法的不足之处是反应的底物浓度较低，产品得率也不够高。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一株镰刀霉菌及其用于制备人参皂苷Rh2的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
用于制备人参皂苷Rh2的是一种属于镰刀霉菌属的菌种(Fusariumproliferatum)ECU2042，其具有制备人参皂苷Rh2的能力，该菌种筛选自土壤，并于2005年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.1495。
所述菌种具有以下性质：
在平板上25℃培养五天后，其菌落直径为55mm，气生菌丝透明，呈毡状，老化后带有淡紫色，但琼脂无色。小分生孢子以链状或假头状着生于气生菌丝中散生或聚生的孢子梗上，孢子梗长约25μm，分生孢子呈棒状，大小为6～15μm×3～4μm，底部扁平。没有观察到大型分生孢子，也无厚垣孢子，可在温度10～60℃，pH3.0～8.0和NaCl浓度0～7％(w/v)的环境中生存。
经德国DSMZ公司鉴定，此菌种为镰刀霉菌属(Fusarium proliferatumnirenberg)。它与其它真菌(例如：黑曲霉)的主要不同点在于，此菌种气生菌丝发达，透明，呈毡状，老化后带有淡紫色；而黑曲霉菌落生长稍局限，菌丝初为白色，逐渐变为黑色厚绒状。黑曲霉还具有由顶囊、小梗以及分生孢子链构成的头状结构，称分生孢子头，幼为球形，后为放射状，呈褐黑色。
已有专利的菌种(黑曲霉)与本发明菌种显著不同。
采用上述菌种制备人参皂苷Rh2的方法，包括如下步骤：
(1)斜面培养：所使用的斜面培养基为察氏琼脂培养基，将菌种接种到斜面培养基上，20～40℃恒温培养1～5天后，4℃保存备用；
(2)摇瓶培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到装有4ml液体培养基(察氏培养基：蔗糖30g/l，NaNO3 3g/l，K2HPO4 1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.01g/l)的φ10×100mm的摇管中，在20～50℃，最好25～35℃和60～300转/分钟的旋转摇床上培养12～20h后，接种于装有生长培养基的1L大摇瓶中，在摇床上培养1～5天，摇瓶的装液量10～30％(v/v)，接种量2～10％(v/v)；
(3)酶促水解反应
培养后的霉菌发酵液经抽滤获得菌丝体，用生理盐水洗涤，经研磨破碎细胞后，在4℃以15000r/min离心，取上清液作为酶源，以人参皂苷Rg3为底物，其加入量为0.5～20g/L(反应物总体积)，酶的加入量为10～100U/g底物，在pH3.0～8.0，最好是pH5.0～6.0的缓冲液中进行水解反应，反应温度为20～60℃，最好为35～50℃，反应时间为3～30小时，然后从反应产物中收集人参皂苷Rh2；
所说的缓冲液优选为NaAc/HAc体系；
本发明为在温和条件下催化水解相对易得的人参皂苷制备极具应用潜力的稀有皂苷提供了一株制备方便、价格相对低廉的镰刀菌株，用该菌株制备人参皂苷Rh2，成本相对较低，转化率可达到60％以上，所得皂苷纯度≥95％。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为更好理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。
实施例1
斜面培养：采用察氏琼脂培养基。将菌种接种到斜面培养基上，30℃恒温培养大约3天。
产酶培养：采用察氏液体培养基，100ml摇瓶装液量20ml，灭菌后接入预先已在摇管中培养了18小时的培养液作为种子，接种量10％(v/v)，培养温度30℃，摇床转速160r/min，在上述条件下摇瓶培养3天，产酶量可达到48.8U/L发酵液。
酶活单位(U)的定义为：在40℃、pH5.0条件下，每小时生成1μmol Rh2所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
实施例2
斜面培养与实施例1相同。将在30℃、160r/min条件下预培养了18小时的培养液作为种子，按10％(v/v)的接种量转入装有20ml察氏培养基的100-ml摇瓶中，在培养温度30℃，摇床转速160r/min的条件下培养24小时，加入0.5mg/ml的人参总皂苷进行产酶诱导，继续培养48小时，酶产量提高了一倍。
实施例3
种子培养与实施例2相同。在若干个1L大摇瓶中各装入200ml察氏液体培养基，经高温灭菌后，分别接入8ml预培养18小时的种子液，在培养温度30℃，摇床转速160r/min的条件下培养3天后，酶产量达30.9U/L发酵液。
实施例4
取实施例3中的发酵液1000ml，经抽滤获得细胞，用生理盐水(0.85％NaCl)洗涤，将所得细胞研磨破碎，离心，以所得上清液作为酶液，加入NaAc/HAc缓冲液(50mM，pH5.0)，使反应体系为10ml，再加入10mg人参皂苷Rg3，在40℃、摇床转速160r/min的条件下，转化反应24小时后，进行HPLC分析(UV 203nm，流动相：甲醇/水＝85/15，v/v)，转化率接近100％。
实施例5
粗酶液制备方法同实施例4，将所得粗酶液制成冻干粉末。在250ml磨口三角瓶中依次加入12mg粗酶，50mg人参皂苷Rg3，再加入50ml缓冲液(NaAc/HAc，100mM，pH5.0)，塞紧磨口塞，用生料带封口，50℃、160r/min旋转摇床上振荡反应24h，反应结束后分别加入正丁醇25ml萃取四次，收集正丁醇相，旋转蒸发除去溶剂，经过硅胶快速柱层析(氯仿/甲醇＝9/1)分离纯化，再经甲醇-水(70/30，v/v)重结晶，得到11mg人参皂苷Rh2，转化率为60.3％，最终摩尔产率为29％，制备所得人参皂苷Rh2的纯度≥95％。
Claims (7)
1.一株镰刀霉菌(Fusarium proliferatum)ECU2042 CGMCC No.1495。
2.采用权利要求1所述的菌种制备人参皂苷Rh2的方法，其特征在于，包括如下步骤：
发酵培养镰刀霉菌(Fusarium proliferatum)ECU2042 CGMCCNo.1495；
培养后的霉菌发酵液经抽滤获得菌丝体，洗涤，破碎细胞，离心取上清液作为酶源，以人参皂苷Rg3为底物，其加入量为0.5～20g/L(反应物总体积)，酶的加入量为10～100U/g底物，在pH 3.0～8.0的缓冲液中进行水解反应，反应温度为20～60℃，反应时间为3～30小时，然后从反应产物中收集人参皂苷Rh2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，水解反应的pH是5.0～6.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应温度为35～50℃。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的缓冲液为NaAc/HAc体系。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养镰刀霉菌(Fusariumproliferatum)ECU2042 CGMCC No.1495包括下列步骤：
(1)斜面培养：将菌种接种到斜面培养基上，20～40℃恒温培养1～5天；
(2)摇瓶培养：摇瓶装液量10～30％(v/v)，接种量2～10％(v/v)，培养温度20～50℃，摇床转速60～300r/min，摇瓶培养1～5天。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所使用的发酵培养基为察氏培养基。
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