CN107991423A - 一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法，属于微生物菌种筛选技术领域，该方法利用微生物在土壤中经过一定途径的代谢活动将自毒物质降解的原理，用带有一定含量人参自毒物质人参皂苷的培养基培养不同菌种，在菌种利用培养基中营养物质生长之后，将用反相高效液相色谱检测发酵液中自毒物质人参皂苷的含量变化进行对比，从而筛选出具有较高人参自毒物质降解能力的菌株。应用本方法筛选出的人参自毒物质降解菌用于人参种植，既解决了人参重茬病害问题，且不会对人参的正常生长有副作用，又不会污染环境、对环境造成危害，具有良好的经济和社会效益。

Description

一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法

技术领域

本发明涉及微生物菌种筛选技术领域，具体涉及一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法。

背景技术

随着科技的发展，近几年来，农业种植重茬病害日益严重。人参是国家一级重点保护植物，作为“东北三宝”之一，其同样受到重茬病害的危害。很多资料显示，人参重茬的主要原因是由于其本身自毒物质的存在，而人参皂苷是人参主要自毒物质，土壤中人参皂苷的存在导致种过一茬人参后的地块基本都不能再连续种植，需要整地、修整之后才能基本恢复正常种植，否则出苗率极低，且易发生根腐病等严重病害。但是目前该方法时间成本较高，大大减少了人参的正常产量，若改在其他地方载种人参，由于气候环境的差异，又会使人参缺少很多道地药材的药用价值，质量不能得到保证。

因此，找到一种合适的方法降解人参自毒物质是极其必要的，但是要求其既不能对人参的正常生长有副作用，又不能污染环境、对环境造成危害。利用微生物对土壤中的人参皂苷进行降解是一种不会造成污染的方法，且能够解决人参重茬病害问题。

发明内容

针对以上技术缺陷，本发明的目的是提供一种能够降解种植人参时土壤中自毒物质人参皂苷的菌种的筛选方法，进而解决人参自毒物质人参皂苷对人参生长产生的重茬障碍。

为达到上述的技术目的，本发明提供的一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法采用以下技术方案：

步骤一：人参皂苷降解菌的初步筛选

（1）取50mL培养基加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，制备多组样品液，向其中分别接入不同菌种；

（2）将（1）中的多组处理样品分别于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养24h，之后由高速冷冻离心机以12000rpm的速度离心20min；

（3）分别取（2）中的上清液于60℃旋转蒸发器旋转蒸干；

（4）将（3）中所得的各蒸干固体用甲醇溶解定容至10mL；

（5）将（4）所得溶液分别由高速冷冻离心机以12000rpm的速度再次离心20min；

（6）取（5）中所得的各上清液分别由0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后，利用反相高效液相色谱法检测各组样品中人参皂苷的含量，以人参皂苷含量最低为判断标准筛选出具有最优人参皂苷降解效果的菌种；

步骤二：人参皂苷降解菌对人参皂苷降解效果的进一步判定：

（1）选用步骤一筛选出的人参皂苷含量最低的菌种为进一步的实验菌种；

（2）取两瓶100mL的LB培养基，分别向其中加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，其中一瓶设置为对照，另一瓶接入步骤一筛选出的人参皂苷降解菌菌种；

（3）两瓶实验样品均于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养48h；

（4）每隔两天跟踪检测各实验样品中的人参皂苷含量，其中，每一次检测取10mL发酵液，在6℃条件下由高速冷冻离心机以10000rpm的速度离心20min；

（5）分别取上清液于0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后利用反相高效液相色谱法检测人参皂苷的含量，从而判定所筛选菌种对人参皂苷降解效果的有效性。

其中，所述反相高效液相色谱法检测人参人参皂苷的含量的方法包括：

（1）色谱条件：

色谱柱C18，流动相:乙腈+水=35+65，波长：203nm，柱温：35℃，流速:1.00mL/min，进样量：10μL；

（2）标准曲线的绘制：

a、取0.04mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4、6、8、10μL，

b、取0.06mg/mL98%标准样品溶液分别进样5、10μL，

c、取0.08mg/mL98%标准样品溶液进样10μL，

d、取2.00mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4μL，进而获得标准曲线。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用微生物在土壤中经过一定途径的代谢活动将自毒物质降解的原理进行自毒物质降解菌的筛选，适用于利用微生物对人参自毒物质的降解，进而利用该方法解决人参重茬连作障碍的问题。本发明方法能够有效运用微生物生防菌的生长代谢作用，可以降解自毒物质，又不会对植物本身以及环境产生不利影响，并对我国有限的土地资源实现有效的综合利用，减少每年废弃老参地、开垦新林地用于满足人参种植需要对当地自然生态环境造成的毁灭性破坏。同时，本发明人参自毒物质降解菌的筛选也有利于西洋参、三七等人参属植物连作障碍的解决，有助于改进人参、西洋参、三七等的栽培模式，促进其耕作***的可持续发展。

附图说明

图1是利用本发明提供的反相高效液相色谱法绘制的标准曲线；

图2是本发明的标准物质即人参自毒物质人参皂苷的反相高效液相色谱图；

图3是实施例1中对照组经摇床培养4天后的反相高效液相色谱图；

图4是实施例1中经筛选出的降解菌处理后的样品经摇床培养4天后的反相高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细描述，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互结合，另外，实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

大量文献显示，人参皂苷是人参主要自毒物质，因此，在本发明中，以人参皂苷含量作为人参自毒物质的含量，以各样品中检测到的人参皂苷的含量变化来判定人参自毒物质降解菌降解效果的有效性。

本发明公开了一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法，方法包括：

用反相高效液相色谱法检测人参自毒物质人参皂苷的含量，其色谱条件如下：

色谱柱C18；流动相:乙腈+水=35+65；波长：203nm；柱温：35℃；流速：1.00mL/min；进样量：10μL，其中，标准物质即人参自毒物质人参皂苷经过反相高效液相色谱后得到如图2所示的人参皂苷的反相高效液相色谱图。

本发明中，取0.04mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4、6、8、10μL，取0.06mg/mL98%标准样品溶液分别进样5、10μL，取0.08mg/mL98%标准样品溶液进样10μL，取2.00mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4μL，进而获得如图1所示的标准曲线。

降解菌的筛选方法：

包括样品前处理，用带有一定含量人参自毒物质人参皂苷的培养基培养不同菌种，在菌种利用培养基中营养物质生长之后，用反相高效液相色谱检测发酵液中人参自毒物质人参皂苷的含量变化，从中筛选出人参皂苷含量变化最大，即对人参皂苷降解效果最佳的菌种。

为了使本技术领域的技术人员进一步理解该技术方案，下面举一具体实施例：

实施例1、京青公司现有生防菌对人参皂苷降解情况对比及降解菌筛选

试验地：京青公司研发实验室

方法如下：

利用岛津LC-20A，设置仪器参数：色谱柱C18；流动相:乙腈+水=35+65；波长：203nm；柱温：35℃；流速:1.00mL/min；

1、降解菌初步筛选

取50mL培养基加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，制备多组样品液，向其中分别接入不同菌种，各于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养24h，之后由高速冷冻离心机以12000rpm的速度离心20min；分别取各样品的上清液于60℃旋转蒸发器旋转蒸干，所得蒸干固体用甲醇溶解定容至10mL；各溶解液分别由高速冷冻离心机以12000rpm的速度再次离心20min之后，分别取上清液于0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡，用反相高效液相色谱法检测各处理样品中人参自毒物质的含量，检测结果如下表所示：

根据检测结果，JQ2301对人参自毒物质的降解率最高，其他菌种降解率明显偏低。

2、筛选出的降解菌对人参皂苷降解效果的进一步判定

取两瓶100mL的LB培养基，分别向其中加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，其中一瓶设置为对照，另一瓶接入步骤1筛选出的菌种JQ2301。两个实验样品在完全相同条件下于34℃以220rpm的速度摇床培养，每隔两天跟踪检测自毒物质含量，其中，每一次检测取10mL发酵液，6℃下用高速冷冻离心机以10000rpm的速度离心20min。本步操作中，实际离心时间依样品浑浊程度而定。离心后分别取上清液于0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后经反相高效液相色谱法进行人参皂苷含量检测。

摇床培养4天后对照组和接入菌种的样品的检测结果分别如图3和图4所示。其中，利用液相色谱图峰面积计算，对照组中人参自毒物质含量为65%，接入菌种后的样品中人参自毒物质含量为3%。因此，从谱图中可以看出，采用筛选出的降解菌对实验样品进行摇床培养4天后，人参自毒物质含量即有明显的降低，进一步证明了本降解菌对人参自毒物质人参皂苷降解的有效性。

实施例2、利用实施例1中筛选出的生防菌做成成品进行盆栽实验

试验地：京青公司研发中心人工气候室

方法如下：

取一定量人参种植重茬土和一定量的可种植人参的新土，分装至15盆；

做五个处理，每个处理做三个平行实验，分别为对照组CK（新土）、重茬土、CK+10mL浓度为5mg/mL的自毒物质、CK+10mL浓度为5mg/mL的自毒物质+实施例1制备的生防菌成品颗粒（每株20g）、重茬土+实施例1制备的生防菌成品颗粒（每株20g）。

一个月后，统计出苗率及发病率，统计结果如下：

由于在人参种植时引起重茬的主要病因是人参自毒物质，从以上统计结果可以发现，使用生防菌成品颗粒的处理，出苗率明显提高，发病率明显降低，由此可以说明用该方法筛选出的降解菌对人参重茬障碍有一定的缓解。应用本方法筛选出的人参自毒物质降解菌用于人参种植，既解决了人参重茬病害问题，不会对人参的正常生长有副作用，又不会污染环境、对环境造成危害，具有良好的经济和社会效益。

此外，本发明人参自毒物质降解菌的筛选也有利于西洋参、三七等人参属植物连作障碍的解决，有助于改进人参、西洋参、三七等的栽培模式，促进其耕作***的可持续发展，对解决其他中药材的连作障碍问题也具有参考价值，从而更好地保证药材的质量和提高药材的产量。

以上是对本发明实施例所提供的一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法进行的详细介绍。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法，其特征在于：

步骤一：人参皂苷降解菌的初步筛选

（1）取50mL培养基加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，制备多组样品液，向其中分别接入不同菌种；

（2）将（1）中的多组处理样品分别于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养24h，之后由高速冷冻离心机以12000rpm的速度离心20min；

（3）分别取（2）中的上清液于60℃旋转蒸发器旋转蒸干；

（4）将（3）中所得的各蒸干固体用甲醇溶解定容至10mL；

（5）将（4）所得溶液分别由高速冷冻离心机以12000rpm的速度再次离心20min；

（6）取（5）中所得的各上清液分别由0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后，利用反相高效液相色谱法检测各组样品中人参皂苷的含量，以人参皂苷含量最低为判断标准筛选出具有最优人参皂苷降解效果的菌种；

步骤二：人参皂苷降解菌对人参皂苷降解效果的进一步判定：

（1）选用步骤一筛选出的人参皂苷含量最低的菌种为进一步的实验菌种；

（2）取两瓶100mL的LB培养基，分别向其中加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，其中一瓶设置为对照，另一瓶接入步骤一筛选出的人参皂苷降解菌菌种；

（3）两瓶实验样品均于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养48h；

（4）每隔两天跟踪检测各实验样品中的人参皂苷含量，其中，每一次检测取10mL发酵液，在6℃条件下由高速冷冻离心机以10000rpm的速度离心20min；

（5）分别取上清液于0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后利用反相高效液相色谱法检测人参皂苷的含量，从而判定所筛选菌种对人参皂苷降解效果的有效性。

2.根据权利要求1所述的一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱法检测人参人参皂苷的含量的方法包括：

（1）色谱条件：

色谱柱C18，流动相:乙腈+水=35+65，波长：203nm，柱温：35℃，流速:1.00mL/min，进样量：10μL；

（2）标准曲线的绘制：

a、取0.04mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4、6、8、10μL，

b、取0.06mg/mL98%标准样品溶液分别进样5、10μL，

c、取0.08mg/mL98%标准样品溶液进样10μL，

d、取2.00mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4μL，

进而获得标准曲线。