CN103205365B

CN103205365B - 塔宾曲霉及其在制备人参皂苷Rh4及其苷元中的应用

Info

Publication number: CN103205365B
Application number: CN201310101653.4A
Authority: CN
Inventors: 张怡轩
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2033-03-27
Also published as: CN103205365A

Abstract

本发明公开了塔宾曲霉（Aspergillustubingensis）及其制备稀有人参皂苷Rh4及其苷元的应用。选取具有水解人参皂苷的活性菌株塔宾曲霉，采用需氧发酵生物转化技术，转化人参总皂苷，生成人参皂苷Rh4及其苷元与提取纯化Rh4及苷元。选取的具有水解人参皂苷活性的菌株为塔宾曲霉Aspergillustubingensis，该菌株是2007年6月采自泰国普吉岛，在PDA固体培养基上菌落为黑色，实验室保藏编号SYP-F-2612，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC6992。该发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。

Description

塔宾曲霉及其在制备人参皂苷Rh4及其苷元中的应用

技术领域：

本发明涉及药品技术领域，涉及一种塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis.）及其在制备人参皂苷Rh4及其苷元中的应用。

背景技术：

人参（Panax ginseng C. A. Meyer）为五加科人参属多年生草本，是我国著名的中药材，在我国药用历史约四千年，以“东北三宝”之首驰名中外，久服健身延年，具有很大的药用价值。Garriques在1854年首先开始对人参及其同源物进行化学成分的研究，从此，人们便开始对人参进行大量的化学、生物化学和药理学的研究。到目前为止，从中发现的化学成分主要为三萜皂苷、倍半萜、黄酮、多糖、田七氨酸、聚烯炔和多胺等成分。

国内外学者对人参皂苷抗肿瘤活性的构效关系研究表明：低糖链的皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用，其规律如下：苷元>单糖苷>二糖苷>三糖苷>四糖苷。如Rg₁和Rh₁都具有抑制癌细胞增殖的作用，但Rh₁C-20位上缺少一分子β-D-葡萄糖，其抑制癌细胞增殖的能力约为Rg₁的15倍。可见，人参皂苷分子中的糖基侧链对于其生物活性有着显著的影响。因此，通过一定的手段改变原有人参皂苷的结构，获得活性更强的稀有人参皂苷，已成为很多学者研究的重要课题。

目前，国内外对其主要的活性成分人参皂苷的预防和抑制肿瘤的作用进行了深人的研究，结果发现，人参总皂苷及各单体化合物对促进肿瘤细胞凋亡，促使肿瘤细胞分化，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性以及提高机体抗肿瘤的免疫力等方面具有重要的作用。而稀有人参皂苷Rh4及其苷元经过MTT法进行生物学活性的检测，发现其具有不同程度的抗肿瘤活性，因此找到制备稀有人参皂苷Rh4及其苷元的方法具有很重要的意义。

发明内容

本发明提供一种生物转化菌种和实施方法，改变人参皂苷糖基制备稀有人参皂苷Rh4及其苷元的方法。选用一种真菌（塔宾曲霉）菌种，采用需氧发酵生物转化技术、固定化细胞技术固定化酶技术中的一种或者两种方法连用，直接以总人参皂苷作为底物，转化制备人参皂苷Rh4及其苷元。

该方法包括：原始菌种的活化、摇瓶种子培养、生物转化培养、以及后提取的各种步骤。其生产工艺流程如下：

脱脂牛奶冻干管保存的原始菌种→斜面活化→摇瓶种子→生物转化瓶，投入人参皂苷底物进行生物转化→终止转化→提取纯化→获得Rh4及其苷元。

具体工艺步骤如下：

（1）培养基斜面培养基为PDA培养基，配方为：马铃薯 200g 葡萄糖 10g 琼脂 20g pH 7.2-7.4；将马铃薯去皮切块煮沸30min，然后四层纱布过滤，补足水定容至1L，灭菌121℃×30min。种子培养基和微生物转化培养基中的营养包括发酵过程中专业技术人员经常采用的各类碳源和氮源以及无机盐。如1L培养基中所含有的碳源可为：1~30g葡萄糖、1~100g糊精；1~50g蔗糖；1~100g淀粉；1~50g麦芽糖；1L培养基中氮源可为：1~20g蛋白胨；1~50g花生饼粉；1~20g酵母粉；1~50g黄豆饼粉；1~50g棉籽饼粉；1~10g尿素；1~10g 氯化铵。此外还需要添加无机盐，如氯化钙；磷酸二氢钾；硫酸镁；硫酸锌；氯化钠；硫酸铵；KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄、(NH₄)₂SO₄。

（2）生物转化工艺：将脱脂牛奶冻干管保存的原始菌种接到斜面培养基上，在25~28℃环境下培养3~7天，待菌苔生长致密。将活化后的斜面挖块接种到种子瓶中，于自动旋转摇瓶机上25~28℃恒温震荡（200r/min）培养 48h后，按10%的转种量转种于生物转化培养基中，同时按照0.5%（w/v）的比例加入人参总皂苷，于28℃，200r/min震荡培养时间144h，转化结束。

（3）提取工艺：等体积的水饱和正丁醇三次萃取抽滤液，合并正丁醇萃取部分，减压浓缩至干。浓缩液用甲醇溶解，硅胶拌样，进行硅胶（200-300目）柱层析，采用氯仿-甲醇梯度（15:1→12:1→10:1→8:1→5:1）洗脱，每100ml为一馏分，根据TLC分析，合并极性相近部分，得到Section A和Section B两部分。分别将A、B两部分进行制备液相作进一步纯化，得到2个单体化合物，纯化样品经过核磁共振碳谱检测，鉴定其转化产物为稀有人参皂苷Rh4及其苷元。

本发明所述的摇瓶种子培养是指：采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量菌体斜面，转移到种子摇瓶中，在自动旋转摇瓶机上震荡培养，200rpm，28℃，培养48小时获得摇瓶种子。

本发明所述的微生物转化是指：采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，按10%的转种量转种于发酵培养基中，同时按照0.5%（w/v）的比例加入底物（人参总皂苷），温度为28℃，200r/min培养时间144h。

本发明所述的生物转化产物—稀有人参皂苷Rh4及其苷元的提取纯化过程是：将真菌转化液抽滤，收集滤液，用水饱和正丁醇分三次萃取，合并正丁醇萃取部分，减压浓缩至干。浓缩液用MeOH溶解，硅胶拌样，进行硅胶（200-300目）柱层析，采用氯仿-甲醇梯度（15:1--5:1）洗脱，每100ml为一馏分，根据TLC分析，合并极性相近部分，得到Section A和Section B两部分。分别将A、B两部分进行制备液相作进一步纯化，得到单体化合物Rh4及其苷元。

本发明使用的塔宾曲霉菌株已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏日期2012年12月14日，保藏编号为CGMCC No.6992，分类命名为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis.

附图说明

图1人参皂苷Rh4及其苷元的化学结构式

图2 菌株SYP-F-2612菌落形态

图3 菌株SYP2612孢子囊和孢子形态

图4 菌株SYP2612依据ITS-5.8S rDNA序列的***进化树。

具体实施方式

下面结合优选实施例对本发明做进一步叙述，但保护范围不受所述实施例的限制。

实施例1：本发明所述真菌SYP-A-2612在不同培养基上的培养特征

上述菌株的生长状态请见附图1。

菌株在PDA培养基上生长后的光学显微镜下的特征：

菌丝及孢子形态：分生孢子头球形至辐射形；分生孢子梗壁光滑，顶囊球形，产孢结构双层，分生孢子球形，壁粗糙或具疣状突起。参见附图2。

以分子生物学手段，提取上述真菌基因组DNA，以ITS1、ITS4（ITS1:5’-TCC GTC GGT GAA CCT GCG G-3’；ITS4：5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）为引物进行PCR扩增, 测序，并将所测序列与Genbank中的rDNA同源序列比对，选取11株较高同源性的菌株，并以Sphingobacterium siyangensis为参照，利用软件Clustal X与Mega3.1构建菌种进化树。菌株SYP2612与Aspergillus tubingensis strain CBS 103.12同源性最高（100%）。再结合形态学鉴定结果，该菌株被鉴定为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis。参见附图3。

实施例2:需氧发酵法转化生产稀有人参皂苷Rh4及其苷元的方法

一、培养基

（1）PDA培养基

马铃薯 200g 葡萄糖 10g 琼脂 20g pH 7.2-7.4

将马铃薯去皮切块煮沸30min，然后四层纱布过滤，补足水定容至1L，灭菌121℃×30min

（2）种子培养基（g/L）

（3）生物转化培养基（g/L）

二、需氧发酵微生物转化

1、菌种的斜面活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量粉匀涂布在灭菌后的PDA斜面上，在28℃温度下培养5-7天，菌苔生长致密、布满斜面、无杂菌，冰箱4℃保存。

2、摇瓶种子培养：将活化好的PDA斜面菌种，挖块1*1cm²接种到种子培养瓶中，在28℃温度下恒温震荡培养，200rpm，培养448h，镜检菌丝生长舒展、染色深、无杂菌即可。

3、生物转化：生物转化培养基如上，按10%的转种量转种于生物转化培养基中，同时按照0.5%（w/v）的比例加入转化用底物-人参总皂苷，28℃，200r/min，培养时间144h后，转化结束。

三、稀有人参皂苷Rh4及其苷元的鉴定与纯化

1、将生物转化产物液在室温常压下，用减压抽滤法除去菌丝体，收集上清液采用TLC、HPLC方法，进行人参皂苷Rh4及其苷元的定性与定量分析。

2、TLC检测条件：硅胶GF254；展开剂：氯仿：甲醇= 8：1（v/v）。检测样品为人参皂苷Rh4标准品、人参皂苷Rh4苷元、生物转化后的样品。薄层层析后，挥干展开剂，喷10%（v/v）H₂SO₄-EtOH于105 ℃烘烤10min，斑点显***。比较标准品和样品的比移值（Rf），可以看到塔宾曲霉能够将人参皂苷不同程度的转化成人参皂苷Rh4及其苷元。

3、HPLC检测条件如下。在生物转化液中投入0.5%人参皂苷时，塔宾曲霉能将90%以上的人参皂苷转化为稀有人参皂苷rh4及其苷元。

4、转化产物的分离纯化

等体积的水饱和正丁醇三次萃取抽滤液，合并正丁醇萃取部分，减压浓缩至干。浓缩液用甲醇溶解，硅胶拌样，进行硅胶（200-300目）柱层析，采用氯仿-甲醇梯度（15:1→12:1→10:1→8:1→5:1）洗脱，每100ml为一馏分，根据TLC分析，合并极性相近部分，得到Section A和Section B两部分。分别将A、B两部分进行制备液相作进一步纯化，得到2个单体化合物，纯化样品经过核磁共振碳谱检测，鉴定其转化产物为稀有人参皂苷Rh4及其苷元。相关的¹³C-NMR结构解析数据见表1。

5、转化产物稀有人参皂苷Rh₄及其苷元的生物学活性的研究结果

采用MTT法，研究转化产物稀有人参皂苷Rh₄及其苷元对人胃癌细胞（SGC-7901）、人成纤维肉瘤细胞（HT-1080）、人口腔癌细胞（KB-A-1）的增殖抑制作用，抑制率及相应的IC₅₀见表2和表3所示。

表2 人参皂苷Rh₄及其苷元对三种细胞生长抑制率的考察

抑制率 <20%背景为亮灰色；抑制率在 20-90%之间背景为深灰色；抑制率>90%背景为黑色。

由表2可以发现，稀有人参皂苷Rh₄对上述三种细胞均有抑制作用，随着浓度的增加，抑制作用逐渐增加，当浓度达到156.99μM时，抑制率均达到90%以上，且对SGC的抑制率明显高于HT和KB。同样，稀有人参皂苷Rh₄苷元的浓度增加，抑制作用逐渐增加，当浓度达到218.34μM时，三种细胞的抑制率均大于90%。由表3可见，与阳性对照药多柔比星相比，稀有人参皂苷Rh₄及其苷元IC₅₀值较大。

Claims

1.塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis），其特征在于：其保藏编号为：CGMCC No.6992。

2.权利要求1所述的塔宾曲霉在制备稀有人参皂苷Rh4及苷元中的应用,其特征在于，采用需氧发酵生物转化技术，以总人参皂苷作为底物转化人参总皂苷，生成人参皂苷Rh4及其苷元，提取纯化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：其生物转化步骤如下：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、微生物发酵、发酵液的后处理；具体工艺流程如下：脱脂牛奶冻干管保存的原始菌种→斜面活化→摇瓶种子→生物转化瓶，投入人参皂苷底物进行生物转化→终止转化→提取纯化→获得Rh4及其苷元

（1）培养基种子培养基和微生物发酵培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源为葡萄糖、糊精、蔗糖、淀粉或麦芽糖，氮源为蛋白胨、热轧花生饼粉、酵母粉或黄豆饼粉，还需要添加NH₄Cl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、ZnSO₄、(NH₄)₂SO₄；

（2）微生物发酵工艺：通过摇瓶二级发酵获得人参皂苷Rh4及Rh4苷元，培养方法包括：摇瓶种子的制备：灭菌前培养基保持自然pH，灭菌后挖块接种生产菌株斜面菌苔后，于自动旋转摇瓶机上，转数200rpm，温度为28℃，200r/min培养48h后，按10%的转种量转种于发酵培养基中，同时按照0.5%（w/v）的比例加入底物，28℃，200r/min，培养时间144h，转化结束。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：其纯化步骤如下：将真菌转化液抽滤，收集滤液，用等体积的水饱和正丁醇分三次萃取，合并正丁醇萃取部分，减压浓缩至干，浓缩液用MeOH溶解，硅胶拌样，进行硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇梯度洗脱，每100ml为一馏分，根据TLC分析，合并极性相近部分，得到Section A和Section B两部分，分别将A、B两部分进行制备液相作进一步纯化，得到单体化合物Rh4及其苷元。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的氯仿-甲醇的梯度为15：1-5：1。