CN103952447B - 一种利用厌氧条件下发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种利用玉米粉全水解液作为发酵培养基厌氧发酵生产丁二酸的方法。本发明采用玉米粉双酶解法生产的葡萄糖水解液为唯一碳源，玉米粉生产葡萄糖所产生的滤渣——玉米渣经中性蛋白酶酶解所得到的玉米糖渣水解液作为唯一氮源，将这两种水解液组合形成玉米粉全水解液作为发酵培养基，在不添加其他营养物质条件下，利用其厌氧发酵生产丁二酸。本发明发酵生产丁二酸的方法，可以代替价格昂贵的酵母粉和蛋白胨，同等条件下，与LB培养基发酵生产丁二酸相比，丁二酸的产量提高了1.37%，转化率提高了21.65%。本方法更经济，更清洁，该方法对于丁二酸产业化有着重大的意义及经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种厌氧条件下利用玉米粉全水解液发酵生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸又称琥珀酸，是三羧酸循环的中间产物，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。其作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12 种最有价值的生物炼制品之一。
生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸。利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，故成为近年来研究的热点。
玉米是世界上最重要的农作物之一，而中国是生产玉米的大国之一，有着丰富的玉米资源，有报道称，中国的玉米年产量超过1亿吨。另外，据报道，玉米中含有对菌体生长和产酸有促进作用的因子，如生物素、VB1等。玉米粉是制作葡萄糖的重要原料，但是在过滤工艺之后，也产生了大量的副产物，玉米渣。因此，将廉价而易得的玉米粉及副产物玉米渣充分利用到发酵产丁二酸当中，这必将对发酵生产丁二酸产业化有着重要的意义。
大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，丁二酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸，并进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸，最终以丁二酸的形式积累。G. N. Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段是菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。然而两阶段发酵过程中，需要消耗大量的营养成分用于菌体的生长，导致丁二酸总得率下降，同时由于菌体有氧生长对溶氧要求较高，搅拌及冷却等所需要较高的能耗及成本投入，因此，一步厌氧发酵产丁二酸受到越来越多的关注。然而在专一性厌氧条件下，重组大肠杆菌生产丁二酸需要酵母粉、蛋白胨等复合氮源作为发酵培养基成分，但价格过于昂贵，除此之外，还有菌株生长缓慢，丁二酸终浓度和收率较低等问题未解决。为此，寻找一种在专一性厌氧条件下利用发酵培养基菌株快速生长提高丁二酸终浓度和收率的方法对于发酵生产丁二酸产业化有着突破性的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能使菌株在厌氧条件下无需价格昂贵的酵母粉、蛋白胨等复合氮源作为发酵培养基成分仍能发酵生产得到高浓度和高收率丁二酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：
本发明提供的一种厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述方法的发酵培养基为玉米粉全水解液。
优选的，所述的玉米粉全水解液包括玉米粉水解所得的葡糖糖水解液和玉米渣水解液。
优选的，所述的葡萄糖水解液为玉米粉经双酶解法水解所得；所述的玉米渣水解液由上述玉米粉双酶法水解过虑后的玉米渣经中性蛋白水解所的。
优选的，所述的玉米粉双酶解法的具体步骤为：将玉米粉与纯水以固体质量分数38 %的比例混合均匀，并加入钙离子，其添加量按照每克原料添加0.000175g钙离子，在pH=6.5，95℃条件下添加7 U/克原料的液化酶，并保温至液化结束；将液化液灭完酶活后在pH=4.5，60℃条件下添加200 U/克原料的糖化酶，并保温48 h，所得糖化液经过滤得到的滤液为葡萄糖水解液；
优选的，所述的玉米渣水解的具体步骤为：将糖化液过滤后的滤渣和纯水按固体质量百分数10%的比例混合，在pH=7.0，55℃条件下添加中性蛋白酶，其添加量为滤渣质量的0.3%，24 h后过滤所得滤液为玉米糖渣水解液，并用凯式定氮法对水解液进行氮含量的测定。
优选的，所述的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌AFP111（ Escherichia coliAFP111）。
优选的，所述重组大肠杆菌AFP111产丁二酸的方法具体步骤如下：
（1）试管培养：将抗生素和重组大肠杆菌 Escherichia coliAFP111接种在5 ml液体LB培养基中厌氧培养，培养温度为37℃，200r/min,培养时间为12 h；
（2）种子培养：将抗生素和试管培养的 Escherichia coli AFP111接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量50 ml，有氧培养，培养温度为37℃，200r/min，培养时间为6 h；
（3）厌氧摇瓶发酵生产丁二酸：将抗生素和种子培养液接种到发酵培养基中，100ml厌氧摇瓶装液量为30ml，接种量为10 %，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳；培养温度为37℃，200r/min，培养时间为48 h。
优选的，所述步骤1）中LB培养基的配方为蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L ；
所述的步骤2）中种子培养基配方为蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L；
所述步骤3）水解液培养基配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米糖渣水解液，
葡萄糖水解液10 g/L～80 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
优选的，所述步骤3）中葡萄糖水解液为20 g/L。
优选的，所述的步骤3）中充二氧化碳的时间为2分钟；所述的抗生素为卡那霉素和氯霉素，且添加的终浓度都为100 μg/mL。
本发明的有益效果在于：
本发明仅仅利用玉米粉作为原料生产碳源（葡萄糖）和氮源作为发酵培养基代替价格昂贵的LB培养基（含有进口蛋白胨和酵母粉），在不添加其他营养物质和专一性厌氧条件下，使菌株厌氧发酵生产丁二酸的产量和得率相比LB培养基的丁二酸产量和得率略高。并且玉米渣作为工业上的副产物被充分利用，这种方法不仅经济，节约，还节能减排，减少环境污染。如以重组大肠杆菌为发酵菌株，在5 L厌氧发酵罐中，利用玉米粉经酶解所得到的两种水解液，发酵120 h消耗50 g/L的葡萄糖，生产丁二酸的产量为42.29 g/L，丁二酸转化率为84.58%，与LB培养基发酵生产丁二酸相比，丁二酸的产量提高了1.37%，转化率提高了21.65%。
附图说明
图1为重组大肠杆菌在纯厌氧条件下不同初糖浓度发酵丁二酸的对比。
图2为重组大肠杆菌在纯厌氧条件下发酵120 h实验结果曲线图。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明实施例所用的菌株为重组大肠杆菌AFP111（ Escherichia coli AFP111[F+ λ - rpoS396(Am) rph-1 △(pflAB::Cam) l dhA::Kan 95 ptsG]）来源于公开文献(Mutation of the ptsG Gene Results in Increased Production of Succinate inFermentation of Glucose by Escherichia coli， Appl Environ Microbiol. Jan2001; 67(1): 148–154)。由David P. Clark 教授 (Southern Illinois University) 惠赠，本发明人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。但本发明的玉米粉全水解液作为发酵培养基不仅仅是针对大肠杆菌Escherichia coliAFP111的，对于其他的菌株也适用。
实施例1 本实施例说明重组大肠杆菌Escherichia coliAFP111在厌氧摇瓶中发酵生产丁二酸的工艺
本实施例所述的培养基配方：
试管、种子培养基的配方包括：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L 。
发酵培养基配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液20 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
具体步骤如下：
（1）试管培养：将卡那霉素和氯霉素连同大肠埃希氏菌 Escherichia coliAFP111接种到试管培养基中，在厌氧条件下，培养温度37℃，200 r/min，培养时间12 h。；
（2）种子培养：将卡那霉素和氯霉素和试管培养的AFP111接种到种子培养基中，500 ml三角瓶装液量50 ml，培养温度37℃，200 r/min，培养时间6 h；
（3）厌氧摇瓶发酵生产丁二酸：将卡那霉素和氯霉素和种子液接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），100 ml血清瓶装液量30 ml，充二氧化碳2 min，培养48 h后检测丁二酸的产量为16.39 g/L，丁二酸转化率为81.95 %，详见下表。
| OD600 | 耗糖（g/L） | 丁二酸（g/L） | 得率（%） | |
| 水解液培养基 | 4.31 | 20.00 | 16.39 | 81.95 |
| LB培养基 | 6.00 | 20.00 | 14.32 | 71.6 |
实施例2 本实施例说明大肠埃希氏菌 Escherichia coliAFP111在葡萄糖水解液添加量为10 g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L条件下发酵生产丁二酸的对比
本实施例所述的培养基配方：
试管、种子培养基的配方包括：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L 。
发酵培养基（1）配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液10 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
发酵培养基（2）配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液20 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
发酵培养基（3）配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液40 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
发酵培养基（4）配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液60 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
发酵培养基（5）配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液80 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
具体步骤如下：
（1）试管培养：将卡那霉素和氯霉素连同大肠埃希氏菌 Escherichia coliAFP111接种到试管培养基中，在厌氧条件下，培养温度37℃，200 r/min，培养时间12 h。；
（2）种子培养：将卡那霉素和氯霉素和试管培养的AFP111接种到种子培养基中，500 ml三角瓶装液量50 ml，培养温度37℃，200 r/min，培养时间6 h；
（3）厌氧摇瓶发酵生产丁二酸：将卡那霉素和氯霉素和种子液分别接种到发酵培养基（1）至（5）中，接种量10%（v/v），100 ml血清瓶装液量30 ml，充二氧化碳2 min，发酵培养48 h，发酵结果如图1所示，当初糖浓度在20 g/L的时候，丁二酸的产量在16.09 g/L，丁二酸转化率为80.45%，是不同初糖浓度发酵结果中丁二酸产量和转化率最高的。
实施例3
本实施例说明大肠埃希氏菌 Escherichia coliAFP111在5 L发酵罐中发酵生产丁二酸的工艺。
本实施例所述的培养基配方：
试管、种子培养基的配方包括：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L 。
发酵培养基配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液20 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
具体步骤：
（1）试管培养：将大肠埃希氏菌 Escherichia coliAFP111连同卡那霉素和氯霉素一起接种到试管培养基中，在厌氧条件下，培养温度37℃，200 r/min，培养时间12 h；
（2）种子培养：将卡那霉素和氯霉素和试管培养的AFP111接种到种子培养基中，500 ml三角瓶装液量50 ml，培养温度37℃，200 r/min，培养时间6 h；
（3）厌氧摇瓶发酵生产丁二酸：将卡那霉素和氯霉素和种子液接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v）,5 L发酵罐装液量3 L, CO2 流速为每分钟0.2 L，200 r/min，37°C 培养120 h。
发酵结果如图2所示，发酵培养120 h后消耗了50 g/L的葡萄糖，丁二酸的产量为42.29 g/L，丁二酸转化率为84.58%；相比LB培养基的发酵结果，玉米粉全水解液发酵丁二酸的产量和收率提高了1.37%和21.65%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述方法的发酵培养基为玉米粉全水解液；
所述的玉米粉全水解液包括玉米粉水解所得的葡萄糖水解液和玉米渣水解液；
所述的葡萄糖水解液为玉米粉经液化酶和糖化酶双酶解法水解所得；所述的玉米粉双酶解法的具体步骤为：将玉米粉与纯水以固体质量分数38 %的比例混合均匀，并加入钙离子，其添加量按照每克原料添加0.000175g钙离子，在pH=6.5，95℃条件下添加7 U/克原料的液化酶，并保温至液化结束；将液化液灭完酶活后在pH=4.5，60℃条件下添加200 U/克原料的糖化酶，并保温48 h，所得糖化液经过滤得到的滤液为玉米葡萄糖水解液；
所述的玉米渣水解液由上述玉米粉双酶法水解过滤后的玉米渣经中性蛋白酶水解所得; 所述的玉米渣水解的具体步骤为：将糖化液过滤后的滤渣和纯水按固体质量百分数10%的比例混合，在pH=7.0，55℃条件下添加中性蛋白酶，其添加量为滤渣质量的0.3%，24 h后过滤所得滤液为玉米渣水解液，并用凯式定氮法对水解液中总氮含量进行测定；
所述的发酵菌株菌为重组大肠杆菌AFP111（ Escherichia coli AFP111）。
2.根据权利要求1所述的产丁二酸的方法，其特征在于 ，所述方法具体步骤如下：
（1）试管培养：将抗生素和重组大肠杆菌AFP111接种在5 ml液体LB培养基中厌氧培养，培养温度为37℃，200r/min,培养时间为12 h；
（2）种子培养：将抗生素和试管培养的重组大肠杆菌AFP111接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量50 ml，培养温度为37℃，200r/min，培养时间为6 h；
（3）厌氧摇瓶发酵生产丁二酸：将抗生素和种子培养液接种到发酵培养基中，100ml厌氧摇瓶装液量为30ml，接种量为10 %，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳；培养温度为37℃，200r/min，培养时间为48 h。
3.根据权利要求2所述的产丁二酸的方法，其特征在于，所述步骤1）中LB培养基的配方为蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L ；
所述的步骤2）中种子培养基配方为蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L；
所述步骤3）水解液培养基配方为：含1.8 g/L氮元素的玉米糖渣水解液，
葡萄糖水解液10 g/L～80 g/L，碱式碳酸镁16 g/L。
4.根据权利要求3所述的产丁二酸的方法，其特征在于，所述步骤3）中葡萄糖水解液为20 g/L。
5.根据权利要求2所述的产丁二酸的方法，其特征在于，所述的步骤3）中充二氧化碳的时间为2分钟；
所述的抗生素为卡那霉素和氯霉素，且添加的终浓度都为100 μg/mL。
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